（微生物学专业论文）itk分子在t淋巴细胞活化过程中的作用机制研究.pdf

哪f l i ii i i ii l l 1 i l ti 18 819 4 5 so u t h w es tu n i v e r s i t y i n s t i t u t eo f m i c r o b i o l o g y , c h i n e s e a c a d e m y o fsc i e n c es m a s t e r d e g r e et h e s i s m e c h a n i s m a n a l y s i so f i t km o l e c u l eo nt h e a c t i v a t i o no ft l y m p ho c y t e c a n d i d a t e ：y i n p i n gj i a s u p e r v i s o r ：p r o f y u a n y ip e n g p r o f j i l o n gc h e n d i s c i p l i n e ：m i c r o b i o l o g y d i r e c t i o n ：r e g u l a t i o no fm i c r o b i o l o g ys e c o n d a r ym e t a b o l i s m c h o n g q i n g ，c h i n a m a y , 2 0 1 1 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同 仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 。 学位论文作者：签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 学位论文作者繇、亥银罕 签字日期： 加f ，年z 月吁日 导师签名： 签字日期： ，年i 月f 午日 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 第一部分文献综述1 第一章i t k 分子信号通路的研究进展1 1 i t k 及其基本结构l 2 i t k 、s l p 7 6 及p l c 一7 1 之间的相互作用。2 3 i t k 对t 细胞功能的影响。4 第二章甲型流感病毒的研究进展7 1 流感概述7 2 流感病毒感染对宿主信号通路的影响8 第二部分实验部分1 l 第三章i r k 分子突变影响t 细胞信号通路机制的研究一1 1 引言一1 1 1 材料与方法1 1 1 1 材料1 1 1 2 实验方法1 4 2 结果与分析2 2 2 1 真核表达质粒( i t k 、s l p 7 6 和p l c o , 1 ) 构建2 2 2 2i t k 突变体与s l p 7 6 之间的相互作用2 3 2 3i 伙突变体对p l c - 1 i 磷酸化水平的影响2 5 2 4l d k 突变体与p l c - 7 1 之间的相互作用2 6 2 5i t k 突变体与p l c 吖1 共转染对p l c 吖i 磷酸化的影响一2 7 3 讨 仑2 8 4 本章小结2 9 第四章甲型流感病毒感染对j u r k a t 细胞i t k 信号通路的影响3 1 引言31 1 材料与方法31 1 1 材料31 ? ”、 。? 一一 一i ：，。一 一1 ，”一 ” 1 2 实验方法：3 2 2 结果与分析3 7 2 1 甲型流感病毒可以直接感染j u r k a t 细胞3 7 2 2 甲型流感病毒感染j u r k a t 细胞后影响内源i t k 的分布3 8 2 3 流感病毒感染j u r k a t 细胞影响i 墩下游信号分子p l c - 7 1 的磷酸化水平3 9 2 4 干扰i 墩表达对病毒感染的j u r k a t 细胞p l c 7 1 磷酸化的影响3 9 3 讨论：z 1 1 4 本章小结4 1 参考文献4 3 附录二。5 3 致谢5 7 硕士期间发表论文5 9 摘要 i t k 分子在t 淋巴细胞活化过程中的 作用机制研究 摘要 在免疫细胞信号传导通路中，s r e ，s y k z a p 7 0 和t e e 三个p t k 家族参与了t 细胞活化的信号转导过程。i r k 属于非受体型酪氨酸激酶t e c 家族成员之一，它特 异性地表达于t 细胞系，参与了t 细胞活化的信号转导过程，其酪氨酸磷酸化以 及与其它信号分子s l p 7 6 和p l c - 丫i 之间的相互作用，在t 淋巴细胞信号转导及 细胞活化过程中起着重要的作用。但目前对i 出在t 细胞信号传导中的具体作用机 理还不十分明确。 本论文的研究目的是探索i t k 对t 淋巴细胞信号通路的影响。研究主要是通过 两方面的工作来进行。一方面是通过对i t k 的s h 2 结构域和s h 3 结构域进行定点 突变，以2 9 3 t 细胞为模型，利用免疫共沉淀技术来研究i t k 的突变体是否会影响 i 墩与s l p 7 6 的结合，从而影响i 伙下游p l c 吖l 信号通路；另一方面以j u r k a t 细胞 为研究模型，探讨甲型h 1 n 1 流感病毒感染t 细胞后对i t k 信号通路的影响。 首先，通过免疫共沉淀及免疫印迹实验发现i t k 的七个突变体可以和s l p 7 6 相互作用，其中i r kt 2 7 9 d 、i t kw 2 0 8 k 、i t ky 2 9 2 a 三个突变体会影响i t k 与s l p 7 6 的结合；同时研究结果表明，在没有s l p 7 6 参与的情况下，i r k 突变体也能直接与 p l c - ，、1 相互作用，但是不能削弱敞与p l c - , y l 之间的结合，其中i t k 的四个突变 体t 2 7 9 d 、w 2 0 8 k 、c 2 8 8 a 、y 2 9 2 a 会显著降低p l c - 一、1y 7 7 5 和y 7 8 3 两个位点的 磷酸化水平，影响i 墩下游p l c - 3 , 1 信号通路。其次，我们用甲型h 1 n 1 流感病毒 感染t 细胞，研究发现：流感病毒感染j u r k a t 细胞后，细胞内源性i r k 由细胞质向 细胞膜迁移，n k 下游蛋白p l c - ，、1 蛋白的表达水平无明显变化，而p l c - 1 , iy 7 7 5 和 y 7 8 3 两个位点的磷酸化水平随病毒感染时间的延长而逐渐升高，表明在甲型流感病 毒感染j u r k a t 细胞的过程中，i t k p l c 丫1 信号通路被逐渐激活；应用s h r n a 技术 干扰j u r k a t 细胞中的i t k 表达，发现敲低i 墩表达后，p l c 丫1y 。7 7 5 的磷酸化水平在 感染后无明显变化，而p l c - 丫iy 缁3 的磷酸化水平在感染后随时间延长而降低。实 验结果提示，甲型流感病毒感染j u r k a t 细胞后可能通过改变i t k p l c , 1 信号通路 的活性，从而影响t 细胞的活化。 本研究为甲型流感病毒感染的免疫保护机理提供新线索，同时对i r k 、s l p 7 6 及p l c 吖1 三者之间相互作用的研究，也有助于我们深入了解t 细胞活化的分子调 控机制。 关键词：i t k ，p l c - 7 i ，流感病毒，j u r k a t 细胞，信号传导 两南大学硕士学位论文 i l ab s t r a c t m e c h a n i s m a n a l y s i so fi t km o l e c u l eo nt h ea c t i v a t i o no ft l y m p h o c y t e y i n p i n gj i a ( m i c r o b i o l o g y ) d i r e c t e db yd r y u a n y ip e n g d r j i l o n gc h e r t a b s t r a c t p r o t e i nt y r o s i n ek i n a s e s ( p t r u s ) o ft h es r c ，s y k z a p 一7 0a n dt e ca r ec r u c i a lf o r a n t i g e n - r e c e p t o r - i n d u c e dl y m p h o c y t ea c t i v a t i o n i t k i so n eo ft h et e cf a m i l y n o n r e c e p t o rt y r o s i n ek i n a s e s ，i t st y r o s i n ep h o s p h o r y l a t i o na n di n t e r a c t i o nb e t w e e ni t k a n do t h e rs i g n a lm o l e c u l e sp l a yac r u c i a lr o l ei nr e g u l a t i n gt h et c e l lr e c e p t o rs i g n a l i n g t r a n s d u c t i o np a t h w a y s h o w e v e r ，t h ec u r r e n ts t u d yi sn o te n o u g ht o c l a r i f yt h e m e c h a n i s m s s oo u rw o r kf o c u s e so nt h ei n f l u e n c eo fi t ki nt h et c e l lr e c e p t o rs i g n a l p a t h w a y i nt h ef i r s t c h a p t e r ，t oe x p l o r et h ep o s s i b i l i t yi n f l u e n c eo fi t km u t a n t so nt h e s i g n a l i n gp a t h w a y ，s e v e nm u t a n t s ( w 2 0 8 k , t 2 7 9 d ，1 2 8 2 a ，c 2 8 8 a ，y 2 9 2 a ，v 3 3 0 a , r 3 3 2 k ) w e r eg e n e r a t e d c o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o na s s a yv e r i f i e dt h a tt h o s em u t a n t s c o u l di n t e r a c tw i t hs l p 7 6 ，t h r e em u t a n t s ( w 2 0 8 k ，t 2 7 9 d ，y 2 9 2 a ) s i g n i f i c a n t l y d i s r u p t e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ni r ka n ds l p 7 6 i n t e r e s t i n g l y ，w eo b s e r v e dt h a ti t k i n d u c e dp l c - 7 1p h o s p h o r y l a t i o nw a si n d e p e n d e n to ns l p 7 6i n2 9 3 tc e l l s ，f o u ri t k m u t a n t s ( w 2 0 8 k , t 2 7 9 d ，c 2 8 8 a , y 2 9 2 a ) d r a s t i c a l l yd i m i n i 【s h e d t h e t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o no fp l c 7 1a ty 7 7 5a n dy 7 8 3b yw e s t e r nb l o ta s s a y i n f l u e n z aav i r u sc a nc a u s eah i g h l yc o n t a g i o u sa c u t er e s p i r a t o r yi l l n e s sa n di ss t i l l am a j o rc a u s eo fh u m a ni n f e c t i o u sd i s e a s e sa m o n gt h ev i r u s e s i n f l u e n z av i r u s - i n d u c e d s i g n a l i n gi n v o l v e sac o m p l e xn e t w o r ko fd i f f e r e n to v e r l a p p i n gm o l e c u l e sa n ds i g n a l c a s c a d e w h e t h e rt h i ss i g n a lp a t h w a yi nj u r k a tc e l l si sa f f e c t e db yi n f l u e n z av i r u s i n f e c t i o nw a si n v e s t i g a t e dh e r e i nt h es e c o n dc h a p t e r , w eo b s e r v e dt h a tj u r k a tc e l l sc a l l b ei n f e c t e dd i r e c t l yb yi n f l u e n z av i r e sa n di r kt r a n s l o c a t e df r o mt h ec y t o p l a s m at o m e m b r a n ei ni n f l u e n z av i r u s i n f e c t e dj u r k a tc e l l s s t r i k i n g l y , c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no f p l c - ) , iw a sn o tc h a n g e d , b u tp h o s p h o r y l a t i o nl e v e l so fp l c 7 1 a ty 7 7 5a n dy 7 8 3 i n c r e a s e dc l e a r l yd u r i n gi n f l u e n z aav i r u si n f e c t i o n m o r e o v e r , as t a b l ei t k d e f i c i e n t j u r k a tc e l ll i n ew a sg e n e r a t e d w eo b s e r v e dt h a ti nt h i sc e l ll i n et h ep h o s p h o r y l a t i o no f u i 两南大学硕士学何论文 p l c t 1a ty 墙3w a sd o w n - r e g u l a t e dd u r i n gt h ei n f e c t i o n 谢mi n f l u e n z av i r u s ，i n d i c a t i n g t h a tp h o s p h o r y l a t i o no fp l c - t 1a ty 7 8 3i si t kd e p e n d e n ti ni n f l u e n z av i r u s i n f e c t e d j u r k a tc e l l s t a k e na l lt o g e t h e r ，t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a ti n f l u e n z av i r u si n f e c t i o nm a ya f f e c t t h ea c t i v a t i o no ftc e l lt h r o u g ht h ei 出p l c - t 1s i g n a l i n gp a t h w a y f u r t h e r m o r e ，t h e r e s e a r c ho fa s s o c i a t i o na m o n gi t k 、s l p 7 6a n dp l c - t 1w i l lh e l pu st ou n d e r s t a n dt h e m o l e c u l a rm e c h a n i s mf o ra c t i v a t i o no ft c e l 】 k e yw o r d s ：i t l p l c - t 1 ，i n f l u e n z aav i r u s ，j u r k a tc e l l ，s i g n a l i n gt r a n s d u c t i o n i v 第一章i t k 分子信号通路的研究进展 第一部分文献综述 第一章i t k 分子信号通路的研究进展 在免疫细胞信号传导通路中，s r c ，s y l d z a p 7 0 ( s y k - f a m i l yk i n a s e - c h a i n - a s s o c i a t e dp r o t e i nk i n a s eo f 7 0k d a ) 和t e c 三个p t k ( p r o t e i nt y r o s i n ek i n a s e ) 家族参与了t 细胞活化的信号转导过程。目前发现t e c 家族非受体型激酶i t k ( i n t e r l e u k i n - 2 i n d u c i b l et - c e l lk i n a s e ) ，因其在t 细胞系中的特异性表达，并与t 细胞中其它已经确定的非受体酪氨酸激酶互相作用，在t 细胞活化的通路中处于 重要地位，引起了广泛的关注。 1 i t k 及其基本结构 t e e 家族是近年来国内外研究较活跃的胞浆内酪氨酸激酶分子，它们主要在淋 巴细胞和髓样细胞中表达。敞属于非受体型酪氨酸激酶t e e 家族成员之一，由五 个结构域组成1 1 翔：p h 结构域( p l e c k s t r i nh o m o l o g yd o m a i n ) ；t h 结构域( t c c h o m o l o g yd o m a i n ) ：s h 3 结构域( s r ch o m o l o g y3d o m a i n ) ：s h 2 结构域( s r ch o m o l o g y 2d o m a i n ) 和激酶结构域( k i n a s ed o m a i n ) 。i r k 结构如图1 1 所示。 i r kn c 图1 - 1i t k 结构示意图i 习 f i g u r e1 - 1s t r u c t u r em o d e lo fi 墩 当t 细胞受体t c r ( t - c e l lr e c e p t o r ) 受到刺激后，烛的p h 结构域与p d k ( p h o s p h o i n o s i t i d e3 - k i n a s e ) 相互作用产生的p i p 3 ( p h o s p h a t i d ) r l i n o s i t o l 3 , 4 5 - t r i s p h o s p h a t e ) ，使i t k 由胞浆向胞膜募集，并定位于细胞膜上1 4 5 1 。此外，s h 2 结构域属于i t k 的非催化调控区之一，它调控着破的催化活性，在t 细胞激活时， s h 2 结构域介导信号复合物的构象1 6 1 。s h 3 结构域内含有对酞活性起重要作用的 酪氨酸磷酸化位点y 啪，此结构域的缺失则会改变腴激酶的活性【7 1 。 近年研究表明，i t ks h 2 结构域上的1 2 8 2 、c 2 8 8 、v 3 3 0 及r 3 3 2 是i t ks h 2 结 构域与另一个i t ks h 3 结构域结合相关的残基阎。对侧链1 2 8 2 a 位点的突变会抑制 i t k 自身的相互作用 9 1 ，而对侧链c 2 8 8 残基进行共价键修饰，则会改变i t ks h 2 顺 反异构体构象的平衡 g l ，进一步研究显示，i t ks h 2 结构域的缺失则会导致酞变成 无活性形式【1 0 1 。此外，i t ks h 3 结构域上w 2 0 8 位点的突变会抑制敞与脯氨酸配 两南大学硕十学位论文 体的结合i 1 ，同时也影响i t ks h 2 结构域与s h 3 结构域之间的相互作用l l 引。 i r k 含有两个对它活性具有重要作用的酪氨酸磷酸化位点，即位于激酶域活性 环内的y 5 和位于s h 3 结构域内的y 1 8 0 1 3 , 1 4 。目前研究表明，若对i t ks h 2 结构 域上e 2 3 5 、y 2 3 7 、l 2 5 2 、k 2 5 8 、y 2 9 2 、e 3 0 8 、k 3 0 9 、g 3 2 8 、l 3 2 9 、r 3 3 2 和r 3 3 4 进行突变则会显著降低i t ks h 3 结构域上y 啪的磷酸化i l 鲥，而i r kr 2 6 5 k 位的突变 却不会影响y 1 的磷酸化u 6 1 ，但i t kw 3 5 5 的突变会显著降低胀激酶的活性【1 7 , 1 8 l 。 近期研究报道，在两名患有免疫缺陷综合症的土耳其( 1 、l r k j s h ) 妇女中，i r ks h 2 结构域上r 3 3 5 w 纯合子的突变会增加人体对e b v ( e p s t e i n b a r rv i r u s ) 病毒的敏 感性，导致e b v 阳性b 细胞的增殖和霍奇金淋巴瘤的产生【1 9 1 。 目前研究显示，在t 细胞静止期，i t k 以自动抑制构象存在，通过s h 3 结构域 与富含脯氨酸区域之间的分子内相互作用使自身处于稳定状态【i 。t c r 受到刺激 后，i t k 经过一系列的酪氨酸磷酸化和生化反应，释放出它的激酶域，使其从非活 性构象转变成活性构象1 3 j 。近年研究表明，i t ks h 3 域与s l p 7 6 ( s r ch o m o l o g y2 ( s h 2 ) d o m a i n - c o n t a i n i n gl e u k o c y t ep r o t e i no f7 6k d a ) 的p r r 域之间的相互作用 可以维持敝的折叠构象；i t k 分子的s i - 1 2 域与另一个i t k 分子的s h 3 域之间的相 互作用，可以引起它们在头尾构型中形成二聚体【2 0 , 2 1 l 。此外，另有研究显示，当 t c r 受到刺激后，i t k 的s h 2 域与s l p 7 6n 端酪氨酸磷酸化位点之间的相互作用， 还可能与维持酞自动抑制构象存在着竞争关系 4 1 。 2 i t k 、s l p 7 6 及p l c - q , 1 之间的相互作用 s l p 7 6 含有三个功能结构域：n 端为含有三个酪氨酸的酸性结构域( y 1 1 2 ，y 1 2 3 ， y 1 4 5 ) 、中间富含脯氨酸的结构域、c 端为s h 2 结构域1 2 2 2 3 1 。s l p 7 6 作为一种衔 接蛋白，缺少内在酶活性，但含有多蛋白结合位点。在t 细胞t c r 受到刺激后可 激活s r c 激酶l c k ，随后l c k 使i t a m s ( i m m u n o r e c e p t o rt y r o s i n e - b a s e da c t i v a t i o n m o t i f s ) 中的酪氨酸发生磷酸化。磷酸化后的i t a m s 招募并激活z a p 7 0 ( s y k - f a m i l yk i n a s e - e h a i n - a s s o c i a t e dp r o t e i nk i n a s eo f 7 0k d a ) ，随后z a p 7 0 磷 酸化s l p 7 6 并激活t 细胞的转膜衔接蛋白l a t ( l i n k e rf o ra c t i v a t i o no ftc e l l s ) 1 2 4 , 2 5 1 。磷酸化后的l a t 将s l p 7 6 招募到细胞膜上，并以这两个衔接蛋白为核心， 招募其他信号蛋白形成一个多分子复合物。其他信号蛋白包括：p l c 一1 ( p h o s p h o l i p a s ec f f l ) 、v a v ( t h eg u a n i n e - n u c l e o t i d e - e x c h a n g ef a c t o r ) 、n c k ( t h e a d a p t o rn o n - c a t a l y t i cr e g i o n o ft y r o s i n ek i n a s e ) 、i r k 、a d a p ( a d h e s i o n - a n d d e g r a n u l a t i o n - p r o m o t i n ga d a p t o rp r o t e i n ) 和h p k l ( h a e m a t o p o i e t i cp r o g e n i t o rk i n a s e 1 ) 等田, 2 6 , 2 7 1 。i t k 的信号通路图如图1 2 所示。 2 第一章i t k 分子信号通路的研究进展 图l - 2 i 墩在t 细胞中的信号通路图1 2 8 1 f i g u r e1 - 2i 墩i nt c e l lr e c e p t o rs i g n a l l i n gp a t h w a y s p l c q , i ，磷脂酶c ( p h o s p h o l i p a s ec ，p l c ) 的一个亚型，是磷脂代谢的关键 酶之一。p l c - y 1y 7 7 5 和y 7 两个位点的磷酸化水平对p l c l , i 的活化起着重要的 作用【l l 】。目前研究显示，当p l c f f l 被激活后，它的产物肌醇三磷酸i p 3 则会结合 到内质网等细胞器的受体上，从而使c a 2 + 从胞内释放出来 2 9 1 ，随后则激活钙调蛋 白和对c a 2 + 敏感的磷酸酶钙神经素的活性1 3 0 】；p l c q , i 的另一个产物二酰甘油d a g 则可以激活多条通路，比如细胞外调节蛋白激酶e r k ( e x t r a c e l l u l a rr e g u l a t e dp r o t e i n k i n a s e s ) 通路，从而可以增强e l l 【1 介导的a p - 1 ( a c t i v a t o r p r o t e i n1 ) 转录因子f o s 的表达【3 l 】，同时d a g 也能激活蛋白激酶c ( 包括对j n k 和n f 1 国活性起重要作 用的p k c - - 0 ) 晔1 。 此外，p l c - y 1 可与m 【s h 2 结构域相结合，二者之间的相互作用通过t c r 、 c d 3 、c d 2 、c d 4 和c d 2 8 等受体进行调节【3 3 j 。i 墩的突变会影响p l c f f l 的磷酸化 3 4 , 3 5 , 3 6 1 ，同时也降低了t 细胞的反应及c a 寸的流动。有趣的是对陆无活性的激酶 域进行突变不会降低t c r 介导的c a 寸的流动强度 3 7 1 。另有研究表明，在正反馈调 节中，增强p i p 3 与i t kp h 结构域的结合有利于增加m 【的酶活性【3 引。 近年研究表明，s l p 7 6n 端三个酪氨酸( y l l 2 ，y 啪，y 1 4 5 ) 已被证实是s y k 家族p t k s 的底物圈。体内外实验表明，对t 细胞功能起重要调控作用的敞通过 其s h 2 结构域与s l p 7 6 的n 端y 1 4 5 相连接。磷酸化多肽研究实验证实，相比y u 3 肽( 人类是y 1 1 3 ，小鼠中为y 1 1 2 ) 的磷酸化，磷酸化y 1 4 5 肽能更好的阻断s l p 7 6 与酞之间的相互作用 4 1 。活体实验进一步表明，s l p 7 6n 端y 1 4 5 对c d 6 9 及c d 2 5 3 在s l p 7 6 缺失的细胞中，i 墩的活性会显著地降低【4 7 1 。在i 墩或s l p 7 6 缺失的情况 下，t c r 介导的酪氨酸磷酸化和p l c - q l 的活性都会显著地降低，随后c a 2 + 的流量 也会急剧地减少【4 3 , 4 9 1 。 3 i r k 对t 细胞功能的影响 近年研究表明，敞特异性地表达于t 细胞系，它对t 细胞功能起着重要的调 控作用。i 出有助于t c r 介导的细胞骨架的调控，以j u r k a t 细胞为模型，在t c r 的刺激下，i r ks h 2 结构域的突变会阻止肌动蛋白产生极性，而缺失激酶域的敞 则不能影响肌动蛋白的极性产生【地”】。有证据表明，肌动蛋白细胞骨架的调节在 人类免疫缺陷病毒h i v ( h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s ) 感染中发挥着重要的作用 【5 2 】，通过抑制膜突蛋白和人肌动蛋白素等可以降低h 1 v 的入侵以及h i v 在细胞内 的传播1 5 3 ，5 4 , 5 5 , 5 6 1 。在j u r k a t 细胞和初级c d 4 + 人t 淋巴细胞中，酞表达的降低及功 能的丧失将会削弱h i v 在细胞中复制能力1 5 。 另外，酞的缺失会对t 细胞的发育和功能造成严重的缺陷m 娜删，以敲除掉 胜的小鼠为模型，酞的缺失将会严重影响到t 细胞受体介导的细胞增殖及i l 2 的产生，同时会降低p l c f f l 的磷酸化和c a 2 + 流动。此外，在脓缺失的小鼠中， 通过降低t h 2 ( t - h e l p e r2 ) 的极性和减少t h 2 细胞因子的产生可应对t h 2 介导的 因子和体内的感染 6 0 , 6 l 6 2 ) 。有证据表明，在r l k 小i r k4 - 缺失的胸腺细胞中，单阳 性胸腺细胞的数目和比例都会增加1 6 3 】。但是另有研究报道，在肽缺失的小鼠中， c d 4 单阳性细胞会减少而c d 8 单阳性细胞的比例不受影响 6 4 1 。 1 砬细胞分泌的i l 4 ，i l 5 ，i l 1 0 ，i l 1 3 对机体的免疫屏障和过敏反应具有 重要的调节作用，同时也应对细胞外寄生虫的入侵阱】。在c d 4 和c d 2 8 的共同刺 激下，t c r 被激活并启动一系列的信号转导事件，敞被活化后向细胞膜迁移 4 第一章i t k 分子信号通路的研究进展 1 8 , 6 6 , 6 7 】。在缺失i 墩的t 细胞中，转录因子n f a t 的活性、c a + 流量、a p 1 的活性 及n f r d 3 的活性均受到影响【6 8 , 6 9 , 7 0 , 7 1 , 7 2 】，同时初始c d 4 和c d 8t 细胞的发育也受 到严重的阻碍【3 4 , 7 3 , 7 4 , 7 5 , 7 6 , 7 7 】。而在肥大细胞中，n k 的缺失则有助于t h 2 细胞因子的 产生，同时提高了活化t 细胞核因子n f a t ( n u c l e a rf a c t o ro f a c t i v a t e dtc e l l s ) 转 录因子的活性【7 8 】。在分化的t 细胞中，i 伙在t h 2 细胞中高表达，而另一个t e c 家 族激酶t x k 则只在t h l 细胞中表达【7 引。同时有研究显示，在患有过敏性鼻炎的病 人中，t 细胞外周血液中也可检测到高表达的i r k 8 0 】。近年来通过在小鼠的体内加 入i t k 的化学抑制剂【8 1 】，从而可达到降低肺部炎症性反应的目的，这为i 伙作为药 物靶标的确立奠定了基础。 弄清楚肽结构域的突变对敞信号通路的影响无疑对阐明i t k 在t 细胞信号 传导中的作用机理具有重要的意义。实验部分第三章以2 9 3 t 细胞为模型，探讨他 s h 2 和s h 3 结构域的突变对i 墩信号通路及其下游信号分子p l c 吖1 的影响。 西南大学硕士学位论文 6 第二章甲犁流感病毒的研究进展 _ i i l a p l l 一 第二章甲型流感病毒的研究进展 1 流感概述 流行性感冒简称流感，是由流感病毒( i n ! l u 即z a 、，i l 懈) 引起的、流行于人群 和多种动物中的急性、高度接触传染性疾病，至今仍是全球发病最多、传染最快、 传播范围最广、造成危害最大的病毒性传染病。由于流感病毒不同亚型和不同毒 株不断发生抗原漂移和抗原转变，新毒株不断的出现，对人类健康造成了很大的 威胁 8 2 , s 3 , s 4 。 流感病毒属于正粘病毒科( o r t h o m y x o v i d d a e ) ，是负链r n a 病毒【8 5 】。根据 流感病毒抗原性的不同分为a ( 甲) 、b ( 乙) 、c ( 丙) 三型。其中a 型流感病 毒可见于人类、多种禽类、猪、马及其他哺乳动物，b 型和c 型一般只见于人类； 对于a 型流感病毒，根据病毒表面结构蛋白血凝素( h e m a g g l u t i n i n ，h a ) 和神经 氨酸酶( n e u m m i n i d a s e ，n a ) 抗原性的不同，可分为不同的血清亚型。迄今已发 现有1 6 种不同的h a 亚型( h 1 h 1 6 ) 和9 种n a 亚型( n 1 n 9 ) ，在禽流感中， h 5 与h 7 型为高致病性毒株 8 6 , 8 7 , 8 8 , 8 9 。 流感病毒是胞膜病毒，具有包膜及核衣壳，病毒包膜来自宿主细胞的双层类 脂膜，由双层类脂膜、糖蛋白突起和基质蛋白构成，其中糖蛋白突起散布于流感 病毒颗粒表面，分别是三聚化的血凝素蛋白h a 和四聚化的神经氨酸酶n a 。h a 在病毒吸附和穿膜过程中以及决定病毒致病力方面起重要作用，n a 的非极性跨膜 区则起着固定和信号肽的双重功能，两种糖蛋白突起在包膜上的比例为7 5 ：2 0 。 基质蛋白( m l ，m 2 ) 是病毒粒子内的主要成分，m l 位于双层类脂膜内面，形成 结构完整的病毒壳，具有稳定而强化细胞膜结构的作用，m 2 则大量表达于病毒表 面，在病毒内含量很少。流感病毒颗粒内部为核衣壳，呈螺旋对称，直径约1 0n m ， 由核蛋白n p 、p b i 、p b 2 、p a 三种聚合酶蛋白和8 个病毒单股负链组成，其中 h a 、n p 为结构蛋白唧, 9 1 j 。流感病毒结构如图2 1 所示。 图2 1 甲型流感病毒结构示意图嗍 f i g u r e2 一ls t r t l c n 翟ld i a g r a mo f t h eh i n iv i r u s 7 两南大学硕+ 学位论文 皇皇皇苣豳皇皇簟| 皇皇喜皇薯置量鼻| 曩曾量鱼皇囊| 皇量量量量曹_ 2 流感病毒感染对宿主信号通路的影响 病毒与宿主的共进化塑造了宿主的免疫系统。天然免疫系统不仅是一道天然 屏障，同时也为适应性免疫反应的激活提供了一些必要的刺激信号。目前研究表 明，流感病毒感染并诱导体内外宿主细胞发生凋亡，是多种病毒组分和细胞成分 共同参与多条互相联系信号通路的结果。其中部分信号通路可以介导宿主细胞的 天然免疫反应抵抗流感病毒，而另一部分信号通路则有利于病毒的复带1 9 3 , 9 4 , 9 卯。 目前研究显示，在流感病毒感染细胞的各个时期，不同病毒蛋白的表达效率 不同。在感染早期，病毒n p ( n u c l e o p r o t e i n ) 和n s i ( n o n s t r u c t u r a l ) 蛋白大量合 成，而h a 、n a 及m 1 蛋白的合成则受到抑制m , 9 7 , 9 8 】，这可能反映出不同病毒蛋 白在流感病毒生活周期中发挥着不同的作用，目前这种调控的具体机制还不明确。 越来越多的证据表明，当宿主细胞被流感病毒感染时，流感病毒的蛋白及核 酸可以被细胞膜上或者细胞内特异性的受体识别并启动细胞内一系列的信号转导 过程 9 4 1 。近年研究显示，病毒感染除了能够激活宿主的免疫系统，同时还能诱导 细胞凋亡阴, 1 0 0 l 。流感病毒感染宿主细胞后，病毒复制过程中产生的单链或者双链 r n a 能够与模式识别受体结合，可以激活一系列的信号通路，包括促分裂素原活 化蛋白激酶m a p k ( m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s ) 通路、n f 1 出通路、p k r 通 路和p 1 3 k 通路等f 1 0 1 , 1 0 2 , 1 0 3 】。在急性和持续性感染中，流感病毒可通过激活p 1 3 k a k t 信号通路抑制病毒感染诱导的细胞凋亡以延长病毒复制时间f i 州。在a 5 4 9 细胞中， p 1 3 k a k t 信号通路以一种不依赖流感病毒吸附和内吞的方式激活，使用p 1 3 k 特异 抑制剂可以显著地抑制病毒r n a 的合成和病毒蛋白的表达【l j 。 此外，作为细胞内一个重要的抗病毒反应信号通路，p k r 信号通路在细胞的 生长调节、抗病毒保护、信号传导等调控过程中发挥着重要作用【1 0 6 1 。近年研究表 明，在病毒感染时，p k r 被激活后与双链r n a 相结合，通过磷酸化真核细胞翻译 启始子2 a ( e u k a r y o t i ci n i t i a t i o nf a c t o r2 ，e l f 2 a ) 抑制流感病毒细胞核蛋白的合成， 同时p k r 的信号通路也介导炎症因子的转录【1 0 7 3 0 8 。在p k r 功能缺失的小鼠中， p k r 可以通过自身分泌的干扰素而抑制流感病毒复制【l 吲，同时为了逃避宿主的抗 病毒效应，甲型流感病毒的n s i 蛋白可以直接与p k r 结合以阻止p k r 的活化 【l i 0 , 1 1 1 1a 目前研究表明，在以小鼠为动物模型的试验中，交叉活性的t 细胞反馈有利 于抵制新型流感【1 1 2 1 ，c d 8 + t 细胞在c i m + t 细胞的协助下分化成完全的记忆细胞， 维持c d 8 + t 细胞介导的免疫反应来抵制病毒的入侵1 1 1 3 】。此外，几7 通过激活t 细胞反应，可诱导减少淋巴细胞的增生来抵制流感病毒的感染 1 1 4 。 流感