（分析化学专业论文）新型双子表面活性剂在毛细管胶束电动色谱中的应用.pdf

硕j ：学位论文 摘要 毛细管电泳( c e ) 是一类以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依 据样品中组分之间电泳淌度和分配容量的差异，进行分离的一种色谱分析技术。它 具有分离模式多、分离效率高、分析速度快、灵敏度高、进样量少和应用范围广 等特点。其应用已涉及到医药检测、环境检测和生命科学等诸多领域。表面活性 剂在毛细管电泳中的应用颇多，主要用做毛细管胶束电动色谱中( m e k c ) 的伪 固定相。m e k c 需要在缓冲液中加入高于临界胶束浓度的表面活性剂形成胶束。 被分离物质在水和胶束两相之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移，达到分离。 新型双子表面活性剂拥有连接两个头基的中间基和两条长链疏水链。中间基长度 和类型对此类表面活性剂的物化性质有着重大的影响。因此双子表面活性剂性能 独特，除比传统的表面活性剂性能优越外，还具有中间基可调的性质。中间基为 零的表面活性剂作为固定相时，头基的电荷分布和双疏水链性质将影响到分析物 与伪固定相的作用，而具有中间基的双子表面活性剂将要考虑更多，例如中间基 对胶束或者囊泡形态的影响，中间基对分离选择性的影响，中间基对电渗流稳定 性的影响等等。因此本文开展了双子表面活性剂在以下几个方面的工作： 1 无中间基的双子表面活性剂的应用，即双链阳离子表面活性剂双十二烷基二甲 基溴化铵( d d a b ) 作为伪固定相，在胶束电动色谱( m e k c ) 中分离酸、碱、 中性三类典型的药物。尼古丁、可替宁、利多卡因、普鲁卡因、咖啡因五种碱 性药物在含0 0 8m md d a b 的5 0m m 磷酸( p h4 0 ) 缓冲溶液中得到最佳分离。 该m e k c 方法在分离酸性药物阿莫西林和氨苄青霉素同样具有优势。间苯二 酚、1 萘酚和2 萘酚三种中性药物在含3 0 乙腈的o 1m md d a b 缓冲液中得 到最佳分离。 2 新型阳离子双子表面活性剂作为开管毛细管电色谱固定相，分离分析了无机阴 离子。可调型的双子表面活性剂，通过中间基长度的增加，使分离的选择性得 到改善。双子表面活性剂( 18 1 0 18 ) 作为固定相在3 0 ( v v ) 甲醇水混合溶液体 系中，分离无机阴离子日内( r s d 1 0 0 ) 和日间( r s d 2 5 ) 迁移时间 的重现性都非常好。离子检测线的范围从0 0 4 到1 2 8i t g m l 。实验结果证明这类 双子表面活性剂稳定好，分离选择性可调，且是简便可更新的固定相，能够解 决常规的固定相的许多缺点。 3 新型阳离子双子表面活性剂作为伪固定相，用于c e 中同时分离了酸碱蛋白。 在最佳条件下( 含0 1m m 双子表面活性剂1 0m m 的磷酸缓冲溶液p h3 0 ) ， 蛋白质分离日内( r s d 0 7 6 ) 和日间( r s d 3 的缓冲溶液中，硅羟基解离使毛细 管内壁表面带负电荷，产生负的定域电荷，并在一定距离内形成阳离子相对过剩 的扩散双电层，其结果是产生指向负极的电渗流。 电泳是指在缓冲溶液中，带电粒子在电场作用下，以各自不同速度向其所带电 荷极性相反方向移动。当在毛细管两端加上电压时，离子会受到电场力的作用， 这与离子所带的电荷量有关。 带电粒子在毛细管缓冲液中的迁移速度等于电泳和电渗流的矢量和有效电泳 淌度。各种粒子由于所带电荷多少、质量、体积以及形状不同等因素都会对有效 电泳淌度造成影响。 e o f 。o f ) 、电泳淌度( m ) 和有效电泳淌度 。f f ) 计算采用下列公式： c o f = l d l t f 耐y 。= l d l t t 。v ( 1 1 ) ( 1 2 ) e f r = m + 。f ( 1 3 ) 其中厶和d 分别为毛细管总长和到检测窗口的长度，。o f 和分别为e o f 标 记物和分析物的迁移时间，矿为应用电压。 1 1 1 2 仪器结构 毛细管电泳基本仪器结构女f l f i g u r e1 1 ，主要部件有o 3 0k v 可调稳压稳流电 源，内径小于1 0 0 “m ( 常用5 0 7 5 “m ) 、长度一般为3 0 1 0 0c m 的熔融石英毛细管、 电极槽、柱上检测器和进样装置。检测器有紫外一可见分光检测器、激光诱导荧光 检测器和电化学检测器。常用进样方法有电动法、压力法和扩散法。成套仪器还 配有自动冲洗、自动进样、温度控制、数据采集和处理等部件。在毛细管和电极 槽充有相同组分和浓度的背景电解质( 缓冲溶液) 。样品从毛细管进样端导入，在 毛细管两端加上电压后，带电溶质朝与其电荷极性相反的电极方向移动。若样品 硕卜学位论文 组分淌度不同则迁移速度不同，一定时间后各组分按其淌度大小依次通过检测器 被检测出，得到按时间分布的电泳图。 f i g u r e1 1s c h e m a t i cd i a g r a mo fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 1 ) ah i g h - v o l t a g ep o w e rs u p p l y ，2 ) c a p i l l a r y , 3 ) b u f f e rr e s e r v o i r s ，4 ) p te l e c t r o d e s ，5 ) ad e t e c t o r 1 1 2 毛细管电泳分离模式 毛细管电泳的多样化是由于它有多种操作方式，各种方式的分离机理不相同， 它们能够提供互不相关而又相互补充的信息，而且有可能同时分析所有不同带电 状况的物质。这是毛细管电泳在出现后不久就被广泛地接受并逐步应用到各个领 域的原因之一。目前，毛细管电泳的分离模式有以下几种： 1 1 2 。1 毛细管区带电泳 毛细管区带电泳( c z e ，c a p i l l a r yz o n ee l e e t r o p h o r e s i s ) 是毛细管电泳中最基本、 应用最普遍的一种分离模式3 1 , 3 2 】。它是在毛细管内进行的自由溶液区带电泳。采 用均一的、组成不因电场作用而发生变化的电解质体系。通常具有p h 缓冲能力的 缓冲体系充当背景电解质，其作用提供自由移动的阴阳离子成为电流通过的介质， 建立恒定电场，并影响样品组分的有效淌度。当样品组分从毛细管一端引入后， 各组分在电渗流和电场力的双重作用下以恒定但不同的速度向另一端迁移，经过 一定时间后被分成不同区带。分离基于离子组分之间有效淌度的差异，而所有的 中性化合物只受电渗流作用，淌度与电渗流相同，所以c z e 可以有效地实现阴阳 离子同时分离，但对中性组分无分离效果。 1 1 2 2 毛细管胶束电动色谱 毛细管胶束电动色谱( m e k c ，m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y ) 由t e r a b e 1 7 , 3 3 1 等首次提出，在背景电解质溶液中加入超过其临界胶束浓度( c m c ， c r i t i c a lm i c e l l ec o n c e n t r a t i o n ) 的表面活性剂作为添加剂。当表面活性剂的浓度超 新型双了表面活性剂在毛细管胶束电动色谱的应用 过了c m c 后，就形成有疏水内核，外部带电的胶柬。分离通道中的样品各组分除 受电场作用以外，也在胶束和流动相之间进行分配，根据两相分配系数差异而进行 分离。中性化合物因其本身疏水性不同，在两相中分配存在差异而得以分离，使 非荷电物质的分离成为可能，最终能够实现正负离子及中性化合物的同时分离。 m e k c 是唯一的一种既适宜分离带电组分又能分离中性化合物的模式。阴离子型、 阳离子型、中性或两性离子型表面活性剂形成的胶束，其作用类似于色谱固定相， 被称为“伪固定相 ( p s p ，p s e u d o s t a t i o n a r yp h a s e ) 。常用的表面活性剂有单链阴 离子型的十二烷基硫酸钠( s d s ) 和单链阳离子型的十六烷基三甲基溴化铵 ( c t a b ) 。 1 1 2 3 毛细管筛分电泳 毛细管筛分电泳( c s e ，c a p i l l a r ys i e v i n ge l e c t r o p h o r e s i s ) ，下分为凝胶 3 4 , 3 5 1 和无 胶筛【3 6 】两类。毛细管凝胶电泳c g e 由k a r g e r 于1 9 8 7 年提出，将凝胶移到毛细管中 作为支持介质的方法。管中凝胶起到“分子筛 的作用。样品中各组分不仅受电 场力的作用，而且还受凝胶的尺寸排阻效应( 分子筛效应) 的影响，因此可进一步 提高分离度。对荷质比接近但分子大小形状不同的样品，如蛋白质、r n a 、d n a 及其碎片有很高的分离能力。常用的凝胶材科有聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶，又分 交联和非交联凝胶两类。另有将聚合物溶液等具有筛分作用的物质，如葡聚糖、 聚环氧乙烷，装入毛细管中进行分析，称毛细管无胶筛分电泳。 1 1 2 4 亲和毛细管电泳 亲和毛细管电泳( a c e ，a f f i n i t yc a p i l l a r ye l e c t o p h o r e s i s ) 是指在电泳过程中具有 生物专一性亲和力的抗原和抗体，发生了特异性相互作用，形成了受体一配体复 合物，通过研究受体或配体在发生亲和作用前后的电泳谱图变化，可获得有关两 者亲和力大小、结构变化、作用产物等方面的信息【3 7 】。亲和试剂可以在毛细管内 壁涂布或作为缓冲溶液的添加剂。a c e 技术广泛地应用于分子生物学和生物化学 等研究领域，如核酸片段的特异性识别、蛋白相互作用、竞争性免疫分析、药物一 受体和药物一蛋白作用研究等。此外，a c e 也可用于提高毛细管电泳分析灵敏度、 选择性和分辨率。根据样品在配体加入前后迁移时间变化，可判断样品与配体是 否发生亲和相互作用，并可估计亲和力大小。这种方式适于相互作用双方结合力 较弱、在电泳过程中不断进行结合与解吸过程。还可将亲和配体化学键合到毛细 管柱上，制成亲和毛细管柱，亲和毛细管柱增加分离选择性，延长与亲和配体作 用力强的样品组分出峰时间。 硕t 学位论文 1 1 2 5 毛细管电色谱 毛细管电色谱( c e c ，c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ) 是近年发展起来的一种新 型微分离分析技术，将高效液相色谱( h p l c ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ) 中的固定相微粒填充到毛细管中( 或涂渍到毛细管壁) ，以样品在 固定相流动相之间的分配为分离机制，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程【3 3 1 。 此模式是毛细管电泳与色谱法相结合的产物，不仅要考虑系统的电属性，还需兼 顾溶质的两相分配特征，兼具电泳和液相色谱的分离机制，同时具有毛细管电泳 的高分离效率和液相色谱的选择性。它整合了毛细管电泳与微径柱液相色谱的优 点，达到其对痕量复杂生物及化学体系样品优越的分离能力。但c e c 用毛细管柱 制备难度高和操作条件苛刻是其不便之处。 1 1 2 6 毛细管等电聚焦 毛细管等电聚焦( c i e f , c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ) 采用p h 梯度，它使样品组 分发生变速迁移，因其等电点的不同而分离 3 9 1 。毛细管先将样品和两性电解质混 合进样，两个电极槽中分别为酸和碱背景电解质，在外加电场的作用下，背景电 解质的组成沿毛细管轴向发生变化，各种两性电解质按其等电点大小顺序依次排 列，形成稳定的p h 梯度，然后溶质在毛细管中迁移至各自的等电点，因失去电荷 而停止移动形成明显区带从而实现分离。当聚焦后用压力或改变电解质体系驱使 溶质通过检测器。 1 1 2 7 毛细管等速电泳 毛细管等速电泳( c i t p , c a p i l l a r yi s o t a c h o p h o r e s i s ) 是一种不连续介质电泳分离 模式。采用前导电解质和终结电解质两种不同的电解质缓冲溶液【4 0 1 。所有样品离 子淌度小于前导电解质的淌度，小于终结电解质的淌度，所以样品离子被夹在前 导电解质和终结电解质之间。当毛细管两端加上电压后，样品组分按其淌度大小 依次连接迁移，得到了互相连接而又不重叠的区带。因为区带间连续运载电流， 则后一区带受前一区带速度的控制。依次类推，所有区带都受前导电解质的控制 并按前导电介质的速度等速前进，故称“等速电泳。c i t p 是富集浓缩样品的常 用方法。 以上模式中以c z e 为毛细管电泳中最基本的方式。其它分离模式都是通过在 c z e 中的毛细管和缓冲液进行修饰而衍生出来，是建立在c z e 上的扩充。因c z e ， m e k c 和c e c 的通用性和可调节性大，较常使用。 1 1 3 毛细管电泳的应用 毛细管电泳应用十分广泛，例如分子生物学、基因组学、蛋白质组学、糖生物 新型双了表面活性剂在毛细管胶束电动色谱的应用 学、各种生物技术、生物化学、细胞学等生物或生命科学以及医药、食品和环境 等等领域，现选择一些重要应用及重要发展作简要介绍。 1 1 3 1 药物分离 药物分析主要分两个部分。一是对原药物材料的药物活性成分定性分析及组分 的定量分析，药物制剂的组分定量定性分析和稳定性的评价，和以药品质量管理 为目的的测试方法。这些方法要求有良好的选择性，适当的分析灵敏度，可靠的 重现性和准确度等。二是对进入人体内的药物或代谢物的吸收、分布、代谢和排 泄等体内动态的研究，即临床药物分析【1 2 , 1 3 , 4 1 - 4 3 】。药物分析其中包括是手性药物 的鉴别：基因工程药物的纯度检测和分子量测定；h p l c 或其它方法难于解决的药 物质量难题方面。c e 的高分离性能和超微量进样成为药物分离分析的一大优势。 目前，手性药物在新药中所占比例在逐年增高【4 引。手性对映体分离、鉴定有巨大 的应用价值，已成为医药领域内一个重要课题。c e 进行手性分离，通常均在运行 缓冲液内加人手性选择剂，在操作及分离效率上均优于h p l c 手性分离。今后c f 手 性分离将会在发展更多手性选择剂、更深入地探讨分离机理及手性药物在体内的 作用及代谢等方面开展研究。另一方面c e 在临床化学中除进行临床分子生物学测 定外，也广泛地用于疾病临床诊断、临床蛋白分析、临床药物监测和药物代谢研 究 4 5 - 4 6 。药物代谢研究对c e 是一个挑战。目前，医药领域内大量研究工作c e 在药 物和临床研究领域已成为不可缺少的有力手段，正在走向成熟。 1 1 3 2 蛋白质分离 毛细管电泳对于蛋白质分离分析方面，主要集中在物化常数的测定，组成或成 分分析、结构分析及相互作用研究。毛细管筛分电泳c s e 能快速准备地定量测定蛋 白质分子，并对尺寸进行分离【4 7 4 引。用c i e f i 贝! j 定未知蛋白质的等电点，并能得到 高达1 0 0 倍的富集技术【4 9 1 。蛋白结构的完全表征尚需采用多种c e 模式，结合多种 仪器联用，特别是和m s 等联合使用或联用，才能得到正确结果。当c e m s 联用进 行分析，可推断蛋白质的分子结构，分析更加复杂的样品，并且提高选择性，使检 测限更低【5 0 巧2 1 。毛细管电泳技术参与到蛋白质一级数据库，包括蛋白质一级结构 表征的内包括纯度、含量、等电点、分子量、肽谱、氨基酸序列和n 端序列的测定 等【5 3 1 。用亲和毛细管电泳进行蛋白质本身反应及和小分子相互作用研究是研究热 点，如亲和常数测定、特异性相互作用、蛋白质结合或降解反应、酶动力学、抗 体一抗原结合动力学、受体一配体反应动力学等等【5 4 确1 。 1 1 3 3d n a 分析 自从1 9 8 8 年c e 被用应用到d n a 分析【5 7 制】至今，d n a 的c e 分析在这段时间 内成为了一个较为成熟的领域【8 , 5 9 】。现在的d n a 研究已经离不开c e ，包括碱基、 硕上学位论文 核苷、核苷酸、寡核苷酸、引物、探针、单链d n a 、双链d n a ( d n a 片段、p c r 产物) 分析及d n a 序列测定。c z e 和m e c c 通常用来分离碱基、核苷酸、简单的 核苷酸等【6 0 , 6 1 】。c g e 可以进行尺寸分离，或用于较大的寡核苷酸、s s d n a 、d s d n a 和d n a 序列分析【6 2 1 。高压分离和毛细管阵列技术使得d n a 分析高速和高通量化， 解决了基因组计划中的高速测序问题，取代了传统的平板凝胶电泳测序系统1 6 3 1 。 d n a 分析中c e 分离、鉴别p c r 扩增产物及d n a 基因突变是其重要发展方向。 1 1 3 4 单细胞分析 只分析一个细胞的c e 操作叫做单细胞分析 1 5 , 6 4 - 6 6 】。细胞膜上存带电基团，这 使得细胞能够在电场中迁移。自由溶液的c e 模式对生物细胞和生物粉子环境友好。 单细胞分析的内容包括：测定细胞胞浆内各种物质的含量；获得反映细胞生理状 态和生化过程的更准确、更全面的信息；了解细胞群体中某些特殊的细胞功能； 认识细胞个体差异、细胞间相互作用和信息传递以及神经递质、药物或毒物刺激 的生理影响等更深层次的信息。已报道对单个肾上腺细胞、红细胞、白血病细胞、 淋巴细胞、嗜铬细胞和胚胎细胞等均取得一定的成功。单细胞c e 分析打开了生命 科学的新天地，对生命科学和化学有巨大潜在意义。 1 1 3 5 离子和小分子分析 毛细管电泳应用广泛不单包括生物大分子，而且还涉及有机小分子和无机小离 子。有机小分子酸类的分析测定方法和无机阴离子两者相似【6 7 。6 9 1 。有机小分子酸 的分离方法主要采用c z e 和m e k c 7 0 , 7 1 】。但是随着有机小分子酸碳链的增长，水 溶性降低、疏水性加强而且容易在溶液中形成胶束，因此要在缓冲溶液中加入选 择试剂或者有机试剂来增加分析物的分离度和溶解性。阳离子( 主要包括：碱金属、 碱土金属、过度金属离子) 间的有效迁移差异小，需要加入较弱的络合剂与被测离 子形成络合物，从而根据络合分配常数的不同将有效迁移相似或者区别不大的离 子分离【7 。6 9 】。无机阴离子电泳方向和电渗流方向相反而速度相当，因此c e 分离 无机阴离子的关键是在背景电解质溶液中加入改变电渗流方向的添加剂c t a b ， 同时加入有机试剂改善分离的选择性【_ 7 2 】。c e 离子和小分子技术主要应用在环境科 学和食品工业中阴离子和阳离子的检测。 1 2 表面活性剂用于毛细管壁涂层 1 2 1 毛细管壁涂层的研究进展 毛细管是c e 分离和检测的通道，是其核心组成部分。它容积小、截面积大、 在介质中产生平头状电渗流的特点，使c e 具有高效、快速、微量、经济、自动等 优点。毛细管电泳虽然已经发展了几十年，但仍有很大的发展空间，其中蛋白质 新型双子表面活性剂在毛细管胶束电动色谱的应用 的分离是最热门的研究课题之一，也是一个难点【7 引。在很宽的p h 范围内毛细管的 硅羟基都会解离，使管壁带负电荷，这是电渗流产生的根源。毛细管内壁由于硅 羟基存在引起的吸附，在分离生物大分子如蛋白质、肽、d n a 等大分子物质情况 尤为严重。因为它们具有高级结构，具有除主要静电作用以外，还存在疏水、氢 键、范德华力等多种作用力，极易吸附在管壁。这些生物大分子吸附在管壁表面， 不仅使峰展宽、峰形变差，影响了分离效率和检测灵敏度，定性定量困难，而且 此时毛细管的电渗流大小不稳定，造成基线不稳，峰迁移的重现性变差等一系列 危害。因此，对管壁进行修饰以改变电渗流的大小甚至是方向，来消除吸附是很 有必要的。 如今如何控制电渗流及消除吸附成为毛细管柱研究的重要内容，研究工作十分 活跃。很多方法被研究应用，如极端p h 【7 4 1 ，高离子强度缓冲溶液7 5 1 和涂层技术f 7 6 椰】 等。目前控制电渗和抑制吸附的主要方法是涂层技术。涂层应该有以下几个特点： 分离效率高，回收率高，重复性好，要求易操作，便宜，适用的p h 范围宽等。其 中表面活性剂的动态涂层和半永久涂层，为管壁改性修饰提供了多种可能的选择。 1 2 2 动态涂层 动态修饰采用在运行缓冲液中加入添加剂，在内壁形成物理吸附层，抑制e o f 或者使e o f 反向。根据添加剂的性质，这种方法的主要优点是易于制备，且容易 更新。阳离子表面活性剂常被用作缓冲液添加剂应用到c e 的动态涂层。它能够改 变毛细管壁的电荷量和符号，用于电渗大小和方向的控制，改善分离【7 8 。8 0 1 。它们 易和管壁解离的硅羟基产生强烈的静电作用，吸附在管壁上。当阳离子添加剂的 浓度低时可抑制电渗流；当浓度高时，它和负电荷中和完全，管壁不带电荷时可消 除电渗流；如果阳离子添加剂的浓度再不断增大，将会产生相反方向的电渗流， 且随着添加剂浓度的增大，电渗流也不断增大。 单链阳离子表面活性剂，女i t t a b 和c t a b 【7 9 】。c t a b 的动态涂层在2 5m m 磷酸 缓冲溶液p h3 0 分离溶菌酶，a 胰凝乳蛋白酶a ，核糖核酸酶a 这三种蛋白质时， 分离效率达至u 5 0 00 0 0p l a t e s m 1 1 2 3 j 。当c t a b 在1 5m mt r i s - h c i 缓冲溶液( p h3 4 5 和p h4 6 0 ) 不但可以使前三种蛋白质的分离效率同样达至u 5 0 00 0 0p l a t e s m ，还可 以让蛋白质细胞色素c 和胰蛋白酶原在最佳条件下同样达至, j 3 0 00 0 0p l a t e s m 。 当双链表面活性费u d d a b 添加到缓冲溶液中，形成半永久涂层。相对在相同条件下 c t a b 只能分离三种蛋白质时，d d a b f l 邑够在2 5m m 磷酸缓冲溶液p h4 o 分离五种 蛋白质，且分离效率高于c t a b 8 0 】。 1 2 3 半永久涂层 对比上面的动态涂层法，半永久涂层与其的最大区别在于：半永久涂层预处理 过程中多余的表面活性剂，会被不含表面活性剂的缓冲溶液在冲洗的过程中带出 硕l j 学位论文 分离通道，并且在分离缓冲溶液中无需加入佟玉酣1 。半永久涂层能够在一定时间和 分离次数中保持涂层的完整性，提供稳定的电渗流。而当涂层发生衰减脱落时， 只需再用含涂层试剂的缓冲溶液按预处理的方法再次更新涂层，即可再生。 因此半永久涂层需要稳定性能更好的表面活性剂。双链表面活性剂d d a b 因其 c m c 低和特殊的囊泡结构，被证明比单链表面活性剂涂层性能更加稳定【8 2 。8 4 1 。l u c y 小组首次将d d a b 用做半永久涂层，在2 5m m 磷酸缓冲溶液p h4 0 分离四种蛋白 质，分离效率达至1 j 5 6 00 0 0 7 5 00 0 0p l a t e s m 。蛋白质峰迁移时间的平均标准偏差 r s d 为0 8 1 0 ( n = 1 0 ) 。在连续的电泳条件下，运行7 5m i n 后，反向的电渗流仅仅 下降3 。在p h2 o 时，d d a b 的反向电渗流 ：l c t a b 高6 0 t 8 2 j 。有文章报道，d d a b 在2 5 “m 的毛细管中0 0 7mn h 4 a c 缓冲溶液p h4 0 下能稳定运行5 4 0m i n 而不需要 重新涂层【8 3 】。涂层的步骤只需用1 0m md d a b 水溶液在高压下冲洗平衡5m i n ，并 平衡重复三次。分离蛋白质时，峰面积的平均标准偏差r s d 为1 1 ( n = 1 0 ) 。有文 章报道d d a b 双链类型不同链长的阳离子表面活性剂用做半永久涂层，在c e 中分 离蛋白质【8 3 1 。 1 3 表面活性剂作为m e k c 伪固定相的研究进展 自从在背景电解质溶液中添加胶束来修饰毛细管电泳技术【l7 1 ，胶束电动色谱 e k c 使c e 能用于中性物质的分离并提高了分离的选择性，扩展了高效毛细管电 泳的应用范围，对c e 有极大的贡献。 1 3 1 毛细管胶束电动色谱的基本理论 中性化合物可以溶解于胶束中，所以其迁移不但与电渗流e o f 有关，而且与胶 束的迁移也有关系【85 1 。当中性化合物完全溶解到胶束中，与胶束形成一体时，分 析物的速率与胶束的迁移速率相同。其他的中性化物的迁移时间在e o f 的迁移时 间f o 和胶束的迁移时间，m 。之间。在e o f 的迁移时间，o 和胶束的迁移时间，m 。之间的时 间间隔被称为迁移时间窗1 3 8 6 - 8 9 】。窗口越宽，一次运行中分离出峰的数目即峰容 量，就越大。迁移时间可以通过甲醇作为电渗流标记物测定电渗流迁移时间，采 用s u d a ni i i 作为标记物测定胶束迁移时间。而阴、阳离子的m e k c 分离机制与中性 分子不同 9 0 , 9 1 】。在离子的m e k c 分离过程中，电泳与色谱两种分离方式同时起作 用。除了在水与胶束两相之间进行分配之外，阴离子的迁移方向与e o f 方向相反， 所带电荷与胶束的相同而相互排斥，因此阴离子的k 大于胶束的t m 。阳离子迁移 方向与e o f 一致，所带电荷与胶束相反而相互吸引，因而阳离子的靠介于e o f 与胶 束之间。 类似色谱上的一些参数可以应用至i c e 中来描述分析物的迁移行为。例如，色 谱中的参数保留因子k 也可以用来解释c e 中分析物的迁移行为。保留因子k 被定义 新型双了表面活性剂在毛细管胶束电动色谱的应用 为： 七：垒 肌a q ( 1 4 ) 在公式中，? m 。和以a 。分别代表分析物在胶束和周围溶剂中的质量摩尔数。对于中性离 子分析，迁移时间( r ) 主要取决于e o f 的迁移时间f o 和胶束的迁移时间f m 。由t o 和 k 。和计算的分析的动力学参数一一保留因子k ： 拈抵 ( 1 5 ) 这个方程与色谱中用到的传统计算保留因子k 公式的不同点在于胶束电动色谱 m e k c 的迁移时间窗口f r f m 。尽管胶束没有固定在毛细管内，但它与色谱中的固 定相扮演着相同的角色，所以被称之为“伪固定相”。 1 3 2m e k c 中表面活性剂伪固定相的种类 表面活性剂其分子结构均由两部分构成。分子的一端为非极性亲油的疏水基， 有时也称为亲油基；分子的另一端为极性亲水的亲水基，有时也称为疏油基或形 象地称为亲水头。两类结构与性能截然相反的分子碎片或基团处于同一分子的两 端并以化学键相连接，形成了一种不对称的极性的结构，因而赋予了该类特殊分 子既亲水、又亲油，但又不是整体亲水或亲油的特性。表面活性剂的这种特有结 构通常称之为“双亲结构 ，表面活性剂分子因而也常被称作“双亲分子”。当 水溶液中表面活性剂浓度超过一定值( 称为临界胶束浓度，c m c ) 时，表面活性剂单 体会聚集成胶束，或称之为胶团。在胶束中，表面活性剂的非极性端朝内聚集在一 起，形成一个疏水空腔，而极性端朝外，使胶束能稳定地溶于水 3 3 , 9 2 】。构成胶束的 离子类型分为阴离子、阳离子、非离子和两性离子表面活性剂等。 1 3 2 1 离子表面活性剂伪固定相 t e r a b e 等人首先将十二烷基硫酸钠( s d s ) 应用到m e k c 的电泳分离技术【l 7 ， 从而大大拓宽了c e 的应用范围，使之可以分离测定不带电荷的中性分子。s d s 成为最常用的阴离子表面活性剂。它具有较小的临界胶束浓度( c m c8 1 1 0 一m ， 2 5 纯水中) 【8 5 】。同时类似与s d s 的阴离子表面活性剂都得到了发展。阳离子表 面活性剂也可用作m e k c 的伪固定相，进行中性分子或离子型化合物的分离。 c t a b 是最常用的阳离子表面活性剂，不但可以形成胶束，还能因为带正电荷与 毛细管壁作用而控制电渗流【9 3 】。此类阳离子表面活性剂与阴离子表面活性剂还有 着不同的选择性。根据线性自由能的研究1 9 引。c t a b 既是氢键的给体也是受体。 c t a b 替代s d s 使用可以作为改变选择性的一种变换。 硕十学位论文 1 3 2 2 非离子和两性表面活性剂伪固定相 非离子表面活性剂在水中不发生电离，是以羟基或醚键为亲水基的两亲结构分 子。在m e k c 中，用作m e k c 的伪固定相，并可以控制电渗流。虽然非离子表面 活性剂自身不能形成电泳淌度，但是非离子表面活性剂形成的胶束来分离化合物。 d e s b 6 n e b 等人用非离子表面活性剂o c t a e t h y l e n eg l y c o lm o n o d o d e c y le t h e r ( c 1 2 e s ) 分离吩噻嗪和它的去甲基衍生物，获得很好的基线分离效果【9 引。尽管c 1 2 e 8 可以 在高浓度下使用而无需提高离子强度，但最佳的分离浓度只需要非常低的c 1 2 e 8 浓度。这是因为因为本身c 1 2 e 8 的c m c 就比较低，同时胶束和吩噻嗪化合物存在 很强的作用。t e r a b e 小组利用烷基聚氧乙烯醚类型的非离子表面活性剂 p o l y e t h y l e n eg l y c o ld o d e c y le t h e r ( b r i j3 5a n db r i j58 ) 在m e k c 中用于带电分析物 的柱上富集【9 6 1 。峰高富集效果达到1 0 0 倍。样品的堆积效果可以应用到高浓度的 背景溶液中。非离子表面活性剂也可以与离子表面活性剂一起使用。大部分非离 子表面活性剂有乙氧基官能团，因此非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂形成 的混合胶束有不同于阴离子表面活性剂胶束的选择性【9 7 1 。 两性离子表面活性剂，这类表面活性剂的分子结构中同时具有正、负电荷基团， 在不同p h 值介质中可表现出阳离子或阴离子表面活性剂的性质。在m e k c 伪固 定相使用的不多，主要进行多肽的分离【9 8 1 。现在主要用于两性离子表面活性剂用 于混合胶束或者修饰胶束【9 9 d0 1 】。这是由于它们有与其他表面活性剂明显不同的选 择性。有报道利用两性离子表面活性剂3 ( n , n - d i m e t h y l h e x a d e c y l a m m o n i u m ) p r o p a n e s u l f o n a t e ( p a p s ) 和非离子表面活性剂b r i j3 5 的混合胶束分离维管组织的 水解产物，来改善分离的选择性【l o o 】。t e r a b e 等人采用n - d o d e c y l ，n d i m e t h v l a m m o n i u m 3 p r o p a n e 1 s u l f o n i ca c i d ( s b 1 2 ) 两性表面活性剂和阴离子表 面活性剂的混合胶束在m e k c 中进行柱上富集【l 叭j 。混合的胶柬相对一般的胶束 具有两大特点，较大的胶束直径和适度的表面电荷，使得它们在分离阴离子和疏 水化合物有很好的表现，同时能够提高c e 的浓度灵敏度。 1 3 2 3 手性表面活性剂伪固定相 在表面活性剂中引入手性基团即可得到手性表面活性剂。手性表面活性剂用于 对映异构体的c e 分离，包括天然的与化学合成的两大类。胆汁盐是天然离子型的 手性表面活性剂，既有疏水基也有亲水基，并且他们的亲水基能形成手性胶束 1 0 2 - 1 0 4 】。t e r a b e 等人用胆酸盐m e k c 法分离了三种药物和几种氨基酸的对映体【1 0 5 1 ， 研究了胆酸盐种类对分离的影响，其中以脱氧牛胆酸盐的效果最好。化学合成的 表面活性剂如氨基酸类，糖类手性化合物，聚合物手性化合物等等。而在所有的 手性表面活性剂中，基于单体或聚合物的氨基酸表面活性剂是最常用的。手性识 别决定于待测物与胶束中手性基团的疏水相互作用，因此选择性和分离度与氨基 新型双了表面活性剂在毛细管胶束电动色谱的应用 酸侧链的疏水性有很大关联。d e y 1 0 6 】利用氨基酸衍生的表面活性剂来研究氨基酸 头基的空间位阻因素和对映异构体分析中的亲水和疏水作用，用来分析异构化合 物。结果证明头基对异构体的选择性有很大影响。 1 2 2 4 聚合物表面活性剂伪固定相 聚合物胶束具有高分子量的化合物，m e k c 胶束发展的又一大变化趋势。可以 分为聚合胶束和聚合物表面活性剂。其中聚合胶束是指单体表面活性剂胶束的聚 合物。聚合物表面活性剂是指具有表面活性剂性质的聚合物，如丙烯酸类共聚物， 聚丙烯酸丁酯2 甲基丙烯酸丁酯2 甲基丙烯酸( b b m a ) 【1 0 7j 。它们同传统小分子量 表面活性剂相比，具有几大不同特性。由于它们是通过共价键键合而成，不具有 c m c ，可以在低于它们单体化合物的c m c 下使用。稳定的聚合物表面活性剂胶束 性质使其的应用不受缓冲溶液的影响，这样可以在低离子强度的条件下使用，用 来降低焦耳热和提高重现性。它们良好的稳定性同样能减少溶质与部分胶束或单 个表面活性剂分子之间可能存在的竞争性作用，保证迁移时间和峰面积良好的重 现性。研究表明，这些伪固定相可以在大量有机溶剂改性的缓冲液中保持稳定的 结构【1 0 8 , 1 0 9 】。聚合物表面活性剂所具有的稳定性、高分子量和尺寸一致的性能让它 们在m e k c m s 联用技术中具有更好的兼容性。还有一类多聚电解质表面活性剂化 合物( p s c ，p o l y e l e c t r o l y t es u r f a c t a n tc o m p l e x e s ) ，它是由多聚物电解质和表面活性 剂组合的伪固定相0 1 。如p o l y a c r y l i ca c i d ( p a a ) 和d o d e c y l t r i m e t h y l a m m o n i u m b r o m i d e ( d t a b ) 。p s c s 通过表面活性剂离子和高分子的电离单体发生的离子交换 作用形成。表面活性剂的烷基链的疏水作用使得这类化合物非常的稳定，被认为 是一类具有表面活性剂性能的高分子电解质【1 1 。p s c 的胶束形态不同于典型的表 面活性剂胶束，它们能够在分子内形成胶束相。同上面介绍的聚合物表面活性剂 胶束一样具有高稳定性，零c m c 和重现性好等优点。 1 4 双子表面活性剂 双子表面活性剂是近年来国际上研究较热的一类表面活性剂，它的出现代表着 一类新型的、具有特殊分子结构表面活性剂的诞生。双子表面活性剂由两个两亲 性分子单体在其头基或靠近头基处由中间连接基团通过化学键连接在一起构成， 结构女h f i g u r e1 2 玉1 14 。 对这种表面活性剂进行研究始于1 9 7 1 年b u n t o n 等 1 1 5 j ，他们对烷基a ，双二烷 基双甲基烷基溴化胺【c m h 2 m + l n 十( c h 3 ) 2 b r 】2 ( c h 2 ) 5 ( 记为m - s m ，2 b r 。) 的表面性质 和临界胶束浓度进行了研究。并考察了对连接基团分别为亲水、疏水、柔性和刚 性的双子表面活性剂的性质。这些表面活性剂被称为“双季铵盐 、“双子表面 活性剂”、“二聚表面活性剂 等，一直没有一个统一的名称。直到1 9 9 1 年m e n g e r 硕十学位论文 等【1 1 6 1 合成了刚性基团连接离子头基的双烷烃链表面活性剂，他给这种类型的两亲 分子起名：g e m i n i ( 天文学上称“双子星座”) 表面活性剂。m 壬l z r o s e n d 、组【1 1 7 1 采纳了 “g e m i n i 的命名，并系统合成和研究了氧乙烯或氧丙烯柔性基团联结的双子表面 活性剂。 f u g u r e1 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h eg e m l ms u r f a c t a n ts t r u c t u r e 因为双子表面活性剂的独特结构，引起了对其研究的热潮。它具有以下三个不 同于一般表面活性剂的性质。一是双子表面活性剂的c m c 比其相对应的常规单体 表面活性剂要低1 2 个数量级【1 1 2 。1 1 4 1 。例如， ( d i m e t h y l e n e 1 ，2 - b i s ( d o d e c y l d i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ) 双子表面活性剂1 2 2 1 2 的c m c 为0 0 5 5w t ， 而它相对应的单体表面活性齐u d t a b ( d o d e c y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ) 的c m c 为0 5 0w t 。二是双子表面活性剂比相对应的单体表面活性剂能更有效地降低水 溶液的表面张力。例如水溶液的表面张力降低到o 0 2n m 所需的表面活性剂浓度， d t a b 为0 2 1w t ，而1 2 2 1 2 仅需要0 0 0 8 3 叭【1 1 2 - 1 1 4 】。三是带有短链中间基的双 子表面活性剂水溶液在很低的浓度仍然具有高粘度性质，而其相对性的单体表面 活性剂粘度很低。例如，d t a b 的水溶液粘度甚至在其浓度高于1 0w t 时，才能稍 微高出纯水溶液的粘度。而5w t 的1 2 2 1 2 水溶液就具有几百帕斯卡秒的粘度，显 现它的粘弹性。而且1 2 2 1 2 水溶液在相对低的浓度下具有剪切增稠的性质1 1 1 4 1 。只 有含短链中间基的表面活性剂才有此性质，例如1 2 2 1 2 ，就能在相对低的表面活 性剂浓度下，形成蠕虫状胶束【l i 。 上述结论说明双子表面活性剂的性质与传统表面活性剂迥然不同。两者间差异 产生的主要原因由这两类表面活性剂形成胶束后头基之间产生的距离分布决定 u 1 9 j 。对于传统的表面活性剂，它的距离分布最大值为热力学平衡的距离卉0 7 0 9n m 。而双子表面活性剂的距离分布具有双峰性，一个最大值在热力学平衡处卉， 另一个最大值为凼。这个以与中间基长度有很大关联。中间基长度可以通过键长和 构成中间基团的原子之间的角度计算得到。影响表面活性剂层弯曲状态的原因， 一个是头基距离的双峰分布性质，另一个是胶束核内表面活性剂烷基链上头基之 间的化学键连接。这两个因素影响了胶束的形态和溶液的性质。调节中间基的结 构能够使距离魂发生变化，或大于、小于、等于卉。因此中间基长度成为影响双子 新型双子表面活性剂存毛细管胶柬电动色谱的应用 表面活性剂性质的重要因素。 双子表面活性剂的优点很多，通常报道其水溶性、润湿能力、发泡能力和钙皂 分散能力都比传统的单体表面活性剂强【1 2 0 1 。这些性质都是评价表面活性剂的主要 标准。另外，带亲水中间基的双子表面活性剂k a f f t 点相当的低，使其在冷水中继 续发挥表面活性剂的性能。特别是阳离子表面活性剂，具有很强的生物活性【1 2 1 1 。 刚性中间基的双子表面活性剂能够抑制了分子内链与链之间的作用，展现了自组 装成胶束的性质【1 2 2 j 。 一般通过任何两个已知的两亲性分子就有可能合成双子表面活性剂。这两个两 性分子，类型可相同也可不同。连接两个两性分子的中间基团化学性质可以是疏 水的或者亲水的，可以是刚性的或者柔性的。这就导致双子表面活性剂结构和性 质都是可设计调控的，能够合成许多与传统表面活性剂性质不同的新型双子表面 活性剂。 双子表面活性剂在毛细管中应用报道为数不多。t e r a b e 1 2 3 1 曾报道过一类具有 两条亲脂性长链和两个磺酸盐头基基团的阴离子型双子表面活性剂，并将其用在 m e k c 中分离八个萘的衍生物。这些双子表面活性剂跟传统单链的s d s 分离选择性 不同，且它能提供更宽的迁移窗口。另外阳离子双子表面活性剂也曾被用在m e k c 中，分离十七种麦角碱对映体【1 2 4 1 。但是在以前的报道中仅仅研究了实验条件如p h 对电渗流和分离效果的影响，未深入探讨阳离子双子表面活性剂的分离机制。 1 5 本文构思 综上所述，毛细管电泳技术具高效、快速、样品用量少和易于自动化等特点， 涉及很多前沿研究领域，受到越来越来多的重视。其应用已涉及到生命科学、医 学、环境、食品分析等诸多领域。一端极性亲水基和一端非极性疏水基团的表面 活性剂凭借其总类繁多，性能独特等特点，在毛细管电泳中应用颇多。例如表面 活性剂作为伪固定相成功地应用到毛细管胶束电动色谱中。现为了提高胶束电动 色谱的应用，伪固定相更有待于进一步发展。我们需要寻求新型的表面活性剂伪 固定相，来改善分离的选择性和分离效率。双子表面活性剂结构特殊，拥有连接 两个头基的中间基和两条长链疏水链。中间基长度和类型对此类表面活性剂的物 化性质有着重大的影响。因此双子表面活性剂性能独特，除比传统的表面活性剂 性能优越外，还具有中间基可调的性质。但现在处于研究热点的双子表面活性剂 在毛细管电泳少有报道。我们认为双子表面活性剂是一个可以值得探索的方面， 譬如作为毛细管胶束电动色谱的伪固定相。双子表面活性剂的双头基、双疏水链 和中间基可设计等性质可能会给伪固定相的选择性带来更多的优势。因此本文拟 开展四个方面的工作： 1 将阳离子双链表面活性剂d d a b 作为m e k c 的伪固定相，用于分离酸、碱和 硕七学位论文 中性三种化合物。探讨d d a b 伪固定相与酸、碱、中性三种化合物的相互作用 和分离机理。同时调节d d a b 的胶束浓度，优化缓冲溶液p h 值和离子强度等 影响分离效率、分离度和迁移时间等的因素。 2 将新型的阳离子双子表面活性