细菌学检验22真菌感染的实验室诊断.ppt

第十八章真菌感染的实验室诊断,真菌概述,定义真菌（fungus）是一类具有细胞壁和典型细胞核，不含叶绿素，不分根、茎、叶的真核细胞型微生物。,真菌概述,特点1.细胞核高级分化，有核膜核仁，胞质内有完整细胞器，能进行有丝分裂。2.细胞壁由几丁质或纤维素组成，无肽聚糖。3.少数为单细胞，大部分为多细胞并有发达的菌丝体。4.不含叶绿素，不分根、茎、叶。以腐生或寄生的方式摄取养料。5.以无性和有性方式进行繁殖。6.种类繁多，数目大，分布极广。,原核细胞型微生物与真核细胞型微生物比较,第一节分类与命名,一、生物学分类与医学有关的真菌为真菌界真菌门中的四个亚门：接合亚门（Zygomycotina）：毛霉目子囊菌亚门（Ascomycotina）：酵母属担子菌亚门（Basidiomycotina）：新生线状黑粉菌半知菌亚门（Deutermycotina）：多数致病性真菌假丝酵母菌属（Candida）隐球菌属（Cryptococcus）表皮癣菌属（Epidermophton）球孢子菌属（Coccidioides）组织胞浆菌属（Histoplastoma）,二、临床分类（按致病部位）浅部感染真菌：侵犯皮肤、毛发、指甲，为慢性，对治疗有顽固性，但影响身体较小。深部感染真菌：可侵犯全身内脏，严重的可引起死亡。三、形态学分类单细胞真菌多细胞真菌四、命名同细菌，采用国际植物命名法规,第二节生物学性状,多数对人有益，仅少数导致人类疾病。医学（病原）真菌400种，常见的有50100种。目前大多数真菌的鉴定，形态学（包括真菌形态、菌落形态）检查仍有重要意义。,真菌大小不一，比细菌大几倍至几十倍，光镜可见，形态多样，按形态结构可分为：单细胞真菌：呈圆形或椭圆形酵母菌：孢子，无菌丝。由母细胞芽生方式繁殖，芽体脱离母细胞，成为子细胞（新的繁殖体），其菌落与细菌菌落相似。类酵母菌：芽生孢子，假菌丝。芽生方式繁殖，芽体不脱离母细胞并延长伸进培养基中假菌丝，菌落与前者相似，但在培养基内可见假菌丝体。,一、真菌形态特征,单细胞真菌（酵母菌）形态,类酵母菌白假丝酵母菌,孢子,假菌丝,多细胞真菌（丝状菌、霉菌）：由菌丝和孢子组成，交织成团，菌落疏松呈丝状。,孢子,菌丝（hypha）：成熟孢子在适宜条件下长出芽管，逐渐延长呈丝状,生出嫩芽,芽管,延长成丝状,菌丝,不断生长分支、交织,菌丝体,菌丝为管状结构，内充满细胞浆,适宜温/湿度,菌丝分类,单纯菌丝球拍状菌丝梳状菌丝结节状菌丝鹿角状菌丝螺旋状菌丝,返回,真菌的菌丝,真菌的气生菌丝及营养菌丝,真菌菌丝形态,多细胞真菌形态,孢子（spore）是真菌的生殖结构，通过产生孢子进行繁殖，孢子由特化的菌丝生殖菌丝产生。孢子也是其鉴定和分离的依据。分类：,孢子,无性孢子：菌丝上细胞分化生成，不发生细胞融合。,有性孢子：同一/不同菌体上两细胞融合减数分裂而成。,大多真菌行有性/无性生殖，病原性真菌多以无性生殖为主。,真菌的形态构成,真菌的有性孢子（根霉菌的接合孢子）,真菌无性孢子形态,芽生孢子,厚膜孢子,关节孢子,小分生孢子,大分生孢子,1叶状孢子,2分生孢子,芽生孢子,假丝酵母菌厚膜孢子,关节孢子,3、孢子囊孢子,孢子囊孢子,生殖菌丝末端细胞分裂或收缩形成；也可从菌丝侧面出芽形成,大分生孢子的形态,真菌孢子和细菌芽胞的区别,二相型真菌:许多病原性真菌因生活的环境如营养、温度氧气等的改变，孢子与菌丝两种形态可以互变，这类真菌称为二相性真菌。,机体内寄生37,单细胞型：,多细胞型：,含动物蛋白培养基,酵母菌,沙保氏培养基25,普通培养基25,丝状菌,二相性真菌,二、真菌的培养特性,营养要求不高，常用沙保氏（Sabouraud）培养基,基本成分：葡萄糖、蛋白胨、琼脂；pH4.06.0,生长条件：较高的湿度、O2浅部真菌：2228，生长缓慢，大多于12周出现典型菌落。深部感染真菌：37长的最好，生长较快，34天即长出菌落。培养时间：病原性真菌多为1-4W。加抗生素（氯霉素）抑菌。,菌落类型,（1）酵母型/类酵母型（单细胞真菌菌落形式）,A、湿润、柔软而致密，形态似一般细菌菌落B、镜下：酵母型类酵母型,卵圆孢子、芽生孢子,芽生孢子、假菌丝,酵母型菌落,白假丝酵母菌菌落(类酵母型),菌落类型,（2）丝状菌落（多细胞真菌菌落形式）,A、棉絮状、绒毛状、粉末状（气生菌丝体）菌落正背面呈不同颜色（可为鉴定依据）B、玻片小培养,乳酚棉蓝,镜下,孢子、菌丝及完整菌丝体,曲霉菌,石膏样癣菌,青霉菌,三、变异性和抵抗力,真菌易变异：经多次传代或培养时间过久，其形态、结构、菌落性状、色素及毒力等都可以发生改变。用不同的培养基和不同温度培养，其性状也可不同。抵抗力真菌对干燥、阳光、紫外线及一般化学消毒剂抵抗力较强；对热敏感，一般60701小时可杀死真菌菌丝和孢子。对2.5%碘酒，10%福尔马林都敏感，一般可用福尔马林薰蒸被真菌感染的房间。对抗细菌的抗生素不敏感；灰黄霉素、制霉菌素、二性霉素克霉唑等对其有抑制作用。,四、致病性与免疫性,对人致病的真菌分为四类：病原性真菌：浅部真菌、深部真菌条件致病性真菌产毒真菌致癌真菌所致疾病：真菌性感染真菌性超敏反应真菌毒素中毒,真菌性感染：引起真菌病（mycoses），由真菌引起的感染。1.原发性感染：球孢子菌（Coccidiodes）皮炎芽生菌（Blastomyoesdermatitidis）组织胞浆菌（Histoplasma）等2.继发性感染：机体免疫功能显著下降时发生。,目前真菌症呈明显上升趋势的原因：1.抗生素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂等的滥用2.器官移植、介入性治疗等新技术的开展3.艾滋病、糖尿病、恶性肿瘤等疾病造成宿主免疫低下,真菌性超敏反应1.按性质分类：感染性超敏反应：感染，型接触性超敏反应：入或食入，型2.按部位分:皮肤超敏反应呼吸道超敏反应消化道超敏反应,来源：真菌代谢产生毒素，存在于农作物、食物或饲料中表现：1.肝、肾、神经、造血系统等损伤2.致癌（黄曲霉毒素等）,免疫性非特异性免疫1.皮肤粘膜屏障作用2.正常菌群拮抗作用（白假丝酵母菌）3.吞噬作用特异性免疫1.细胞免疫2.体液免疫由于皮肤癣真菌与腐生性真菌间有共同抗原，因此一般不做血清学检查Ab辅助诊断此类真菌感染。,真菌的常规检验法,实验室检查：标本采集分离培养直接镜检生化反应染色镜检免疫学试验,以直接镜检和分离培养最重要。,第三节真菌感染的病原学诊断,一、临床标本的采集种类（1）皮肤的角质性物质：毛发、指（趾）甲、皮屑等。（2）各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。（3）血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。（4）脓汁及渗出物。,采集标本注意事项,（1）采集的标本要适宜不同真菌感染应采取不同的临床标本。怀疑为浅部真菌感染如体癣，应刮取病变边缘的痂、皮屑，发癣应取折断了的病发。怀疑为深部真菌感染应取血液、脑脊液、痰、脓汁等。（2）在用药前采集标本一般真菌标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。,采集标本注意事项,（3）采集的标本量要足血液和脑脊液标本5ml，胸腔液20ml，皮屑标本两块，活体组织两份（一份送病理科检查，一份作镜检和培养）。（4）严格无菌操作在采集标本时严格无菌操作，并进行消毒处理，尤其是在采集血液和脑脊液标本时，要避免污染杂菌。（5）采集的标本立即送检对采集的标本应立即送检，特别是深部真菌标本采集后最长不超过2h。,三、真菌的检验方法,镜检真菌形态：标本直接检查真菌抗原检测真菌分离培养与鉴定真菌核酸检测真菌毒素检测,（一）真菌标本直接检查,1.直接镜检：方法简便，快速直接采取标本制片、显微镜下直接观察，若发现真菌菌丝或孢子存在时，即可初步判定为真菌感染。,10%KOH,微加热,低倍/高倍镜检查有无菌丝/孢子,角质标本,（皮肤癣菌）,直接观察/染色后观察,不染色标本检查标本制备：取标本加一滴固定液，如毛发标本可稍微加温。检查方法：高低倍观测封固液：KOH：促进角质蛋白溶解如皮屑10%，毛发20%。本液适于检查致密的难以透明的材料、角质标本。（如毛发、指甲、鳞屑等）。墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌如新生隐球菌。用于检测病人脑脊液标本中新生隐球菌，需作墨汁负染色后检查，背景为黑色，新生隐球菌和荚膜不着色水合氯醛石炭酸乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。,KOH处理,新型隐球菌墨汁,染色标本检查革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。如酵母菌和假丝酵母菌。乳酸酚棉蓝染色：适用于各种真菌的检查糖原染色（PAS）：又称过碘Schiff（简称PAS或PASH）。真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。过碘酸使糖氧化成醛，再与品红亚硫酸结合，成为红色，故菌体均染成红色。为真菌染色最常用的方法之一。嗜银染色（GMS）：原理类似，用铬酸代替过碘酸。,革兰染色,嗜银染色（GMS）,染色标本检查粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新生隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。瑞氏染色：对检测骨髓和外周血中的荚膜组织胞浆菌，需作瑞氏染色或姬氏染色后镜检。荣光染色：主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。,直接镜检意义,阳性结果意义1.有诊断意义，如浅部真菌病、隐球菌病、皮肤粘膜假丝酵母菌病等。2.代表组织相，直接镜检看到的真菌形态就是该真菌的组织形态，如假丝酵母的菌丝、浅部真菌的厚膜孢子等；确定某些致病性真菌属或种，如皮肤癣菌、曲霉等。3.判断某些真菌种的致病性等。,直接镜检意义,直接镜检局限性1.阴性结果不能排除真菌感染，直接镜检不如培养敏感，其敏感性随标本类型、数量、采集时间和质量等而有所不同2.有假阳性结果，如溶解的淋巴细胞在脑脊液印度墨汁湿片中易误认为新生隐球菌；脂肪微滴也可与出芽酵母细胞混淆因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。,真菌标本直接检查,2.抗原检测:,采用免疫学方法检测真菌抗原，常用的方法有胶乳凝集试验、ELISA、半定量放射免疫测定法。,（二）分离培养,真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。培养成功与否与采集的标本是否适当、是否新鲜、培养基的选择、培养温度与时间等有关。大多数真菌培养的温度为28，但深部真菌为37。对二相性真菌培养时，28培养真菌呈菌丝相（霉菌型），37培养为组织相（酵母型）。培养基：沙保培养基玉米吐温琼脂培养基,1、培养基,常用真菌培养基及用途,培养基,用途,沙保培养基真菌的常规培养,放线菌酮氯霉素琼脂同上,玉米粉聚山梨酯80琼脂观察白假丝酵母菌的厚膜孢子,马铃薯葡萄糖琼脂观察真菌菌落色素，用于鉴别,尿素琼脂用生化反应鉴别真菌（红色癣菌和石膏样癣菌）,心脑浸液葡萄糖血琼脂深部真菌培养（二相性真菌）,真菌培养方法,大培养：用平皿或培养瓶培养。表面较大可使标本散布，便于观察菌落形态，但水分易蒸发，只能培养生长繁殖较快的真菌，如假丝酵母菌、隐球菌。试管培养：水分不易蒸发，主要用于皮肤癣菌的培养和真菌菌种传代接种与保存。玻片培养（微量培养、小培养）：可观察结构特征及发育的全过程。可用于真菌菌种的鉴定。将接种好的玻片，放在平皿内，并放湿纱布以防干燥。逐日镜检，一般约7即可长好。根据菌丝和孢子的结构特点进行真菌类别的鉴定。,观察菌落形态时注意,1.菌落性质，是酵母菌还是霉菌。2.菌落大小，一般病原性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大。3.菌落颜色，一般病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深。4.致病性真菌菌落下沉，污染性真菌菌落不下沉；致病性真菌有时使培养基开裂，但污染霉菌很少引起培养基开裂。,（三）真菌鉴定,菌种鉴定是一个复杂过程，仅观察菌落形态是远远不够的，还需作生化反应，分子生物学鉴定，必要时将菌种送有关单位鉴定。检验真菌常用的生化反应：糖(醇)类发酵试验、同化碳源试验、同化氮源试验或利用硝酸钾试验、牛乳分解试验、酚氧化酶试验、明胶液化试验和脲酶试验等。试验方法同细菌试验，主要用于检验深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。,1.多烯类抗生素：如两性霉素B、制霉菌素、曲古霉素等。2.吡咯类：包括酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑、克霉唑、益康唑等。3.其他类：如氟胞嘧啶。,抗真菌药物分类-化学结构分类,1.作用于真菌细胞膜：两性霉素B、制霉菌素、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑及克霉唑等。2.作用于真菌细胞壁：尼可霉素Z、卡泊芬净及普拉米星（pradimicin）等。3.作用于真菌核酸：干扰真菌DNA合成，5氟尿嘧啶（5FC）等。4.其他：大蒜新素（allitridum）及冰醋酸（glacialeaceticacid）等。,抗真菌药物分类-作用机理分类,1两性霉素B两性霉素对大多数深部致病真菌具有活性，如念珠菌、新型隐球菌、曲菌、组织胞浆菌、双向真菌等均有较强的抑制作用。但对皮肤和毛发癣菌大多耐药。2酮康唑(ketoconazole)对念珠菌、着色真菌属、球孢子菌属等有抗菌活性，对毛发癣菌亦具抗菌活性。,临床常用抗真菌药物,3氟康唑(fluconazole)对念珠菌、隐球菌具有较高抗菌活性。4氟胞嘧啶为窄谱抗生素，对念珠菌、新型隐球菌和球拟酵母有较高抗菌活性，对其他真菌抗菌作用差，易产生耐