（分析化学专业论文）有机药物的电化学行为及其与dna相互作用的研究.pdf

西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 本论文采用多种电化学方法研究了新橙皮苷二氢查尔酮、尼莫地平、阿魏酸乙 酯、咖啡酸乙酯、新橙皮苷五种有机药物分子在玻碳电极上的电化学行为并建立了 定量测定方法，进一步探讨了阿魏酸乙酯、咖啡酸乙酯、新橙皮苷与d n a 相互作 用的模式和机理。该研究对于发展有机药物分析的新方法、了解药物分子在生物体 内与d n a 相互作用的机理、丰富电化学的研究内容具有重要的意义，并可为生物 医学研究提供依据。全文主要内容如下： 1 、研究了新橙皮苷二氢查尔酮和尼莫地平在玻碳电极上的电化学行为，探索了 电极反应机理。实验结果表明：新橙皮苷二氢查尔酮和尼莫地平在玻碳电极上的电 化学行为均受表面过程控制，是一个两电子转移、两质子参与的电化学过程。 2 、采用循环伏安法、差分脉冲伏安法并结合紫外吸收光谱法研究了阿魏酸乙酯 和新橙皮苷的电化学行为，探讨了两种药物与小牛胸腺d n a ( c t - d n a ) 相互作用 的机理。实验结果表明：阿魏酸乙酯与c t - d n a 之间存在静电作用。通过计算引入 c t - d n a 前后的电化学参数，推测阿魏酸乙酯与c t - d n a 作用形成了一种非电活性 的超分子化合物，其结合比和结合常数分别为3 和6 0 1 0 6 ；新橙皮苷与c t - d n a 之间也存在静电作用，通过计算可得新橙皮苷与c t - d n a 作用的结合比和结合常数 分别为3 和2 2 1 0 1 6 。紫外吸收光谱法测定结果与电化学方法测定结果相吻合。 3 、采用循环伏安法、差分脉冲伏安法并结合紫外吸收光谱法考察了咖啡酸乙酯 的电化学行为及其与鲱鱼精d n a ( h s e 吐、a ) 相互作用的机理。实验结果表明：咖 啡酸乙酯与h s d n a 之间的作用方式为静电作用。通过计算引入h s - d n a 前后的 电化学参数，推测咖啡酸乙酯与h s d n a 作用形成了一种非电活性的超分子化合 物，其结合比和结合常数分别为2 和9 8 1 0 6 ，表明一个h s d n a 分子可结合2 个 咖啡酸乙酯分子。 关键词：有机药物分子小牛胸腺d n a 鲱鱼精d n a 电化学行为光谱法 玻碳电极相互作用 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 i 页 a b s t r a c t i l lt h i s t h e s i s ，t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so fn e o h e s p e r i d i nd i h y d r o c h a l c o n e ， n i m o d i p i n e ，e t h y lf e r u l a t e ，e t h y lc a f f e a t ea n dn e o h e s p e r i d i na tg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ew e r e s t u d i e db ys e v e r a le l e c t r o a n a l y t i c a lm e t h o d s ，a n ds o m en e wm e t h o d sf o rq u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o no fo r g a n i cp h a r m a c e u t i c a l sm o l e c u l a ra b o v e m e n t i o n e dw e r ep r e s e n t e d f u r t h e r m o r e ，t h e i n t e r a c t i o nm e c h a n i s mb e t w e e ne t h y l f e r u l a t e ，e t h y lc a f f e a t e ， n e o h e s p e r i d i na n dd n aw e r ed e s c r i b e d ，r e s p e c t i v e l y t h e s es t u d i e sh a v eg r e a t s i g n i f i c a n c et od e v e l o pn e wa n a l y t i c a lm e t h o d sf o ro r g a n i cp h a r m a c e u t i c a l s ，t oi n v e s t i g a t e t h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mb e t w e e np h a r m a c e u t i c a l sa n dd n ai nl i v i n gb o d i e s ，t oe n r i c h t h ec o n t e n t so fe l e c t r o c h e m i s t r ya n dt oo f f e rt h ef u n d a m e n t a lf o rb i o m e d i c i n ea n a l y s i s t h em a i nc o n t e n t so ft h i st h e s i sw e r e2 l sf o l l o w s ： 1 t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so f n e o h e s p e r i d i nd i h y d r o c h a l c o n ea n dn i m o d i p i n ea t g l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ew e r es t u d i e d , a n dt h ee l e c t r o d er e a c t i o nm e c h a n i s mw a se x p l o r e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so fn e o h e s p e r i d i n d i h y d r o c h a l c o n ea n dn i m o d i p i n ea tg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ew e r ec o n t r o l l e db ys u r f a c e r e a c t i o n , i n v o l v i n gat w o p r o t o n , t w o e l e c t r o np r o c e s s 2 t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so fe t h y lf e r u l a t ea n dn e o h e s p e r i d i na tg l a s s yc a r b o n e l e c t r o d ew e r ei n v e s t i g a t e db yc y c l i cv o l t a m m e t r y , d i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r ya n d u l t r a v i o l e ta b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r y f u r t h e r m o r e ，t h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mb e t w e e nt h e t w op h a r m a c e u t i c a l sa n dc t - d n aw e r es t u d i e d t h ee x p e r i m e n tr e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ne t h y lf e m l a t ea n dc t - d n aw a sm a i n l yo fa ne l e c t r o s t a t i co n e i n t e r m so fe l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r si nt h ea b s e n c ea n dt h ep r e s e n c eo fc t - d n a ，i tw a s d e d u c e dt h a tan o n - e l e c t r o a c t i v es u p r a m o l e c u l a rc o m p o u n dw a sf o r m e db e t w e e ne t h y l f e m l a t ea n dc t - d n a t h eb i n d i n gr a t i oa n dt h eb i n d i n gc o n s t a n to fe t h y lf e r u l a t ei n t o c t - d n aw e r ec a l c u l a t e dt ob e3a n d6 0 1 0 6 , r e s p e c t i v e l y s i m i l a r l y , w i t ha n e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n , t h eb i n d i n gr a t i oa n dt h eb i n d i n gc o n s t a n to fn e o h e s p e r i d i ni n t o 西南科技大学硕士研究生学位论文 第1 i i 页 c t d n aw e r ec a 3a n dc a 2 2 10 怕，r e s p e c t i v e l y u l t r a v i o l e ta b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y h a sv a l i d a t e dt h ea b o v ec o n c l u s i o n s 3 ，n l ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ra n dt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mb e t w e e ne t h y lc a f f e a t e a n dh s d n aa tg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ew e r ei n v e s t i g a t e db yc y c l i cv o l t a m m e t r y , d i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r ya n du l t r a v i o l e ta b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r y i tw a ss h o w nt h a t a l le l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nw a st h em a i np a r e mb e t w e e ne t h y lc a f f e a t ea n dh s d n a i t w a sd e d u c e dt h a tan o n - e l e c t r o a c t i v es u p r a m o l e c u l a rc o m p o u n dw a sf o r m e db e t w e e ne t h y l c a f f e a t ea n dh s d n aa c c o r d i n gt ot h ee l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r sw i t l la n dw i t h o u t h s d n a m o r e o v e r , t h eb i n d i n gr a t i oa n dt h eb i n d i n gc o n s t a n to fe t h y lc a f f e a t ei n t o h s d n aw e r ec a l c u l a t e dt ob e2a n d9 8 10 6 r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：o r g a n i cp h a r m a c e u t i c a l sm o l e c u l a r , c a l ft h y m u sd n a ；h e r r i n gs p e r m d n a ；e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r ；s p e c t r o m e t r y ；g l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ； i n t e r a c t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南科技大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：- 于婧婷日期：伽夕乡 关于论文使用和授权的说明 本人完全了解西南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留学位论文的复印件，允许该论文被查阅和借阅；学校可以公布该论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 签名：于痔睹 导师签名：日期： d 9 ， 6 乡 i 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 1 1引言 电分析化学方法是一种利用物质的电化学性质进行分析的方法i lj 。近年 来，它在方法、技术、应用等方面都取得了长足的发展，尤其是对生命科学 领域中相关问题的研究【2 】。由于许多生命物质是带电荷的微粒或分子，所以 生命过程中最基本的运动为电荷运动，因此可以认为生命学科中最基础的研 究方法为电化学方法【3 l 。正由于电分析化学结合了电化学与分析化学等多门 学科，所以它成为了揭示生命现象最有力的工具。利用电化学方法，可以将 在体内以温和条件下进行的各种氧化还原反应的机理( 电子传递过程) 在体 外进行模拟，包括模拟有机药物在体内的作用机理” 8 j 。由此可见，用电化 学方法研究有机药物是分析化学中一个广泛的研究领域。本章综述了近年来 电化学方法在有机药物分析中的应用，并介绍了本论文的研究内容。 1 2有机药物分子的电化学研究方法 近年来，电化学方法广泛地应用在能源、材料、环境、生物、药物、微 纳米器件等多个研究领域。众所周知，生物体系是一个充满电解质溶液的体 系，绝大多数反应都发生在膜系统的界面上，因而尽管存在许多物理和化学 上的差异，电化学体系仍然是一个非常好的生物模拟体系。而具有药理活性 的多种药物在生物体内所进行的一系列复杂过程多与其所具有的氧化还原 特性及电子转移行为相关，这种氧化还原和电化学过程都具有电子转移的共 性【9 j 【1 0 j ，因此，将电化学手段应用在药物分子氧化还原机理的研究上具有重 要的意义。 结合多种电化学方法来研究药物的电化学行为可以从多个角度来了解 药物的信息，为进一步研究其在体内的作用机制提供依据。基于电解原理的 电化学分析方法可分为控制电位和控制电流两大类。其中线性扫描伏安法、 循环伏安法和脉冲伏安法等是控制电位的电化学方法。线性扫描、循环和差 分脉冲等伏安方法具有简单、快速、灵敏等特点，己广泛应用于药物、生化、 材料和环保等方面的检测及其电化学特性研究【4 1 。 西南科技大学硕士研究生学位论文第2 页 1 2 1线性扫描伏安法 将一快速线性变化的电压施加于电解池上，并根据所得的电流电压曲 线进行分析的方法，称为线性扫描伏安法，其主要特点是加电压的速度很快 i q1 1 2 。相对于经典的伏安法，线性扫描伏安法有如下特点：( 1 ) 灵敏度高， 可达1 0 一1 0 m o l l ，这主要与扫描速率有关系；( 2 ) 分辨率较高，所以 两波相差5 0m v 也可以分开。线性扫描伏安峰峰电位岛在一定的实验条件 ( 温度、底液组成等) 下，仅决定于去极化剂的性质，因而可作为定性分析 的依据。 线性扫描伏安法在用玻碳电极研究和测定有机药物的过程中得到了广 泛的应用。董社英等【7 】采用线性扫描伏安法、循环伏安法及恒电位电解法研 究了新型抗血脂紊乱药物阿托伐他汀钙( a c ) 的电化学行为，建立了一种直接 测定a c 的方法；她还应用线性扫描伏安、循环伏安、常规脉冲伏安等电化 学方法并结合紫外吸收光谱法研究了药物克拉霉素在p h = 1 8 9 2 的b r 缓冲溶液和0 0 5m o l l 1 n a o h 溶液中的电化学行为。在所研究的p h 值范围 内，克拉霉素分别产生p l ，p 2 ，p 3 ，p 4 四个还原峰，其中p i ，p 2 ，p 4 三个峰 均为其药效活性基团c 9 位羰基的还原所产生i l 引。 1 2 2 循环伏安法 循环伏安法是一种常用的电化学研究方法，素有“电化学谱”之称。该 法控制电极电势以不同的速率，随时间以三角波形一次或多次反复扫描，电 势范围是使电极上能交替发生不同的氧化还原反应，并记录电流一电势曲线 【1 4 l 。根据曲线形状可以判断电极反应的可逆程度、中间体、相界吸附或新相 形成的可能性、以及偶联化学反应的性质等。常用来测量电极反应参数，判 断其控制步骤和反应机理，并观察整个电势扫描范围内可发生哪些反应及其 性质如何【”】。对于一个新的电化学体系，首选的研究方法往往就是循环伏安 法，因此在有机药物分析中得到了广泛的应用 1 6 1 8 j 。本法除了使用玻碳电 极外，还可以用铂、金、汞、碳纤维微电极以及化学修饰电极等。冶保献等 i s 研究了抗癌药物冬凌草甲素的电化学性质，建立了一种简单、快速、灵敏 的电化学分析方法并应用于实际样品中冬凌草甲素含量的测定，取得了良好 的结果。此外，循环伏安法也是研究电极表面吸附现象的重要方法。如果循 环伏安曲线呈钟罩型，说明反应物在电极上产生了吸附。已有文献报道用这 种方法对反应物在电极上吸附的可逆和不可逆过程进行了系统的研究，导出 了数学表达式，并从理论上加以诠释l l9 1 。 西南科技大学硕士研究生学位论文第3 页 1 2 3 差分脉冲伏安法 脉冲伏安法是在一线性增加的直流电压上，叠加一频率较低的( f = 1 2 5 h z ) 的脉冲电压，在脉冲电压后期测定其法拉第电流的方法。脉冲伏安法具 有以下特点：( 1 ) 极高的灵敏度，这也是脉冲伏安法最突出的特点。与阳极 溶出法结合起来，脉冲伏安法灵敏度可达1 0 d 1 1 0 。1 2m o l l 一；( 2 ) 很强的 分辨能力。脉冲伏安法可消除大量前放电物质的影响，前放电物质超过被测 物质浓度5 1 0 4 倍时仍可测定，两个波电位相差2 5m v 也可明显分开；( 3 ) 支持电解质的浓度可减小至0 0 2m o l l 。以减小底液的影响。m i c h a l k i e w i c z 【2 0 j 利用差分脉冲伏安法测定了药物制剂中的辅酶q 1 0 ，发现在h a c n a a c 缓冲溶 液中辅酶q 1 0 在玻碳电极上于0 0 2v ( ，s a g a g c i ) 左右产生一灵敏的脉冲伏 安峰，检出限可达1 4 1 0 一t o o l l ，从而建立了一种简单、快速、灵敏的 电化学分析方法。 1 3有机药物分子与d n a 相互作用的研究 药物分子的药理作用涉及的是药物小分子对生物大分子特定部位的识 别和专一性切割作用，从而对整个大分子构象产生一定的影响【4 儿2 l j 。因而， 合理、高效的药物分子设计的基础就是建立在分子识别尤其对生物大分子识 别的分析理论上。众所周知，生命信息传递的物质基础是脱氧核糖核酸 d n a t 2 2 1 ，除了少数r n a 病毒，d n a 几乎是所有生命遗传信息的携带者，具 有储存和传递信息的功能。因此，d n a 分子的破坏势必造成生命过程的障 碍。 自从1 9 5 3 年w a t s o n 提出d n a 的双螺旋结构模型【2 引，从分子水平上阐 述了生命遗传物质通过d n a 的半保留体制机理，有关生物基本遗传物质 d n a 的研究也就成为分子生物学、生物化学及电化学的重要课题，其覆盖 面之广、进展之迅速，远超出其它领域的研究【2 4 27 1 。其中，d n a 与其它小 分子尤其是药物分子的相互作用一直是一个比较活跃的研究领域。而这些领 域的发展使人们能够从基因水平上理解某些疾病的发病机理，并通过分子设 计来寻找有效的治疗药物1 2 引。电化学法和光谱法等多种研究技术的有机结合 对于深刻理解d n a 与药物分子相互作用的机理具有重要意义。 1 3 1药物分子与d n a 相互作用的模式 药物分子与核酸结合的部位是核酸的碱基、磷酸骨架和戊糖环。核酸平 西南科技大学硕士研究生学位论文第4 页 行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条有核苷酸形成的大沟、小沟 组成了药物分子识别的位点。药物分子与核酸相互作用结合方式有非共价结 合、共价结合和剪切作用4 】【2 9 1 。 1 3 1 1 非共价结合模式 非共价结合分为静电结合、沟槽结合和嵌插结合三种模式( 如图1 1 所 示) 【3 们。( 1 ) 静电结合：一般认为表面结合的药物分子作用于d n a 双螺旋 结构的外壁，无选择性；( 2 ) 沟槽结合：是指药物分子与d n a 大沟或小沟 的碱基对边缘直接作用；( 3 ) 嵌插结合：是指具有一定平面性的药物分子嵌 入到d n a 分子的双螺旋结构中，与d n a 的碱基对发生作用。 1 静电结台 2 沟结合3 1 良插结合 图1 1药物分子与d n a 的结合方式 f i g 卜l t h eb i n d i n gm o d eo ft h ep h a r m a c e u t i c a lm o l e c u l e sa n dd n a 这三种基本作用方式中，静电结合无选择性，沟槽结合和嵌插结合有选 择性。药物分子与d n a 相互作用时，可以同时存在一种或几种基本作用方式。 另外还有氢键、离子键、范德华力、疏水键这些弱作用键。各作用力问相互 依赖，静电吸引会诱导和强化嵌插和氢键作用，静电结合没有选择性，作用 于磷酸骨架。 1 3 1 2 共价结合模式 与d n a 共价结合的有亲核试剂和亲电试剂。其中亲电试剂则表现为d n a 的链内交联、链间交联等。共价结合的序列识别能力比非共价结合要强得多。 分子与特定碱基作用并形成加合物，使d n a 的双链解旋且产生弯曲【3 0 1 3 1 l 。 西南科技大学硕士研究生学位论文第5 页 1 3 1 3 剪切作用 剪切作用是指具有特殊识别功能的药物分子不但特异性选择结合位点， 而且最终使d n a 断裂。而d n a 断裂在d n a 修复、转录及突变中是很重要的 生物学过程。具有剪切作用的分子断裂d n a 的位点是由其与d n a 结合的选 择性决定的。目前常见的d n a 断裂剂有抗生素类如博莱霉素1 3 2 1 、水溶性金 属卟啉类化合物【3 3 】等。 1 3 2 药物分子与d n a 相互作用的作用力本质及影响因素 药物分子与d n a 相互作用的上述几种模式都是通过一定的作用力来体 现的，其中包括库仑力、共价键合和矛拥互作用、疏水作用、氢键和范德 华力【3 3 】 3 4 】。库仑力主要存在于静电结合模式以及沟槽结合模式中，共价键 合主要存在于沟槽结合的相互作用模式中，矛嘲互作用主要存在于嵌插结 合模式中，疏水作用主要存在于嵌插结合模式中，氢键等分子间作用力主要 存在于沟槽结合模式中，范德华力主要存在于沟槽结合模式中。 影响药物分子与d n a 相互作用的因素很多，如分子的结构，分子的形状、 大小、柔性等。即使缓冲溶液相同，当浓度不同、p h 值不同时，药物分子与 d n a 结合的方式也有可能不同 3 5 3 8 。 1 3 3常用的研究方法 由于药物分子与d n a 作用模式的多样性，以及药物分子种类的广泛性和 d n a 结构的复杂性，需要人们借助一些先进的分析测试手段，与原有的常规 生化分析技术相结合，从而建立一系列快速、灵敏、有效的方法体系。药物 分子与d n a 相互作用的研究方法通常有电化学分析方法、光谱法和生物学方 法等【3 9 4 8 1 。 1 3 3 1药物分子与d n a 的相互作用电化学行为 近年来，在药物分子与d n a 相互作用的研究中，电化学研究起着巨大的 作用，这是由于生物体系是一个充满电解质溶液的体系，具有药理活性的多 种药物在生物体内进行的一系列复杂过程多与其所具有的氧化还原特性及 电子转移行为相关【1 3 】 4 9 5 3 】。因此，将电化学手段应用在药物分子与d n a 相 互作用机理的研究上具有重要的意义。 电化学分析方法研究溶液中药物分子与d n a 相互作用是基于d n a 分子 存在与否时体系伏安特性的差异【5 4 6 0 1 ，包括由于嵌插反应引起的体系式电 西南科技大学硕士研究生学位论文第6 页 位的移动和当药物分子与d n a 分子结合后扩散系数大幅度的下降而导致扩 散电流的减小等，并由此通过非线性拟合可得到一些相互作用的热力学和动 力学参数，如结合位点、结合常数、结合自由能、相互作用模式、相互作用 性质的转变过程及结合离解速率常数等信息【6 1 6 5 1 。b a r d 等( 6 6 1 通过对一些电 活性分子与d n a 之间相互作用模式对电活性分子的伏安行为的影响，从 n e r n s t 方程出发，阐明当电活性分子的式电位正移时，电活性分子与d n a 的 作用模式为嵌插结合，当式电位负移时，两者的作用为静电作用。k a n g 等【6 7 1 采用伏安法并结合紫外可见吸收光谱法研究了桑黄素与小牛胸腺d n a ( c t d n a ) 的相互作用。随着体系中c t d n a 的加入，桑黄素的氧化峰电 流变小，式电位正移，表明桑黄素与c t d n a 之间的作用方式为嵌插作用， 即药物分子的平面构型部分嵌入到d n a 分子的双螺旋结构中，与d n a 碱基 对发生作用。除此之外，研究药物分子与d n a 相互作用的另外一种经典方法 是d n a 修饰电极，即用d n a 修饰裸电极，然后将其放入含有药物分子的溶 液中进行电化学扫描，从而研究药物分子与d n a 的相互作用，能得到良好的 结果。t i a n 等【6 8 】采用循环伏安法、差分脉冲法和紫外可见光谱方法研究了黄 连素在d n a 修饰玻碳电极上的电化学及光谱学行为。电化学研究表明黄连素 与d n a 之间的作用方式为静电作用，紫外光谱研究结果与电化学研究结果相 吻合。 在研究药物分子与d n a 的相互作用中，虽然电化学方法在一定程度上受 分子电活性的限, i j t 6 9 1 ，但对于一些吸收光谱比较弱或与d n a 作用前后光谱 无明显变化，而无法用紫外可见、荧光等光谱方法来研究的分子，却有可能 用电化学分析方法来进行研究【7 叫 t h 。因此，电化学研究可以得到药物分子 与d n a 相互作用的宏观信息。 1 3 3 2 药物分子与d n a 相互作用的光谱效应 已有许多谱学技术被应用于药物分子与d n a 相互作用的研究。药物分 子与d n a 相互作用后，其结构和化学性质会发生变化，根据这些结构和性 质的改变可以判断它们之间的作用方式，进而阐述其作用机理。常用的光谱 学研究方法有紫外可见吸收光谱法、荧光光谱法、表面增强拉曼散射光谱等 【8 0 s 2 1 【8 8 1 9 9 1 。 ( 1 ) 紫外可见吸收光谱法 紫外可见吸收光谱法是研究药物分子与d n a 相互作用的最方便，最经典 的方法。含有碱基生色团的双螺旋结构d n a 分子，其紫外可见吸收光谱在2 6 0 西南科技大学硕士研究生学位论文第7 页 n m 附近有一强的吸收峰，且某些药物分子亦有吸收谱带。可根据相互作用 前后药物分子或d n a 的吸收谱带的变化对二者相互作用模式进行判断。根据 l o n g 等i 7 2 j 提出的判据，当药物分子与d n a 发生嵌插作用时，药物分子的：轨 道和d n a 碱基石轨道相互耦合，最大吸收峰发生红移或蓝移【7 3 7 5 1 ，且存在减 色或增色效应【7 6 7 9 1 ：当药物分子与d n a 发生静电作用时，峰位置不变，只 有强度改变 s o j 【引】。席小莉等【8 2 j 应用循环伏安法和紫外可见吸收光谱法研究 了表柔比星及表柔比星c u 2 + 体系与d n a 的相互作用。结果发现，在p h7 4 时表柔比星与c u 2 + 形成稳定体系。加入d n a 后表柔比星c u 2 + 体系的紫外吸 收光谱明显降低并伴有一定程度的蓝移，表明表柔比星及表柔比星c u 2 + 体 系与d n a 之间均为嵌插作用。l i n 等【8 3 1 采用伏安法并结合紫外可见吸收光谱 法研究了芦荟大黄素与鲱鱼精d n a ( h s d n a ) 的相互作用，当体系中存在 h s d n a 时，紫外可见吸收光谱图中最大吸收峰发生红移并伴有一定程度的 减色效应，表明芦荟大黄素与h s d n a 之间为嵌插作用，这与电化学方法得 出的结果相吻合。 ( 2 ) 荧光光谱法 荧光光谱法灵敏度高、选择性好、操作方便，在研究药物分子与d n a 相互作用的过程中有非常广泛的应用。根据相互作用前后荧光强度的变化， 对二者的作用模式进行判断【s 4 1 。对于自身荧光较弱的某些药物分子来说，当 与d n a 发生嵌插作用时，荧光猝灭受到抑制，配合物的荧光强度增强【8 5 j 【8 ； 而对于自身无荧光特性的某些药物分子来说，可借助荧光探针诸如溴化乙 锭、丫啶橙、二氨基丫啶等对药物与d n a 的作用模式进行判断【8 7 嵋9 1 ，荧光 探针技术还可以用来测定药物与d n a 相互作用的强度。通过药物与d n a 相互作用，使d n a 与探针键合的程度减小，反映在探针荧光光谱的改变， 从而可以了解药物与d n a 的作用机理并且获得热力学和动力学的数据。胡 亚敏等【9 0 j 以吖啶橙( a o ) 作荧光探针在b r 缓冲溶液中研究了核黄素与鲱 鱼精d n a ( h s d n a ) 的相互作用。在p h 值为7 2 5 时，随着核黄素中d n a 的加入，d n a 对核黄素在5 2 4n m 处具有明显的猝灭效应，在波长4 9 3n m 处出现了等荧光强度点，表明核黄素与d n a 发生作用生成了复合物，同时 通过粘度法、盐效应和s c a t c h a r d 法等研究了核黄素与d n a 的作用方式，确 定了在该实验条件下核黄素与鲱鱼精d n a 之间主要为沟槽和静电作用方 式。z h o u 等p l j 采用高效液相色谱质谱法分析测定了金银花中生物活性成分 芦丁、忍冬苷和槲皮素的含量，并结合荧光光谱法以吖啶橙( a o ) 为荧光 探针，研究了这三种黄酮类药物与小牛胸腺d n a ( c t d n a ) 的相互作用， 西南科技大学硕士研究生学位论文第8 页 实验结果表明这些黄酮类药物与d n a 之间作用模式为沟槽作用方式。在应 用荧光探针时，还可以用s c a t e h a r d 方程【9 2 l 来判断结合方式。s c a t c h a r d 方程 的具体表达式见式( 1 1 ) ： r c = k ( n r )( 1 1 ) 式中：r 为每个核苷酸结合药物的分子数；c 为药物的游离浓度；n 为每 个核苷酸上的成键位点数；k 为单个位点固有的结合常数。实验中通常以r c 对r 作图来判断药物分子与d n a 的结合方式。 药物分子与d n a 相互作用后荧光偏振的变化情况是判断药物分子是否 与d n a 发生嵌插作用的又一标准。如果发生嵌插作用，药物分子的转动受阻， 荧光偏振会变大，而非嵌插作用不会引起荧光偏振的增大1 3 0 1 。 ( 3 ) 表面增强拉曼散射光谱 表面增强拉曼散射光谱【9 3 】是一种敏感的技术，且具有较高的指纹印迹能 力。因此，表面增强拉曼散射光谱已被用作一种研究药物分子与d n a 相互作 用的有效手段。分析相互作用前后不同基团振动谱带的变化，可判断药物分 子与d n a 相互作用的位点【9 4 l 【9 5 1 。 除了上述三种常见的方法外，圆二色谱、线二色谱、质谱、x 射线晶体 衍射、核磁共振光谱等方法也是研究药物分子与d n a 相互作用较常用的方法 【9 3 】【9 6 _ 9 9 1 。由此可根据药物分子与d n a 相互作用引起的光谱效应，对药物分 子与d n a 的相互作用模式进行判断。 1 3 3 3 生物学方法 凝胶电泳法是生物学中用来研究药物分子与d n a 相互作用的最基本的 方法【1 0 0 1 1 0 h ，它可以获得药物分子与d n a 结合的热力学、动力学数据以及 药物分子与d n a 的精确结合位点【1 0 2 1 1 0 3 。f i e l 等【1 0 4 认为嵌插作用可导致药 物分子d n a 复合物电泳迁移率明显降低，而仅仅静电作用不会对迁移率产 生大的影响，据此可初步判断药物分子是否与d n a 发生了嵌插作用。 1 3 3 4 其它方法 黏度测定也是检验药物分子与d n a 是否以嵌插方式结合的有效方法【1 0 5 】 1 0 6 】。当药物分子以嵌插模式与d n a 作用时，d n a 相邻碱基对的距离会变大 导致d n a 双螺旋伸长，d n a 溶液的黏度增加；当以静电、沟槽结合等模式 与d n a 作用时，d n a 的黏度不会发生明显变化；当以部分嵌插模式与d n a 作用时，则可能使d n a 双螺旋发生扭结，使其黏度减小。 西南科技大学硕士研究生学位论文第9 页 综上所述，研究药物分子与d n a 的相互作用涉及化学、生物学多种技术 手段。但一般而言，单独的一种技术所提供的信息量有限，因此多种技术的 联合运用是非常必要的，可以为研究药物分子与d n a 相互作用的方式及其机 理提供更加可靠的理论依据。 1 3 4展望 多年来，人们对药物分子与d n a 相互作用的研究取得了一定的理论和实 际应用成果，但也还存在着许多亟待解决的问题。例如，继续寻找能够与d n a 相互作用的药物，采用多种方法和分析测试手段进行研究，从而获得药物分 子与d n a 相互作用的结合方式、结合位点数以及反应的热力学和动力学数 据，进一步研究药物分子与d n a 相互作用的机理，从而为指导新药的合成及 体外筛选提供一定的理论依据：继续完善有关d n a 修饰电极的研究，除了研 究其对基因的检测，还应将其应用于d n a 与外源分子间的相互作用研究；同 时进一步加强电化学d n a 传感器的研究，主要是传感器的稳定性、重现性、 灵敏度等还有待于提高。这些问题不仅仅是电化学理论中比较重要的问题， 无疑已成为生物电化学中非常有生命力的前沿领域。随着各种研究角度的不 断深入和先进的分析手段的不断优化，生物电化学研究必将达到新的阶段。 1 4 本论文的研究内容 本论文采用多种电化学方法研究了新橙皮苷二氢查尔酮、尼莫地平、阿 魏酸乙酯、咖啡酸乙酯、新橙皮苷五种有机药物分子在玻碳电极上的电化学 行为并建立了定量测定方法，进一步探讨了阿魏酸乙酯、咖啡酸乙酯、新橙 皮苷与d n a 相互作用的模式和机理。该研究对于发展有机药物分析的新方 法、了解药物在生物体内与d n a 相互作用的机理、丰富电化学的研究内容有 重要意义，并可为生物医学研究提供依据。全文主要内容如下： 本章主要综述了近年来有机药物分子的电化学行为及其与d n a 相互作 用的研究进展。 在第二章和第三章中，主要研究了新橙皮昔二氢查尔酮和尼莫地平在玻 碳电极上的电化学行为，探索了电极反应机理并建立了定量测定方法。结果 表明：新橙皮苷二氢查尔酮和尼莫地平在玻碳电极上的电化学行为均受表面 过程控制，是一个两电子转移、两质子参与的电化学过程。 结合多种电化学方法和分析测试手段研究有机药物分子与d n a 相互作 西南科技大学硕士研究生学位论文第10 页 用机理已成为生物电化学的研究热点。在第四章和第五章中，采用循环伏安 法、差分脉冲伏安法并结合紫外吸收光谱法研究了阿魏酸乙酯和新橙皮苷在 玻碳电极上的电化学行为，探讨了两种药物与小牛胸腺d n a ( c t - d n a ) 相 互作用的机理。实验结果表明：阿魏酸乙酯与c t - d n a 之间存在静电作用。 通过计算引入c t - d n a 前后的电化学参数( a 和以) ，推测阿魏酸乙酯与 c t - d n a 作用形成了一种非电活性的超分子化合物。新橙皮苷与c t d n a 之 间也存在静电作用，通过计算可得新橙皮苷与c t - d n a 作用的结合比和结合 常数分别为3 和2 2 1 0 1 6 ，表明一个c t - d n a 分子可结合3 个新橙皮苷分子。 紫外吸收光谱法测定结果与电化学方法测定结果相吻合。 在第六章中考察了咖啡酸乙酯的电化学行为及其与鲱鱼精d n a ( h s d n a ) 相互作用的模式。实验结果表明：咖啡酸乙酯与h s d n a 之间 的作用方式为静电作用。通过计算引入h s d n a 前后的电化学参数( a 和k ) ， 推测咖啡酸乙酯与h s d n a 作用形成了一种非电活性的超分子化合物，其结 合比和结合常数分别为2 和9 8 1 0 6 ，表明一个h s d n a 分子可结合2 个咖啡 酸乙酯分子。并结合紫外吸收光谱法对电化学方法所得结论加以验证。 西南科技大学硕士研究生学位论文第11 页 2 新橙皮苷二氢查尔酮的电化学性质及电分析方洳开究 2 1 前言 新橙皮苷二氢查尔酮( n e o h e s p e r i d i nd i h y d r o c h a l c o n e ，n d h c ) 是从天 然柑、橘等植物中提取经氧化而成的二氢查尔酮类衍生物，早在1 9 6 3 年 h o r o w i t z 用柑桔类果皮为原料制成甜度极高的甜味剂【1 0 7 l 1 0 s 1 ，其有效成分就 是二氢查尔酮类衍生物。新橙皮苷二氢查尔酮( 结构式如图2 1 所示) 作为 二氢查尔酮类衍生物中的一种具有抗氧化作用 1 0 9 】和较高的甜度，无毒性、 低热量【1 1 0 1 ，对治疗糖尿病有一定的疗效【1 1 1 】【1 12 1 。 h ，h l r = 1 l ； o h c h 2 0 h 图2 1新橙皮苷二氢查尔酮的结构式 f i g 2 l t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fn e o h e s p e r i d i nd h y d r o c h a l c o n e 近年来，对新橙皮苷二氢查尔酮的研究主要集中在其合成3 1 、药理活 性【1 1 4 】 1 i s l 以及高效液相色谱分析【1 1 6 】 1 1 7 等方面。而关于新橙皮苷二氢查尔 酮电化学行为的研究尚未见报道。众所周知，具有药理活性的多种药物在生 物体内进行的一系列复杂过程多与其所具有的氧化还原特性及电子转移行 为相关。因此，将电化学手段应用在药物分子氧化还原机理的研究上具有重 要的意义。 本文采用循环伏安法和线性扫描伏安法在醋酸醋酸钠缓冲溶液中研究 了玻碳电极上新橙皮苷二氢查尔酮的电化学行为。结果表明，新橙皮苷二氢 查尔酮的电化学过程伴随着质子的参与，表现出良好的可逆性，其电子转移 数和质子参与数为2 。新橙皮苷二氢查尔酮的还原峰峰电流与其浓度在2 8 1 0 。1m o l l 。1 至3 1 1 0 m o l l 。1 范围内呈现出良好的线性关系，检出限为 1 1 1 0 7m 0 1 l 。 西南科技大学硕士研究生学位论文第12 页 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与试剂 c h i7 6 0 c 型电化学工作站( c hi n s t r u m e n t s ，u s a ) ；三电极系统：以玻 碳电极( g c e ，西3m m ) 为工作电极，饱和甘汞电极( s c e ) 为参比电极， 铂片电极作对电极；d p s 3 2 a 型酸度计( 成都方舟科技开发公司) ； b p l 2 1 s a t o r i s 型电子天平( 德国赛多利斯集团) ；k q 2 2 0 0 e 型超声清洗仪( 昆 山市超声仪器有限公司) ：s h 3 型磁力搅拌器( 北京金紫光科技发展有限公 司) 。 新橙皮苷二氢查尔酮( c 2 8 h 3 6 0 1 5 ，西南科技大学生命科学与工程学院提 供) 储备溶液：5 7 1 0 t o o l l 。1 乙醇水溶液( 乙醇与水体积比为4 ：1 ) ； 其余试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。 2 2 2实验方法