（有机化学专业论文）面包酵母催化芳香酮不对称还原反应研究.pdf

中文摘要 具有光学活性的芳香醇类化合物对映体通常被用来作为有机合成的手性砌 块和药物合成的中间体，成为新药研究的热点和方向。生物催化还原因其温和的 反应条件和高度的立体选择性，成为合成手性芳香醇最重要的方法之一。 实验以面包酵母完整细胞作为生物催化剂，研究苯乙酮，苯丙酮，4 一氯苯乙 酮，4 一羟基苯乙酮，4 一硝基苯乙酮等潜手性芳香酮不对称还原反应。 以苯乙酮( a c p ) 为模型底物研究水相体系中酵母细胞催化芳香酮不对称还原 反应的特性，考察了反应温度、底物浓度、酵母浓度、反应时间、反应体系的 p h 、辅助底物及浓度等多个因素对反应产物的产率及e e 值的影响情况，确定了 最佳反应条件：反应温度3 0 ，底物浓度为0 1 5 m o l l ，酵母浓度为1 7 0 9 l ，反 应时间3 0 小时，反应体系的p h 值为7 ，辅助底物葡萄糖浓度1 0 9 l ；在此条件 下，底物苯乙酮的转化率为8 2 ，产物( s ) 0 【苯乙醇的e e 值为9 3 8 。 面包酵母在水相体系中催化苯乙酮还原生成的产物以( s ) 0 t 苯乙醇为主，产 物的立体选择性较高，利用p r e l o g 规则解析这一现象并探索面包酵母不对称还原 苯乙酮的机理。 合成得到4 一羟基苯乙酮和4 一硝基苯乙酮两种芳香酮类化合物，产品经i r ， g c - m s ，h p l c 分析，含量在9 9 以上。 利用面包酵母细胞催化不同结构的芳香酮类化合物一苯丙酮，4 一氯苯乙酮， 4 一羟基苯乙酮，4 一硝基苯乙酮不对称还原相应的手性醇，发现产物的立体选择性 受到与羰基相连的两个基团体积和与苯环相连基团电子效应的共同作用：两个基 团的体积差异越大，产物的立体选择性就越高，反之亦然；苯环上连接吸电子基 团提高产物的立体选择性，供电子基团降低产物的立体选择性。产率只与同羰基 相连基团体积大小有关，基团体积增大就会降低反应产率。 关键词：面包酵母芳香酮不对称还原p r e l o g 规则 a b s t r a c t t h ea r o m a t i ca l c o h o lw i n lo p t i c a l l ya c t i v ea r eu s u a l l yu s e da st h ek e yc h i r a lb u i l d i n gb l o c k s i no r g a n i cs y n t h e s i sa n di n t e r m e d i a t ef o rd r u gp r o d u c t i o n , s ot og e tt h i sc h a r i a la l c o h o lb e c o m e o n eo ft h eh o tf i e l d sa n dp r o s p e r o u sd i r e c t i o n so fn e wd r u gi n t e r n a t i o n a l l y b i o t r a n s f o r m a t i o n b e c o m eo n eo ft h em o s ti m p o r t a n tm e t h o d si na s y m m e t r i cs y n t h e s i sb e c a u s eo fm i l dr e a c t i o n c o n d i t i o na n dh i g hs t e r e o - s e l e c t i v i t y i nt h i st h e s i s ，t h eb a k e r sy e a s t ( w h o l ec e l l ) m e d i a t e da s y m m e t r i cr e d u c t i o no fa c t o p h e n o n e ， p r o p i o p h e n o n ea n do t h e rp r o c h i r a la r o m a t i ck e t o n e sa r es t u d i e d t h ea s y m m e t r i cr e d u c t i o no fa r o m a t i ck e t o n e sb yy e a s tc e l l s i na q u e o u sp h a s ew a s i n v e s t i g a t e dw h e na c t o p h e n o n e ( a c p ) w a sc h o s e na st h em o d e ls u b s t r a t e ，t h ee f f e c t so fr e a c t i o n t e m p e r a t u r e ，a c pc o n c e n t r a t i o n ，c e l la m o u n t ，r e a c t i o nt i m e ，p hv a l u e ，c o s u b s t r a t ea n dg l u c o s e c o n c e n t r a t i o no nb o n lt h ey i e l da n dt h ee n a n t i o s e l e c t i v i t yo fa s y m m e t r i cr e d u c t i o no fa c et h e r e s u l t ss h o w dt h eo p t i m a lc o n d i t i o nw a sr e a c t i o nt e m p e r a t u r e3 0 c ，s u b s t r a t ea c p0 15 m o l e ， b r a k e r sy e a s t17 0 9 l ，r e a c t i o nt i m e3 0 h ，p h 7 ，g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n10 9 l ，u n d e rt h ec o n d i t i o n ， t h ey i e l da n de eo f1 - p h e n y l e t h a n o la r e8 2 a n d9 3 8 t h em a j o rp r o d u c t i o no f a s y m m e t r i cr e d u c t i o no f a c pb yb a k e r sy e a s ti s ( s ) 一i - p h e n y l e t h a n o l ， h a sh i g hs t e r e o - s e l e c t i v i t y ( 9 3 8 ) ，u s et h ep r e l o gr u l et oe x p l a i nt h i se x p e r i m e n t a lp h e n o m e n a a n d t r yt of i n dt h em e c h a n i s ma n dc h a r a c t e ro f t h i sk i n do f r e a c t i o n s s y n t h e s e s4 - h y d r o x y a c e t o p h e n o n ea n d4 - n i t r o a c e t o p h e n o n e ，t h ep r o d u c t i o n sa r ec h a r a c t e r i z e d b yi r , g c m s ，h p l c ，a n dt h ec o n t e n ti sg r e a t e rt h a n9 9p e r c e n t t h ea s y m m e t r i cr e a c t i o n so fa r o m a t i ck e t o n e sw i t hd i f f e r e n ts t r u c t u r eb yy e a s tc e l l si na q u e o u s p h a s ea r ea l s os t u d i e d , t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h ee n a n t i o m e r i ce x c e s sv a l u ei se f f e c t e db yt h e s i z ed i f f e r e n c eo ft h ec o n t a c t e dw i t hc a r b o n y lg r o u pa n dt h ee l e c t r o n i ce f f e c to ft h ec o n t a c t e dw i t h b e n z e n er i n gg r o u p ，e ev a l u ei se n h a n c e dw h e nt h es i z ed i f f e r e n c ei n c r e a s e so re l e c t r o n a c c e p t i n g g r o u p sc o n t a c tw i t hb e n z e n er i n g ，a n dv i c ev e r s a t h ey i e l di so n l ye f f e c t e db yt h ev o l u m eo f t h e c o n t a c tw i t hc a r b o n y lg r o u p ，t h ey i e l dd e c r e a s e dw h e nt h es i z eo fg r o u pi n c r e a s e d k e yw o r d s ：b a k e r sy e a s t ，a r o m a t i ck e t o n e ，a s y m m e t r i cr e d u c t i o n ，p r e l o gr u l e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤注盘茔或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：血蓬堡签字日期：秒厂年衫月班日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤盗盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨盗盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：二幺逮型 导师签名： 签字日期：少口7 年【7 铝o g - e t i 材国謦 签字目期：2 幻7 年多月。日 天津大学学位论文 第一章 1 1 手性的发现及概念 第一章绪论 手，陛( c h i r a l i t y ) - - 词源于希腊词“手”( c h e i r ) ，指左手与右手的差异特征。立体 化学中，手性是指一个物体与其镜像不能叠合的特性，不能与其镜像叠合的分子 叫手性分子【。 1 8 1 1 年，法国物理学家阿瑞洛( a r a g o ) 在研究石英的光学性质时发现天然石 英有两种晶体，一种使偏振光左旋，称之为“左旋石英”；另一种能使偏振光右 旋，称为“右旋石英”。这两种石英不具有任何对称性，两者互为实物与镜像的 关系，互相不能重叠。 1 8 1 5 年，法国物理学家拜奥特( b i o t ) 观察到蔗糖水溶液、酒石酸水溶液、松 节油的酒精溶液、樟脑的酒精溶液等液体和溶液都具有偏转旋光的作用，而且旋 光性与其存在的状态无关，他推测这种现象与物质组成的不对称性有关。 1 8 4 8 年，法国科学家巴斯德( l p a s t e u r ) 提出光活性是由于分子的不对称性所 引起的，并且他用放大镜和镊子挑出了酒石酸钠铵的两种结晶晶体，发现其中一 种晶体能使偏振光右旋，另一种能使偏振光左旋，这两种晶体等浓度的水溶液， 旋光度相等，方向相反。 1 8 6 3 年，德国有机化学家韦斯立森努斯( w i s l i c e n u s ) 对乳酸进行了一系列研 究，发现肌肉乳酸( + ) 和发酵乳酸( ) 有着相同的化学组成，但却具有相反的旋光 方向。因此，他断言如果分子在结构上相同，而性质不同的话，这种差别只能认 为是由原子在空问的不同排布所引起的。 1 8 7 4 年，范霍夫( v o n th o f f ) 和勒贝( l e b e l ) 分别提出了碳四面体学说，提出 了不对称碳原子的概念，并且预言某些分子，如丙二烯型分子，即使没有不对称 碳原子，也应有旋光异构体存在。 互为原像与镜像的手性分子称为对映异构体( e n a n t i o m e r ) ，对映异构体的绝 大多数物理性质都相同，如熔点、沸点、比重、折光率、在一般溶剂中的溶解度 以及光谱图等；与非手性试剂作用时，表现出的化学性质也一样；手性分子在立 体结构上的差异，在物理性质上主要表现为使平面偏振光的旋转方向不同【2 1 。 天津大学学位论文第一章 1 2 手性在医药领域的重要性 虽然在与非手性试剂作用时表现出完全相同的物理化学性质，对映异构体在 不对称环境中，则表现出完全不同的物化性质。自然界中构成生命体的基础物质 核苷酸、氨基酸和单糖以及由它们构成的生物大分子核酸、蛋白质和糖类都具有 独特的手性特征。许多物理、化学、生物功能的产生都起源于分子手征性的精确 识别和严格匹配，例如酶催化的高度化学、区域和立体选择性作用，手性药物的 手性对其生物应答关系等，所以分子手性识别在生命活动中起着极为重要的作用 p j 。手性直接关系到药物的药理作用、临床效果、毒副作用、药效发挥及药效时 间等。正是由于药物和其受体之间的这种立体选择性作用，使得药物的一对对映 异构体不论是在作用性质还是作用强度上都会有差别。但是，这一差异性并没有 引起人们足够的重视，直到2 0 世纪6 0 年代发生在欧洲的“沙利度胺( t h a l i d o m i d e ) 悲剧”：外消旋的沙利度胺作为针对早期妊辰期有效的镇静剂和止吐剂加以使 用，不幸的是，许多服用过该药的孕妇产下畸形婴儿，后来的研究表明：( r ) 构 型才真正起镇静作用，而( s ) 构型则有强致畸作用。其它一些手性药物的另一异 构体表现不良作用的例子也很多1 4 ，5 j ，如下表： 表1 - 1 两种异构体具有不同活性的外消旋手性药物 t a b l el - 1t w oi s o m e r sw i t hd i f f e r e n ta c t i v i t yo fm c e m i cc h i r a ld r u g s 药物名称 有效异构体 不良异构体 d o p a( s ) 异构体，冶疗帕金森症( r ) 异构体，严重副作用 k e t a m i n e ( s ) 一异构体，麻醉剂( r ) 异构体，致幺j 药 p e n i c i l l a m i n e ( s ) 异构体，治疗关节炎( r ) 异构体，突变剂 e t h a m b u t o l ( s ，s ) - 异构体，治结核病( t l r ) 异构体，致盲 乙胺丁醇 ( s ，s ) 一构型，抗结核菌，活性2 0 0 x ( rr ) 构型，导致失明 r r p r o p r a n o l o l( s ) - 构型，b 一受体阻断剂，活性1 0 0 ( r ) 构型，影响或抑制性欲 xr 作用 氯霉素 ( r ，r ) 一构型：抗菌，活性5 0 、一1 0 0 x ( s ，s ) 构型：抗菌活性低 s s k e t o p r o f e n( s ) - 构型：抗炎 ( r ) 构型：防治牙周病 鉴于以上理由，美国食品药物管理局于1 9 9 2 年发布了手性药物指导原则【6 1 ， 2 天津大学学位论文 第章 新规定要求，所有在美国上市的消旋体类新药生产者均需提供报告，说明新药中 所含的对映体各自的药理作用、毒性和临床效果。 同手性药物类似，许多杀虫剂、杀菌剂、除草剂和作物调节剂等也具有手性， 且某些对映异构体只有一个具有所希望的生物活性，如具有两个手性中心，四个 立体异构体为两对对映异构体的杀虫剂a s a n a ，只有一个立体异构体为强杀虫剂， 其它三个都对作物具有毒性【7 】。 此外，手性化合物在香精香料【8 1 、手性聚合物【9 】、手性液晶等高档材料中 也有着广泛的应用。 因此，有选择地生成光学异构体，或是分离出单一的左旋或右旋对映异构体， 对于医药、农药及精细化工产品等诸多领域都具有重要意义。2 0 0 1 年诺贝尔化 学奖就颁给在不对称催化方面做出了卓越贡献的美国和日本学者，这也从另一个 方面说明手性技术正引起全世界的重视。 1 3 得到手性化合物的方法 目前获得手性化合物的方法主要有：手性源合成法、外消旋拆分法和不对称 合成法。 1 3 1 手性源合成法 手性源合成法是以天然的手性化合物即来源于动物和植物的碳水化合物、氨 基酸、脂类、菇类和生物碱为原料，经过构型保持或构型转化等化学反应，合成 新的手性化合物1 1 】。手性源法的关键在于获得制备所需对映体的手性原料，即“手 性源”( c h i r a lp 0 0 1 ) 。一方面天然手性物质品种和数量有限，难以满足实际的需 求，另一方面利用天然手性物质衍生出所需的手性化合物反应的步骤多，难度大。 这些不利因素制约了手性源法制备手性化合物的进一步发展。 1 3 2 外消旋拆分法 手性化合物的拆分是给外消旋混合物制造了一个不对称的环境，使两个对映 异构体能够分离开来的手性拆分技术，分为物理拆分、化学拆分和生物拆分。 1 3 2 1 物理拆分 物理拆分法主要是指消旋化合物通过利用物理手段，如晶体机械分离，直接 结晶、色谱，手性膜等使外消旋化合物得以拆分的方法。 3 天津大学学位论文 第一章 早在1 8 5 8 年，法国科学家巴斯德( p a s t e u r ) 借助放大镜，用镊子成功地分 离了酒石酸铵盐的两种对映异构体的晶体。晶体机械分离拆分法要求生成的晶体 较大，在外观上能直接辨别。但是符合这些要求的例子很少，且操作过程烦琐、 效率低下，能够实际应用的对象十分有限。结晶法工业生产上已采用这种方法大 规模由丙烯睛制备l 谷氨酸实际应用过程中，利用优先结晶的特点进行循环往 复的结晶分离，目前工业生产中可以用这种方法拆分抗生素氯霉素的中间体和抗 高血压药物l 一甲基多巴。虽然这种直接结晶法拆分较方便、经济，但因其应用 范围有限而不能大规模应用。 色谱法利用高效液相色谱的手性固定相来分离光学异构体，拆分纯度最高， 成本也较高，目前主要用于分析与小规模制备。色谱法适用性强，应用范围广， 气相色谱( g c ) 1 1 2 1 和高效液相色谱( h p l c ) 1 1 3 】已成功地用于许多对映体的制 备及纯度测定。但色谱法分离对映异构体受到手性固定相的限制，且气相色谱有 消旋化的作用，只能分离挥发性物质，而高效液相色谱将大量手性试剂加入流动 相中或使用昂贵的特殊固定相，耗费较大，成本也太高。 手性膜法是将具有手性选择能力的载体溶解于一定的液体溶剂之中，通过与 某个对映异构体特异性的结合，将其从上相运输到下相，从而实现手性分离。具 有低能耗、稳定性强、易于连续操作等优点，是大规模进行手性拆分中比较有潜 力的方法之一l l 引，但是支撑液膜的稳定性较差，其工业应用受到很大限制。 1 3 2 2 化学拆分法 化学拆分是利用手性化学试剂把外消旋混合物中的两个对映体转变成非对 映异构体，再利用两种非对映体异构体的物理性质差别将其相互分开。但由于这 些方法存在制备不易、操作复杂、试剂昂贵、光学纯度不高等缺点，难于适应手 性产品制备的技术要求。 1 3 2 3 生物拆分法 生物法拆分是一种比较成熟的生物制备单一对映体的方法。此法利用酶促反 应或微生物转化的高度立体、位点和区域选择性，将化学合成的外消旋衍生物前 体或前手性化合物转化成单一光学异构体。近年来，利用酶的高度立体选择性进 行外消旋体的拆分已成为制备手性药物的重要途径。 除上述几种主要的拆分方法外，还有一些新近发展的拆分技术，如以环糊精 及其衍生物为手性选择剂的高效毛细管电泳法( c e ) 及将毛细管电泳法与色谱 相结合的毛细管胶束电动色谱分离法等。 4 天津大学学位论文第章 1 3 3 不对称合成法 不对称合成是指在手性环境中，由潜手性化合物出发，用化学方法、生物方 法转化为手性产物的方法，包括化学不对称合成和生物不对称合成。 1 3 3 1 化学不对称合成 1 9 6 6 年，野依良治设计了以希夫碱与铜合成的络合物催化剂，进行均相不 对称催化环丙烷化反应，开创了化学不对称催化反应的先河【l5 | 。有机化学中不对 称化学合成方法的出现促进了手性化合物合成工业的快速发展，7 0 年代中期， 美国m o n s a n t o 公司首先采用不对称催化氢化工业生产l 多巴；之后e m e r c k 和 a n i ce n i c h e n 等公司分别用不对称环氧化反应和氢化反应生产抗高血压药物克罗 卡林( c r o m a k a l i m ) ，卡巴青( c a r b a p e n e m ) 及新型甜味剂a s p a r t a n m e 的原料l 苯丙 氨酸；日本的野依良治利用b i n a p r u 络合物不对称催化氢化反应合成了e e 值 高达9 7 的s 萘普生( s n a p r x e n ) ；但不对称化学合成方法通常反应步数较多，要 使用价格昂贵的对映体试剂( 二磷配体与铱、锗络化物等) ，因此给产业化带来 了一定的阻碍l 泊j 。 1 3 3 2 生物不对称合成 生物催化不对称合成是以微生物和酶为催化剂，立体选择控制合成手性化合 物的方法。该方法主要是通过利用氧化还原酶、合成酶、裂解酶、水解酶、羟化 酶、环氧化酶等，直接从前手性化合物不对称合成各种复杂的手性醇、酮、醛、 酯、胺衍生物，以及各种含磷、硫、氮及金属的手性化合物，不需制备消旋化合 物，理论上可将前手性化合物1 0 0 的转化为手性目标产物；具有高区域和立体 选择性，反应条件温和、环境友好等特点。 酶法获得手性化合物的研究和开发已取得长足的进步，但目前能真正用这种 方法制备并用于工业化生产的手性化合物类型不够多，主要原因有：( 1 ) 可以利 用的酶制剂品种有限，自然界中已经发展的酶制剂约2 5 0 0 0 多种，其中只有1 5 0 种得到应用开发，但工业上有用的酶有5 0 6 0 种，而大量制造与应用开发的还只 限于淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶等1 0 多 种，且大部分是水解酶类。( 2 ) 酶比较娇嫩，容易失活。( 3 ) 酶制剂相对较贵， 特别是对氧化还原酶来说，由于其要完全发挥作用需要价格昂贵的辅酶因子参 加，在工业上很不经济。 与酶法相比，微生物法有以下优点：( 1 ) 有利于提高酶的稳定性，延长催化 剂的使用寿命。许多酶特别是胞内酶对外界环境相当敏感，对p h 、温度、底物、 天津大学学位论文 第一一章 产物、离子强度及流体剪切等有较高要求，容易失活。菌体细胞是酶的天然载体， 胞内环境可以增强酶对反应诸因素的适应性从而增加使用的稳定性。( 2 ) 降低生 产成本。微生物是取之不尽的酶源，依靠其增殖培养可以保证酶的充分供给，反 应中甚至可以使用死亡的细胞，只要酶未失活。( 3 ) 菌体细胞的使用可以避免酶 的分离、提取和纯化等繁琐程序从而简化工艺。( 4 ) 对于较复杂的反应，微生物 可利用其体内精巧的酶系进行催化，避免副产物的形成。( 5 ) 相对于需要辅酶方 能起作用的酶而言，由于微生物细胞内含有辅助因子，其优点更为明显。此外菌 体细胞可以减少一些过渡金属元素对酶的失活作用，因此微生物在生物催化的手 性合成中有着重要的用途，以酶或者全细胞直接进行催化，能完成化学法难以或 者无法完成的反应l l7 ，而且以生物法进行催化，高区域和立体选择性，反应条件 温和，对环境友好，符合世纪“绿色化学”的要求，被认为是手性化合物生产取 得突破的关键技术。 与化学法相比，虽然生物催化法的生产效率较低，但是其转化率高，无需高 温、高压、冷冻及强碱或强酸等极端条件，腐蚀性低，污染小，并且具有很好的 化学、区域和立体选择性，可用于制备许多常规化学法不能或不易合成的手性化 合物。目前，该方法已经在治疗帕金森症、高血压、高胆固醇等疾病药物的合成 上。由于微生物全细胞内含有许多立体选择性酶，可用于多种手性化合物的不对 称合成，尤其对于那些要求辅酶( n a d p h ) 参与的氧化还原反应体系，只需要在全 细胞反应体系中添加廉价的糖源就可使辅酶再生，比使用纯酶或粗制酶更经济方 便。 目前，我国对生物催化的不对称合成反应、细胞催化的选择性有机合成反 应、具有独特立体选择性的生物催化反应、组合生物催化反应、新的生物催化剂 的筛选以及基因工程等方面的研究己得到加强。 1 4 面包酵母在手性合成中的应用 酵母作为生物催化中常用的一种微生物，也是世界上研究最多的微生物之 一，是当今生物技术产品研究开发的热点和现代生物技术发展、基因组研究的模 式系统，同时也是生物催化中常用的一种微生物。工业上最常用的酵母属菌种是 面包酵母( b a k e r sy e a s t ，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，其安全不产生有毒产物，生 长快、价廉易得，无需特殊设备，可在普通实验室中进行生物催化反应。体内含 有脱氢酶、酯酶、丙酮酸脱酶及烯醇酸( 酯) 还原酶等多种能催化不对称合成反应 的酶类，催化底物的范围非常广，因而在不对称合成领域具有广泛的应用前景， 受到广泛关注f l 引。与其他酵母相比较而言，面包酵母具有以下优势：首先，从经 6 天津大学学位论文第一章 济角度看，它的价格便宜，全世界年产量稳定在1 0 0 万吨左右，容易培养；其次， 面包酵母含有丰富的酶，目前，酶手册列出的1 6 0 0 多种酶中7 0 0 多种来自于 面包酵母；另外，面包酵母在基因水平上也比较稳定，这在一定程度上保证了生 物催化的相对稳定。 1 4 1 面包酵母的还原反应 面包酵母由于含有脱氢酶、酯酶、丙酮酸脱竣酶、还原酶等多种酶在生物不 对称还原，尤其在催化羰基及活性碳碳双键不对称还原方面的应用广泛，使用全 细胞酵母菌催化，不仅可以省去昂贵的单一酶的分离纯化费用，更重要的是酵母 菌体内含有氧化还原所需的辅助因子及其再生系统，只需廉价的碳源就可以进行 辅酶再生。其中酮羰摹的反应大多数遵循p r e l o g 规则，形成( s ) 型醇，多数长链 酮不能被面包酵母还原，只有长链甲基酮才能被面包酵母催化还原，此外，面包 酵母还可以用于1 3 二酮、q ，1 3 酮酸酯以及带有硝基、氟、硫和杂环等功能基 的酮类化合物的还原i l9 i ，可用面包酵母催化的还原反应的类型列表如下1 2 0 】： 表1 2 面包酵母不对称还原反应的类型 t a b l el - 2d i f f e r e n tr e a c t i o no f a s y m m e t r i cr e d u c t i o nb yb r a k e r sy e a s t 反应的类 反应方程式文献 型 o o h 酮的还原 人么i - 夏 么 2 1 ，2 2 】 1 3 羰基酮 a 1 1 y 州( 3 1 - 1o v f 2 3 ，2 4 】 还原 q 羰基酮 训9 吖- 洲。刚叫。 【2 5 】 还原 b 二酮还 人人吖，久h o 人or 【2 6 】 原 y 二酮还 人吖州- 夫- 【2 7 原 7 天津大学学位论文 第一章 碳碳双键 蟛丫1 y 哆丫。呲 【2 8 】 还原 芳香酮的 砂。刚，o 犬h o h 【2 9 还原 含硫官能 v l 跚与h l o 鼢卧 3 0 】 团酮还原 叠氮基还 扳 【3 1 】 原 由表1 2 可以看出，面包酵母可以应用于多种官能团的不对称反应，催化带 有两个以上羰基化合物时，反应的非对映体选择性与对映体选择性主要由化合物 所带的基团和环的大小决定的，由于空间位阻效应常常还原其中的一个碳基，而 另外一个则保持不变。酵母催化羰基还原反应的效率和立体化学选择要受多种因 素的影响，这些因素包括酵母形式和底物结构等。 选用适合的反应体系，酵母催化还原羰基反应已经成功的将一些含羰基化合 物还原相应的羟基化合物，具有较高的立体选择性等优点，对于手性有机合成具 有十分重要意义。 1 4 2 不同状态的酵母在不对称还原反应中的应用 1 4 2 1 静息细胞的催化 文献报道中比较多的是用静息酵母细胞催化不对称还原反应【3 2 , 3 3 】，其通常的 催化反应方法是细胞在培养基中增殖至一定的生物量后，经离心洗涤、加入底物 和一定量的碳源作为辅助底物后，直接用于不对称还原反应；也有通过商品化的 面包干酵母经过活化以后，再用于催化反应。 静息酵母细胞催化法所使用的酶一般为酵母细胞中组成性表达酶，而非诱导 性表达酶，能够有效控制转化液的组成，以适应底物转换的最佳条件。这类细胞 的催化效果要比发酵得到细胞催化效率要低，但是酵母来源容易，并节省了培养 酵母环节。一般来说，影响静息细胞催化效果的因素有温度、p h 值、底物浓度、 辅助底物的类型和浓度以及细胞浓度。 天津大学学位论文第一章 1 4 2 2 酵母细胞丙酮粉的催化 为了提高催化效果，有报道将静息酵母细胞制作成丙酮粉( a c e t o n ep o w d e r ) 进行反应【3 4 】。经过丙酮脱水及减压干燥，将游离的静息细胞制成粉末状干细胞， 其制备过程比从细胞中提取酶要便利得多，在反应过程中通过添加另外的醇，来 实现d n a + 还原为n a d h ，其反应的收率和e e 值都比静息细胞都有所提高。其 反应如图1 1 所示： n a o t p i ha c e t o n ep o w d er n a d f p 2o l l l k 竹0 图1 - 1 静息细胞丙酮粉还原羰基示意图 f i gl - 1s k e t c ho fr e d u c t i o no fc a r b o n y lg r o u pc a t a l y s e dw i t hr e s t i n gc e l la c e t o n e p o w d e r 1 4 2 3 冻干细胞的催化 f r a n c e s c om o l i n a r i 等人【3 5 】将若干种微生物通过冷冻干燥的方法制备成粉末， 与湿的静息细胞相比，不同的微生物冻干前后的催化性能变化不同，面包酵母在 冻干后的催化性能下降，但使用冻干的粉末，可以便于筛选合适的微生物来催化 特定的底物。 9 天津大学学位论文 第一章 1 4 2 4 生长细胞的催化 生长细胞催化法是在微生物细胞培养前或培养一段时间后，将底物直接加到 微生物生长培养基中，微生物自身繁殖生长的同时对底物进行生物转化。这是生 物转化法中最简单和最常用的一种方法。该法的优点是微生物生物转化容易、效 率高，缺点是分离纯化困难。这种方法特别适合于经过诱变处理的微生物菌种， 它们能将底物作为唯一的碳源，同时还能适应连续化操作过程。马小魁等人f 3 6 】 在酵母的发酵液中直接添加底物进行反应，由于发酵液组成的复杂性，以及所用 模型底物的特殊性，其催化效果并不理想，但通过添加t 3 环糊精的方法，使产 物的得率和酵母的立体选择性得到提高。此种方法可以较久地维持细胞的活性， 但发酵液的难以控制，对于不同的底物，尤其酯酷类物质，会造成不同程度的水 解。 1 4 2 5 固定化酵母催化 固定化细胞催化是利用惰性基质，通过物理或化学法把生物细胞束缚在空间 内，然后用于催化有机化合物的生物转化，从而得到所需产物。固定化物细胞生 物转化法将微生物的生长与它们的生物催化过程相分离。在手性化合物催化合成 方面，利用固定化细胞能够实现酵母细胞在生物转化上的重复或连续使用，而且 固定化细胞容易与反应体系分离，可以简化产物分离工艺，用海藻酸钙包埋和聚 丙烯酰胺固定化酵母细胞是常见的固定化方法。 由于底物在水相中溶解度低，可以采用在有机相中进行反应的方法，这样一 方面保证了底物在有机相中的分散性能，同时也能保证固定化酵母细胞所需的微 水环境：g u 等用p7 j 海藻酸盐固定化酵母，用于有机相己烷中催化还原醒类化合 物，取得了较好的效果。 酵母固定化能减少有机溶剂、底物、金属离子对酵母细胞的毒害作用，k a n d a 等人1 3 8 j 采用共价交联的方法，以海藻酸钠和聚氮从甲酸树脂p u 6 ，形成双包埋， 减少了有机溶剂对酵母的毒害作用，实现了在异辛醇中还原乙酰乙酸甲酯： n a k a m u r a l 3 9 1 海藻酸镁固定化面包酵母还原3 羰基戊酸甲酯，发现在较高的镁离 子浓度下，可以得到较高的收率和立体选择性。 此外，酵母固定化还可以促进反应的立体选择性：b e r t a u 等【4 0 】用聚亚氨醋固 定化面包酵母，在水相中催化q 碳基庚酸乙醋还原得到了s 构型产物，其e e 值 为6 3 ，比游离细胞的3 0 高出3 3 ，而在有机相中应用聚亚氨酷固定化面包 酵母甚至可以得到r 构型的光学异构体。 1 0 天津大学学位论文第一章 1 5 课题提出的意义 手性醇是合成手性药物、农业化学品、香料和液晶等物质的重要中间体，是 一大类有着重要工业潜力的有机化合物，并且一些手性药物或者药物中间体的有 效成分就是手性醇类物质。二十一世纪是手性药物飞速发展的世纪，手性醇合成 方法的成熟与改进对手性药物的合成具有重要的促进作用。因此，手性芳香醇的 不对称合成研究具有极大的商业价值。 光学活性的苯乙醇及其衍生物可用于合成诸多手性药物，如：l 沙丁胺醇， r 肾上腺素，s - 4 二, 得安，s 舒喘宁，s 氟西汀，r 托莫西汀等【4 1 a 2 。前手性取代 苯乙酮的不对称化学催化还原是制备光学活性醇的一个重要方法【4 3 】。但随着矿石 资源不断枯竭、环境污染的日益严重，高效专一、绿色节能的“生物转化”技术 越来越受到重视。 面包酵母作为广泛利用的微生物之一，其细胞内存在着丰富的氧化还原酶， 可催化各种羰基化合物的不对称还原反应【4 4 1 ，并具有高度的立体选择性，而且由 于它价廉易得，因而常用于羰基化合物的不对称还原。化学法中采用的反应体系 一般为有机溶剂，而微生物法采用水相体系，比化学法的成本更低，生物法中， 辅酶和酶的价格昂贵，提纯工艺复杂。面包酵母细胞中含有许多具有立体旋择性 酶和辅酶，直接用面包酵母进行反应有利于还原过程中实现辅酶原位再生，同时 也省略了酶的分离纯化过型4 5 , 4 6 】。而且，面包酵母细胞中还含有一些在胞内具有 催化活力而在胞外极容易失活的酶有利于生物催化的进行：同时，具有生物活性 的细胞在催化过程中只需添加廉价的能源物质就能再生催化不对称还原所必需 的且价格昂贵的辅酶。 本课题将从以下几个方面进行研究： 1 ，利用面包酵母催化芳香酮不对称还原为手性醇，以苯乙酮还原为( s ) q 苯乙 醇为模型体系，考察对水相中面包酵母催化不对称还原反应的产率及立体选 择性的影响因素如反应温度、酵母浓度、体系p h 值、底物浓度、反应时间， 辅助底物及浓度，优化反应条件以得到较好的反应收率和较高的立体选择性； 2 ，建立面包酵母不对称还原苯乙酮反应模型，更进一步了解面包酵母催化不对 称还原的一般特征，为下一步的研究提供基本数据和研究方向； 3 ，合成4 硝基苯乙酮和4 羟基苯乙酮，对产物进行表征； 4 ，利用面包酵母不对称还原不同结构芳香酮类化合物，考察底物结构差异对产 物收率和立体选择性的影响，为实际应用提供参考。 天津大学学位论文第二章 2 1 主要实验试剂 第二章实验药品及实验仪器 表2 1 主要实验试剂 t a b l e2 1t h em a i nc h e m i c a lr e a g e n t s 1 2 天津大学学位论文 第二章 2 2 主要实验仪器 表2 2 主要实验仪器 t a b l e2 2t h em a i ni n s t r u c t i o n sa n de q u i p m e n t s 实验仪器型号产地或生产厂家 托盘天平 电子分析天平 电热鼓风干燥箱 自动平衡微量离心机 磁力加热搅拌器 旋转蒸发仪 熔点测量仪 红外光谱议 气相一质谱仪 气相色谱仪 液相色谱仪 水循环真空泵 恒温培养振荡器 h c t p llb 5 型 北京医用天平厂 a c l 0 0 s 2 型瑞士赛多利斯公司 1 0 1 3 5 型 天津市华北实验仪器有限公司 l d z 4 0 8 型北京医用离心机厂 8 4 3 型 鄄城华鲁电热仪器有限公司 s e n c o r 系列 上海申生科技有限公司 m p 一5 0 0 型 株式会社柳本制作所 a v a t a r3 6 0t h e r m on i c o l e t 美国 t r a c e d s q t h e r m of i n n i g a n 公司 s p - - 2 1 0 0 北京北分瑞利分析仪器( 集团) 有限公司 l c 2 0 a t 型日本岛津 s h 2 3 型郑州杜甫仪器厂 h n i y 系列欧诺仪器仪表有限公司 天津大学学位论文第三章 3 1 前言 第三章面包酵母催化苯乙酮不对称还原 面包酵母细胞中含有丰富的氧化还原酶，被广泛的应用于催化各种羰基化合 物的不对称还原反应，并对该类反应具有高度的立体选择性。酵母细胞在不对称 还原反应中的应用已有许多报道 4 7 , 4 8 , 4 9 , 5 0 】，但主要着重于烷基酮【5 1 , 5 2 1 和乙酰乙酸 酯类化合物 5 3 , 5 4 , 5 5 】的不对称还原，而有关面包酵母用在芳香酮类化台物不对称还 原方面的工作较少。国内化学与生物工作者也报道了将面包酵母用于不对称合成 方面的研究工作【5 6 】。但将其用于催化芳香酮不对称还原的研究还鲜见报划5 7 j 。 实验采用苯乙酮为潜手性芳香酮的模型底物，如图3 - 1 ，考察水相体系中面 包酵母催化苯乙酮不对称还原生成a 苯乙醇反应中影响其产物收率及立体选择 性的因素，得到的最佳反应条件；研究酵母全细胞不对称还原此底物的机理和反 应特征，以期对活性微生物催化此类反应有较全面深入的认识： a c e t o p h e n o n e ( s ) 一q - p h e n y l e t h a n o l ( m a j o r i t y ) + h o ( r ) 一。一p h e n y l e t h a n o i ( m i n o r i t y ) 图3 1 面包酵母还原苯乙酮反应 f i g3 1a s y m m e t r i cr e d u c t i o no fa c e t o p h e n o n e ( a c p lt oq p h e n y l e t h a n o lb yb r a k e r sy e a s t 1 4 天津大学学位论文第三章 3 2 实验部分 3 2 1 面包酵母的活化【5 8 】 在2 5 0 m l 三角瓶中加入蒸馏水1 0 0 m l ，无水葡萄糖7 9 ，硫酸二胺0 2 9 ，磷酸 氢二钠0 1 9 ，硫酸钙o 1 9 ，柠檬酸o 1 9 ，干面包酵母1 5 9 ，盖上纱布，在摇床中 恒温3 0 度( 转速1 2 0 r m i n ) 振荡1 小时，使面包酵母活化。 3 2 2 苯乙酮的还原反应 将苯乙酮加入到面包酵母活化液中，加入具有生理活性的盐调节p h 值，盖 上纱布在摇床中恒温( 转速1 2 0 r m i n ) 振荡反应。反应结束后，加入适量的硅藻 土，离心分离，取上层清液，用无水乙醚( 1 0 m 1 ) 洗固体，将乙醚和上层清液合 并，并用无水乙醚( 2 2 0 m 1 ) 萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥。 3 2 3 分析方法5 9 】 底物苯乙酮及产物( r ) 和( s ) q 苯乙醇的浓度均采用气相色谱仪测定。 色谱条件为：火焰离子化检测器( f i d ) ，柱温使用程序升温，初温8 0 。c 维 持4 m i n ，以1 5 m i n 的速率升至1 5 0 维持3 m i n ，进样气化温度和f i d 检测温 度分别为2 2 0 和2 5 0 ，以氮气作载气，迸样量为0 5 m l 。 苯乙酮，( r ) q 苯乙醇和( s ) q 苯乙醇的保留时间分别为8 8 6 2 ，1 0 3 1 3 和 1 0 。4 6 6 m i n ；采用面积归一法计算含量。 分别以产物的收率( y ) 和对映体过量值( e e ) 表示反应的程度和立体选择 性，其表达式为： y = ( c s + c r ) c o lo o e e = ( c s - c r ) ( c s + c r ) 1 0 0 其中：c o 为底物的初始浓度，c s 和c r 分别为( s ) 型和( r ) 型产物的浓度。 3 2 4 面包酵母催化苯乙酮反应的工艺条件研究 水相体系中，酵母全细胞催化不对称还原苯乙酮的影响因素有很多，较为显 著的有反应温度、苯乙酮的浓度、酵母细胞的浓度、反应时间、反应体系的p h 值、辅助底物及浓度等因素。实验主要考察上述工艺条件对酵母细胞催化还原苯 乙酮为a 一苯乙醇的影响情况： 天津大学学位论文第三章 ( 1 ) 温度