（生物化学与分子生物学专业论文）利用人转录因子sirna文库筛选凋亡相关sirna.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究 成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位做储签谤参彳签字吼尹莎年月歹日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解j 匕塞坯塑医堂医有关保存、使用学位论文的管理办 法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权j e 塞垃塑匡堂瞳可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 靴敝储签叻乞彳 签字日期：徊莎年j 月矽日 | 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 3 7 新躲统毁 签字日期： 年月 日 电话： 邮编： 北京协和医学院硕士学位论文 中文摘要 r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 是双链r n a 分子引发的序列特异性转录 后基因沉默过程。该现象广泛存在于多物种中。r n a 干扰所致的同源基因降解现象 引起生物学家的广泛关注并将其改造成一种人为的基因阻断技术，用于基因功能的 研究。由于长双链r n a 分子在哺乳动物细胞能引起非特异性的干扰素反应，r n a i 技 术的应用最初局限于线虫、果蝇等低等生物。随着s i r n a ( s m a l li n t e r f e r i n gr n a ) 特异性抑制作用的发现，r n a i 技术的应用范围延伸到哺乳动物；并且从对单一、特 定基因的研究迅速推及全基因组水平的功能研究，以此为契机推动了s i r n a 文库的 构建和使用s i r n a 文库进行高通量筛选。 凋亡又叫做程序性细胞死亡。凋亡有其特有的形态学特点和生化机制。凋亡对 于各种生命过程非常重要，如正常的细胞更新、发育和免疫反应，激素依赖性组织 萎缩，胚胎发育和化学物质诱导凋亡等。凋亡失常与许多人类疾病有关，如神经退 行性疾病、缺血损伤、自身免疫和肿瘤等。调节细胞凋亡对于治疗这些疾病非常重 要。因此，很多研究致力于分析阐明细胞凋亡的机制和信号通路。 我们利用人转录因子s i r n a 文库在j u r k a t 细胞中筛选凋亡相关s i r n a 。s i r n a 文库稳定转染细胞后使用r h t r a i l 诱导凋亡。由于s i r n a 作用，那些具有抗凋亡特 性的细胞将会存活、增殖，其他细胞将会被筛除。最终，那些具有抗凋亡特性的细 胞在细胞群中得以富集。经过3 轮筛选，稳定转染人转录因子s i r n a 文库的实验组 细胞较稳定转染n c 的阴性对照组细胞具有显著增强的抗凋亡能力。随后通过p c r 克隆测序的方法获知这些阳性细胞中所转染的s i r n a 表达片段序列。然后 这些s i r n a 表达片段的抗凋亡作用被逐个验证。其中部分s i r n a 表达片段在j u r k a t 细胞中表现出明确的抗细胞凋亡作用。 综上所述，我们建立了基于细胞功能表型的高通量s i r n a 文库筛选方法；用人 转录因子s i r n a 文库成功地进行了大规模筛选，获得了多个与细胞凋亡相关的s i r n a 序列。为发现新的凋亡相关基因奠定了基础。 关键词转录因子，s i r n a 文库，功能筛选，凋亡 2 北京协和医学院硕士学位论文 a b s t r a c t i 蝌ai n t e r f e r e n c e ( r n a i ) i sas e q u e n c e - s p e c i f i cp o s t t r a j l s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i i 培 p r o c e s sm e d i a t e db yd o u b l e s t 舳d e di 之n a 砌q ai n t e r f e r c n c eo c c u r si na 诵d ev 蜀u r i e t ) ，o f o 唱a i l i s m s b i o l o g i s t si k a v ep a i da t t e n t i o nt 0r n a is i n c er e s e a r c h e r sf o u n dd s r n a c 趾 t r i g g e rt 1 1 ed e 铲a d a t i o no fh o m o l o g o u sm i 矾a s r e c e n t l yr n a i h a sb e c o m eac o m m o n l y u s e dt e c h n o l o g ) rt 0s t i l d yt l l e 如n c t i o no fg e n e b e c a u s el o n gd o u b l e - s 仃锄d e di 斟a c a u s e sn o n - t 鹕e t r e l a t e di l l d u c t i o no ft y p el 硫e 疵r o n ( i f n ) ，m ea p p l i c a t i o no fr n t e c h n o l o g yi sr e s t r i c t e dt ot l l el o 、v e ro 玛a n i s m s ，s u c h 嬲cp 曙口凇，) ，d s 哪妇t h e b 硎e rw 觞o v e r c o m e 、订mt h eo b s e r v a t i o nm a tt l l es e q u e n c e s p e c i f i ci a ip a t h 、a yc a n b et r i g g e r e db ys m a l li n t e 彘r i r 培r n a ( s i r n a ) w i t l l o u ta c t i v a t i n gt h ei f nr e s p o n s e rn a it e c h n o l o g yh a sb e e nu s e dn o to i d yt o 如j d yt h e 劬c t i o no fi i l d i v i d u a lg e n e ，b u t a l s ot 0p e o 皿t h er n b 嬲e dg e n o m e - 晰d e m c t i o n a l 觚a l y s i sf o rm a 1 1 2 l l i 趾c e l l s ， w r h i c hp r o m o t e st t l ec o n s n 佻t i o no fs i r n al i b r a 拶a 1 1 dh i g l l t h r o u 曲p u ts c r e e n 1 h ep r o c e s so fp r o 铲a l t l l l l e dc e l ld e a ：t l l ，o r 印o p t o s i s ，i sg e n e r a l l yc h a r a c t 耐z e db y d i s t i n c tm o 印h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n de n e 唱y d e p e n d e n tb i o c h e r i l i c a lm e c l 砌s m s a p o p t o s i si sc o n s i d e r e dav i t a lc o m p o n e n to fv 撕o u sp r o c e s s e si i l c l u d i n gn o 肌a l lc e n t u m o w i r ， p r o p e rd e v e l o p m e m锄d 缸l c t i o l l i n g o ft h ei i i m l u n e s y s t e m ， h o 咖o n e d e p e n d e ma 舡d p h 弘e m b d ，o i l i cd e v e l o p m e n ta n dc h e m i c a l h l d u c e dc e l l d e a n l i i l a p p r o p r i a t ea p o p t o s i s ( e i t l l e rt o ol i t t l eo rt o om u c h ) i sm ec a u s ei i lm 肌yb l u n a nd i s e a s e i 1 1 c l u d i n gn e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e s ，i s c h e m i cd 锄a g e ，卸t o i 删：1 1 m e d i s o r d e r sa n d m a i l yt y p e so f c 觚c e r 1 1 1 ea b i l i t ) ，t 0m o d u l a t et l l el i f eo rd e a mo f a c e l li sr e c o 班z e df o r i t si i t 】m e i l s e t h e r a p e u t i cp o t i 斌i a l t i l e r e f 0 r e ，r e s e 盯c h c o m i n u e st 0f o c u s0 nt l l e e l u c i d a t i o na n da n a l y s i so f 印o p t o s i sm a c h i n e 巧a n ds i g i l a l i n gp a t l l 、v a y s w eu s e dt h eh 岫锄仃a n s c r i p t i o nf a c t o rs i r n a l i b r a r yi i las c r e e 血gf o rs i r n at h t c a i la 虢c tt 1 1 ec e ua p o p t o s i si nj u r k a tc e l l s 1 1 1 ec e l l sw e r es t a b l y 仃a i l s f e c t e d 淅t i l l e s i i 矾al i b 删可a n dt h e n 仃e a t e d 谢t hr h t r a i l ，c e l l s 诵t 1 1a n t i - 印o p t o s i sc 印a c 时、o u l d s u f v i v e 觚dp r o p a g a t em o r cm a i lo m e r sa n de v e n t u a l l yb e c o m ee 耐c h e di i lt l l ec e n p o p u l a t i o n a r e r3r o m l do fs e i e c t i o n ，w ef o u l l dt l l ec e l l s 协m s f e c t e d 、i t ht h eh 啪锄 饥m s c r i p t i o nf a c t o rs i i 矾al i b r a 巧d i dh a v ea m i - 印o p t o s i s ic 印a c 时t l l 锄m ec e l l s 衄m s f e c t e d 澌t ht l l en e g a t i v ec o n t 】r 0 1p l 姗i d t h e nt l l es i r n a e x p r e s s i n gc a s s e t t e sw e r e r e c o v e r e d 丘0 mt i l ec e l l ss e l e c t e d t h e s es i r n ae x p r e s s i n gc a s s e t t e sw e r ev e r i f i e df o r t l l e i r 锄t i 一印o p t o s i sa b i l i 谚i n d i v i d u a l l y s o m eo f t h es i i 斟ae x p r e s s i n gc 嬲s e n e sd i dh a v e a n t i 一印叩t o s i sa b i l 时i i lj 删诫c e l l 3 北京协和医学院硕士学位论文 i n s u m m a r y ，w eu s e dt 1 1 eh 嘲锄廿 m s c r i p t i o nf a c t o rs i r n al i b r a d rf o r m g h - t h r o u g h p u tp h e n o t y p e d r i v e ns c r e e i l i r 培，a n dm u l t i p l es i r n a s t l l a t h a 、，e 锄t i 一印o p t o s i sa b i l i t ) r ，e r ei d e n t i f i e d f a c i l i t a t i n g 1 e 胁h e ri d e n t i f i c a t i o no fn o v e l a p o p t o s i sr e l a t e dg e n e s 。 k 奄y 、v o r d s ：眦s c r i p t i o nf a c t o r s i r n al i b r 2 u 吼缸l c t i o r “s c r e e 血唱，印o p t o s i s 4 北京协和医学院硕士学位论文 前言 基因组d n a 测序是人类对自身基因组认识的第一步。随着测序的完成，功能基 因组学研究成为研究的主流，它从基因组信息与外界环境相互作用的高度，阐明基 因组的功能。传统研究基因功能的最有效技术之一是细胞和动物的基因敲除技术。 但该技术存在技术复杂、周期长、费用昂贵等缺点，极大地限制了它的应用。应 用物理和化学突变技术可以诱导基因的随机突变，导致细胞或动物表型的缺陷，直 接进行基因功能的筛选。但由于该方法通常需要两个等位基因同时突变才会出现明 显的表型变化，因此成功的机会比较低。运用生物信息学技术指导新基因克隆和功 能鉴定的方法大大加速了新基因的发现和基因功能的注释。然而，从生物信息学方 法获得正确研究线索的基因毕竟是有限的，而且在人类基因组中可能的3 5 万个基 因中，很大一部分基因几乎没有任何功能提示。全面解读生物基因组遗传信息资源 需要建立更多有效的基因功能研究平台。r n a 干扰现象的发现为功能基因组的研究 注入新的活力，带来全新的革命。 r n a 干扰( r n a i ) 是双链r n a ( d o u b l es t r a n d e dr n a ，d s r n a ) 分子在m r n a 水平 上诱发的序列特异性的转录后基因表达沉默。r n a i 现象自从1 9 9 8 年f i r e 等在秀 丽隐杆线虫( 饧鲫卯芒“芒6 以芒拈p 馏劾曲中首次发现以来，人们已在不同种属的生 物中进行了广泛而深入的研究，结果证实r n a i 现象广泛存在于植物、真菌、线虫、 果蝇和脊椎动物等多种生物中。随着人们对r n a i 研究的深入，r n a i 的分子机制逐步 被揭示出来，如z a i i l o r e 和d y k x h o o r n 等详尽准确地阐述了这一分子机制。可以简单 地归纳为：在r n a i 的起始阶段，长链d s r n a 被特异性的内切酶d i c e r 识别并水解切 割为2 l 一2 3 n t 的小干扰r n a 片段( s m a l li n t e r f e r i n gr n a ，s i r n a ) 。d i c e r 促进s i r n a 结合到核酶复合物形成r n a 诱导沉默复合物( r n ai n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ， r i s c ) 。r i s c 包含了双链s i r n a 解旋所必需的蛋白，将双链s i r n a 解旋后，解开的链 识别与之互补的靶m r n a 。r i s c 同时具有核酸酶活性，在距离s i r n a3 端第1 0 和1 1 位 核苷酸之间切割靶向m r n a ，使其降解，从而引起转录后基因沉默。由于r n a i 能够 高效并且特异地导致基因沉默，从而可以推断该基因的功能，该技术已经广泛应用 于功能基因组学等基础研究领域，帮助人们找到一些与疾病相关的靶蛋白，同时由 于r n a i 可以阻止外源性基因，如病毒等进入体内，可以抑制病毒基因及抑制内源 基因的转录和蛋白翻译，从而有望研制出治疗肿瘤、病毒感染等人类疾病的新型药 物，并且r n a i 技术可以作为一种简单、高效、大规模、高通量的药物研究的工具， 所以越来越多的研究显示了s i r n a 用于基因治疗和药物研究与开发的潜在优势。 5 北京协和医学院硕士学位论文 r n a 干扰( r n a i ) 技术是近年发展起来的一种人为进行特异性基因表达抑制的 核酸操作技术，又称k n o c kd o w n 技术。它一经创建就迅速成为基因功能研究的主 导性技术之一。r n a i 技术操作简单、作用迅速、高效、特异、对序列无特殊要求。 r n a i 技术应用范围广，理论上可以在任何动物中进行靶基因的抑制。另外对基因敲 除后纯合子不能存活的基因，可以用r n a i 技术来研究以弥补其局限。再者针对靶 基因中不同靶序列片段的s i r n a 有可能获得不同程度的基因沉默效果，从而可以模 拟数量遗传性状。r n a i 技术的高效性、操作简单易行等优点使其不仅用于单基因的 研究，还适合大规模功能基因的筛选。 果蝇中的r n a i 功能基因筛选研究已经在亚基因组水平进行。2 0 0 6 年，霍华德 修斯医学院遗传系的a d 锄f r i ed i r i a n 和n o r b e r tp e r r i m o n 研制了一种特殊的能够 报告r t k ( 受体酪氨酸激酶，r e c e p t o rt y r o s i n ek i n a s e ) 途径活性的磷酸特异性 抗体，研究人员利用此抗体对果蝇基因组进行s i r n a 文库筛选，筛选出3 0 0 多种r t k 途径的调节因子。r n a i 技术在果蝇s 2 细胞中筛选出两万多个预报基因靶点，其中 1 1 6 8 个基因在胰岛素引起的反应中受到调节，5 6 的基因没有任何相关分子记录， 2 3 的基因与哺乳动物急病相关，还有很多基因在细胞骨架维持、神经发育和细胞 增殖方面发挥作用。( f r i e d m a na ，p e r r i m o nn ，2 0 0 6 ) 此外，k i g e r 等在两种不同 的细胞中，针对约1 0 0 0 个信号传导或细胞骨架蛋白，用显微镜进行细胞形态学表 型的r n a i 筛选；k i m 等用注射d s r n a 到果蝇胚胎的方法，针对5 8 0 0 个基因进行心 脏发生相关基因的大规模筛选，都取得了成功( k i g e re ta 1 ，2 0 0 3 ，k i me ta 1 ， 2 0 0 4 ) 。果蝇的全基因组( 9 1 ) r n a i 功能基因筛选在2 0 0 4 年得以实现( b o u t r o se t a 1 。2 0 0 4 ) 。 在线虫中的r n a i 功能基因筛选也取得了很多进展。2 0 0 2 年，来自美国哈佛医 学院的g a r yr u v k u n 和来自英国剑桥大学的j u l i ea h r i n g e r 合作，在线虫的5 6 9 0 个基因中，通过使用s i r n a 文库筛选与线虫寿命相关的基因。研究结果发现，与线 粒体功能相关的一群基因影响线虫的寿命。其中影响线粒体功能的线粒体亮氨酸 t r n a 合成酶突变与线虫寿命增加有关。 线虫和果蝇的全基因组水平r n a i 功能基因筛选证明了r n a i 在高通量基因功能 研究中的巨大潜能。模式生物研究虽有重要的意义，但不能取代对人等哺乳动物的 直接研究，建立人及哺乳动物的r n a i 文库并应用于功能基因筛选亦非常重要。到 目前为止，已经报道的用于哺乳动物细胞的r n a 干扰文库有三类：哺乳动物细胞已 知基因的r n a 干扰( r n a i ) 文库、来源于c d n a 文库的亚随机r n a i 文库和随机r n a 干扰( r n a i ) 文库。本研究使用人转录因子s i r n a 文库进行功能基因筛选。 6 北京协和医学院硕士学位论文 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞 凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系 列基因的激活、表达以及调控等的作用。它并不是病理条件下，自体损伤的一种现 象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如b c l 2 家族、 c a s p a s e 家族、癌基因如c m y c 、抑癌基因p 5 3 等，随着分子生物学技术的发展对多种 细胞凋亡的过程有了相当的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。而 凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。如肿瘤、自身免疫性疾 病等，能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、药物等。 t r a i l 属于肿瘤坏死因子超家族，因其特异性地诱导肿瘤细胞发生凋亡，而对 正常细胞没有显著细胞毒性的特点，使其在肿瘤治疗中成为研究的热点。目前已知 的t r a i l 受体共有5 种，根据功能不同分为三类，即死亡受体和假死亡受体和可溶 性受体。其中死亡受体包括d r 4 和d r 5 ，它们均含有胞内死亡结构域和依赖胱天蛋白 酶( c a s p a s e ) 途径的凋亡信号的识别结构，与t r a i l 结合后能将t r a i l 的死亡信息 传递至胞质，激活胱天蛋白酶系统，最终引起细胞凋亡；假死亡受体包括d c r l 和 d c r 2 。d c r l 和d c r 2 的胞外区均由2 个与d r 4 、d r 5 高度同源的富含半胱氨酸的重复 序列，d c r l 缺少含有死亡结构域的胞质区，故虽能与t r a i l 结合但不能诱导细胞 凋亡；d c r 2 细胞内的死亡结构域不完整，缺少氨基端的部分，因而缺乏诱导凋亡 的能力。可溶性受体是一种分泌型糖蛋白，由于没有跨膜区及胞内区，缺乏完整的 死亡结构域，因此与t r a i l 结合不能转导凋亡信号，而是在体内具有抑制破骨细胞 发生、增加骨骼密度的作用。 t r a i l 与d r 4 或d r 5 受体结合后，d r 4 和d r 5 的死亡结构域传导凋亡的信号 通过f a d d 和依赖c a s p a s e 8 机制在细胞内途径和细胞外途径实现的。在细胞内途径， c a s p a s e 8 和c a s p a s e l 0 的活化以级联反应激活下游的效应胱天蛋白酶分子 c a s p a s e 3 、c a s p a s e 6 和c a s p a s e 7 ，从而引起细胞凋亡。同时，激活的c a s p a s e 可 裂解b i d ( b c l 一2 家族成员) ，裂解和缩短的b i d 易位到线粒体，通过和b a x 、b a k 相 互作用来启动内源的线粒体依赖的凋亡途径。在细胞外途径，t r a i l 分别与d r 4 和 d r 5 受体结合，导致t r a i l 受体三聚体化，被激活的t r a i l 募集接头分子f a d d 则 通过它的死亡效应结构域与细胞内的半胱天冬氨酸蛋白酶原( p r o c a s p a s e ) 结合， 形成死亡诱导信号复合物，后者刺激c a s p a s e 8 和c a s p a s e l 0 的活化，c a s p a s e 8 活 化后能够引发c a s p a s e 蛋白酶级联反应，并进一步水解激活其下游的同源酶，如 c a s p a s e 6 和c a s p a s e 7 等，最后激活其效应物c a s p a s e 3 发挥生物学功能。 7 北京协和医学院硕士学位论文 本研究使用r h t r a i l 诱导j u r k a t 细胞凋亡，利用高通量s i r n a 文库筛选的方 法，筛选并鉴定凋亡相关s i r n a 。为发现新的凋亡相关基因奠定基础。 8 构建人转录因子s i i 矾a 文库 i r s i i a 文库稳定转染j u r k a t 细胞 ： 【 将获得阳性表型的细胞从细胞群中筛选出来 1 r 从阳性表型细胞中获得转染的s i r n a 表达序列 】 1 r 【 逐个验证s i i a 的作用 北京协和医学院硕士学位论文 1 实验材料 材料与方法 1 1 随机r n a i 文库和质粒载体： 具有相向双启动子( h 1 和u 6 ) 的s i r n a 表达载体p c u 1 h 6 ( 实验室自建) ；涵盖 约5 3 0 0 种人转录因子s i r n a 的质粒表达型人转录因子s i r n a 文库( 梁子才教授惠 赠) 。 1 2 细菌菌株 大肠杆菌菌株基因型 t o p l 0 f m r c a ( m r r h s d r m s m c r b c ) 8 0 1 a c zm 1 5 1 a c x 7 4d e o r r e c a l a r a d l 3 9 ( a r a l e u ) 7 6 9 7g a l kr p s l ( s t r 2 ) e n d a l n u p g d h 5q f j 8 0l a c z m 1 5 ( 1 a c z y a a r g f )u 1 6 9 d e o re n d a l r e c a lh s d r l 7 ( r k 一，i i l l + ) s u p e 4 4t h i 一1g y r a 9 6r e l a lp h o a 1 3 细胞株 了凇l 舳耪 j u r k a t e 1 ( 夺鼠妊舶戒骨样细胞) 购自中国协和医科大学基础所细胞中心 1 4 主要溶液的配制 参见分子克隆实验手册和公司的产品说明书 1 5 工具酶及试剂 限带0 性内切酶( e c o r i 、b g l i i 、h i n d i i i 、s a l i 、b a m h i 、k p n i 、x h o i 、a p a i 等) 购自p r o m e g a 公司、t a qd n ap 0 1 y m e r a s e 、d n t p 购自t a k a r a 公司。t 4d n a1 i g a s e 购自p r o m e g a 公司。 1 6 分子量标准 d n a 分子量标准d l l 5 0 0 0 、d l 2 0 0 0 购自t a k a r a 公司 1 k b 和1 0 0 b p 的d n a1 a d d e r 购自p r o m e g a 公司 1 7 试剂盒 q i a q u i c kg e le x t r a c t i o nk i t 凝胶回收试剂盒、q i a q u i c kn u c l e o t i d er e m o v a l k i t 核苷酸纯化试剂盒、q i a g e np l a s m i dm i d ik i t 质粒中提试剂盒购自q i a g e n 公 1 0 北京协和医学院硕上学位论文 司；w i z a r d 。p l u ss vm i n i p r e p sd n ap u r i f i c a t i o ns y s t e m 质粒d 、提试齐u 盒购自 p r o m e g a 公司。 1 8 细胞培养基及细胞培养耗材 p r m i1 6 4 0 培养基、胎牛血清购自h y c l o n e 公司 d m s o 购自s ig i i l a 公司 g 4 1 8 购自a m r e s c o 公司 细胞培养瓶、培养板等细胞培养耗材购自c o s t a r 或b df a l c o n 公司 1 9 主要化学试剂 m t sa s s a y( c e l l t i t e r9 6 a q u e o u so n es o l u t i o nc e l lp r o l i f e r a t i o na s s a y ) 购自p r o m e g a 公司 c a s p a s e 3 7 检测试剂( n l ec a s p a s e _ g 1 0 。3 7 ) 购自p r 伽e g a 公司 r h t i 认i l( r e c o m b i n a n th u m a nt r a i l ) 购自r ds y s t e m s 公司 6 x h i sa b ( m o n o c l o n a la n t 卜p 0 1 y 叭s t i d i n ea n t i b o d y ) 购自r ds y s t 钿s 公司 1 1 0d n a 合成 d n a 寡核苷酸由上海英俊公司合成，具体引物名称及序列见附录 1 1 1 核酸序列分析 使用序列分析软件b i o e d i t 对序列进行分析。 1 1 2 主要仪器 仪器 来源及产地 普通冰箱 一8 0 冰箱 微量加样器 c o ：细胞培养箱 振荡混匀器 b i o f u g ep r i m o r 高速低温离心机 a v a n t i j 一2 5 高速冷冻离心机 5 4 1 5 d 台式高速离心机 d u 6 4 0 型紫外可见光分光光度计 紫外线荧光凝胶成像仪 l k b e p s5 0 0 4 0 0 型电泳仪 p t c 一1 0 0 型p c r 仪 温度梯度p c r 仪 l l 海尔，青岛 s a n y o ，日本 g i l s o n ，法国、e p p e n d o r f ，德国 s a n y oe 1 e c t r i cc o ，l t d ，日本 s c i e n t if i ci n d u s t r i e s i n c 美国 h e r a e u s ，德国 b e c k m a n ，美国 e p p e n d o r f ，德国 b e c k m a n ，美国 b i o r a dg e ld o c2 0 0 0 ，美国 p h a r m a ci a ，瑞典 m jr e s e a r c h ，i n c ，德国 德国 北京协和医学院硕士学位论文 电穿孔仪 p c r 仪u n i i 普通细菌培养箱 落地摇床 a b ip r i s m3 7 0 0 型d n ai 贝0j = 笋仪 g e ld o c2 0 0 0 型凝胶成像系统 m i ll i p a k 4 0 型纯水机 s i m f 1 2 4 型制冰机 0 1y m p u s 荧光显微镜 f l u o s t a ro p ，i i m a 发光检测仪 2 实验方法 b t xe c m 8 3 0 ，g e n e t r o n i c s ，美国 b i o m e t r o ，德国 广东 f o r m as c i e n t i f i c ，美国 p e r k i ne 1 m e r ，美国 b i o r a d ，瑞典 m i l l i p o r e ，法国 s a n y oe l e c t r i cc o ，l t d ，日 本 日本 b m gl a b t e c h n o l o g i e s ，德国 2 1 常规实验方法 各种试剂的配制、培养基的配制、琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶酶切、核酸 片段的连接等常规实验方法，如非特殊说明，基本上参照分子克隆或厂商 要求。 2 2 质粒的提取和纯化 用于测序和基因克隆操作的质粒采用分子克隆的碱裂解法。 2 3 用于转染真核细胞的质粒小提( w i z a r d p 1 u ss vm i n i p r e p sd n ap u r i f i c a t i o n s y s t e m ，p r o m e g a ) 挑单菌落于3m 1 含适当抗生素的l b 培养基中，3 7 培养过夜。 1 2 0 0 0r p m 离心1m i n ，收集菌体。 所得细菌沉淀中加入2 0 0ulr e s u s p e n s i o ns 0 1 u t i o n ，震荡充分重悬细菌。 加入2 0 0i i1l y s i ss o l u t i o n ，轻轻颠倒6 8 次， 加入1 0i lla l k a l i n ep r o t e a s es 0 1 u t i o n ，轻轻颠倒4 6 次，室温放置 不超过5m i n 。 加入3 5 0u ln e u t r a l i z a t i o n b i n d i n gs 0 1 u t i o n 轻轻颠倒4 6 次，1 2 0 0 0 r p m 离心1 0m i n 。 将离心1 0m i n 后得到的上清加入柱中，1 2 0 0 0r p m 离心o 5m i n 1m i n ， 弃去流出液。 1 2 北京协和医学院硕士学位论文 向柱中加入7 5 0ul 含乙醇的w a s hs o l u t i o n ， 1 2 0 0 0r p m 离心lm i n ，弃 去流出液。将柱子重新放入离心管中，1 2 0 0 0r p m 继续离心lm i n 。 将柱子放入新的离心管中，加入1 0 0u le l u t i o ns o l u t i o n ，室温放置lm i n ， 1 2 0 0 0r p m 离心1m i n ，收集流出液。 2 4 质粒大提( q i a g e np 1 a s m i dm i d ik i t ) 挑单菌落于3m 1 含适当抗生素的l b 培养基中，3 7 培养过夜。 将培养过夜的3m l 菌液转入1 0 0m l 含适当抗生素的l b 培养基中，3 7 培 养1 2h 1 6h 。 将1 0 0m l 菌液4 6 ，0 0 0g 离心1 5m i n ，收集菌体。 加入4m lb u f f e rp 1 ，重悬菌体。 加入4m 1b u f f e rp 2 ，轻轻颠倒4 6 次，室温放置5m i n 。 加入4m lb u f f e rp 3 ，轻轻颠倒4 6 次，冰上放置1 5m i n 。 4 1 3 ，0 0 0r p m 离心3 0m i n ，将上清转入新的5 0m 1 离心管中，4 1 3 0 0 0 r p m 继续离心1 5m i n 。 平衡柱子：将4m lb u f f e rq b t 加入q i a g e n t i p1 0 0 柱中，使其在重力作 用下自然流干。 将离心得到的上清加入柱子中，使其在重力作用下自然流干。 2 1 0m 1b u f f e rq c 洗柱。 5m 1b u f f e rq f 洗脱d n a 至干净的离心管中，加入0 7 倍体积的室温异丙 醇，混匀，4 1 3 ，0 0 0r p m 离心3 0m i n ，弃上清。 加入2m l7 0 乙醇洗沉淀，4 1 3 0 0 0r p m 离心1 5m i n ，弃上清。 待沉淀干燥后，加入1 5 0i ilb u f f e rt e 溶解d n a 。 2 5 p c r 产物和酶切体系的纯化( q i a q u i c kg e le x t r a c t i o nk i t ) p c r 产物或酶切体系经琼脂糖凝胶电泳分离后，切下所需条带，称重。 加入3 倍体积的b u f f e rq g ，5 0 水浴l om i n ，期间每2m i n 3 m i n 震荡 一次，以利于琼脂糖凝胶的溶解。 待琼脂糖凝胶完全溶解后，加l 倍体积的异丙醇混匀。 将q i a q u i c k 柱放入2m 1 收集管中。将样品加到q i a q u i c k 柱中，1 3 0 0 0r p m 离心1m i n ，弃去流出液。 1 3 ! ! 室堡塑堕兰堕堡主兰垡丝茎 加7 5 0ul 含乙醇的b u f f e rp e ，1 3 ，0 0 0r p m 离心1m i n ，弃去流出液。 将q i a q u i c k 柱重新放入收集管中，1 3 ，0 0 0r p m 继续离心1m i n 。 将q i a q u i c k 柱放入新的1 5m l 离心管中，加3 0u1 5 0u1b u f f e r 朗， 室温静置1m i n ，1 3 ，0 0 0r p m 离心1m i n ，收集流出液。 2 6 高效率电转化感受态的制各 挑取生长良好的e c o l it o p l 0 单克隆菌落，划线培养于l b 平板。 挑出分隔清楚的一个单菌落接种于2 0m 1l b 培养基，3 7 摇床，3 0 0r p m 震 荡过夜培养。 将2 0m l 菌液转到8 0 0m ll b 培养基中，3 7 摇床，3 0 0r p m 震荡培养2h 3h 至0 d 6 0 0 达o 5 0 6 。 将摇菌的锥形瓶置于冰上3 0m i n 6 0m i n ，不时轻轻摇动，使菌液迅速冷 却。 4 ，4 0 0 0g ，离心1 0m i n 收集菌体。 8 0 0m 1 灭菌去离子水( 4 ) 重悬菌体，4 ，4 0 0 0g ，离心2 0m i n ，弃上 清。 。4 0 0m l1 0 甘油( 4 ) 重悬菌体，4 ，4 0 0 0g ，离心2 0m i n ，弃上清。 2 0 0m l1 0 甘油( 4 ) 重悬菌体，4 ，4 0 0 0g ，离心2 0m i n ，弃上清。 以2m l1 0 甘油( 4 ) 重悬菌体，分装至0 5 le p 管，5 0ul 6 0i j1 管，一8 0 保存。 2 7 重组质粒的电穿孔转化 取一管感受态细胞置于冰上，加入1p 1 连接产物，混匀后移入冰预冷的电 击杯中。 电穿孔条件：电压2 5k v ，电阻2 0 0q ，电容2 5 虾。一般情况下，电击时 间常数在4 3m s 5 2m s 之间，表示电击成功。 加入1m 1l b 培养基，3 7 摇床3 0 0r p m ，复苏4 5m i n 。 取一定体积的复苏菌液( 1 0 0u1 2 0 0u1 ) 均匀涂于含适当抗生素的l b 平板，3 7 过夜培养。 2 8 测序 使用a b i 公司的3 7 0 0d n a 测序仪，在北京诺赛基因组研究有限公司测序。 2 9 细胞培养：j u r k a t 1 4 北京协和医学院硕士学位论文 2 9 1 细胞复苏： 用烧杯接4 0 温水。 从液氮中取出冻存细胞的冻存管，迅速放入烧杯中使其尽快融化。 待冻存液完全融化后，吸取冻存管内容物于含8 m l 完全培养基的离心管中， 于8 0 0r p m 离心5m i n ，去除冻存液。 将细胞重悬于新鲜培养基中，将其转移至t 一2 5 细胞培养瓶中置3 7 ，5 c 0 2 培养箱中培养。 2 9 2 细胞传代培养： 所用培养基p r m l l 6 4 0 完全培养基( p r m l l 6 4 0 、1 0 f b s 、1 谷氨酰胺、1 双 抗) 。 细胞每1 2 天传代一次。传代时取适量细胞悬液转入离心管，8 0 0 r p m ，5 m i n 离心收集细胞。弃上清后，以一定体积的新鲜培养基重悬细胞，并将细胞悬 液转移到新的培养瓶中，置3 7 ，5 c o ：培养箱中培养。 2 9 3 细胞冻存： 冻存液配制：完全培养基5 0 ，f b s4 0 ，d m s 01 0 。 将需冻存的细胞按照传代时的方法消化，离心。 将细胞沉淀重悬于冻存液中，细胞浓度约2 3 1 0 6 m l 。将细胞悬液分装 至冻存管中，标明细胞系的名称、代数、日期。 将冻存管置4 3 0m i n ，一2 0 1h ，一8 0 过夜。 次日将冻存管转移至液氮中。 2 1 0 j u r k a t 细胞稳定转染 使用电穿孔的方法转染j u r k a t 细胞，操作简述如下： 转染前一天j u r k a t 细胞换液。转染当天8 0 0 r p m ，5 m i n 离心收集细胞后预冷 无血清p r m i1 6 4 0 培养基重悬、洗涤细胞并再次离心收集。少量预冷无血清 p r m i1 6 4 0 无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度至约1 1 0 7 个m 1 。 转染所用质粒使用含去除内毒素程序的质粒大提试剂盒提取。质粒使用无菌 水溶解，浓度 l u g u l 。 取细胞悬液5 0 0 u 1 与5 0 u g 待转染d n a ( d n a 浓度 1 u g u 1 ) 混匀后加入4 硼 g a p 的预冷电转杯上电转仪电转。电转仪参数设置为：l v ，3 0 0 v ，1 0 m s ，单 次电击。 北京协和医学院硕士学位论文 细胞电击后冰浴l o m i n ，然后室温