（基础兽医学专业论文）暹罗鳄（crocodylus+siamensis）组织细胞中抗菌活性物质的提取与效果研究.pdf

摘要 暹罗鳄( c b 咖觑ss 缸肌绷s 豇) 组织细胞中抗菌活性物质的提 取与效果研究 邹黎黎 专业：基础兽医学 指导老师：罗永煌教授李安兴教授 摘要 生物源性抗菌活性物质在生物体免疫机制中发挥着重要的作用，它们的分离鉴定和功能 研究也是近年来新一代抗菌剂研发的热点。鳄鱼作为爬行动物的代表，具有生命力旺盛，抗 感染力强的特点。虽然科学家已经对种类繁多的爬行动物进行了生物源性抗菌活性物质的研 究，但是对于鳄鱼的相关研究却鲜见报道。本文针对此研究空白，在提取得到暹罗鳄外周血、 肠道、肝脏、脾脏和肾脏组织细胞抗菌活性物质的基础上，对组织细胞提取物的体外抗菌活 性以及外周血白细胞提取物在小鼠体内抗海豚链球菌感染的效果进行了初步探讨，进而研究 了外周血白细胞提取物的部分理化特性。本论文包括4 个部分： 1 、暹罗鳄组织细胞抗菌活性物质的提取及组织分布 本实验采用改良乙酸提取法、硫酸铵提取法及丙酮甲醛混合液提取法分别从成年暹罗鳄的 外周血、肠道、肝脏、脾脏和肾脏组织中提取抗菌活性物质，初步对比了3 种提取方法的提 取效率以及抗菌活性物质的组织分布。结果显示：改良乙酸法从暹罗鳄各组织细胞中提取 的物质的其抗菌作用要强于( 或等于) 硫酸铵提取法；而丙酮甲醛混合液法没有提取到相应的抗 菌活性物质。其中，改良乙酸法提取外周血得到抗菌活性物质的效率最高，在提取物蛋白浓 度为o 2 6 5g n l l 时抑菌圈直径能达到9 1m m 。肠道、外周血和肝脏提取物的抗菌效果明显， 而脾脏和肾脏组织的提取物未表现出抗菌活性。由此可见，抗菌物质在肠道、外周血以及肝 脏组织中含量较多，在脾脏和肾脏中没有抗菌成分或者含量较少。 2 、遏罗鳄外周血白细胞提取物的体外抗菌效果 本实验用改良乙酸法提取成年暹罗鳄外周血白细胞的抗菌活性物质，测定其对1 0 种细菌 西南大学硕士学位论文 的体外抗菌活性。结果表明遏罗鳄外周血白细胞提取物对埃希氏大肠杆菌c 胁c j i l 绷r 瑚胁c d 、 海豚链球菌m f i d c c 船加细力、多杀性巴斯德菌( 胁舰比妇朋纵聊d f ，o p 豫) 、温和气单胞菌 研删嗍鲫邯s d 6 ，f 口) 、金黄色葡萄球菌( 锄p 砀，l 船，c c 淞口堋毋岱) 、嗜水气单胞菌似e r d 小佣口s l i l 幻p 矾肠) 、副溶血弧菌( 矽硒，如p 口，口j i l 册d 纱咖淞) 、溶藻弧菌( 助，幻口j ：咖d 缈耙淞) 、创伤弧菌 ( 弘z 6 ，面跏 7 钯船) 、霍乱弧菌( p 硒，幻c j i i d 伽d 等1 0 种细菌均有一定的抗菌效力；其中，对海豚 链球菌的抗菌效力最强，抑菌圈达2 2 1n 蚰；对大肠杆菌的抗菌效力次之，抑菌圈达2 1 7m m ： 对霍乱弧菌的抗菌效力较弱，抑菌圈为7i 姗。此外，还比较了暹罗鳄外周血白细胞和密西西 比红耳龟、花田鸡外周血白细胞提取物的抗菌效力的强弱，发现前者对于实验所用1 0 种细菌 的抗菌效力明显强于后两者：其中，对链球菌的抗菌效力，暹罗鳄外周血白细胞提取物最强， 抑菌圈达2 1 3 舢，密西西比红耳龟外周血白细胞提取物次之，抑菌圈为5 3m m ，花田鸡白 细胞提取物最弱，抑菌圈为0 6 7 衄。 3 、遏罗鳄外周血白细胞提取物抗海豚链球菌感染效果 本实验通过改良乙酸提取法从成年暹罗鳄外厨血白细胞中获得提取物，并将此提取物以3 种不同的方式注射小鼠，测定其在小鼠体内抗御海豚链球菌感染的效果。实验结果表明，海 豚链球菌以腹腔注射感染小鼠，小鼠表现出明显病理症状，用不同浓度( 2 2 1 0 、2 2 1 、 2 2 1 0 1 “酣t l l ) 的提取物腹腔注射小鼠，可使小鼠分别获得7 7 8 、5 5 6 、4 4 4 的相对保护 率；海豚链球菌与不同浓度( 2 2 1 0 3 、2 2 1 0 2 、2 2 1 0 1 g ：1 1 l ) 的提取物在体外等体积混合，将 此混合物腹腔注射小鼠，可使小鼠分别获得5 5 6 、8 8 9 、7 7 8 的相对保护率；海豚链球 菌以肌肉注射小鼠左腿，同时以不同浓度( 2 2 1 0 3 、2 2 1 0 2 、2 2 1 0 1 的提取物以肌肉注 射小鼠右腿，可使小鼠分别获得7 7 8 、6 6 7 、4 4 4 的相对保护率。 4 、遏罗鳄外周血白细胞提取物的理化性质 本实验研究了成年暹罗鳄外周血白细胞提取物的部分理化性质及抗菌动力学。理化因子研 究表明，抗菌成分对热稳定、对e d l a 敏感、对氯仿稳定；动力学研究表明：暹罗鳄外周血白 细胞提取物抗菌作用迅速，在其与大肠杆菌作用3l i l i n 内，即表现出明显的抗菌效力( 差异极 显著) 。其中提取物与大肠杆菌作用0m i i l 和lm i i l 时，抗菌效果并没有表现出统计学差异( 差 异不显著) ，但作用2r r l i i l 后，差异极显著。 i i 关键词：暹罗鳄，组织细胞提取物，外周血白细胞提取物，抗菌活性，海豚链球菌 a b s t r a c t t h ei s o l a t i o na n da n t i b a c t e r i a la c t i v i 锣o ft i s s u ea n dc e n e x t r a c t si i r o ma c r o c o d i l e ：c ，j 切c 口而窟玎s 5 渤j p 刀s 豇 m 萄o r ：b a s i cv e t e r i n a 巧m e d i c i n e n a m e ：l i 1 iz o u s u p e r v i s o r ：p r o y ，o n g - h u a n gl u o p r o fa n x i n gl i a b s t r a c t i i ld e c a d e s ，a n t i b a c t e r i a lc o n 叩0 n e n t ，w h i c hp l a y s 锄i l n p o r t a i l tr o l ei ni 伽m u 他s y s t e 册，i sg e n i n g m o 咒a j l dm o r ea t t e n t i o no fs c i e n t i s t s a sar 印r e s e n t a t i o no fr 印t i l e ，c r o c o d i l ei sc h a r a c t e r e dw i t l l s 仃o n gl i v a b i l i t ya n dg r e a tr e s i s t a i l c ea g a i n ti n f e c t i o n u pt on o w o n l yl i t t l er e s e a r c h e sa b o u t a n t i b a c t e n a lc o m p o n e n t so fc r o c o d i l e sh a v eb e 锄r e p o n e d ，a l m o u g l ls 0 m es t u d yo nt h a to fag r e a t v a d e t yo fr e p t i l ew e r ec 硎e do u t h lp r e s e n tt i l e s i s ，s e v e r a im e t h o d sb yw h i c ha n t i b a c t e r i a l c o m p o n e n sw e r ee x t m c t e df b mt i l eb l o o d ，i n t e s t i n e ，1 i v e r s p l e e n 锄dk i d n e yo fs i 锄e s ec c o d i l e ( c ，d c d 咖协妣l 所e 淞括) ，柚t i b a c t 喇a le 腩c to f l e 麟妇c t s ，e s l ，e c i a l l ym ee 位c to fe x 妇c t s 缸胁 p e r i p h e r a lb l o o dl e u k o c y t e sa g a i n s tv 撕e t i e so fp a 吐1 0 9 e i l i cb a c t e r i u m s ，f o re x 锄叩l e 鼬印f d c c 淞 加砌pt i l a ti n f e c t e di nk 1 哪【1 1 i n gm t s ，舔w e n 船t l l ep h y s i c a l 姐dc h e i i l i c a lp r o p e n i e so f 觚t i b a c t e r i a l c o m p o n e n t sw e r ed e s c r i b e d t h i sn l e s i si n c l u d e sf o u rp a n s 勰f o l l o w s ： 1 i s o l a t i o na n dd i s t r i b u t i o no f a n t i b a c t e r i a lc o m p o n e n t sf r o mi ，口c d 遁i 堰i 坶s z 固腑e h s 妇 a n t j b a c t e r i a lc o m p o n e n t sw e r ee x t m c t e d 丘o mv 鲥e dt i s s u e so fc 丸盼优匀p ，如& 口册臼 括b yt l l l 优 m e t l l o d s ：t 1 1 em o d i 6 e dc h 3 c o o h 眦m o d ，( n h 4 ) 2 s 0 4m e t l l 咄锄dt l l ec h 3 c o c h 3 + h c h o m e t l l o dr e s p e c t i v e l y ，锄dn l e i ra n t i b a c t e r i a le f f e c t sw e r ec o r 印a r e d d i s t r i b u t i o no f 觚t i b a c t e r i a l c o m p o n e n t s i nc m c o d i l et i s s u e sw e r e 锄a l y s i e db y d e t e c t i i l g 吐l e i r a n t i b a c t e r i a le f f c c t s t h e c o m p 蚰e n t se x 仃a c t e d b y 龇m o d i f i e dc h 3 c o o h 眦m o dp f e s e n t e d h i 曲e r 锄t i b t e f i a la c l i 啊t y t 1 1 a nn l a t b y ( n h 4 ) 2 s 0 4m e t l l o d w i 廿l9 1 m m ， n o 锄t i b t e r i a la c t i v i t yi ne x 仃t sb y c h 3 c o c h 3 + h c h om e t l l o dw 觞d c t c c t c d o ft h 托em e t l l o d s ，忙m o d i f i e dc h 3 c o o hm e t l l o d s h o w e dm eh i g h e s te m c i e n c yt 0e x n 秕t 柚t i b 北t e i a lc o i n p o 鹏鹏丘1 0 mt i s 蛐e so fc m c o d i l e 姐d “妇t s 筋mp 硎p h e 同b 1 0 0 dl e u l ( 0 c 妒b y 吐i i sm e t 1 0 dp 陀s 明t e d9 1 舢o fa i l t i b a c t e r i a lc i r c l ei l l n i 西南大学硕士学位论文 d i 锄e t c rb yp r o t e i nc o n c e n h 锄i o no fo 2 5 6m g n l l t h ee x 缸c t s 舶mi i l t e s t i l l e s ，l i v e 娼姐dp e p h e m l b 1 0 0 dl e u k o c y t e ss h o w e dh i g l l 锄t i b a c t c r i a la c h v i t yw i t l l16 2 珊【l l 8 5 姗i i l 9 1m mo f 孤t i b t c r i a l c i r c l ei nd i 锄e t 盯b y3 2 4 2 ，2 9 7 3 ，o 2 6 5m g m le x p e c t i v e l y ，w l l i l e a n t i b 孔t e n a l 扯t i v i t yw e 聆 d e t e c t e di i le x 仃a c t sf o ms p l e e na n dk i d 舱y t h e r e s u l t sp v e dt l l a tt l l e 锄t i b t e 嗽lc o f n p i d n e n t s o fs i 锄1 e s ec r o c o d i l ee x i s tm a i n l yi i it l l e i ri l l t e s 血e s ，l i v e r s 孤l dp 盯i p t l m lb 1 0 0 dl e u k o c y t e s 2 t h ea n t 洳a c t e r i a la c t i v 姆o f 幽ec 知叩咖加s 研砌l 删s 豇a n 曲a c t e r i a ic o m p o n e n t si nv i t m h u k o c y t e sw e r ei s o l a t e 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防治感染性疾病成为现代医药界的迫切任务。 与此同时，生物源性抗菌活性物质渐渐走入研究者们的视野。生物源性抗菌活性物质广 泛存在于动植物细胞和体液中，包括：抗菌肽、溶菌酶、补体、c 反应蛋白( c r p ) 、凝集素( 1 e c t i n ) 等。抗菌肽( 锄t i b a c t e r i a lp e p “d e s ) 是现代生物技术最活跃的研究内容之一，是一类在自然界，“ 泛分布，具有抗微生物作用及其他多种功能的小分子多肽，因其独特的生物活性以及不同于 传统抗生素的特殊作用机理，已引起人们极大的研究兴趣。传统抗生素，是通过消除微生物 生长或生存的作用，如阻挠细菌蛋白质的合成或者改变酶的活性来达到杀菌目的，而细菌通 过改变一种基因就足以对付抗生素的这种攻击。抗菌肽却是作用于细菌细胞膜，导致膜的通 透性增大，以此穿透、杀灭细菌，细菌必须改变膜的结构，即改变相当部分的基因才能防御 抗菌肽的进攻，而这几乎是不可能的。因此，抗菌肽极大的降低了细菌产生耐药的可能性。 近年来，国内外不少学者都在研究爬行动物的药用价值，并在它们体内发现了具有强生理活 性的生物源性成分。如陈东风等( 2 0 0 6 ) 报道，益肾龟板能促进脊髓损伤移植m s c s 存活和分 化为神经元；李熙灿等( 2 0 0 7 ) 报道，龟板醇提物对大鼠m s c s 氧化损伤具有明显修复作用， 这些研究都为利用爬行动物研制新药展示了广阔的前景。我国现有爬行动物2 1 科、1 0 5 属、 3 1 5 种，其中药用种数占3 7 ，暹罗鳄作为一种古老的爬行动物，具有长寿及极强的抵御外 界感染的特点，生命力相当旺盛，因而具有突出的研究价值。 尽管生物源性抗菌活性物质具有很多优点，但它们在动物体内表达分泌的量是十分有限 的，加上现代饲养业日益集约化的养殖趋势，增大了病原传播和入侵的可能性，使得饲养动 物很难依靠自身表达的有限抗菌活性物质来达到理想的保护作用。若能利用具有极强生命力 的爬行动物体内的生物源性抗菌活性物质制备新型抗菌剂，则有望保证饲养动物在受到病原 菌入侵或遭受应激反应时的机体健康。本研究在提取得到暹罗鳄组织细胞抗菌活性物质的基 础上，对其体内外抗菌活性效力及理化性质进行了研究，以期为高值化开发利用来源于暹罗 鳄的生物源性抗菌活性物质奠定理论基础。 第一章文献综述 第一章文献综述 生物源性抗菌活性物质广泛存在于动植物细胞和体液中，包括：抗菌肽、溶菌酶、 c 反应蛋白、凝集素等。迄今国内外对多种动物如昆虫、蛙类、鱼类等动物进行了广泛 深入的研究，相继分离和分析了数千种不同类型的抗菌活性物质，如林栖蛙的皮肤中的 一种称为d e 咖弱e p i i ll 的抗菌肽，它是由3 4 个氨基酸残基组成的阳离子亲水脂多肽，对不 同的致病微生物( 包括细菌、酵母、原生动物和丝状真菌) 都表现出抑制活性【i 】；s h a h a b u d d i i l 等( 1 9 9 3 ) 【2 】研究发现，昆虫抗菌肽能对卵囊期和子孢子期的疟原虫造成明显损伤：赵红霞 等( 2 0 0 3 ) 【3 1 发现，一种人工合成的天蚕素一蜂毒素杂合体对莱什曼原鞭毛虫表现出损伤作 用。 由基因编码、核糖体合成的抗菌肽( 卸t i b a c t 喇a lp e p t i d e ，a b p ) ，是一种广泛分布于微 生物、高等植物、昆虫、两栖爬行类、鸟类、哺乳动物、人体内的具有抑制和杀灭病原 微生物活性的多肽或小分子蛋白质，是生物先天免疫的重要组成部分【4 】。大多数抗菌肽对 革兰氏阳性菌有较强的杀灭作用，有的类型则对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有活性， 有的抗菌肽具有抗病毒活性，有的抗菌肽能够对部分真菌、原虫和病毒产生明显的杀伤 作用，还有的能影响精子的呼吸甚至具有杀灭精子的活性。世界上第一个被发现的抗菌 肽是瑞典科学家b o m 锄等( 1 9 7 5 ) 【5 l 用阴沟杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的天蚕 素( c e c r 0 0 p i n s ) ，此后，科学家们又相继从不同动、植物分离获得多种类似性质的活性多 肽，并根据结构和功能的不同将其分别命名为杀菌肽( c e c r 0 0 p i n s ) 、防御素( d e f e n s i n s ) 、 蛙皮素( m a g a i l l i 憾) 和蜂毒素( m e l e t t i n ) 等。近年来，对抗菌肽的研究越来越受到人们的重 视：一方面在分子水平上研究抗菌肽在动物免疫防御系统中的精细合成过程及调控机制； 另一方面，探讨抗菌肽的药用开发价值，努力使之成为继青霉素等传统抗生素之后的又 一类重要的新型抗菌药物。 抗菌肽的特征 性质方面：绝大多数的抗菌肽是由2 0 5 0 个氨基酸残基组成的小肽，分子质量多为 2 5 3 0l ：几乎所有的抗菌肽都是阳离子型，等电点大于7 ；无论是a 螺旋还是b 一折 叠，都具有两亲结构；抗菌肽对热稳定，许多抗菌肽在l o o 加热l om i l l 还能保持一 定的活力；抗菌肽对较大的离子强度或较高的p h 都有较强的抗性，部分抗菌肽还有抵御 胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力；此外，抗菌肽还具有水溶性好、无抗药性等特点【6 】。 3 西南大学硕士学位论文 结构方面：大多数抗菌肽为碱性多肽，n 端有多聚腺苷酸残基，c 端均酞胺化，第2 位 氨基酸多为色氨酸( t r 叻，具两亲性结构，分子量一般为4k d 左右。抗菌肽有许多保守序 列，在n 端易形成a 螺旋，中间部分易形成b 折叠或铰链。a 螺旋是一个近乎完美的水 脂两亲结构，即圆柱形分子的纵轴一边为带正电荷的亲水区，对称面为疏水区，这种两亲 结构是抗菌肽具有抗菌活性的核心结构。q 螺旋肽主要包括天蚕素、爪蟾抗菌肽( m a g a i l l i n ) 等；b 折叠肽主要包括哺乳动物防御素、植物防御素、昆虫防御素和富含脯氨酸的抗菌肽 等f 7 1 。 2 抗菌肽的分类 迄今为止，从不同生物体内诱导获得的抗菌肽已有2 0 0 多种，仅从昆虫体内分离得到 的就有1 7 0 余种。根据来源不同可把抗菌肽分为8 大类：哺乳动物抗菌肽、两栖动物抗菌 肽( 主要为皮肤抗菌肽) 、水生动物抗菌肽、昆虫抗菌肽、植物抗菌肽、原索动物抗菌肽、 鸟类抗菌肽、原核生物抗菌肽。 2 1 哺乳动物抗菌肽 哺乳动物抗菌肽主要存在于嗜中性粒细胞、皮肽和粘膜的上皮细胞，如牛的b 防御素 是d i 撇n d 等首次在气管黏膜上皮细胞中发现的短肽，命名为t a p ，后来又在牛的粒性白细 胞中发现了1 3 种与t a p 序列高度同源的b 防御素，在牛的舌、气管、牙槽巨噬细胞及小 肠细胞中还发现了另外2 种防御素l a p 和e b d 。另外，首先从猪肠道分离得到的猪抗菌肽 p r 3 9 【钔，后来在嗜中性粒细胞中也有发现【9 1 。此外，在鼠、羊、鸡和火鸡中也有大量的b 防御素分布，如b a 而a r a 等( 1 9 9 9 ) 【i o 】从羊的白细胞中提取到的抗菌肽s m a p 2 9 ，具有抗真菌 作用。哺乳动物抗菌肽基因的表达发生在正在分化的嗜中性白细胞、巨噬细胞和上皮细胞 中，健康组织上皮细胞中抗菌肽的基因表达水平较低，然而在蛋白炎症因子、脂多糖( l p s ) 或细菌等刺激因子的作用下，抗菌肽的含量升高。目前，对哺乳动物抗菌肽基因表达的调 控途径和机制还不清楚，但有研究发现，在昆虫抗菌肽基因表达调控中起重要作用的一些 蛋白质，在哺乳动物也发现其对应物，但还不清楚这些蛋白质是否对哺乳动物有同样或相 似的调控作用。 根据其共同特征，哺乳动物抗菌肽可分d e f e m i 璐和c a m e c i l i d i 璐两大主要家族。其中 d e f e i 塔i i l s 含3 4 对二硫键，包括a 防御素、b 防御素和o 防御素：c a l e c i l i d i i l s 则是一组 结构不同的抗菌肽，只存在于哺乳动物中，因其前肽区域与猪巯基蛋白酶抑制剂c a t l l e l i n 相 似而命名为c 抽e c i l i d i 璐。它们的氨基酸肽链中5 0 以上的氨基酸是疏水的，这有利于抗菌 4 第一章文献综述 肽与细菌细胞膜相互作用。根据其结构特征，哺乳动物抗菌肽可被分为4 类，即b 折叠型， 如：a 防御素、8 防御素、猪p t e g 血等：q 螺旋型，如猪c e c r o p i l lp 1 等；富含一种或两 种氨基酸的伸展结构型( 线性) ，如牛b s 、猪p r 3 9 等；环状结构型，如牛b t e n c c i r 等。 2 2 两栖类抗菌肽 两栖类动物皮肤光滑、裸露，没有鳞片、甲壳和毛发的保护，但能分泌具有良好保护 作用的皮肤粘液，其中含有大量分子结构特殊、功能复杂多样的抗菌活性物质，主要包括 蛋白多肽类和小分子有机物【l i 】。蛋白多肽类主要包括小分子多肽、大分子多肽和抗菌肽【1 2 】， 小分子有机物包括生物胺、生物碱与甾类化合物【3 l ，尤其是生物胺和多肽的种类及数最特 别丰富【1 4 1 。皮肤分泌液中的活性生物胺可分为3 大类：吲哚乙酞胺类，咪唑胺和相关的 组胺以及酪胺，儿茶酚胺类【15 1 。生物碱的分布较为有限，除蝾螈碱外，其他主要分布于 南美和澳洲的两栖类动物。甾类化合物有蟾毒配基和蟾蜍毒素2 种，主要分布于蟾蜍属p l 咖) 两栖类动物，这类动物广布于世界各地【m 】。 两栖类皮肤抗菌多肽从结构上可以简单地被分为2 大类，一类为线性a 螺旋多肽，它 们不含二硫键，如来源于非洲爪蟾的m a g a i n i n s ( g i g 吧h s a 口g k a f v g e i m n s ) ， q 一 螺旋是其二级结构的主要成分；另一类是环性肽，含有分子内二硫键，如来源于日本林蛙 的j 印0 1 1 i c i n ( f f p l g v f c f k t c ) 1 ，其分子中含有由l 对半胱氨酸组成的二硫键。绝大多数 抗菌肽都是由单个多肽链组成，但最近从叶水蛙( 肋，d m p d 埘口如砌c 细) 得到的抗菌肽 d i s t i n c t i n ( 链l ：e n r e v p p g f t a l i k t l r j ( c k l l ；链2 ：n l v s g l i e a r k y l e q l h r k i ，k n c k v ) 却是由分子间二硫键连接而形成的异源双体。大部分两栖类抗菌多肽在正常p h 环境下带净 的正电荷，因为它们的分子结构中含有多个赖氨酸或者精氨酸。最近我们从中国大蹼铃蟾 的皮肤中得到一类由基因编码的阴离子抗菌肽m a ) 【i i l l i nh ( i l g p 正l ，v s d t l d 2 d 正i l n h 2 ) 【1 引，由于其分子结构中含有多个天冬氨酸而使整个分 子在正常p h 环境下带净的负电荷，这是第一次发现的由基因编码的带净的负电荷的抗菌 肽。最短的抗菌多肽是从虎纹蛙，l 口f 瑶y r 加口) 的皮肤中发现的t i g e r i i l i i ll ( f c t m i p i p r c y n h 2 ) ，仅由1 1 个氨基酸残基组成9 j 。c a e 咖l 家族是从几种树蛙皮肤上分 离得到的具有广谱抗菌活性的一组抗菌肽，它们的结构和功能被研究得较为清楚。c r i nl 家族的多肽均发生了翻译后的修饰，即多肽的羧基端都已酰胺化。c 椭1 1 的核磁共振 ( n m r ) 显示出2 个螺旋，第1 个螺旋是从第2 位的l 到第l l 位的k ，第2 个是从第1 7 位的v 到第 2 4 位的h 。连接这两个螺旋的是一段多变的绞合区，其中第1 5 位的p r o 残基直接导致了在肽 的中间区域不能形成螺旋【2 0 1 。在c a e 血l 家族中，肽链上的2 个p r 0 残基是活性必须的，如 果其中1 个或者2 个的p m 被g 替代，都将直接导致多肽活性的下降。此外，无论从n 端或c 端 降解2 个氨基酸残基都会导致c 咖l 家族抗菌活性的丧失【2 m 2 1 。如树蛙的皮肤分泌物中含 5 西南大学硕士学位论文 有一种内肽酶，能将其分泌的c a e 咖1 6 和c 咖1 7 从n 端开始切去2 个氨基酸残基，从而 使之丧失抗菌活性【2 3 1 。 2 3 水生动物抗菌肽 水生动物的抗菌肽大部分属于小分子肽，种类繁多，结构和组成也复杂多样。从来源 划分，可以分为水生甲壳动物抗菌肽和鱼类抗菌肽2 大类。 2 3 1 水生甲壳动物抗菌肽 水生甲壳动物主要是甲壳纲的虾、蟹和鲎等。s c 咖等( 1 9 9 6 ) 【2 4 l 从青园蟹( 砌厂c 砌螂 m 口删口s ) 的血细胞中分离到3 种具有杀菌作用的肽，其序列与b a c t e l l e c i l l 7 高度一致：从 ”研加p d 6 p e 脚“s ) 体上分离到有7 9 个氨基酸残基的肽，具有杀菌作用，分子结构类似于 兔和牛的血球防御素；罗氏沼虾似a 伽6 朋幽f “，l ，- p ，1 6 p ，g “) 受感染或受伤后体内也会产生 类似杀菌肽的物质；南美白对虾( n 刀口p 淞m ，l n 口m e f ) 的抗菌肽p e l l a e u d i i l s 是目前研究得比较 清楚的，d e s t o u n l i e u x 等( 1 9 9 7 ) 【2 5 1 从养殖的南美白对虾的血细胞和血浆中分离出3 种抗菌肽 类，分别命名为p e n 1 、p e n 2 和p e n 3 。p a e u d i n s 具有与几丁质结合的特性，免疫学研究证 实受感染后的免疫反应发生在角质层，抗菌活性主要是抗真菌和革兰阳性细菌f 2 6 1 。当受到 外界刺激时，p e n u d i l l s 被释放入血液，通过血液循环与全身的几丁质结合，覆盖身体甲壳， 起到保护全身的作用2 7 1 。p e n a e u d i n s 与大多数抗菌肽一样，分子结构中有较多的阳离子，n 端富含脯氨酸，c 端由3 个分子内二硫键来维持稳定。其他几种甲壳类抗菌肽也具有与 p e m e u d i i l s 相似的性质。 2 3 2 鱼类抗菌肽 鱼类抗菌肽的数目和种类繁多，同一种鱼在体内不同组织可能产生不同的抗菌肽；在 不同鱼类，其分子结构和作用机制差异比较大。比较已有的鱼类抗菌肽氨基酸序列，相互 之间的同源性并不大，但结构上具有一定共性，如带正电，含有较多精氨酸、赖氨酸和疏 水氨基酸，可折叠成a 螺旋等。依据不同的蛋白质序列组成和结构特点，可以把它们简单 分成4 种类型。 第l 类不含半胱氮酸，可以折叠成疏水或双亲性a 螺旋结构。这一类抗菌肽主要是 p 卸d 戡i i l 和m i s g u i n 。p 妇i n 是从豹鳎( p 口，妇c 触粥聊口册d 阳行船) 体表黏液分离到的抗菌肽， 由3 7 个氨基酸残基组成【2 引。经测定，p 础x i n 的抗菌肽活性比蜂毒素更强，对人红血球的 溶血活性更低。电镜观察显示其溶血机制是溶解细菌的细胞壁，并不形成离子通道：m i s g i l i i l 是从泥鳅( f 西秽朋淞口恻妇e 口“出f 淞) 上分离得到的2 1 个残基的抗菌肽口9 】，具有较强的体外 广谱抗菌活性且没有明显的溶血作用，其抗菌活性是蛙皮素的2 6 倍。此外，来源于虹鳟 6 第一章文献综述 血清的s a l i i l o c i d i i l 、美洲黄盖鲽皮肤粘液的p l e u r o c i d i n 等也属于这一类【3 0 l 。 第2 类含有多个半胱氨酸，可以折叠成b 结构。来源于虹鳟的h 印c i d i i l ，6 1 个氨基酸残 基组成的肽链结构中含有6 个半胱氨酸；c o l o n 等( 1 9 9 6 ) 3 1 1 从海七鳃鳗m 彻力朋口，加淞) 的皮肤上分离到富含半胱氨酸和精氨酸的抗菌多肽，其1 9 个氨基酸残基中也含有6 个半胱氨 酸。 第3 类抗菌肽的分子结构与组蛋白高度相似，因而被称为组蛋白样蛋白( h i s t o n e 1 i k e p t c i 璐，h l p ) ，包括从鲶c p 口，娜f 胁，螂珊d f l l d 受伤上皮黏膜分泌的抗菌肽p a m s i ni 【3 2 j ，其氨基 酸序列与组蛋白h 2 a 的n 端完全一致。p a r 舔i ni 具有厂“谱抗菌活性，无溶血作用，抗菌活性 是蛙皮素的1 2 1 0 0 倍。从斑鲴皮肤中也分离得到了3 种h l p 【3 3 】，其分子结构与h l 和h 2 b 非 常相似；从鲑鱼肝脏中分离到的抗菌s a m ( 勋砌d 口甩f 砌f c 厂d 6 妇，卿删童) ，实际上就是组蛋白 h 。【3 4 】。 第4 类是具有糖基化修饰的抗菌肽，包括从鲤鱼体表黏液分离到的m 。为2 70 0 0 的疏水蛋 白，以及从虹鳟、丁鲷及鳗鲡皮肤黏液中分离到的抗菌蛋白等3 5 1 。 2 4 昆虫抗菌肽 昆虫虽没有完善的免疫防御体系，但却有高效的细胞免疫系统。昆虫主要采用细胞和 体液两种免疫机制，大量研究表明抗菌肽是昆虫免疫防御系统的重要成分，它是昆虫免疫 后血淋巴产生的一类小分子抗菌多肽，当昆虫受到外界抗原刺激( 如病原微生物的入侵) 时 就会迅速地诱导合成抗菌肽，这些抗菌肽具有对革兰氏阴性菌和阳性菌的广谱抗菌活性， 大多带正电荷。目前为止，昆虫上已经鉴别了超过1 7 0 种这样的抗菌肽。虽然这些抗菌肽 表现出结构的多样性，但也存在着明显的共同结构模式，它们通常可以被分为4 类：天 蚕素( c e c d 叩i n ) ：昆虫防御素( i n s e c td e f e 雌i 1 1 ) ；富含脯氨酸或( 和) 氨基乙酸抗菌肽 ( p r o l i i l e 一 c hp e p t i d e s ) ；富含甘氨酸的抗菌肽( g l y c i n e f i c hp e p t i d e s ) p 6 l 。 天蚕素是最早被发现的抗菌肽，它对革兰氏阳性菌和阴性菌都有较高的抗性。b o m a n 等( 1 9 8 0 ) 【3 7 1 首次分离到纯的天蚕素a 和b 。翌年，b o m 锄又与b e l l l l i c h 等人合作测定了天蚕素 a 和b 的一级结构，随后在柞蚕肉蝇、烟草天蛾中都发现了天蚕素或类