（微生物学专业论文）产表面活性剂采油菌株的诱变育种.pdf

中文摘要 中文摘要 生物表面活性剂主要是由微生物产生的天然表面活性化合物。生物表面活性 剂与化学合成表面活性剂性能相似，具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等功 能。但相比之下，还有其自身的许多优势：可生物降解，不会造成再污染；无毒或 低毒；一般不致敏、可消化。随着现代生物技术的迅猛发展以及生物表面活性剂在 环保、石油开采、制药、食品加工等方面的潜在应用价值的研究，已引起人们对 在工业规模上用生物技术生产表面活性剂的强烈兴趣。 本文首先是对产表面活性剂菌株h d y 系统鉴定，通过形态观察、生理生化 实验和1 6 s r r n a 同源序列比对，发现h d y 菌株与芽孢杆菌属的地衣芽孢杆菌有 9 8 以上的相似性，所以，鉴定该菌株为一株地衣芽孢杆菌属，经过薄层层析分 析，该株菌产的表面活性剂为酯肽类表面活性剂， 然后对菌株进行选育及对其最佳发酵培养基进行了优化。对h d y 进行紫外 线诱变，d e s 诱变，以及紫外线和d e s 复合诱变处理，获得一株高产菌株u d 一3 2 8 ， 脂肽产量由最初的到经传代实验表明，该菌株遗传性能稳定。 最后高产菌株u d 3 2 8 的培养基进行发酵优化，经过单因素试验和p b 试验确 定硝酸钠，葡萄糖，氯化钠为主要影响因子，以此进行响应面分析，确定了最佳 培养基，并进行了验证试验，优化后的培养基为葡萄糖3 1 8 e e l ，硝酸钠2 1 9 9 l ， 磷源1 2 9 l ，酵母粉1 4 9 l ，氯化钙1 0 9 l ，硫酸镁0 1 9 l ，硫酸铁、1 4 9 l ，氯 化钠3 3 4 9 l ，在此培养基中，脂肽产量达到1 0 4 6 1 2 9 l ，在国内外达到较高的水 平。 关键词：生物表面活性剂；脂肽；菌种鉴定： 发酵 黑龙江大学硕士学位论文 mn mm li m i i i i i i 宣i i i i a b s t r a c t b i o s u r f a c t a n t ss y n t h e s i z e db ym i c r o o r g a n i s m sa r en a t u r a ls u r f a c e a c t i v e c o m p o u n d s l i k es y n t h e t i cs u r f a c t a n t s ，b i o s u r f a c t a n t sc a r lr e d u c et h es u r f a c ea n d i n t e r f a c i a lt e n s i o n so fa d u e o u sm e d i a h o w e v e r , t h e yh a v es e v e r a lo u t - s tan d i n g a d v a n t a g e so v e rt h ec h e m i c a ls u r f a c t a n t s ，s u c ha sl o w e rt o x i c i t y ；h i g h e r b i o d e g r a d a b i l i t y ；b e t t e re n v i r o n m e n t a lc o m p a t i b i l i t y s ob i o s u r f a c t a n t sw i l lh a v ea w i d e r a n g eo fa p p l i c a t i o n sf o rv a r i o u si n d u s t r i e ss u c ha se n h a n c e d o i lr e c o v e r y , r e m e d i a t i o no fo r g a n i c sa n dm e t a l s ，f o o da d d i t i v e s ，c o s m e t i ca d d i t i v e s ，a n dm e d i c i n e a n di nb i o l o g i c a lc o n t r 0 1 i nt h i sp a p e rt h es t r a i n sa r ei d e n t i f i e da n dt h ec h a r a c t e ro ft h es t r a i n sa r es t u d i e d b y t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t so ft h e m o r p h o l o g i c a ls t r u c t u r e ，p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c sa n db yt h ec o m p a r i s o no fi t sw h o l es e q u e n c eo f1 6 sr d n aw i lt h et y p e s t r a i n si ng e n e b a n k ，i tw a ss h o w e dt h a t1 6 sr d n ao ft h es t a i nh d ya n dt h a to f b a c i l l u ss u b t i l i sw a sm o r et h a n9 8p e r c e n to fh o m o g e n o u s 。t h e r e f o r eb a c t e r i u m s t r a i ns d 5 9w a si d e n f i f i e da sb a c i l l u ss u b t i l i s t h e nt h eh i g hy i e l d sl i p o p e p t i d e - p r o d u c i n gm u t a n ts t r a i nw a so b t a i n e df r o m h d y b ys e r i e so fm u t a g e n e f i ct r e a t m e n t ，a s 吣d e s a n du v & d e s t h ep r o d u c t i o no f l i p o p e p t i d ew a s4 3 0 m g l w h i c hw a s1 2 7 t i m e sm o r et h e nt h ei n i t i a ls t r a i nh d y o nt h ef e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o nc o n d i t i o n so fs t r a i nu d 3 2 8 ，t h ef i s t p bd e s i g n w a su s e dt od e t e r m i n e da ss o d i u mn i t r a t e ，g l u c o s ea n d n a c lw e r et h em a i na f f e c t i n g o nl i p o p e p t i d ep r o d u c t i o n t h e nt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nm e d i u mw a sd e t e r m i n e d a c c o r d i n gt ob br e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s 谢t l ld e s o f t w a r e a f t e ra b o v e e x p e r i m e n t s ， t h eo p t i m i z e dc o m p o s i t i o no f m e d i u m ( g l ) w a so b t a i n e d ：s o d i u mn i t r a t e2 1 9 ， g l u c o s e 31 8 ，p h o s p h o r u ss o u r c e12 ，y e a s t l 2 ，c a c l 2 1 0 ，m g s 0 40 1 , f e s 0 41 4 , n a c l 3 3 4 i nt h i sm e d i u m ，l i p o p e p t i d ep r o d u c t i o nw a s10 4 6 12 9 l k e y w o r d s ：b i o s u r f a c t a n t ；l i p o p e p t i d e ；i d e n t i f i c a t i o no f b a c t e r i a ；f e r m e n t a t i o n 1 1 - 黑龙江大学硕士学位论文 i i i i i i i i i i i i i i i 一 i i i i i i i i i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉适太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名：j 步南纸 签字日期：z 汐矽 年月de 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕉塑太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕉堑太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者签名：瓣 导师签名： 签字日期：2 0 d 罗年 f 月f2 日签字日期：2 口护夕年石月e t 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第1 章绪论 第1 章绪论 表面活性剂( s u r 五a c t a n t ) 是指能使表面张力下降的物质，其具有固定的亲水 和亲油基团，在溶液的表面能定向排列。无论何种表面活性剂，其分子结构均由 两部分构成。分子的一端为非极性亲油的疏水基，有时也称为亲油基；分子的另 一端为极性亲水的亲水基，有时也称为疏油基或形象地称为亲水头。两类结构与 性能截然相反的分子碎片或基团分处于同一分子的两端并以化学键相连接，形成 了一种不对称的、极性的结构，因而赋予了该类特殊分子既亲水、又亲油，而又 不是整体亲水或亲油的特性。表面活性剂的这种特有结构通常称之为“双亲结构 ( a m p h i p h i l i cs t r u c t u r e ) ，表面活性剂分子因而也常被称作“双亲分子”。 表面活性剂具有湿润、分散、乳化、发泡、洗涤等作用，因为它在各个工业领域中 具有非常特殊的重要地位，因此素有工业味精的美称口1 。目前全球表面活性 剂年产量已超过3 0 万吨，总产值约4 0 亿美元。几乎所有的表面活性剂都是以石 油为原料化学合成而来，化学合成的表面活性剂在生产和使用过程中常常会带来 严重的环境污染问题h 1 。因此生物表面活性剂的开发与应用无疑是未来表面活性 剂的发展趋势。 生物表面活性剂( b i o s u r f a c t a n t ) 是微生物在一定条件下培养时，其代谢过程 中分泌产生的一些具有一定表面活性、亲水基和疏水基结构集于同一分子内的两 亲化合物口1 。生物表面活性剂与化学合成表面活性剂性能基本相似，同样具有降 低表面张力、稳定乳化液和发泡等功能。但相比之下，具有许多优势：可生物 降解，不会造成再污染：无毒或低毒：一般不会致敏、可消化，因此可用于化 妆品、食品和功能食品的添加剂：可以利用工业废物生产，可用于生物环境治理： 具有更好的环境相容性，更高的起泡性，在极端温度、p h 、盐浓度下的更好选 择性和专一性：结构多样，有可能适用于特殊领域陆1 。生物表面活性剂的这些特 性特别适合应用于石油工业和环境工程，如石油的生物降粘、提高原油采收率、 重油污染土壤的生物修复等1 。另外，生物表面活性剂作为天然添加剂，在食品 黑龙江大学硕士学位论文 工业、精细化工、医药和农业等方面也受到人们的青睐。随着人们崇尚自然和环 保意识的增强，生物表面活性剂必然会取代化学合成表面活性剂，因此未来生物 表面活性剂将有更加广阔的应用前景n 1 。 1 1 生物表面活性剂的种类和及其微生物来源 生物表面活性剂多数由细菌、酵母菌、真菌( 霉菌) 等产生。生物表面活性剂 可以根据来源、生产方法、化学结构和用途分类。广义生物表面活性剂可按用途 细分为生物表面活性剂和生物乳化剂；前者是一些低分子量的小分子，能显著改 变表面张力；后者是一些生物大分子，虽然不能显著降低表面张力，但对油一水界 面表现出很强亲和力，因而可使乳状液得以稳定口1 。按来源分，生物表面活性剂 的获得可分成整胞生物转换法( 也称发酵法) 和酶促反应法。按亲水基的不同生物 表面活性剂可分为五类：糖脂类，如鼠李糖脂、槐糖脂；酰基缩氨酸系，如 脂肽、脂蛋白；磷脂系，如磷脂酰乙醇胺；脂肪酸系，如甘油脂、脂肪酸； 结合多糖、蛋白质及脂的聚合物，如脂多糖复合物僵1 。表卜1 列出了一些常见 的生物表面活性剂的种类及其微生物来源。 1 1 1 糖脂类表面活性剂 糖脂类表面活性剂数量最大，品种最多是生物表面活性剂中最重要的一类，。 其主要结构由糖基连结长链脂肪酸或羟基脂肪酸。根据糖脂生物表面活性剂的化 学结构不同，糖脂可分为糖酯、糖醇酯和糖苷。1 9 4 9 年j a r v i s 和j o h n s o n 首次报 道了铜绿假单孢菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 产生含有鼠李糖的糖脂嘲。以后陆 续在某些放线菌、酵母菌等微生物中发现能产生糖脂类生物表面活性剂的菌株。 目前最有效的糖脂类生物表面活性剂主要有分枝杆菌属( e y c o b a c t e r y u m ) 及相关 细菌产生的海藻糖脂、假单孢菌属的变种( p s e u d o m o n a s s p ) 产生的鼠李糖脂、酵 母菌( y e a s t s ) 产生的槐糖脂和假丝酵母( c a n d i 捌产生的甘露糖赤藓糖醇脂阳幻。 表i - i 为产生糖脂类生物表面活性剂的主要微生物菌株。 第1 章绪论 i i i i i i i i ii i i 宣i i i i i ii i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 表1 1生物表面活性剂的种类及其微生物来源【1 o 1 t a b l el 11 1 1 et y p e so f b i o s u r f a c t a n t sa n di t sm i c r o o r g a n i s m so r i g i n -：i i ：；i ：；二- 二：二：= ：二：= ：；二- 二二二；二_ 二二誓二一一 生物表面活性荆 微生物来源举例 糖艚 鼠李糖脂 海藻糖脑 槐搭脂 纤维= 耱庸 庸肽 s u r f a c f i n 粘液曹秉 桔苹蔼素 短轩翟歇 多轱菌素 膳舫酸、磷滕 多聚表面活性剂 锕绿假单胞藿( 创出坍伽a e r u g l n o s a ) 红串红球菌( x h o d o c o c c 订e 叫 ，叩o “f ) 灰暗诺卡氏菌( n o c o r d 趾州栅粕哪l ，扛) 球拟酵母( t o n d o p , 噼b o m b w o l a ) 茂物假丝酵毋( c a n d i d ab i g a r i c n s i s ) 玉米黑耢麓( u s t i l a g oz e a e ) 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 枯草芽孢轩菌( & _ ，u b t i l t s ) 荧光假单胞菌c p f l l t o t w $ c e 耵) 枯草芽孢杆菌( 度矗w b t t l i s ) 短芽孢杆蓖( b b r e v l s ) 多轱芽孢抒菌( 占p 岣删) 红宰红球蔼( r h o d o c o c c u s # 聊船印“i s ) 氧化硫硫抒笛c t h i o b a e i i l n st h i o o x t d a n s ) 热带假丝酵母c c a n d j d aw o p i e a l l s ) 乙酸不动杆蔼( a c t n 2 t o b a c t e r f c o a c e a u s ) 在糖脂类生物表面活性剂中，最为常见的糖脂为是鼠李糖脂、蔗糖酯、甘露糖 赤藓糖醇脂、海藻糖脂和槐糖脂h 1 。图1 是几种常见糖脂类生物表面活性剂的化 学结构。 0 h o 0 h 7 k # d 。9 。h o - (叠0 。乏。 c h j c h 3 挣露铸办藓糖肆脂 m r l ) 图1 1几种常见糖脂类生物表面活性剂的化学结构 脂肽类生物表面活性剂一般来为革兰氏阳性的芽孢杆菌。脂肽可以从多种细 菌和酵母菌中分离得到。1 9 6 8 年，a r i m a 等首次发现枯草杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) i f 0 3 0 3 9 s 产生的表面活性剂而且是迄今为止报道的最好的脂肽类表面活性剂n 铂。 此外膨胀土壤杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) i f o3 0 5 8 产生的含赖氨酸的脂 肽类表面活性剂n 3 1 和褪色沙雷氏菌( s e r r a t j a m a r c e s c e n s ) n s3 8 产生的一种含氨 基酸的生物表面活性剂都有很好的表面活性。 脂肽表面活性剂具有一些独特的功能，如：能溶解血红细胞，抑制凝血纤维 蛋白凝块；能溶解某些细菌的球形体、原生质体和具有抗生素作用等n 4 1 。但其产 量远不如糖脂类，迄今为止，一般的菌株产量均小于1 o g l ，少的甚至在0 1 9 l 第1 章绪论 以下。个别较高产量的菌株，在批次和循环液体发酵中也只能分别达到3 5 9 l 和1 9 9 l n 5 1 。图2 是几种常见脂肽分子的结构图。 c o _ + l 西u l l e u _ d 1 e u ii c h 2 l l v a l c h b 一( c h 2 ) n - c h 2 - c h i1 0 卜l l e u 卜d l e u l a s p ( a ) n = 8 ，9 0 r 1 0 c o - * l a s n - * d 。i y r _ d a s n i l c h 2 i l g i n c h 3 - ( c h 2 ) a - c h 2 - c h il n h + - l s e r * - - d a s n + - l p r o ( b ) n - - 9 t o1 2 图1 - 2 几种常见脂肽分子的结构图 ( a ) 为灌胃表面活性素的基本结构( b ) 为伊枯草菌素的基本结构 1 1 3 磷脂系和脂肪酸系表面活性剂 磷脂系生物表面活性剂主要来源是从大豆和蛋黄中提取的磷脂类表面活性 剂，它们是一种良好的天然表面活性剂。磷脂类表面活性剂是制备脂质体的主要 原料，特别是近年来，由于脂质体在靶向给药中的应用越来越多，这类生物表面 活性剂及其衍生物的研究和应用将会成为重点，有广泛的应用前景旧1 。通过微生 物培养可制得脂肪酸系生物表面活性剂，例如：覆盖霉菌酸、青霉孢子酸的钠盐 及烷基胺盐。 黑龙江大学硕士学位论文 1 2 生物表面活性剂的提取和定性定量 有多种方法可以用来提取、纯化生物表面活性剂，采用什么方法必须视待分离 的表面活性剂的性质( 水溶剂还是非水溶剂阴离子或非离子，胞外结合或胞壁产物) 而定n 钔。生物表面活性剂的分离提纯主要有以下一些方法： 1 2 1 萃取 萃取是提取生物表面活性剂的经典方法之一，特别是对于亲油性的生物表面 活性剂。萃取方法简便，萃取剂可以重复利用，因而这种方法得到了广泛的应用。 常用的萃取剂有氯仿，乙酸，乙酸乙酯，甲醇等。一般为了调整到目标萃取物所需的 极性，采用的是两种不同极性的萃取剂按照一定得比例混合联用n 7 1 ，常见的是氯仿 和甲烷混合例如j u a n c m a t a _ s a n d o v a l 等在对铜绿假单胞菌产生的鼠李糖脂 ( r h a , 盟n o l i p i d ) 生物表面活性剂的提取采用了氯仿一甲醇( 2 ：1 ) 的萃取液，取得了 很好的效果n 踟。虽然，氯仿甲烷萃取液提取率较高，但是应用于工业大批量生产表 面活性剂时一是不够经济，二是氯仿有高毒性。因此，m a r i a s k u y u k i n a 等对生 物表面活性剂的萃取液进行了研究，他们用甲基一叔丁基醚( m t b e ) 萃取r h o d o c - o c c u s 产生的生物表面活性剂，通过和其它常用的溶剂相比较，认为用甲基一叔丁 基醚( 沁b e ) 做萃取剂可以取得较高的产品产率( 1 0 m g l ) ，高效率( 临界胶束浓度为 1 3 0 1 7 0 m g l ) ，同时产品具有良好的表面活性( 表面张力和界面张力分别为2 9 和 0 9 心t m ) 1 9 o 甲基叔丁基醚( m t b e ) 具有低毒、可生物降解、易回收、不易燃及不 易爆炸等优良特性，因此，对于大规模的生物表面活性剂生产也是良好的萃取剂。 1 2 2 超滤 超滤是用于从发酵液中提取生物表面活性剂的一种新方法，它是在压力的作 用下让不易过滤的样品通过膜来达到提取的目的啪1 。超滤法最主要的优点是发酵 产物的损失很少。像脂蛋白、糖脂等高分子生物表面活性物质为了防止其变形失 活，可以将其溶液经半透膜过滤来进行浓缩。但超滤也具有其局限性，如不溶性溶 质分子s 能在膜表面积聚，形成致密的“溶质层”从而影响膜分离的操作。这种 6 第1 章绪论 现象叫浓度极化。解决办法是在膜表面处充分搅拌混合可减轻极化作用。 1 2 3 结晶与沉淀 结晶与沉淀是常用的提取表面活性剂的方法之一，它是利用溶液中不同溶质 的不同的溶解度，从而使某些溶质结晶分离出来。沉淀后可用离心分离或过滤。 有必要的话，可以再重复结晶沉淀来提高样品的纯度嘲。如，有的糖脂可用盐酸或 硫酸将上清液酸化至p h 值为2 o 一3 o ，然后离心分离得到。类蛋白化合物，如 e m u l s m 或由t o r u l o p s i sp e t r o p h y l u m 生产的蛋白质乳化剂均可以由在上清液中 加入( n h 。) 2 s 0 4 沉淀得到啦羽。另外，由枯草芽孢杆菌产生的表面活性剂，可通过将其 上清液的p h 值调到2 后，在4 c 中形成沉淀物。 1 2 4 泡沫层析法 微生物在发酵培养过程中，都会产生泡沫，泡沫会使产物、营养成分及细胞 流失，在发酵培养产表面活性剂的微生物过程中该现象更为显著。在泡沫中含 有表面活性剂，d a d a v i s 等实验证明泡沫分离法是提取表面活性剂的有效方法， 而且有利于连续生产枷。 1 2 5 薄层色谱法 薄层色谱法( t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，t l c ) ，是将适宜的固定相涂布于 玻璃板、塑料或铝基片上，形成一个均匀薄层，待活化、点样、展开、烘干后， 与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或 成分含量测定的方法。t l c 分析法可以得出生物表面活性剂的定性和定量的信息， 但通常需要花费大量的时间进行预纯化，如沉淀和有机萃取乜。 1 2 6 高效液相色谱( h p l o ) 高效液相色谱法( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 又称 高压或高速液相色谱、高分离度液相色谱或近代柱色谱，以液体为流动相，采用高 压输液系统，是色谱法的一个重要分支。 黑龙江大学硕士学位论文 混合物样品随着流动相，在正向或者反向色谱柱中的固定相中分配和吸附的 能力大小不同，而使它们洗脱时间不同，就把每一个组分分离开了，洗脱时通过 特定的检测器可以定性定量检测。其突出的优点是分析速度快，柱效高，检测灵敏 度高，使定量分析方法的准确度大大提高汹3 。 h p l c 适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较 大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体 代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂等物质的分析。 1 3 采油菌株的菌种鉴定 1 3 1r e p - p c r 指纹法 v e r s a l o v i c 于1 9 9 6 年描述了一种细菌基因组指纹分析方法，即细菌基因组 重复序列p c r 技术( r e p p c r ) 。该技术扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列， 通过电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异。r e p - p c r 分辨效果好，可重复性 强。因此发展迅速并被广泛应用于多种细菌的基因的分类。b a c i l l u sc e r e u s 类 群中6 个菌种之间的遗传关系仍然存在争议，c h e r i fa 等通过对该类群6 个菌种 1 1 2 株细菌进行r e p - p c r 分析，获得9 7 种不同的电泳条带，从而清晰地推断了这6 个种之间的遗传关系嘲。 1 3 2p c r - r f l p 分析法 c a p s 技术又称为p c r - r f l p 。是用特异设计的p c r 引物扩增目标材料时，由于 特定位点的碱基突变、插入或缺失数很少，以至无多态出现，往往需要对相应p c r 扩增片段进行酶切处理，以检测其多态性。p c r - r f l p 分析只有在序列中少数影响 酶切位点的碱基发生改变时才产生不同的图谱，因而分辨能力较低。v a n - d a n m ep 等认为p c r r f l p 分析可用于种到属水平的研究1 。p c r - r f l p 方法分辨能力虽然 低一些，但在不经过微生物分离培养的原位微生物多样性的研究中仍具有重要的 作用。 第1 章绪论 1 3 316 sr d n a 序列分析法 1 6 s r d n a 是编码原核生物核糖体小亚基r r n a ( 1 6 s r r n a ) 的基因。与2 3 s r d n a 等看家基因比较，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石之 称旧1 。w o e s e 等与o l s e n 等基于对1 6 s r d n a 的分析构建了现已被公认的全生命系 统进化树，越来越多的细菌依据1 6 s r d n a 被正确分类或重分类呦1 。结合完善的数 据库，1 6 sr d n a 序列分析可以快速、准确地对微生物进行分类鉴定，确定微生物在 进化中的位置，它已成为微生物分类学中最重要的方法。尽管鉴定同源性很高的菌 种时，需要其它方法作为补充，但1 6 sr d n a 序列分析在微生物分类学中的地位仍是 无法代替的嘲1 。 1 4 采油菌株的诱变育种 由于一般的产表面活性剂产生菌尤其是脂肽类产生菌的产量较低，要达到降 低生产成本和增加产量的目的，对产生表面活性剂的菌株进行诱变选育是常规的 方法之一。诱变育种是指用物理、化学因素诱导微生物的遗传特性发生变异，再 从变异群体中选择符合人们某种要求的菌株，进而培育成新的品种或种质的育种 方法。常规诱变通常采用紫外线、微波，诱变剂用亚硝基胍和硫酸二乙酯等。除 常规方法外，随着对生物表面活剂合成机理的认识和合成酶基因的定位、克隆和 表达，人们亦开始采用基因工程的手段，构建基因工程菌株用于表面活性剂的生 产。s u n c h y rl i n 等在这方面进行了有益的尝试，经过诱变选育和筛选，获得了 一株高产突变菌株，其脂肽产量是出发菌株显l i c h e n i f o r m i s j f - 2 产生的生物表 面活性剂的1 2 倍嘲。 1 4 1 物理诱变 1 4 1 1 紫外线 紫外线照射是诱发微生物突变的一种非常有用的方法。马晓燕等以紫外诱变 原生质选育法筛选高产酒精菌株马克斯克鲁维酵母菌株z r 一2 0 ，比诱变前的酒 精产率提高1 0 5 ，较出发菌株提高了6 8 汹1 。宋绍富等对高效驱油菌进行紫外诱 o 黑龙江大学硕士学位论文 变，培育出代谢性能较好的菌株，发酵液的界面张力可由6 4 9 m n m 降低到 5 8 6 n m ，降低了9 7 。同时，由于诱变的影响，菌液达到最大菌体浓度的时间 也缩短了，表明有效诱变后的菌株生长繁殖速度也得到一定程度的提高口u 。r a z a 等对野生菌p s e u d o 忉o n a s p u t f d a3 3 进行射线诱变，得到突变株只p u t j d a3 0 0 一b ， 使用不同的疏水性碳源( 烃类、植物油提炼厂废物等) 对该突变株进行产鼠李糖脂 发酵培养，得到最大生物量3 5g l 、最大鼠李糖脂产量为4 1 9 l 嘲。 紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到，用出现正突 变的几率较高。 1 4 1 2 电离辐射 电离辐射是一切能引起物质电离的辐射总称，其种类很多，高速带电粒子有 a 粒子、b 粒子、质子，不带电粒子有中子以及x 射线、y 射线。y 一射线是电 离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用，可直 接或间接地改变d n a 结构。电离辐射的直接作用是当辐射线通过微生物时，能使 微生物内部成分分解而引起诱变或死亡。其间接作用是使水分子离解成为游离基， 游离基与液体中的溶解氧作用产生强氧化基团，此基团使微生物酶蛋白的- s h 基 氧化，酶失去活性，因而使其诱变或死亡。该技术能以较小的生理损伤得到较高 的突变率、较广的突变谱，因此将有很好的发展前景。 张伟等将酒精酵母制备成原生质体，经c o 印诱变后，采用四级筛选，得到高产 酒精酵母菌株c o - 1 5 8 ，其遗传性状稳定，成熟醪酒精体积分数比出发菌株提高 1 6 3 4 ，比a d y 提高了2 4 4 8 ，残还原糖含量亦远远低于出发菌株和h i ) y m l 。 1 4 1 3 离子注入 离子注入是2 0 世纪8 0 年代初兴起的一项高新技术，主要用于金属材料表面的 改性。1 9 8 6 年以来逐渐用于农作物育种，近年来在微生物育种中也逐渐引入该技 术汹1 。离子注入诱变育种的主要优点概括起来有以下几点：1 ) 变异率高，一般比 自然变异率高1 0 0 0 倍以上；2 ) 变异谱宽，即变异的类型多，能够产生自然界里 从未见过的新类型；3 ) 变异快，可以大大缩短育种周期；4 ) 离子注入诱变育种 技术稳定可靠，简便易行。 第1 章绪论 我国1 9 9 4 年报道了离子注入链霉菌的诱变效应，获得2 6 7 3 的正突变 率，1 9 9 5 年又有报道指出，采用n + ，c 4 + 注入核糖霉素产生菌、卡那霉素产生菌时， 其中以卜r 诱变效果最显著啪1 。离子注入诱变方法虽然是一种高效的诱变方法，但 是人们在实践的过程中发现该方法的得到的诱变株回复突变率高，因此还需用其 他诱变方法巩固诱变效果，以保证菌种遗传性状的稳定。订。 1 4 1 4 激光 激光在微生物诱变育种方面的研究与开发应用比较晚。激光诱变育种技术研 究始于2 0 世纪6 0 年代，经过世界各国4 0 多年的开发应用研究，证明激光和普通光 在本质上都是电磁波，它们发光的微观机制都与组成发光物质的原子、分子能量状 态和变化密切相关。激光辐射可以通过产生光、热、压力和电磁场效应的综合作 用，引起细胞d n a 或r n a 、质粒、染色体产生畸变效应、酶的激活或钝化、细胞 分裂和细胞代谢活动的改变m 1 。 胡卫红等采用c 0 2 激光照射酿酒酵母a s 2 11 8 9 ，筛选到了乙醇产量有较大提 高的变异株啪1 。鲍淑兰以啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v e s e a ) 为出发菌株，用h e n e 激光进行照射，发现随着照射时间的延长，致死率和突变率均明显增加，同时在 选择培养基上筛选出多种氨基酸突变型。 激光作为一种诱变育种方法，具有操作简单、使用安全等优点，近年来应用于 微生物育种中取得不少进展。 1 4 1 5 微波 微波辐射对生物体具有热效应和非热效应。在这两种效应的综合作用下，生 物体会产生一系列突变效应。因而，微波被用于多个领域的诱变育种，如农作物 育种、禽兽育种和工业微生物育种，并取得了一定成果。这方面的工作贾红华等h 阳 和雷肇祖等叭1 有所报道，。 1 4 2 化学诱变 化学诱变是利用化学物质对微生物进行诱变，引起基因突变或真核生物染色 体的畸变称为化学诱变。能够产生化学诱变的物质很多，但只有少数几种效果明 黑龙江大学硕士学位论文 显，如烷化剂、吖啶类化合物等。 1 4 2 1 烷化剂 这类试剂的共同特点是携带一至多个活跃的烷基，通过“烷化作用”的方式 将d n a 或r n a 分子结构中的h 原子置换，从而导致“复制”或“转录 过程中“遗 传密码”的改变，进而发生变异汹1 。常用的烷化剂有甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、 乙烯亚胺、硫酸二乙酯等。 甲基磺酸乙酯( e m s ) 是最常用的诱变剂，诱变率很高。常用浓度 o 0 5 0 5 m o l l ，作用时间5 - 6 0 m i n 。该物质具有强烈致癌性和挥发性，可用5 硫代硫酸钠作为终止剂和解毒剂n 1 。硫酸二乙酯也很常用，但毒性较大。1 9 6 7 年 n i l a n 用硫酸- - l 酯处理大麦种子，育成了矮秆、高产品种l u t h e r “羽。亚硝基胍 n t g 是一种超强的诱变剂。在碱性条件下，n t g 会形成重氮甲烷( c h 2 n ：) ，它是引起 致死和突变的主要原因。它的效应很可能是c h 2 n 。对d n a 的烷化作用引起的1 。 1 4 2 2 碱基类似物 有些化合物，由于它的结构类似于碱基，可使d n a 复制中发生配对错误。常 见的碱基类似物主要有5 一氟尿嘧啶( 5 一f u ) ，5 一溴尿嘧啶( 5 一b u ) ，6 一氯嘌呤等。 程世清等用5 一b u 对产色素菌( 分枝杆菌t 17 - 2 - 3 9 ) 细胞进行诱变，生物量平均 提高2 2 5 m 1 。 1 4 2 3 吖啶类化合物 这一类化学诱变剂能使d n a 分子上增加或减少一或二个碱基，引起碱基突变 点以下全部遗传密码的“阅读 顺序发生改变，从而发生转录和翻译上的错误， 导致突变。 吖啶类诱发突变的一个重要特征是：吖啶类化合物所诱发的突变型能用吖啶 类来使之回复，但不能使碱基类似物回复，这是因为吖啶类引起移码突变是通过 增加( + ) 或减少( 一) 一个或几个碱基对，所以由增加一个碱基对造成的突变型， 可由邻近一个碱基对的缺失而使遗传密码又回复原来的读序，出现回复突变。这 自然不能由碱基对替换完成陆引。 第1 章绪论 i i i i i i i i i 一ii i i i i i i i i i i ii i i i i i i ii i i i _ i i 宣i i i i l l i i i ii i i i i i i i i i i i i i i i i 1 4 3 复合诱变 复合诱变指两种或多种诱变剂的先后使用，同一种诱变剂的重复作用和两种 或多种诱变剂的同时使用。复合诱变具有协同效应。如果两种或两种以上诱变剂 合理搭配使用比单一诱变效果好“铂。复合处理方法有三类：一类是两种或多种诱 变剂的先后使用；第二类是同一种诱变剂的重复使用；第三类是两种或多种诱变 剂的同时使用见表卜2 0 表1 - 2 诱变因子的复合处理及其协同效应 1 5 产表面活性剂菌种的发酵优化 利用微生物发酵生产有用物质时，培养基成分复杂、可变因子多，因而，微生物 培养基成分的优化工作显得尤为重要“旬。发酵环境条件的优化是发酵过程中最基 本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、p h 值、溶氧、转速、碳源， 氮源，金属离子、微量元素浓度等的优化控制，依据不同的发酵产物其相应的最 黑龙江大学硕士学位论文 i i_ 适环境条件而有所不同。传统的优化方法包括单次单因子法和正交试验设计法。 但传统方法前者存在不能考察因素交互作用而后者虽然考虑到了因素的交互作用 但当因素较多时试验次数太多导致费时费力而且无法找到整个区域上的所有因素 的最佳组合和预测发酵产量最大值等不足m 1 。对于多因素影响的分析，有多种优化 方法，例如p l a c k e t t - b u r m a n ( p b ) 设计法和响应面分析法，它们都成功地运用于 微生物发酵条件的优化工作中。 1 6 生物表面活性剂的应用 1 6 1 石油工业 人们对生物表面活性剂的兴趣最早源于石油工业，而且也是目前最主要的应 用领域。生物表面活性剂可以降低原油与水两相的界面的张力，从而可提高油田 的产量m 1 。利用将某些产生物表面活性剂的微生物菌株投入到油层中，来提高采 油率的方法叫做微生物强化采油技术( m i c r o b i a le n h a n c e do i lr e c o v e r y ，m e o r ) 。 与化学合成表面活性剂比，生物表面活性剂可被微生物降解，不会对环境造成污 染。据报道，紫红诺卡氏菌( n o c a r d j ar h o d o c h r o u s 产生的海藻糖脂，用于地下砂 石中层石油的回收，出油率提高了3 0 h 7 1 。 1 6 2 在环境工程方面的应用 通过提高产生物表面活性剂菌的数目，使烷烃类降解速度加快来修复被烃类 和原油污染的土壤是一项新技术，但这种技术的效果仍存在争议。然而，可以通过 提高土壤中微生物的数量，继而提高烷烃的降解速度，而且降解速度的提高远远高 于单独加入某种营养成分所提高的速度 4 8 o 在污染的砂土和泥浆中，加入铜绿假单 孢菌产生的鼠李糖脂可使烃类的回收率大大提高，用铜绿假单孢菌产生的生物表 面活性剂处理砂土，可分别使脂肪族烃类和芳香族烃类的回收率达5 6 和7 3 嘲。 生物表面活性剂同样也可以用于修复重金属、菲、多氯联苯污染的土壤。 第1 章绪论 1 6 3 在食品工业上的应用 生物表面活性剂已成为一种广泛应用的食品添加剂、乳化剂、风味剂等，符 合功能性食品和绿色食品添加剂的要求。据报道蔗糖酯加入食品中可以改善食品 的加工性能，提高食品抗氧化防霉作用和香味质量，蔗糖酯对柑桔、苹果、梨等水 果的保鲜已取得良好效果嘞1 。产朊假丝酵母( c a n d i d au t i l i s ) 合成的生物乳化剂 可用作色拉调味剂曙。鼠李糖可用于生产香料，也可作为食品添加剂添加入高档咖 啡、饮料、面包、肉制品中阳射。 1 6 4 在医疗工业上的应用 生物表面活性剂具有抗生素作用和良好的抗细菌、霉菌和病毒的性能瞄引，可 抑制疱疹病毒和流行性感冒病毒。据报道，红串红球菌( r h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i s ) 合成的琥珀酰海藻糖脂能够抑制单纯疱疹病毒和流感病毒 5 4 o 假丝 酵母可产生两种甘露糖赤藓糖脂( m a n n o 叫e r t h r it o l i p i d , m e l ) m e la 和m e lb ， 能有效抑制革兰氏阳性菌。i s o d a 等发现所有的糖脂( 除鼠李糖脂外) 都可以诱导 人体前髓细胞的白血病细胞h l 6 0 变异，还能诱导人体骨髓白血病细胞k 5 6 2 ，并将 嗜碱白血病细胞k u 8 1 2 变异为单核细胞、粒性白细胞核和巨核细胞嘲。 1 6 5 在造纸工业上的应用 生物表面活性剂可用作制浆造纸废水的絮凝剂。能产生絮凝剂的微生物有很 多种，有细菌、放线菌、真菌及藻类等。微生物絮凝剂的化学本质是微生物产生的 各种多糖类，c o r y m e b a c t a r i u mh y d r o - c a r b o n c a l a s t u s 产生的絮凝剂中含有聚多 糖和蛋白质，真菌p h o r i m i d i u m s p 产生的絮凝剂的主要成分是连接了脂肪酸和蛋 白质的磺酸异多糖，其多糖的基本骨架是氨基酸、甘露糖、鼠李糖、半乳糖等汹】。 黑龙江大学硕士学位论文 第2 章材料和方法 2 1 材料 2 1 1 菌株 出发菌株h d y ，由黑龙江大学生命科学学院提供 2 1 2 培养基 基础培养基( g l ) ：葡萄糖2 0 0 ，硫酸铵3 0 ，磷酸二氢钾1 0 0 ，磷酸氢二钠 4 0 ，硫酸镁o 3 ，氯化钠5 0 ，酵母粉1 0 ，p h 值自然，1 1 2 。c 灭菌3 0 m i n 。 l b 液体培养基：胰化蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，n a c l1 0 9 ，去离子水1 0 0 0 m l ， p h7 0 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 保存采油茵的斜面培养基： 牛肉膏3 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c l5 9 ，琼脂2 0 9 ， 蒸馏水1 0 0 0 m l ，用1 mn a o h 调p h 至7 0 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 2 1 3 主要仪器和设备 高速离心机：j 2 一m c 型( b e c k m a n ) 、3 k 3 0 型( s i g m a )