（微生物学专业论文）一株新的海洋细菌及其灵菌红素产生条件和生物活性的研究.pdf

袁保红中山大学硕士学位论文 一株新的海洋细菌及其灵菌红素产生条件和生物活性的研究 硕士研究生：袁保红 指导老师：周世宁教授 专业：微生物学 摘要 本文研究了一株新的产灵菌红素( p r o d i g i o s i n ，p g ) 的海洋细菌一一红色海杆 菌( r h o d o m a r i n o b a c t e rs p ) 的生物学特性及其次级代谢产物一些性质。描述了 该菌的形态特征、培养特征、生理生化特征，优化了该菌产生p g 的发酵培养基 和培养条件，并对其产生的p g 进行了分离纯化，最后对p g 的物化特性和抗菌 性及对几种癌细胞凋亡作用进行了一系列的研究。 结果表明，该红色海杆菌生长需要n a + ，光照对菌体的生长和p g 的产量有 影响。该菌生长的温度范围为2 0 c 3 8 c ，在2 0 。c 2 3 。c 时菌体可产生蓝色物质， 3 5 c 一3 8 c 时菌体为白色，产生灵菌红素最适生长温度为2 7 c 。该菌最适生长d h 为7 5 ，p g 在菌体生长的稳定期形成，接近衰亡期p g 产量最高。优化后的发酵 培养基为：o 2 淀粉，0 5 蛋白胨，0 5 葡萄糖，o 1 酵母抽提物。在此条件 下p g 的产量可达到1 6 4 3 ug m l 。在发酵过程中，添加p g 合成的前体物质 脯氨酸，既可加快p g 的合成，又能增加p g 的合成量。p g 随着p h 的变化颜色 也会随之变化。p h 3 0 左右时热稳定性高，部分金属离子对该色素影响也较小。 随着p g 浓度的提高，抗菌活性随之提高，不同细菌对p g 敏感性也不同。 对该菌株产生的次生代谢产物对肿瘤细胞生长的影响进行了研究。用m t t 法测得p g 对人胃腺癌细胞m c g 8 0 3 的i c 5 0 为0 6 2 ug m l ，对人肝癌细胞b e l 7 4 0 2 的i c s o 为0 4 5 u g m l 。5ug m 1 的p g 处理m c g 8 0 3 细胞2 4 h ，用h o e c h e s t 3 3 2 5 8 染色，观察到典型的凋亡核形态；通过单细胞凝胶电泳( 彗星电泳) ，观察到 m c g 8 0 3 凋亡细胞基因组的降解。用2 5 及5pg m l 的p g 处理m c g 8 0 3 细胞2 4 h ， 1 1 1 袁保红中山大学硕士学位论文 经流式细胞仪分析，凋亡细胞比率由未经化合物处理时的4 2 上升到1 4 5 和 2 0 6 。鉴于2 5 “g m l p g 处理m c g 8 0 3 仅2 4 h ，绝大部分细胞已溶胀破裂死亡， 故初步判断p g 对m c g 8 0 3 的细胞毒性作用，诱导凋亡不是其主要的方式。p g 的作用还能导致m c g 8 0 3 周期细胞比例的改变。从该菌株代谢物分离得到的蓝 色物质对m c g 8 0 3 的i c 5 0 为4 6 g m l ， g m l 的蓝色物质处理的m c g 8 0 3 细胞， 对b e l 7 4 0 2 的i c 5 0 为6 8 | lg m l 。1 0 u 2 4 h 后即可观察到典型的凋亡核形态及 基因组的降解。用5 ，1 0 ，2 0 ug m l 的蓝色物质处理m c g 8 0 3 细胞2 4 h ，其凋亡 细胞比例由未经处理的4 2 上升到1 0 1 ，6 3 4 ，7 0 7 。因此初步判断，诱 导肿瘤细胞亡( a p o p t o s i s ) 是其发挥细胞毒作用的主要方式。蓝色物质的作用还 能导致m c g 8 0 3 周期细胞比例的改变。 关键词：灵菌红素红色海杆菌海洋细菌细胞凋亡 袁保红中山大学硕士学位论文 p r o d u c t i o na n db i o a c t i v i t e so fp r o d i g i o s i nf r o m an o v e lm a r i n eb a c t e r i n m m a s t e rc a n d i d a t e ：y u a nb a o h o n g s u p e r v i s o r ：p r o f z h o us h i n i n g m a j o r ：m i c r o b i o l o g y a b s t r a c t t h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h ep r o d i g i o s i n g e n e r a t i n gm a r i n eb a c t e r i a ， r h o d o m a r i n o b a c t e rs p _ a n dt h ep r o d u c t i o na n dc h a r a c t e r i s t i c so fi t ss e c o n d a r y m e t a b o l i t e ，p r o d i g i o s i n ，w e r es t u d i e d ap r i m a r ys t u d yo n i t sm o r p h o r l o g i c a l ，c u l t u r e a n db i n c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sw a sa l s oc a r r i e do u t t h ef e r m e n t a t i o na n dc u l t u r e c o n d i t i o nw e r eo p t i m i z e df o rt h ep r o d u c t i o no fp r o d i g i o s i n n a + i sn e c e s s a r yf o rt h e g r o w t ht ot h es t r a i n l i g h tc o u l d i n f l u e n c ei t sg r o w t ha n dt h ep r o d i g i o s i np r o d u c t i o n t h eb a c t e r i ac o u l dg r o ww e l la tat e m p e r a t u r er a n g eo f2 0 t o3 8 c a b l u e s u b s t a n c ea p p e a r e dw h e ng r o w i n ga t2 0 c 2 3 ca n dn or e do rb l u ep i g m e n tp r e s e n t w h e nt h eb a c t e r i ag r e wa t3 5 ( 3 3 8 c t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ef o rt h ep r o d u c t i o no f p r o d i g i o s i nw a s 2 t ow i t hp ha t7 5 p r o d i g i o s i nc o u l db ed e t e c t e di nt h es t a t i o n a r y p h a s e a n dr e a c h e di t s h i g h e s tp r o d u c t i v i t y i nt h ed e c l i n e p h a s e t h eo p t i m i z e d m e d i u m ，i nw h i c ht h ep r o d u c t i v i t yo fp r o d i g i o s i nw a s1 6 4 3ug m l ，c o n s i s t e do fo 2 s t a r c h ，0 5 p e p t o n e ，0 5 g l u c o s ea n d0 1 y e a s te x t r a c t t h ea d d i t i o n o f p r o l i n e 。a p r e c u r o ro fp r o d i g i o s i n ，c o u l dn o to n l yb r i n gf o r w a r dt h es y n t h e s i sb u ti n c r e a s ei t s p r o d u c t i v i t y t h ec o l o r0 fp r o d i g i o s i n w a ss e n s i t i v et op ha n di tw a sm o s ts t a b l ea t p h 3 0 m o s to fm e t a li o n sh a d l i t t l ee f f e c to ni t t h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t yi n c r e a s e d a l o n g w i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fp g f gw a si s o l a t e da n d p u r i f i e db yu s i n gc h r o m a t o g r a p h ym e t h o d s i t sp h y s i c a la n d v 袁保红中山大学硕士学位论文 c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sw e r es t u d i e d t h ee f f e c to fp go nc a n c e rc e l l sw a sa l s o i n v e s t i g a t e d i nm t t t e s t t h ei c 5 0o fp go nm c g 8 0 3a n db e l 7 4 0 2w e r e0 6 2u g m l a n d0 4 5ug m 1 w h e nm c g 8 0 3w a st r e a t e dw i t h5ug m lp gf o r2 4h t h e m o r p h o l o g y o fa p o p t i s i sa p p e a r e dw h e ns t a i n e dw i t hh o e c h s t 3 3 2 5 8a n dt h e d e g e n e r a t i o no ft h eg e n o m e w a s p r e s e n t i ns i n g l ec e l le l e c t r o p h o r e s i s t h e a p o p t o s i s r a t i ow a s 2 0 6 c o m p a r e d w i t h4 2 i nt h eu n t r e a t e d c o u n t e r p a r t s c e l ll y s i s o c c u r r e di nm o s tm c g 8 0 3c e l l st r e a t e dw i t h2 5u g m lo f p gf o r2 4 h ，i n d i c a t i n g a p o p t o s i si n d u c e m e n tm a y n o tb et h ec h i e f w a y o fi t sc y t o t o x i c i t ya n dp gc o u l da l t e r t h e p r o p o r t i o no f c e l l si nd i f f e r e n tc y c l ep h a s e t h eb l u ee x t r a c ti s o l a t e df r o mt h e b a c t e r i ah a ds i m i l a r b i o a c t i v i t yo fa p o p t o s i si n d u c e m e n t k e yw o r d s ：p r o d i g i o s i n ，r h o d o m a r i n o b a c t e rs p ，m a r i n eb a c t e r i a ，a p o p t o s i s 袁保红中山大学硕士学位论文 英文缩写 a a a b t c p r g t i c l d m s o e c o l i e d t a f c m h i a p m b c n i l i l m t t o d p b s p g p g s p i r p m s c g e s d s t h s u p 缩略词 英文全称 a b s o r b a n c e a m i n oa c i d e b l u e t e t r a p y r r o l e c y c l o p r o d i g i o s i nh y d r o c h l o r i d e d i m e t h y ls u l f o x i d e e s c h e r i c h i ac o l i e t h y l e nd i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d f l o wc y t o m e t e r h o u r m e t h y l p e n t y l p y r r o l e m e t h o x y b i p y r r o l e c a r b o x a l d e h y d e m i n u t e 3 一( 4 ，5 一d i m e t h y l t h i a z o l 一2 一y 1 ) 2 5 一d i o h e y l te t r a z o l i u mb r o m i d e o p t i c a ld e n s i t y o h o s o h a t e b u f f e r e ds a l i n e p r o d i g o s i n p r o d i g i o s i n e s p r o p i d i u mi o d i d e r e v o l u t i o np e rm i n u t e s i n g l ec e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e n - t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e u n d e c y l p r o d i g i o s i n i i 中文全称 吸光度 氨基酸 蓝色四吡咯 盐酸灵菌红素 二甲基皿枫 大肠杆菌 乙二胺基四乙酸 流式细胞仪 小时 分钟 3 - ( 4 ，5 一二甲噻唑一2 - 酰基) ， 一2 , 5 二苯基四氮唑溴盐 光密度 磷酸盐缓冲液 灵菌红素 p g 及其结构类似物 碘化丙啶 每分钟转数 单细胞凝胶电泳 十二烷基硫酸钠 n 一三羟基甲氧基氨基甲烷 灵菌红素2 5 c 袁保虹中山大学硕士学住论文 第1 章前言 1 1 灵菌红素的发现 过去有很多的记载显示，在用于圣餐仪式上的面包、小甜饼和其他谷类食品 上有时候出现血色斑点，这种斑点被认为是不祥之兆，在某些宗教传说中造成一 种神秘的恐慌( g a u g h r a n ，1 9 6 9 ；y u ，1 9 7 9 ) 。在1 8 1 9 年有三个科学家几乎同时揭开了 这个迷信的神秘面纱。植物学家p i e t r om e l o 、药物学家b a r t o l o m e ob i z i o 和物理 学家v i n c e n z os e t t e 均意识到这类事件中出现的这些血样斑点是由于微生物发酵 引起的( b e n n e t t 声ta 1 ，2 0 0 0 ) 。他们在显微镜下观察到这种微生物的存在，并发 现这种微生物在潮湿温暖的环境下，很容易繁殖。后来的研究进一步证实，这些 血样斑点实际上是由于灵菌红素和它的类似物的形成造成的。沙雷氏菌属 ( s e r r a t i a ) 中一些特定的菌株( 如s m a r c e s c e n s , s p l y m u t h i c a , s r u b i d a e a ) ，在潮 湿和闷热的条件下，会在淀粉类食物的表面形成鲜艳的红色菌落，这些菌落的红 色是由于菌株在生长过程中产生了灵菌红素和它的结构类似物( g r i m o n ta n d g r i m o n t ，1 9 7 8 ) 在1 8 9 1 年，w j l l i a mb c o l e y 将链球菌( s t r e p t o c o c c u s s p ) 和神灵杆菌( b a c i l l u s p r o d i g i o s u s ) ( 现称沙雷氏菌s m a r c e s c e n s ) 的培养物混合在一起，经过加热和过 滤灭菌后，组合成一种疫苗，这种疫苗称为c o l e y 毒素( s t a r n e s ，1 9 9 2 ) 。这类毒 素被描述为肿瘤坏i 死n t ：( t n f ) 一种由脂多糖诱导的细胞分裂素，能造成肿 瘤细胞的死亡。这类毒素包含几种有效物质，其中一种就是灵菌红著 ( r o o k ，1 9 9 2 ) 。 灵菌红素于1 9 2 9 年首次从m a r c e s c e n s 中分离并纯化出来，早期研究是用 了p o r d i g i o s i n ( p g ) 这一名称，但是直到1 9 3 4 年其基本结构特征才被得以阐 明( w a s s e r m a n , e ta 1 ，1 9 6 0 ) 。随后，灵菌红素类似物( 或灵菌红素衍生物， p r o d i g i o s i n s e s ，p g s ) 的化学结构逐渐确定下来。p g 及其结构类似物作为典型的 次级代谢产物，它们都具有三个吡咯环骨架结构，其在微生物的产生中的生理作 用尚在研究中( w a s s e r m a n ，e ta 1 ，1 9 6 9 ) 。 袁像红中山大学硕士学位论文 后来，c a s t r o 将灵菌红素溶解在花生油中对受到疟原虫( m a m ap a r a s i t e ) p l a 跏d d i “mb e r g h e i 感染的小鼠皮下给药，结果显示在一定剂量的范围内，灵菌红 素能延长小鼠的生命( c a s t r o ，1 9 6 7 ) 。除了灵菌红素，大环结构的环壬基灵菌红素 ( c y c l o n o n y l p r o d i g i i l i n c ) 和甲基环癸基灵菌红素( m e t h y l c y c l o d e c y l p r o d i g i n i n e ) 电 具有此活性，而十一烷基灵菌红素( u n d e c y l p r o d i g i o s i n ，2 5 c 或u p ) 就不具备 ( g e r b e r , 1 9 7 5 ) 。二十世纪六七十年代，许多疟原虫对传统的治疗药物具有抗 性，p g s 的发现无疑激发起人们发现新药物的兴趣。 二十世纪六十年代，p g s 也曾被作为抗生素和细胞毒素进行了研究。由于灵 菌红素表现出较高的系统毒陛( s y s t e m i cm x m i t y l ，其应用并没有在临床发展开来 ( m a n d e r v i l l e ，e t a l ，2 0 0 1 ) 。但是，近几十年来研究发现，在一定的剂量范围内表 现出有效的免疫抑制活性，具有一定抗微生物、抗疟原虫和一定的细胞毒性等作 用( n a k a m u r a ，e t a 1 ，1 9 8 6 ，1 9 8 9 ；k a t a o k a ，e ta 1 ，1 9 9 5 ；h a n ，e ta 1 ，2 0 0 1 i s a k a e ta 1 ，2 0 0 2 l l a g o s t e r ae ta 1 2 0 0 3 ) 。许多学者研究了p g s 引起细胞凋亡的作用机制 与当前使用的药物有所不同，如抑制胞液酸化作用，对泡型h + - a t p a s e 解偶联 作用，抑制细胞周期蛋白等等( m a t s u y a ，e t a l ，2 0 0 0 ；m o n t a n e r ，e ta 1 ，2 0 0 2 ； p e r e z t o m a s ，e ta l ，2 0 0 3 ) ，揭示了p g s 及衍生物具有重要的研究价值。因 此，对灵菌红素及其衍生物的生物学活性的研究逐渐引起科学工作者的注意。 1 2 灵菌红素和它的结构类似物 灵菌红素是一组具有毗咯环结构的红色色素类天然产物。这些色素是由一些 微生物如链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) 、沙雷氏菌属( s e r r a t i a ) 、假单胞属( p s e u d o m o n a s ) 和其他海洋细菌产生的( g e r b e r ，1 9 7 5 ；h a r w o o d ，1 9 7 8 ) 。天然产生的灵菌红素类 物质均包含有一个共同的吡咯一双吡咯亚甲基的环状结构骨架( p y r r y l d i p y r r y l m e t h e n e s k e l e t o n ) ，按照c 吡咯环上的基团结构变化分为环状灵菌红素和非环状灵 菌红素( m a n d e r v i l l e ，2 0 0 1 ) ，见图1 1 和图1 2 。灵菌红素( p g ) 是非环状灵菌 红素，2 甲基一3 一戊基一吡咯作为它的c 环，分子式为c 2 0 h 2 5 0 n 3 ；其他的非环状 灵菌红素经常指十一烷基灵菌红素，即灵菌红素2 5 c ( g e r b e r , 1 9 7 5 ) 。环状灵菌红 素，如盐酸环状灵菌红素( c y c l o p r o d i g i s i nh y d r o e h l o r i d e ，c p r g h c l ) 、间环灵菌 红素( m e t a c y c l o p r o d i g i o s i n ) 、壬基灵菌红素( n o n y l p r o d i g i o s i n ) 、和环壬基灵菌 2 袁保红中山大学硕士学位论文 红素( c y c l o n o n y l p r o d i g i n i n e ) 等都是天然的灵菌红素类化合物( g e r b e r ，1 9 7 0 ) ， 见表1 1 及图1 2 。除了以上灵菌红素类化合物外，还有一些天然产物也具有4 甲 氧基一2 2 一双吡咯结构，但没有吡咯环c 结构，而在吡咯环a 上，有一外环状的 烯胺( e n a m i n e ) 结构，这种结构的物质倾向于水解( h y d r o l y s i s ) ，形成多种结 构类似灵菌红素的物质( p r o d i g i o s i n l i k ep i g m e n t ) ( b r a dc a r t e ，e ta 1 ，1 9 8 3 ) ，见 图1 3 。 图1 1 灵菌红素的化学结构 表1 1 灵菌红素和它的结构类似物 旦! ! ! ! ：! 一! 翌! 塑! ! 堕! 塑堂垡! ! 塑! ! 堕! 生! ! ! 型! ! 塑 简称 异名 i 灵菌红素( p r o d i g i o s i n ) 即2 一甲基一3 一戊基灵菌素( 2 m e t h y l 3 p e n t y lp r o d i g i n i n e ) 1 1 壬基灵菌红素( n o n y l p m d i g i o s i n ) 即壬基灵菌素( n o n y l p r o d i g i n i n e ) i i i 十一烷基灵菌红素( u n d e e y l p r o d i g i o s i n ) 即灵菌红素2 5 c 间环灵菌红素( m e t a e y c l o p r o d i g i o s i n ) v 环壬基灵菌红素( c y c l o n o n y l p m d i g i n i n e ) v i 甲基环癸基灵菌素( m e t h y l c y e l o d e e y l p r o d i g i n i n e ) v i i 丁基环庚基灵菌素( b u t y l e y c l o h e p t y l p r o d i g i n i n e 类灵菌红素( p r o d i g i o s i n 1 i k ep i g m e n t ) i x 盐酸环状灵菌红素( c y c l o p r o d i g i s i nh y d r o c h l o r i d e ) 即c p r g h c i 3 袁保红中山大学硕士学位论文 邺以 邺9 ” 翕 殳 p r o d i g i o s e n e c y c l o p r o d i g i o s i n 图1 2 部分天然灵菌红素类化合物的化学结构 f i g 1 - 2s t r u c t u r e so fs o m en a t u r a lp r o d i g i o s i n - g r o u pp r o d u c t s 4 爹一移鬯 k 咻 邸 袁保红中山大学硕士学位论文 “。量蠹，溉 o m e 瓣 “分 圈1 4 蓝色吡咯物和玫瑰酚的化学结构 f i g 1 - 4s t r u c t u r e so fb l u et e t r a p y r r o l ea n dr o s c o p h i l i n 还有一些具有四个吡咯环结构的物质，如蓝色吡咯物( b l u e t e t r a p y r r o l e ) 和 玫瑰酚( m s e o p h i l i n ) ( 见图1 4 ) ，( h a y a k a w a , e t a l ，1 9 9 2 ；m e l v i n ，e t a l ，1 9 9 9 ) 。 这种蓝色吡咯物较上述a , c , e 化合物对捕食者有更强的毒害性( b u r g e r , e t 口，1 9 8 5 ) 。 5 袁保红中山犬学硕士学位论文 h a y a k a w a 等人在1 9 9 2 年从s t r e p t o m y c e sg r i s e o v i r i d i s 中分离出这种玫瑰酚化合物， 发现它具有与甲基灵菌红素和曲线链丝菌素b ( s t r e p t o v a r i c i nb ) 相类似的分子结 构，该物质在体外试验中，对白血癌细胞( 1 e u k e m i a ) 和其他的癌细胞株显示出 很强的细胞毒性( h a y a k a w a ，e la 1 ，1 9 9 2 ) 。在1 9 9 6 - - 2 0 0 0 年间，d a l e s s i o 和他的 同事开始了p g 药物化学的研究。他们主要目的是合成新的p g 的衍生物，希望这些 衍生物具有较天然p g 较高的选择性( s d e c t i v i t yi n d e x ) 和药物毒性学( p h a l t n a c o - - t o x i c o l o g i c a lp r o f i l e s ) 等的一些特征。他们发现比较大的烷氧基( a l k o x y ) 逐步替换 甲氧基( m e t h o x y ) i 拘替代物明显的降低了它的细胞毒性而增强了它的选择性目前， 最有价值的合成产物：是p n u l 5 6 8 4 ( 4 一b e n z y l o x y 一5 - 【( 5 一u n d e c y l 一2 h - p y r r o l - 2 - y l i d e n e ) m e t h y l 】- 2 , 2 一b i - 1h - p y r r o l e ) ( d f a l e s s i o ，e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。这是一个新的 p g 的衍生物，见图1 5 。它的治疗指数( t h e r a p e u t i ci n d e x ) 是十一烷基灵菌红素的 三倍。其他的研究结果也表明，a 口比咯环无论在铜核酸酶的活性还是p g s 毒性的 能力起着重要的作用；与灵菌红素2 5 c 相比较p n u 一1 5 6 8 0 4 提高了免疫抑制活性 ( w a n g ，e ta 1 ，2 0 0 1 ，s t e p k o w s k i ，e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 p u n 一1 5 6 8 0 4 图1 5p u n 1 5 6 8 0 4 的化学结构 f i g 1 - 5s t r u c t u r eo f p u n 一1 5 6 8 0 4 近年来，海洋微生物研究技术取得重大的进展，依赖从海洋微生物发现了各 种各样化学和生物学上有意义的次级代谢产物逐渐成为研究热点( 林永成， 2 0 0 2 ) 。有理由相信，未来将会从海洋中发现更多结构新颖，生物活性奇特的灵 菌红素类物质( 李厚金，2 0 0 2 ) 。 衰保虹中山大学硕士学位论文 1 3 灵菌红素的生物学作用及其作用机制 1 3 1p g s 可能的生态学功能扩散生态学 b u r g e r 和b e r m e t t ( 1 9 8 5 ) 认为，灵菌红素作为一种湿润剂，有利于s m a r c e c e n s 菌株的生态学分散( b u r g e r , e t a l ，1 9 8 5 ) 。当从下往上将气泡吹过菌悬液时，会产 生一些小液滴，与所对应的大批菌悬液比较，在小液滴中含有很多产色素的菌体， 这表明产色素的细胞的疏水性比较高，认为这可能是由于小液滴的菌液中含有更 多灵菌红素的缘故。然而，s y z d e k ( 1 9 8 5 ) 认为，j 、液滴中产色素细胞的富集是一系 列复杂的过程，它受到培养条件的影响。临床应用的s m a r c e c e n s 菌株，即使没 有灵菌红素的条件下，也表现出疏水性；而且疏水性与温度有一定的关系，3 0 c 培养的菌株表现出一定的疏水性，在3 7 。c 培养的菌株没有疏水性( m a l l i c k 。1 9 9 6 ) 。 另外，一些非色素细胞的突变株，细胞表面包含一种m r = 4 0 ，0 0 0 的蛋白质，也具 有较高的表面疏水性。这表明s m a r c e c e n s 细胞表面的疏水性并不完全归因于细 胞表面灵菌红素的存在( m a t s u y a m a ，e ta 1 ，1 9 8 6 ) 。 还有研究表明，产色素细胞和不产色素细胞两者都能产生许多胞外囊泡 ( e x t r a c e l l u l a rv e s i c l e s ) ，它们在3 0 v 乒l 有润湿活性( w e t t i n ga c t i v i t y ) ，而在3 7 c 失 去活性。润湿活性可能对细胞在液滴表面的扩散起着重要作用，使细胞具有疏水 性( m a t s u y a m a ，e t a l ，1 9 8 6 ) 。所以，对灵菌红素的扩散生态学功能还需要作进一 步的研究。 1 3 2p g s 的抗肿瘤活性与细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 在体外寻找抗癌药物的实验过程中和细菌致病过程中发现许多病原菌引发 的疾病都围绕着宿主细胞的凋亡。细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 也称为程序性细胞死亡 ( p r o g r a m m e d c e l ld e a t h ) ，是细胞衰老、死亡过程的主要形式。细胞凋亡已经变 成了细胞生物学研究的新领域之一。现在认为细胞凋亡可能与各种各样的病理过 程比如肿瘤的发生有关，与其它基本的生命过程一样复杂。 1 9 7 7 年，f u l l a n 及其同事用小鼠体内实验研究了灵菌红素的抗肿瘤活性， 研究发现，用这种色素注射后，肿瘤的扩散速度大约是对照组的2 3 ( f u l l a n , e t a 1 ，1 9 7 7 ) 。近来，有研究表明，间环灵菌红素在鼠类皮肤移植和心脏移植中能更 有效地减少脾脏细胞毒性t 一细胞的活性( m a g a e ，e a 1 ，1 9 9 6 ) 。c p r g h c l 能抑制 7 袁保红中山大学硕士学位论文 移植在裸鼠体表的h u h 7 细胞所引起肿瘤的生长，并能诱导肝癌细胞的凋亡，并 且与对照组相比，没有引起其它器官和血清酶活性的改变( y a m a m o t o ，e t a 1 。1 9 9 9 ) 。这表明灵菌红素具有一定的抗癌作用。 在几种培养的人类癌细胞试验中或肝癌移植的过程中观察到灵菌红素能诱 导细胞凋亡。研究发现c p r g h c l 在体内外实验中均能诱导癌细胞的凋亡，尤 其对肝癌( 1 i v e rc a n c e r ) 、乳腺癌( b r e a s tc a n c e r ) 、骨髓白细胞( p r o m y e l o c y t i c l e u k e m i a ) 和肠癌( c o l o nc a n c e r ) 细胞株的效果明显，但是对正常细胞没有明显的毒 性作用( y a m a m o t o ，e ta 1 ，2 0 0 0 a ；y a m a m o t o ，e ta 1 ，2 0 0 0 b ；y a m a m o t o ，e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 p g s 能在短时间内、有效地诱发造血癌( h e m a t o p o i e t i cc a n c e r ) 细胞、骨髓瘤、b u r k i t t 淋巴瘤细胞等的凋亡，还可以诱发其它人类癌细胞如肠癌和胃癌( g a s t r i cc a n c e r ) 细胞的凋亡，但是对于正常细胞( n o n m a l i g n a n t ) 没有显著毒性( m o n t a n e r ，e t a 1 ，2 0 0 0 ，2 0 0 1 ；d f a z r u i z ，e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。p g 也能诱发b 细胞慢性淋巴癌患者的b 和t 细胞的凋亡( c a m e r o n ，e l a l ，2 0 0 0 ) 。 p g 还能够引发肌动蛋白骨架的重组，并可能促进与凋亡有关的肌动蛋白微 丝的崩溃( d i a z r u i z ，e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。凋亡程序的激活受细胞内、外各种刺激信号 的调节。有关p g 诱导的凋亡信号的机制还需要进一步的研究。 p g ，u p 和c p r g h a ，是已从灵菌红素家族中发现的既有免疫抑制特性， 又能诱导癌细胞发生凋亡的三种很具有潜力的天然产物( t s u j i ，e ta 1 ，1 9 9 2 ；s o n g i a ， e t a l ；1 9 9 7 ；h a n ，e t a l ，1 9 9 8 ；m o r t e l l a r o ，e t a l ，1 9 9 9 ) 。其中u p 和p n u 1 5 6 8 0 4 抑制了t 和b 淋巴细胞的增殖，但对已转化的白血癌j u r k a t 细胞无影响( s o n g i a ，e t a l ，1 9 9 7 ； m o r t e l l a r o ，e t a l ，1 9 9 9 ) 。但是c p r g h c i 却可以通过诱导凋亡细胞从而抑常l j j u r k a t 细胞的增殖( k a w a u c h i ，e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。p g 阻止细胞增殖暗示_ 些在g g = s 期参与 细胞转化的周期蛋白可能是灵菌红素的靶部位。实验表明灵菌红素对周期蛋白a 没有影响但能削弱这些蛋白e 的表达。从而阻止了有丝分裂从g 期到s 期。另外灵 菌红素能抑制细胞c y d i n a - - c d k 2 和c y c l i ne - c d k 2 激酶的活性。癌对化疗产生抗 性的部分原因是p 5 3 部位的高突变频率而消弱了p 5 3 依赖性的凋亡。许多抗癌药 物! t 1 d o x o r u b i c i n e ，e t o p o s i d e ，5 - f l u o r o u r a c i l 诱导的凋亡就是通过p 5 3 依赖途径。 p g 类药物的作用与p 5 3 途径无关，这是一重要的发现( m o n t a n e r , e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 近年来研究发现几乎所有的癌一化学治疗试剂都是通过引起细胞凋亡而杀 8 袁保红中山大学硕士学住论文 死细胞的。所以从研究与凋亡有关的药物中，专家们希望能够得到抑制肿瘤的新 型药物，并从中筛选出治疗癌症的药物。 1 3 3p g s 作为免疫抑制剂 免疫细胞表面具有细胞因子受体，对免疫细胞的分化与活化有重要作用。许 多研究证实，灵菌红素类物质可以专一性的抑制淋巴细胞的增殖。灵菌红素能够 通过抑制i l - 2 ra ( i l - 2 r e c e p t o r c i c h a i n ) 在i l - 2 i l - 2 r ( i n t e r l e u k i n 一2 i n t e f l e u k i n 一2 r e c e p t o r ) 信号传递中的表达选择性地抑制t 细胞的增殖，在体内没有其他细胞 毒性( h a n ，e l a l ，1 9 9 8 ；h a r t e t a l ，2 0 0 1 ) ；在体内外实验中，u p 能够抑制t 淋巴细 胞的增殖而作为一种免疫抑制剂，它优先作用于细胞毒性t 细胞( c y t o t o x i ct l y m p h o c y t e s ，c t l s ) ，同时伴随着c d 8 + 淋巴细胞数量的减少( n a k a m u r a ，e t a 1 ，1 9 8 6 ；t s u j i ，e ta 1 ，1 9 9 0 ；s o n g i a ，e ta 1 ，1 9 9 7 ) ；u p 也可通过阻止外源抗原显现细胞 ( a n t i g e np r e s e n t i n gc e l l s ，a p c s ) ，来平息t 细胞的应急反应( l e e e t a 1 ，1 9 9 8 ) c p r g h c l 虽然优先抑制t 细胞的增殖，但是没有调整c d 4 + t 淋巴细 胞和c d 8 + t 淋巴细胞之间的比例( k a w a u c h i ，e l a l ，1 9 9 7 ；a z u m a ，e t a l ，2 0 0 0 ) 。近来 的研究表明，c p r g h c l 能够有效地抑制小肠移植小鼠的急性移植排斥反应，但 是必须对该药物进行修正以减少其副作用的产生( n a k a i ，e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。壬基灵菌 红素可抑制同种异体抗原诱导的小鼠细胞毒t 淋巴细胞( c y t o x i c t l y m p h o c y t e ， c t l ) 分化，与以往其抑制人混合淋巴细胞反应( m i x e dl y m p h o c y t er e a c t i o n ，m l r ) 中c t l 分化一样，对t 淋巴细胞的增殖具有抑制作用( f u r s t n e r , e t 口，2 0 0 1 ) 。 p n u l 5 0 8 6 4 ( 2 5 c 灵菌红素的一种类似物) 能够更有效地抑制人类初级t 淋巴细胞 和b 淋巴细胞的增殖，这在阻止人类移植免疫排斥中有潜在的应用( m o r t e l l a r o e la 1 ，1 9 9 9 ；s t e p k o w s k i ，e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。这表明，灵菌红素及其相关物质( 灵菌红素 2 5 c 、c p r g h c l 、间环化灵菌红素、壬基灵菌红素) 均具有一定的免疫抑制活 性。 研究免疫抑制剂最主要的问题是其靶部位的分布。目前临床上应用于t 淋 巴细胞的钙神经碱免疫抑制剂环孢霉素a 或f k s 0 6 ，能够阻断其它组织中非t 淋巴细胞的丝氨酸苏氨酸磷酸酶的活性，这导致了肾脏毒性和神经毒性的发生。 s t e p k o w s k y ( 2 0 0 2 ) 等证实p n u l 5 0 8 6 4 对天然杀伤细胞和激活的t 和b 淋巴细 9 袁保虹中山大学硕士学位论文 胞中表达的酪氨酸激酶，j a k 3 ，具有选择性抑制作用。j a k 3 特定的表达部位为选 择性的免疫抑制剂的研究提供一条新的思路。 1 3 4p g s 的作用机制 确定p g 作用机制要求确定其作用的靶部位，这些分子有几种可能的作用机 * i j ：p g s 作为p h 调节剂；p g s 作为细胞周期抑制剂；p g s 作为d n a 的断裂剂； p g s 作为有丝分裂激活蛋白激酶调节剂。 ( 1 ) p g s 作为p h 调节剂 有一定的证据表明细胞周期相关蛋白和细胞质的p h 之间存在直接的偶联关 系( s o n g i a ，e ta 1 ，1 9 9 7 ；s h r o d e ，e la 1 ，1