（预防兽医学专业论文）应用cDNA阵列技术分析鸡柔嫩艾美耳球虫抗药性.pdf

摘要 鸡球虫病是危害养鸡生产最严重的三大疾病之一。由其引起的经济损失相当惊人目前控制 此病的主要手段是药物防治，然而由于抗球虫药物的滥用。抗药性在世界各国已经是非常普遍的 问题。抗球虫药物分为两大类，一类是离子载体类药物，另一类是化学合成药物本研究以分别 对马杜霉素( 离子载体类) 和地克珠利( 化学合成类) 敏感的鸡柔嫩艾美耳球虫为参比，利用e d n a 阵列、分子杂交技术和生物信息学分析抗性株和敏感株表达谱的差异。从转录水平研究球虫对两 种药物的抗性表达谱的变化，初步探索球虫抗药性的分子机理 e d n a 文库的构建成功构建了高质量的鸡柔嫩艾美耳球虫敏感株和抗马杜霉素株各四个不 同发育阶段( 未孢于化卵囊、孢子化卵囊，子孢于和裂殖子) 的e d n a 混合文库，文库随机插入 外源e d n a 片段的平均长度约为l k b 为进一步研究球虫抗药性产生的机理，寻找调控生长发育 的相关基因、分析代谢途径寻找新药物靶点、筛选保护性抗原基因等研究工作奠定了基础 大规模e s t 序列测定随机挑选9 6 0 0 个e d n a 克隆进行3 端测序，最终得到2 8 0 6 条长度 大于1 0 0 b p 的高质量3 端e s t 序列，共拼接出1 4 2 4 个假定独立转录本( t u t s ) 目前2 8 0 6 条高 质量的e s t 序列已成功提交至o e n b a n k e d n a 阵列的制备及抗药性表达谱的分析筛选独立基因制备了e d n a 阵列，以分对马杜霉 素和地克珠利敏感的鸡柔嫩艾美耳球虫为参比，利用分子杂交技术和生物信息学分析抗性株和敏 感株表达谱的差异。两种抗药性虫株表现出不同的表达谱变化 马杜霉素抗性株中的差异基因以受抑表达为主：代谢水平的整体下降，能够弥补药物作用引 起的a t p 过度使用对虫体的影响；转运子同源基冈的减量表达也能大大降低能量的消耗；细胞膜 的通透性下降，能够有效地阻止药物的进入；一价阳离子通道相关基因的下调表达能够减少钠离 子内流，胞内的渗透压不会急剧升高。在受抑表达的同时还有积极的抵抗：入侵能力提高，有利 于虫体进入宿主细胞，减少高药物浓度的伤害；一些与细胞生长和修复有关的基因上调表达，提 高了虫体细胞膜的强度，增强了虫体细胞对恶劣环境的抵抗力，从而降低高渗透压使细胞崩解的 几率。 目前地克珠利明确的药物作用机理还不清楚，本研究对地克珠利抗药性表达谱的分析只能限 制于对表达谱的客观描述。地克珠利抗性株子孢子和裂殖子阶段，差异基冈很少并且主要为未知 基丙。差异基因主要集中在孢子化卵囊和未孢子化卵囊阶段，呼吸链相关基因在这两个阶段均呈 现出规律性的低丰度表达的趋势。在孢子化卵囊阶段许多蛋白质代谢水平以及糖代谢水平上的上 调表达，这是一种积极的抵抗形式。鸟苷五磷酸磷酸水解酶同源基因在地克珠利抗性株和马杜霉 素抗性株的孢子化卵囊阶段均特异性上调表达，能够使虫体减少不必要的能量消耗，是一种抵抗 恶劣环境的代偿性表现。 由于所能获得的生物信息学的信息量的限制，还有许多差异基因功能未知。相信随着生物信 息学和球虫分子生物学的不断发展，未知功能基因研究的广泛开展，鸡柔嫩艾美耳球虫抗药性研 究也会不断深入。 关键词：抗药性，e d n a 文库，e s t ，e d n a 阵列，表达谱 a b s t r a c t c e c c i d i o s i si so n eo ft h em o s ti m p o r t a n td i s e a s e st h a ta f f e c tt h ep o u l u yi n d u s t r y t h el o s s e s r e s u l t e df r o mi ti se g r e g i o u s t i l ln o wt h em a i nm e t h o d st h a tc o n t r o lt h i sd i s e a s er e m a i nd r u g p r e v e n t i o na n dl r e a m e n lh o w e v e r , s i n c et h ee x t e n s i v eu s u e g eo ft h ea n t i c o c c i d i a i s , d r u gr e s i s t a n c e b e c a m ep o p u l a ra l lo v e rt h ew o r l d a u t i c e c c i d i a ld r u g sc a l lb ed i v i d e di n t ot w oc a t e g o r i e s , o l 碍i st h ei o n o p h o r o u sa n t i b i o t i c t h eo t h e r i st h es y n t h e t i cc o m p o u n d u s i n gc d n aa r r a y , m o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o nt e c h n o l o g ya n db i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s , i nt h i se x p e r i m e n t w es t u d i e dt h ed i f f e r e n c e so ft h eg a n ee x w e s s i o np r o f i l i n go ft l m a d u r a m i c i nr e s i s t a n ts 舡- a i na n dt h eo i e l a z u r i lr e s i s t a n t 吲哦c o m p a r e dw i t ht h ef o u rd e v e l o p m e n t a l s t a g e so f t h ec o r r e s p o n d i n g s e n s i t i v es t r a i n s h e n c ew et e n t a t i v e l ye x p l o r e dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s m o f t h ed r u gr e s i s t a n c et ot h et w od r u g s c o n s t r u c t i o n o f t h ee d n a l i b r a r y w e s u c c e s s f u l l yc c m s i f 嗽l e d a e d n a l i b r a r y w i t h h i g h q u a i i t y t h el i b r a r yi n c l u d e df o u rd e v e l o p m e n t a ls t a g e s ( o n s p o r u l a t e do u e y s t , o o c y s t , s p o r o 础a n dm e r o z o i t e ) o fe i m e r i at e n e l l a t h ea v e r a g el e n g t ho fi n s e r t e df r a g m e n t si sa b o u t l k b t h i sw o r kp m v i d e s c o n d i t i o n sf o rf i l ef u l t h a fr e s e a r c hi n c h d i n gs t u d i e so fm e c h a n i s mo fd r u gr e s i s t a n c e ，s e a r c h i n gf o r n e wg e n e sr e l a t e , dt od e v e l o p m e n t , f i n d i n gt a r g e t sf o rn e wd r u g s s e l e c t i n gp r e v e n t i v ea n t i g e na n ds oo 仇 l a r g es c a l e so fe s ts e q u e n c i n g r a n d o m l ys e l e c t 甜9 6 0 0e d n ac l o n e sf o r3 e n ds e q u e n c i n g , w ef i n a i yo b t a i n e d2 8 0 6e s ts e q u e n c e sw h i c ha 糟m u c hl o n g e rt h a n1 0 0 b p a f t e ra s s e m b l i n g t h e r ea r c 1 4 2 4t u t s n o wt h e2 8 0 6e s t sh a db e e ns u b m i t t e d 幻o e n b a n k p r e p r u t i o no ft h ee d n aa r r a ya n da n a l y s i so fd r u gr e s i s t a n c eg e n ee x p r e s s i o np r o f i l i u g s e l e c t i n gu n i q u eg e n e sw ep r e p a r e dc d n aa r r a y a n a l y z i n gt h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e sb ym e a r l s o fm o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o nt e c h n o l o g ya n db i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s ，t h ed r u gr e s i s t a n te x p r e s s i o n p r o f i l i n g sw e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tb e t w e e nt h em a d u r a m i c i ns e r i a la n dt h ed i c l a z u r i ls e r i a l m o s to ft h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e sw e r er e s t r a i n e di nm a d r u a m i c i nr e s i s t a n ts t r a i n t h e g e n e sr e l a t e dt om e t a b o l i s ma n ds o m et r a n s p o r t e rp u t a t i v eg e n e sh a dt h et e n d e n c yt ob ed o w n - r e g u l a t e d ， t h i sw i l lc o m p e n s a t et h ed e p l e t i o no fe n e r g yc a u s e db ym a d u r a m i c i n t h ed e c r e a s eo fc e l lm e m b r a n e p e r m e a b i l i t yc o u l de f f e c t i v e l yp r e v e n tt h ed r u gf r o me n t e r i n gc e l li n n e r 1 1 砖d e c r e m e n te x p r e s s i o no f g e n e sr e l a t e dt om o n o v a i a n c ac a t i o nc h a n n e lw o u l dd e c l i n et h ei n d m f lo fm o n o v a l e n c ec a t i o n , a n d w o u l da v o i dt h er a p i d l yi n c r e a s eo f t h eo s m o t i cp r e s s u r e a tt h es a m et i m e , t h e r ew e r em a n yg e n e st h a t h a dt h et e n d e n c yt ob eu p - r e g u l a t e da n da p p e a r e da sp a s s i v ec o u n t e r a c t t h ee n h a n c eo f i n v a s i o na b i l i t y w a sp r o p i t i o u st ot h ee n t e r i n go ft h eh o s te e l i s , w h i c hw i l ld e c r e a s et h eh a r md o n eb yt h eh i g h c o n c e n t r a t i o no fd r u g s s o m eo ft h eg e n e sr e l a t e dt oc e l lg r o w t ha n dm a i n t a i n c ec o u l di n c r e a s et h e i n t e n s i o no f c e l lm e m b r a n e ，h e n c eb u i l du pt h ec a p a b i l i t yt op r e v e n tt h ea b o m i n a b l ee n v i r o n m e n t s i n c et h ea c u t ea c t i o nm e c h a n i s mi ss t i l ln o tc l e a rn o w , i nt h i ss t u d yt h ea n a l y s i so f t h ed i c l a z u r i l r e s i s t a n c ee x p r e s s i o np r o f i l i n gw a sl i m i t e dt ot h eo b j e c t i v ed e s c r i p t i o n f e wd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d g e n e sw e r es e l e c t e di nt h es t a g e so fs p o r o z o i t ca n dm e r o z o i t e t h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e sw e r e m a i n l a yf a s t e no nt h es t a g e so fs p o r u l a t e do e c y s ta n du n s p o r u l a t e do n c y s t i nt h i st w os t a g e s ，g e n e s n r e l a t e dt or e s p i r a t o r yc h a i nh a v et h et e n d e n c yt ob ed o w n - r e g u l a t e di nd i c l a a 埘lr e s i s t a n ts l n l i n c o m p a r e dw i 曲s e n s i t i v es t r a i n 1 1 懈w e r em a n yg e n e st h a tr e l a t e dt op r o t e i nm e t a b o l i s ma n d c a r b o n d r h y d r a t em e t a b o l i s mw e r eu p - r e g u l a t e di nt h es t a g eo fs p o r u l a t e do o c y s t t h i si sap a s s i v e p r e v e n t i v ef o r m g u a n o s i n ep e n t a p h o s p h a t ep h o s p h o h y d r o l a s eh o m o l o g u ew a l eu p - r e g u l a t e di nt h e s t a g eo fs p o r u l 砒e do o c y s tb o t hi nd i c l a z u r i lr e s i s t a n ts t r a i na n dm a d u r a m i c i nr e s i s t a n ts t l t i n t h i s w o u l dh e l pt h ep a r a s i t e st os a v i n ge n e r g ya n di sa p h e n o t y p et h a ta d a p t e dt ot h ea d v e r s ec o n d i t i o n s b e i n gr e s t d c t e dt ot h el i m i t e d “粕u r c e so fb i o i n f o r m a t i c s , t h e r ew e r es t i l lm a n yu n k n o w ng e n e s t h a ti ss i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t w i t ht h ed e v e l o p m e n to f b i o i n f o n n a t i e sa n dc o c c i d i a nm o l e c u l a rb i o l o g y , t h er e s e a r c ho f d r u gr e s i s t a n c ei ne i m e r i at e n e l l aw o u l dg e tf u r t h e ra d v a n c e m e n t k e yw o r d s ：d r u gr e s i s t a n c e ，c d n al i b r a r y , e s t , c d n aa r m y , e x p r e s s i o np r o f i l i n i ! i 缩略语清单 缩写英文中文 a m pa m p i c i l l i n 氨苄青霉素 b p b a s e n a i r碱基对 b s aa l b u m i nb o v i n e牛血清白蛋白 c d n a c o m p l e m e n t a r yd n a 互补脱氧核糖核酸 d b e s td a t a b a s eo f e x p r e s s e ds e q u e n c et a ge s t 数据库 d e p c d i e t h y p y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 e be t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 e d t a e t h y l e n e d i n i t r o t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e s t e x p r e s s e ds e q u e n c et a g 表达序列标签 d n t p s d e o x y r i b o n u c e l e o s i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核糖核苷三磷酸 k b k i l o b a s ep a i r千碱基对 k d ak i l o - d a l t o n千道尔顿 k a n k a n a m y c i n 卡那霉素 l bl u r i a - b e r t e n im e d i u ml b 培养基 m o p s 3 - 【n m o r p h i l i n o p r o p a n e s u l f o n i ca c i d3 州一玛琳代) 丙磺酸 m i nm i n u t e分钟 m r n a m e s s e n g e rr n a 信使核糖核酸 h r h o u r小时 r p m r o t a t ep e rm i n u t e转| 赍钟 l l a r v o ln o r m a l i z e da rv o l u m e信号强度表达值 n c b i t h e n a t i o n a l c e n t e r f o r b i o t e c h n o l o g y i n f o r m a t i o n o f u s a 美国国立生物技术信息中心 u tn u c l e o t i d e核苷 o m t ao a t m e a lt o m a t oa g a t 燕麦番茄培养基 o r f o p e nr e a d i n gf r a m e 开放阅读框 p b s p h o s p h a t eb u f f e r e ds a i h 悖b u f f e r 磷酸盐缓冲液 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 o p c rq u a n t i t a t i v er e a l - t i m ep c r 实时荧光定量p c r r t - p c rr e v e l s et r a n s c d 州o n p c r反转录p c r s d ss o d i u md o d e c y l s u t p h a t e十二烷基磺酸钠 t a e t d s - a c e t a t ee d t ab u f f e rt r i s - 乙酸缓冲液 t r i s t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) - a m i n o m e t h a n e 三( 羟甲基) 氨基甲烷 n ，rt u t a t i v eu n i q u et r a n s c r i p t假定独立转录本 uu n i t酶活力单位 y t y e a s t - t r y p t o n em e d i u m y t 培养基 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意 研究生签名： 时间：力彳年，月砧日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 瓣 晦乏 时间：加彳年i ，月谚日 时间：沙彳年，月潴日 第一章文献综述 1 鸡艾美耳球虫抗药性研究进展 不论在世界的哪个地方，只要有鸡饲养，鸡球虫病就会不可避免的发生j 集约化的养鸡场 则是球虫病爆发的适宜场所，在集约化养鸡场的各种鸡病中球虫病的发生率最高，是危害养鸡生 产最严重的三大疾病之一除去治疗和疫苗的花费，每年由此而引起的经济损失在全球高达2 0 亿 英镑1 2 1 ，其中7 6 是由于临床或亚临床球虫病引起我国在这方面的损失虽然无准确的统计，但 是由于鸡只饲养规模大、数量多，再加上饲养管理粗放，鸡球虫病造成的损失肯定相当惊人川 自从1 9 3 9 年l e v i n e 发现磺胺类药物对鸡球虫有效以来i i 抗球虫药的开发与应用取得了迅猛 发展，在七十年代之前所使用的抗球虫药主要为化学合成类药，如磺胺类药、氨丙啉、尼卡巴嗪、 喹诺酮类药等在当时。这些抗球虫药在减少球虫病的临床暴发上起到了重要作用但由于这类 药中的许多药物，球虫对其抗药性产生快，致使这些药在使用不久即被淘汰。从七十年代早期，随 着第一个聚醚离子载体类抗球虫药一莫能菌素的问世，其他离子载体类抗球虫药在七十年代后期 和八十年代相继投入使用纠。药物已经成为目前控制鸡球虫病的主要手段。人们为了使用方便， 将药物作为饲料添加剂应用到鸡球虫病的预防控制中然而由于抗球虫药物的滥用，抗药性已经 成为非常普遍的问题1 6 7 j 。h o r t o ns m i t h 首先预言抗球虫药可能会产生抗药性i s j 。1 9 5 4 年美国从野 外分离出了几种对包括磺胺类在内的数种药物有明显抗药性的虫株例，1 9 5 5 年c u c k l e r 等也报道了 对呋哺两杯抗药的虫株 1 0 1 。此后，英国、法国、日本、加拿大、中国、巴| 西和阿根廷等国先后对 鸡场的抗药性虫株进行了大量的调查研究，迄今已从养鸡场分离出了几乎对所有使用过的抗球虫 药有抗药性的虫株【6 “- 2 e 1 抗药性被认为是目前球虫病控制失败的主要原因，然而几乎所有的商业化的球虫药均出现了 相应的抗药性虫株【2 “，并表现出一定程度的交叉抗药性或多重抗药性，而且养鸡场抗药株的发生 率很高i l “。使得许多抗球虫药的防治效果显著降低，甚至完全失效，即使是提高药物浓度也无济 于事，仍然出现鸡球虫病的爆发，给养鸡生产带来无法弥补的经济损失1 2 0 l 。1 9 7 5 年，l o n g 等在英 国5 个商业化肉鸡场调查发现，抗球虫药从有抗药性的氯羟毗啶换成对球虫敏感的莫能菌素后， 饲料转化率从2 4 7 明显下降为2 2 9 l “，仅仅更换高效药物这一项，英国每年就可节省大约4 千万美 元换个说法，如果不换用高效抗球虫药，每年则可造成同样或更大数量的损失1 2 3 。同时因球虫 产生抗药性也使得好不容易才筛选出的抗球虫药的使用年限大大缩短。表1 1 列出了不同的抗球虫 药物的引入时间及产生抗药性的情况l ，由于药物的滥_ i ，抗药性产生的周期一般都很短，有的 药物如拉沙里菌素( l a s a l o c i d ) 、盐霉素( s a l n o m y c i n ) 等药物在引入后的一年以内就产生了抗药性虫 株，而一些在使用初期效果很好的药物，如马杜霉素( m a d u r a m i c i n ) l ! 地克珠利( d i c l a z u r i l ) 也在四 年内产生了抗药性。由于鸡球虫抗药虫株的日益增多，进入7 0 年代以来，新药的开发速度已赶 中国农业人学博l 学位论文第一章文献综述 i i 皇皇舅量皇曼曼曼鲁曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼| _ _ _ _ _ 量量_ | 置_ | _ _ 目一 不上耐药株出现的速度，给鸡球虫病的药物舫治造成了很大的障碍 药物名称 药挈嚣入使累国 抗药性描述者 蕴磊筹：球羹种 磺胺喹恶啉( s u l p h a q u i n o x a l i n e ) 1 9 4 3 美国w a l 曲 1 9 5 4t 呋哺西林( n i t r o f u r a z o n e ) 1 9 4 8 美国 c u c k l e r & m a l a l t g a 1 9 5 5 不详 尼卡巴嗪( n i c a r b a r z i n ) 1 9 5 5 英国h e m s l c y 1 9 6 4 t 球痢灵( d i n i t o l m i n e ) 1 9 6 0 英国h e m s l e y 1 9 6 4 t , n 氨埘啉( a m p r o l i u m ) 1 9 6 0 英国h e m s l e y 1 9 6 4b 氯羟吡啶( c l o p i d 0 1 ) 1 9 6 6 英国 w i l l i a m s1 9 6 9 a ，m , t 丁氧哇啉( b u q u i n o l a t c ) 1 9 6 7 美国 m c m a n a s 1 9 6 8 不详 苯甲氧喹啉( m e t h y lb c 0 q 哟 ! 9 6 7 英国 m i l l a r d1 9 7 0t 癸氧喹啉( d c c o q u i n a t e ) 1 9 6 7 英国m i l l a r d1 9 7 0t 莫能菌素( m o n a n s i n ) 1 9 7 1 美国 j c f f c r s1 9 7 4m 氯苯胍( r o b e n i d i n e ) 1 9 7 2 美国 j e f f e r s1 9 7 4m 常山酮( h a l o f u g i n o n e ) 1 9 7 5 法国h a m e t 1 9 8 6 a ，t 拉沙里菌素( l a s a l o c i d ) 1 9 7 6 美国w e p p c l m a nd a 1 1 9 7 7a 氟嘌呤( a r p r i n o c i d ) 1 9 英国c h a p m a n 1 9 8 2t 盐霉素( s a l n o m y c i n ) 1 9 8 3 美国 j c f f e r s1 9 8 4 各个种 那拉霉素( n a r a s i n ) 1 9 8 3 美国w a p p e l m a nc ta 1 1 9 7 7a m , t 马杜霉素( m a d u r a m i c i n ) 1 9 8 3 美国m c d o u g a l dc ta 1 1 9 8 7 备个种 百球清( t o l t r a z u r i l ) 1 9 8 6 荷兰 v e n o m m e n p e e k1 9 9 3 不详 地克珠利( d i c l a z u r i l ) 1 9 9 0 巴西k a w a z o c & f a b i o1 9 9 4a ，m , t 袭l i 艾美耳球虫野外株对抗球虫药的抗药性概况 2 4 1 洼：t ，柔嫩艾美耳球虫；a ，堆形艾美耳球虫；m ，巨型艾荚耳球虫；n ，毒害艾美耳球虫；b ，布氏艾美耳球虫 t a b l ei - 1 t h eo u t l i n eo f t h ed r u gr e s i s t a n c ei nf i e l ds t r a i n so f e i m e r i as p p n o t c ：t e i m e r i at e n e l l a ；a e i m e r i aa c e m , u l i n a ；m 。e i m e r i am a x i m a ；n 。e i m e r i an e e a t r i x ；1 3 , e i m e r i ab r u n e t a 1 1 抗球虫药物的作用机理 抗球虫药物可以分为两大类，一类是合成药，也叫化学合成药( 例如地克珠利，氨丙啉，尼 卡巴嗪等) ，另外一类是发酵产生的离子载体类药物， d a r t 离子载体抗生素( 如莫能菌素、马杜 霉素、盐霉素等) 1 2 5 1 。药物作用机制的阐明有助于研究球虫抗药性产生的机理。然而这方面的研 究资料很不充分抗球虫药的作用形式被证明是多样的，其中包括对共同因子的合成，能量代谢 和对膜功能的合成等方面的影响r s , 2 6 j 1 1 1 影响共同因子的合成 球虫不能从头合成嘌岭而需要次黄嘌呤的参与口7 2 s l 。大量体外试验表明，氟腺瞟呤 ( a r p r i n o c i d ) 作为一种抗球虫药，能竞争性地阻断次黄嘌呤的转膜运输b 因而阻断虫体内嘌岭 的合成。但有人认为，氟腺嘌呤在体内的作用方式也许并非如此，c h i n g 等认为，氟腺嘌呤的肝脏 微粒体代谢物a r p r i n o e i d - 1 一n - o x i d e 可能发挥了抗球虫作用。他们认为这种代谢物可能结合于虫体 细胞的微粒体的细胞色素p 4 5 0 上，后进一步被代谢，导致虫体细胞的粗面内质网肿胀、空泡化， 最终导致虫体死亡i j u j 。杀球灵( d i c l a z u r i l ) 可能影响核酸的合成它可允许裂殖体和小配子体的 核的正常生长与分裂，但却阻止其进一步分化，使得裂殖生殖或配子生殖不能正常完成p 一2 1 。氨 丙啉( a m p r o l i u m ) 能阻碍柔嫩艾美耳球虫的第3 代裂殖体对硫胺素( v b l ) 的摄取。第2 2 代裂殖体 2 中国农业大学博i 。学位论文第一章文献综述 内的v b l 运输系统对氨丙啉的敏感性比宿主体要高出5 0 倍刚 1 1 2 抑制能量代谢 喹诺酮类药能阻碍球虫体内线粒体的呼吸作用，但对小鸡肝细胞的线粒体无影响州 a r p r i n o c i d - 1 - n - o x i d e 的抗球虫i d 的药物浓度为3 0 x 1 0 7 , 而对鸡胚肾上皮细胞和海拉细胞i d s o 的药物浓度为5 o l 旷也就是说，虫体细胞对这种微粒体代谢产物比鸡体细胞要敏感得多p o 。尼 卡巴嗪和氯苯胍也可能通过抑制电子转运达到抑杀球虫的作用，但其具体的作用机制尚不清楚 网。喹啉类药物的作用是抑制艾美耳球虫的呼吸作用，阻止线粒体内电子转运，这种抑制作用是 可逆的，因为一旦撤去药物。裂殖子又能恢复感染能力m i 氯羟毗啶( 克球粉) 也影响球虫的电 子转运，但对喹啉类有抗药性的虫株对克球粉却是敏感的，可见二者的作用方式有区别，可能二 者在电子传递链上的作用点不相同f r y 等运用细胞色素光谱研究了这两类药物的抗药性问题，认 为对癸氧喹酯的抗药性可能来自于电子流通过一个终端在细胞色素a a - 3 氧化酶处的独立通道发生 了转向；对克球粉的抗药性可能来自于通过0 型细胞色素氧化酶途径的电子转运的转向p 6 1 1 1 3 破坏细胞膜的完整性 离子载体类抗生素能与n a * 、k + 、c a 2 + 、m 矿等在虫体内起重要作用的阳离子结合形成 脂溶性络合物，协助阳离子进入虫体内，破坏细胞内外的正常离子平衡，使细胞内外形成渗透压 差，大量水分进入，最后导致虫体细胞破裂死亡印“。这类药物是目前控制鸡球虫病使t h j 最为广 泛的药物，主要作用于细胞膜，转运刚离子通过细胞膜，影响多个依赖离子转运的生理过程这 类药物都是通过破坏球虫细胞膜内外的渗透压平衡，使阳离子和水分丈量进入球虫细胞内，球虫 因肿胀过度而死亡。多聚醚类离子载体药物的作用机理是( 以莫能菌素为典型) ：多聚醚类抗生素 与钠离子结合形成复合物的能力比钾离子强。形成的复合物有一个脂质的表面可以在膜的脂质区 移动，这就使得其能够用钠离子交换质子在于孢子中在药物的作用下，钠离子的浓度会增加5 倍，继而提高n a + k + - a t p a s e 的活性以维持正常生存所需要的钠离子梯度另外，支链淀粉耗竭， 乳酸增多，a t p 水平下降。细胞内的c a 2 + 浓度也会提高，其原因是线粒体中的n a + c a 2 + 交换的 胞内的阳离子浓度的急剧上升水分子人量涌入，改变了胞内的p h 值，细胞膨胀、空泡化内部结 构严重破坏。其它的抗球虫多聚醚类抗生素被认为有相似的机理唧 1 2 交叉抗药性 百球清( t o l t r a z u r i l ) 和地克珠利有交叉抗药性。这两种药物可能有相似的作用方式，二者同属 于芳香基三嗪类药物地克珠利对多种已对其它药物产生抗药性的虫株有效，但对百球清抗药性 虫株效果不佳i 百球清能使虫体细胞内的所有发育阶段的内质网膨大而严重空泡化，但药物不 影响宿主的细胞p 2 】；它能抑制中枢p s i iq a d l 蛋白的功能，d l 蛋白与低氧状态下的电子传递有关， 它有可能提供了氧自由基以帮助球虫进入宿主细胞内m j 。在常用的抗球虫药中，只有这两种在药 物撤去后有残效作用 4 4 1 。 3 中国农业人学博f ：学位论文 第一章文献综述 离子载体抗生素的交义抗药性。离子载体抗生素类药物是目前控制鸡球虫病使用最为广泛的 药物。该类药物主要作用于球虫子孢子、裂殖子的细胞膜，影响转运阳离子通过细胞膜，影响多 个依赖离子转运的生理过程 4 5 1 。这类药物都是通过破坏球虫细胞膜内外的渗透压平衡，使阳离子 进入球虫细胞内，造成细胞内晶体渗透压上升，水分大量进入球虫的子孢子和裂殖子，引起细胞 肿胀，球虫因肿胀过度而死亡一般认为，由于这类药物的作用机理相似，在球虫对其中一种药 物产生抗药性之后易产生对此类的另一种药物敏感性降低( 即交叉抗药性) 但是，有关此类报 道有不统一之处，如r a e t h e r 等发现马杜霉素、莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉紊、拉沙里菌素有很 大程度上的交叉抗药性脚i ；而马杜霉素能有效控制对其它抗生素已产生抗药性的柔嫩艾美耳球虫 m ，对莫能菌素和甲基盐霉素已产生抗药性的虫株也可以用拉沙里菌素防治嗍 1 3 多重抗药性 已有多位研究者报道，一些艾美耳球虫的田间分离株不仅对1 种抗球虫药物产生了抗药性， 而且有的虫株对2 种甚至2 种以上的药物同时具有抗药性1 4 9 j ，即具有多重抗药性，这种多重抗药性 可能与不同抗药性球虫株之间发生基因重组有关网，在实验室内，通过遗传杂交技术已获得了多 个艾美耳球虫多重抗药性虫株。将抗氨丙啉和抗癸氧喹啉的柔嫩艾美耳球虫杂交，获得了抗这两 种药物的柔嫩艾美耳球虫重组株p l 】；j o y n e r 等用同样方法获得了抗苯甲氧喹啉与磺胺喹1 3 恶啉的 巨型艾美耳球虫重组株 5 2 1 ；c h a p m a n 获得了l 株对3 种药物( 氯苯胍、癸氧喹酯、氨丙啉) 有抗药 性的重组株p q ；甘德培则成功地获得了3 株柔嫩艾美耳球虫抗药性重组株：抗地克珠利与盐霉素的 抗药性重组株、抗地克珠利与克球粉的重组株、抗地克珠利与拉沙里菌素的重组株岬j 。但并不是 任意抗药性虫株间杂交都能获得抗药性重组株。j o y n e r 等未能获得抗苯甲氧喹啉与克球粉的重组 株，且当他们将巨型艾美耳球虫磺胺喹1 3 恶啉抗药性虫株与布氏艾美耳球虫混合感染后，发现抗 药性基因不能在种间传递 5 4 1 c a n n i n g 等认为。球虫在有丝分裂期间不形成染色体交叉，如果抗 药性基闵存在于同一染色体上，就不会发生抗药性基因的重组m j ：而且，如果对两种药物产生抗 药性的基因在染色体上紧密联系在一起，即使在有丝分裂期间发生染色体交换。也难于获得对两 种药物均产生抗药性的重组株，抗克球粉虫株和抗喹诺酮类虫株无法通过杂交获得重组株，可能 基于此机理削最近，在分析了对克球粉和癸氧喹酯具有抗药性的堆型艾美耳球虫田间分离株的 表现型后，w i l l i a m s ( 1 9 9 8 ) 提出，有可能克球粉和喹啉类药物之间确实不存在抗药性基因的转移 问题，堆型艾美耳球虫对克球粉和癸氧喹酯的双重抗药性，是因为球虫群体中存在同时对两种药 物有抗药性的突变体p ”。这也许是球虫对一些药物产生多重抗药性的另一种机制，但目前有关此 类的研究极少，如果能更多地进行有关药物压力下能否选择到多重抗药性突变体方面的研究，将 有助于了解球虫多重抗药性产生的原因，探讨抗药性产生的机理 1 4 球虫抗药性研究的方法 球虫抗药性的测定方法包括笼饲试验法、鸡胚试验法、细胞培养试验法、聚丙烯酰胺凝胶电 泳、同一i ：酶电泳测定法、p c r 测定法等。 4 1 4 1 笼饲试验法 将抗球虫药物按照一定的比例与饲料或饮水均匀混合后饲喂试验动物，经过一定时问后接 种球虫，观察记录鸡只的相应变化，通过一定的指标和标准判定球虫的抗药性及其程度判断标 准主要有卵囊产量、病变记分、增重、最适抗球虫活性百分率( e e r c 2 n to f o p t i m u ma n t i c o c c i d i a l a c t i v i t y ，p o a a ) 、粪便记分比率( r a t eo f f e c a ls c o r e ) 、抗球虫指数( a n t i c o c c i d i a li n d e x ，a c i ) 、 综合抗药性指数( g i o b a lr e s i s t a n c ei n d e x ，0 1 ) 、生产力指数( p r o d u c t i v i t yi n d e x ，p 1 ) 和相对卵囊得分 ( r e l a t i v eo o c y s ts c o m ，r o s ) 等。虽然不同的研究人员所选用的判断标准不尽相同，但是综合多个 指标判断球虫对药物的敏感性，能够比较全面的反映球虫的抗药性的产生并且能够为抗药性的程 度提供大量详实的信息 1 4 2 鸡胚试验法 张勤等利用鸡胚感染法，收集纯化子孢子。感染试验鸡胚，测定柔嫩艾美耳球虫对磺胺喹 恶啉( s q ) 和地克珠利的耐药性，在药物存在的情况下，柔