（有机化学专业论文）高纯度低聚果糖单组分的凝胶层析制备和结构表征及其应用研究.pdf

：iq l l l l ll iti i i l l1i ti i i t l l liil ；y 17 3 8 1 0 9 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 勿刃年月多日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时眦 切面备发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 谳糍：砂涛新签嚷郝m 舢 高纯度低聚果糖单组分的凝胶层析制备和结构表征 及其应用研究 摘要 低聚果糖( f r u c t o o l i g o s a c c h r i d e s ，f o s ) 是由蔗果三糖( g f 2 ) 、蔗果四糖( g f 3 ) 、 蔗果五糖( g f 4 ) 和蔗果六糖( g f 5 ) 等组分组成的混合物，低聚果糖具有促进人体和动 物肠道双歧杆菌生长等生理功能，是一种公认的功能性低聚糖，广泛地应用于保健食品 和饲料添加剂行业。 在低聚果糖的h p l c 分析中需要其单组分的标准品进行定性和定量，这种标准品目 前只能从国外进1 2 1 ，价格昂贵，国内f o s 生产企业无法使用。本论文的目的就是为了解 决采用h p l c 一外标法测定低聚果糖含量时需要标准品的问题而立项的。 本文以聚丙烯酰胺凝胶为层析介质，以脱气超纯水为洗脱剂，研究了b i o g e lp 2 柱层析分离低聚果糖混合样品的特性，探讨了层析条件对分离效果的影响。在最佳层析 条件下批量制备了低聚果糖单组分，并进行了定性定量分析和结构鉴定。 b i o g e lp - 2 柱层析分离低聚果糖的特性研究表明：有效分配系数的负对数1 0 9 k a v 与分子量呈线性关系，各组分分子量是影响层析的主要因素，各组分与b i o g e lp 2 之间 无特异性吸附现象，层析过程中完全是按照相对分子量的大小进行的 研究表明，采用e m p o w e r 系统为层析平台，最佳层析条件是：以西1 6 1 0 0c m 夹套 柱为层析柱，柱温4 0 ，柱床高度9 5c m ，上样量o 5m l ( 样液浓度0 4 0g - m l _ 1 ) ，洗 脱速度0 2 0m l m i n 一，洗脱液自动收集，并分流至h p l c 的蒸发光散射检测器( e l s d ) 在线检测，可以实现高纯度的低聚果糖单组分的层析制备。 经高效液相色谱( h p l c ) 、电喷雾质谱( e s i m s ) 和核磁共振( n m r ) 分析所制 备的低聚果糖单组分为蔗果三糖( 1 - k e s t o s e ) 、蔗果四糖( 1 ，1 k e s t o t e t r a o s e ) 、蔗果五糖 ( 1 ，1 ，1 k e s t o p e n t a o s e ) ，与m e g a z l a a e ( 爱尔兰) 公司标准品的结构一致，其纯度分别为 9 9 3 3 、9 9 9 4 和9 9 9 l ，可以作为h p l c 分析的标准品使用。 本实验所制备的低聚果糖单组分已应用于添加低聚果糖的乳粉中f o s 的含量测定。 关键词：低聚果糖蔗果三糖蔗果四糖蔗果五糖聚丙烯酰胺凝胶 层析 s e p a r a t i o na n dc h a ra c t e r i z a t i o n o fh i g h p u r i t y f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e sm o n o c o 噼o n e n t b y g e lc h r o n 队t o g r a p h y a n dt h e i r a p p l i c a t i o n a bs t r a c t f r u c t o o l i g o s c a c c h a r i d e s ( f o s ) a r em a d eu po fg f 2 ，g f 3 ，g f 4 ，g f 5a n d o t h e rc o m p o n e n t s f o si sar e c o g n i z e df u n c t i o n a lo l i g o s a c c h a r i d e ，w h i c hc a n p r o m o t eh u m a na n da n i m a li n t e s t i n a lb i f i d o b a c t e r i u mg r o w t ha n dh a db e e n w i d e l yu s e di nh e a l t hf o o da n df e e da d d i t i v e si n d u s t r y a n a l y s i so ff o so nt h eh p l cn e e dt h e i rs t a n d a r dm o n o c o m p o n e n to ft h e q u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v e a tp r e s e n t , t h es t a n d a r ds a m p l ec a no n l yb e i m p o r t e df r o ma b r o a ds ot h ep r i c ei ss oh i g ht h a td o m e s t i cf o sp r o d u c e r sc a n n o tu s ei t t h ep u r p o s eo ft h i sp a p e ri st os o l v eu s i n gh p l ce x t e r n a ls t a n d a r d m e t h o dt h a tc o n t e n td e t e r m i n a t i o nt os t a n d a r da n dt h ep r o j e c t t h ep o l y a c r y l a m i d eg e la st h ec h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i sm e d i u m ，p u r i f i e d w a t e ra se l u a n t ，t h i sa r t i c l es t u d i e db i o g e lp 一2c o l u m nc h r o m a t o g r a p h i ca n a l , - y s i s t o s e p a r a t eg a t h e r sl o w l yt h ef o ss a m p l ec h a r a t e r i s t i c ，d i s c u s s e dt h e c h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i sc o n d k i o nt os e p a r a t et h ee f f e c tt h ei n f l u e n c e i nt h e b e s tc h r o m a t o g r a p h ym a s sp r o d u c e du n d e rc o n d i t i o no ff o sm o n o c o m p o n e n t a n dh a sm a d eaq u a l t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sa n di d e n t i f i c a t i o n b i o g e lp 一2c o l u m nc h r o m a t o g r a p h yw i t hf o sc h a r a c t e r i s t i c sr e s e a r c h i i s h o w e dt h a tl i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e ne f f e c t i v ec o e f f i c i e n to fn e g a t i v e ( - l o g k a v ) a n dm o l e c u l a rs i z e ，t h em a i n f a c t o rt h a ta f f e c t c h r o m a t o g r a p h y , c o m p o n e n t sa n db i o g e lp 一2w i t h o u ts p e c i f i ca d s o r p t i o np r o c e s s ，c h r o m a t o g r a p h yi sc o m p l e t e l ya c c o r d i n g t or e l a t i v em o l e c u l a rs i z e t h er e s e a r c hs h o w e dt h a ta d o p t i n ge m p o w e rs y s t e mf o rc h r o m a t o g r a p h y p l a t f o r m ，t h eb e s tc h r o m a t o g r a p h yc o n d i t i o n sw e r et h ef o l l o w i n g ，t h ec o l u m n t y p ei so 1 6xl0 0c m ，t h ec o l u m nt e m p e r a t u r ei s4 0 c ，t h ec o l u m nb e dh e i g h ti s 9 5c m ，t h es a m p l ev o l u m ei s0 5 0m l ( 1 i q u i dc o n c e n t r a t i o n0 4 0g - m l 1 ) ，t h e e l u t i o nr a t ei s0 2 0m l m i n ，t h ee l u e n ta u t o m a t i c a l l yc o l l e c t e da n dd i v e r i t e dt o t h eh p l c - e l s dl i n ed e t e c t i o nc a nb ea c h i e v e dw i t hh i g h p u r i t y f o s m o n o c o m p o n e n t t h ep r o d u c ta n a l y s e db yh p l c 、e s i - m sa n dn m r , t h er e s u l ti n d i c a t e d t h a tp r e p a r a t i v ef o sm o n o c o m p o n e n tw e r e1 - k e s t o s e ，1 , 1 - k e s t o t e t r a o s ea n d 1 ，1 ，1 一k e s t o p e n t a o s e t h ep u r i t yw a s 9 9 3 3 、9 9 9 4 a n d9 9 9 1 ，c o n s i s t e n c y w i t ht h ec o m p a n ym e g a z l a a e ss t a n d a r d i tc a nb eu s e da sh p l ca n a l y s i sa s s t a n d a r ds a m p l e i nt h i ss t u d y , p r e p a r a t i v ef o sm o n o c o m p o n e n th a sb e e nu s e dt oa d do f f o sd e t e r m i n a t i o no ff o si nm i l kp o w d e r k e y w o r d s ：f r u c t o o l i g o s c a c c h a r i d e s ；1 - k e s t o s e ；1 ，1 一k e s t o t e t r a o s e 1 ，1 ，1 一k e s t o p e n t a o s e ；p o l y a c r y l a m i d eg e l ；c h r o m a t o g r a p h y ； i i i 目录 摘要i a b s t r a c t i i 第一章绪论1 1 1t 1 毛聚果糖的研究现状及进展1 1 1 1 低聚果糖的结构及来源1 1 1 2 低聚果糖的生理功能1 1 1 3 低聚果糖的理化性质2 1 1 4 低聚果糖的定量检测3 1 1 5 低聚果糖的电喷雾质谱( e s i m s ) 分析3 1 1 6 低聚果糖的生产方法3 1 2 低聚果糖的分离纯化4 1 2 1 层析分离4 1 2 2 膜分离7 1 3 低聚果糖的应用与前景7 1 4 本课题的立题意义及研究内容8 1 4 1 立题意义8 1 4 2 研究内容9 第二章聚丙烯酰胺凝胶柱层析低聚果糖的特性的研究1 0 2 1 引言1 0 2 2 试验材料与设备l o 2 1 1 材料与试剂lo 2 1 1 仪器与设备。1 1 2 3 实验方法11 2 3 1 聚丙烯酰胺凝胶柱的制备1 1 2 3 2 层析系统的准备1 1 2 3 3 上样和洗脱1 2 2 3 4 洗脱液的监测1 2 2 3 5 检测方法。1 2 2 3 6 层析柱分离参数的计算1 3 2 4 结果与讨论1 4 2 4 1 t k 氏聚果糖混合样品的组成1 4 i v 2 4 2 聚丙烯酰胺凝胶分离纯化低聚果糖单组分的初步试验1 5 2 4 3 聚丙烯酰胺凝胶( b i o g e lp 2 ) 分离纯化低聚果糖的特性研究1 8 2 4 4 层析条件对分离效果的影响2 2 2 5 本章小结2 7 第三章低聚果糖单组分的层析制备及结构表征2 9 3 1 引言。2 9 3 2 试验材料与设备2 9 3 2 2 试验材料。2 9 3 1 2 试验仪器与设备2 9 3 3 试验方法3 0 3 3 1b i o g e lp 2 分离制备低聚果糖单组分的层析条件3 0 3 3 2 低聚果糖各峰组分的检测3 0 3 4 结果与讨论3 0 3 4 1b i o g e lp 2 分离低聚果糖的分离图谱及洗脱曲线3 0 3 4 2 层析分离组分的h p l c 定量分析3 1 3 4 3 低聚果糖单组分批量制备及结构表征。3 4 3 5 本章小结5 0 第四章低聚果糖单组分标准品在高效液相色谱分析中的应用5 1 4 1 引言51 4 2 材料与仪器5 1 4 2 1 材料与试剂5 1 4 2 2 仪器与设备5l 4 3 试验方法5 2 4 3 1 低聚果糖单组分标准溶液的配制5 2 4 3 2 待测样品的处理5 2 4 3 3h p l c 色谱条件5 2 4 3 4 低聚果糖各单组分h p l c 线性方程的建立5 2 4 4 结果与讨论5 2 4 4 1 低聚果糖各单组分h p l c 线性方程的建立5 2 4 4 2 低聚果糖单组分标准品在h p l c 分析中的应用5 5 4 5 本章小结5 7 第五章结论与展望5 8 5 1 本研究工作总结5 8 5 2 展望5 9 参考文献6 0 v 附录6 5 虱c 谢6 6 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录。6 7 v i - - 西大掌硕士掌位论文高纯度低聚果糖单组分的凝胶层析制- a - 和结构表征及其应用研究 第一章绪论 1 1 低聚果糖的研究现状及进展 1 1 1 1 氐聚果糖的结构及来源 低聚果糖( f r u c t o o l i g o s a c c h r i d e s ，f o s ) 又名果寡糖或蔗果低聚糖。根据国家标准低 聚果糖【1 1 的规定，低聚果糖是指果糖基经p ( 2 _ 1 ) 糖苷键连接而成的，聚合度为2 9 的功能性低聚糖。按结构分为蔗一果型低聚果糖和果一果型低聚果糖。分子结构分别如 图1 所示： 除删 喃哟h n 翰啪h 占o h h 6 险i 哟h n h 孽甄删 蔗一果型低聚果糖分子结构示意图果一果型低聚果糖分子结构示意图 图1 1 低聚果糖的结构 f i g 1 - ls t r u c t u r eo f f r u e t o o l i g o s a c c h a r i d e 其中蔗一果型低聚果糖分子式为g f n ( n = l - - 4 ，g 为葡萄糖，f 为果糖) ，它是由l 4 个 果糖基通过p ( 2 _ 1 ) 糖苷键与蔗糖中的果糖基结合而成的蔗果三糖( g f 2 ) 、蔗果四糖( g f 3 ) 、 蔗果五糖( g f 4 ) 和蔗果六糖( g f s ) 的混合物。 其中果一果型低聚果糖分子式为f n ( n = 2 - 9 ，f 为果糖) ，它是由2 - 9 个果糖基聚合而 成的低聚糖。 本研究所指的低聚果糖是指蔗一果型低聚果糖，不包括果一果型低聚果糖，以下 所提的低聚果糖均指蔗一果型低聚果糖，特此说明。 蔗一果型低聚果糖( f o s ) 是存在于大蒜、牛蒡、香蕉、洋葱等许多植物中的一类功 能性低聚糖，但含量不高。商品化的低聚果糖是以蔗糖或菊粉为原料采用微生物酶法转 化而成的。 1 1 2 低聚果糖的生理功能 ( 1 ) 改善脂质代谢，降低血脂、降胆固醇，不增加血糖值。 由于低聚果糖是难消化性糖，不能被消化酶分解，基本上很少转化成脂肪【2 3 j 。低聚 果糖被双歧杆菌所利用，分解产生的丙酸能抑制肝脏胆固醇的产生，使得胆固醇向胆汁 酸转化加大了胆汁酸的排出量，因此能够降低血脂；分解产生的醋酸盐又能阻止肝脏中 高纯度低聚果糖单组分的凝胶层析制备和结构表征及其应用研究 葡萄糖转化为脂肪，另外低聚果糖的甜度仅为蔗糖3 0 6 0 左右【4 卅。因此，低聚果糖是 属于低热量、低甜度，能促使血脂正常化，服后不会使人发胖，使人血糖值和胰岛素浓 度增加，所以很适合肥胖型的高血脂、糖尿病患者服用【7 。0 1 。 ( 2 ) 促进对钙、铁、镁、锌等矿物元素的吸收功能 服用低聚果糖之所以可促进钙等矿物元素之吸收，很大程度上是依赖低聚果糖被发 酵产生了有机酸，使在通过小肠时形成的磷酸盐、钙、镁构成的复合物发生溶解而容易吸 收【l 。另外低聚果糖分解产生的弱酸使肠道p h 值降低，使矿物质的溶解性增加，生物 有效性得以提耐叼。 ( 3 ) 抑制致病菌产生，调节胃肠内的菌群的平衡 低聚果糖的热值仅为葡萄糖的一半，而且人体消化道中不存在能够消化此类低聚糖 的酶系，所以摄入低聚果糖后不受胆汁酸、胃酸、消化酶的影响，几乎以原形到达大肠 【1 3 1 。卫生部食品卫生监督检查所实验证实，低聚果糖具有“润肠通便，增强小肠推进运 动”，“排除体内有害物质，抑制致病菌产生，改善便秘”的作用【1 4 1 。 ( 4 ) 增强肌体免疫抗病能力 低聚果糖增殖的双歧杆菌细胞壁和分泌物可产生大量的免疫物，可阻止细菌附着于 宿主的肠勃膜组织的能力，比如s t g a 免疫蛋白是其他免疫球蛋白的7 1 0 倍【1 5 】。双歧杆 菌对肠道免疫细胞有刺激的效果，增加了抗体细胞的数量，激活了巨噬细胞的吞噬力， 提高了机体免疫能力【1 6 1 。 ( 5 ) 显著的双歧杆菌的增殖能力 由于低聚果糖不被人体消化，进入肠道被双歧杆菌选择性利用。研究表明：“正常人 服用低聚果糖后，肠道内双歧杆菌等有益菌迅速可以达至l j l 2 倍以上，产气荚膜梭菌等有 害菌减少至原数量的1 3 0 1 7 - i s 。 1 1 3 低聚果糖的理化性质 低聚果糖具有优良的理化特性【1 9 - 2 2 1 。 ( 1 ) 稳定性 低聚果糖在中性或接近中性中性环境中有良好的热稳定性，在p h 值大于5 的环境中， 低聚果糖加热至l j l 2 0 还比较稳定。但是，在当p h 值小于4 的酸性环境中加热时温度超 过9 0 ，低聚果糖将会发生分解。 ( 2 ) 甜度 低聚果糖的甜度比蔗糖低，纯度为5 5 浓度的低聚果糖糖浆的甜度约为蔗糖的6 0 左右，纯度为9 0 以上的低聚果糖甜度约为蔗糖的3 0 ，口感方面比蔗糖清爽。 ( 3 ) 粘度与水活性 在0 7 0 的范围内，低聚果糖的粘度与玉米高果糖浆相似，并且随温度上升而降低 此外，低聚果糖的水分活性与蔗糖相似，且低聚果糖显略高 ( 4 ) 其它特性 2 高纯度低聚果糖单组分的凝胶层析制备和结构表征及其应用研究 溶解性、非着色性、赋形性、耐碱性、保水性和稳定性均较好，但非吸湿性较差。 1 1 4 低聚果糖的定量检测 现在对于低聚果糖的定量分析已有很多快速、准确的方法。高效液相色谱( h p l c ) 是其中最适用的一种。以极性键合相和树脂基色谱柱配置示差折光检测器( r i d ) 和蒸发 光散射检测器( e l s d ) 是在低聚果糖分析中经常使用的。其中要以极性键合相的色谱 柱效果最好，出峰的顺序是以物质的聚合度依次增大被流动相洗脱出来，而树脂基柱的 出峰时间则与极性键合相柱相反。极性键合相柱又要以氨基( n h 2 ) 柱：乙腈水( v v 7 0 3 0 ) 为流动相，1 0m l m i n 。1 使用最多【2 3 1 ，本文是采用氨基( n h e ) 柱配置蒸发光散射检测 器( e l s d ) 检测方式。另外，配带脉冲安培检测器的高效阴离子色谱( h p a e c p a d ) 和 配带金电极的脉冲电化学监测器，离子色谱( i c ) ，薄层层析( t l c ) 、纸色谱等方法用于 低聚果糖的检测。 1 1 5 低聚果糖的电喷雾质谱( e s i m s ) 分析 质谱( m s ) 分析法是化学研究领域中极其重要的一种分析方法，它是基于气相离 子的产生、分离和检测，利用质量分析器操纵气相离子，通过测定相应的质荷比以完成 待测样品中分子量及分子结构的分析。质谱仪由进样系统、离子源、质量分析器、检测 器和数据处理系统所组成，为了保证有较高的灵敏度、分辨率和干扰讯号的影响，质谱 仪的离子源、质量分析器和检测器需在真空状态下工作【2 4 。2 6 】。 早期的电子轰击离子源质谱( e i m s ) f 7 1 。只能应用于易挥发、受热不分解的化 合物的分子量和分子结构的分析，而对挥发性低、遇热不稳定的化合物需要衍生化后进 行质谱分析。现在由于快原子轰击质谱( f a b m s ) 幽铷】、基质辅助激光解吸电离质谱 ( m a l d i m s ) a i - 3 2 1 和电喷雾电离质谱( e s i m s ) 3 3 - 3 8 】等软电离质谱技术发展，使得 样品的气化和离子化是同时完成，也就是说，样品通常以质子化离子、去质子化离子或 其他准分子离子的形式进入气相中。因此，待测样品进入质谱不再是依靠它自身的挥发 性，而在于它们带上电荷的能力。 在以上质谱技术中，电喷雾电离质谱( e s i m s ) 是应用最为广泛的，其原理是在毛 细管端出口处施加一高电压，使得分析物以单电荷离子或多电荷离子的形式进入气相。 电喷雾电离质谱( e s i m s ) 在不易离子化的化合物( 如糖类化合物) 和不易挥发的 样品( 如蛋白质) 的研究中占有相当重要的地位。 1 1 6 低聚果糖的生产方法 低聚果糖的生产方法主要分为两大类：第一类是以菊芋为原料加入菊粉酶水解生产 低聚果糖【3 9 1 ，菊粉是由葡萄糖一果糖或果糖一果糖高度聚合的天然高分子化合物，菊粉 酶是b 2 1 d 呋喃果糖水解酶，在一定条件下可将菊粉水解为聚合度为2 9 的低聚糖， 再经过脱色、脱盐、浓缩等工艺获得低聚果糖产品。产品包括蔗果型( g f ) 1 1 和果果型 ( g g ) n 两类，本研究所分离的对象是指其中的蔗果型( g f ) n 低聚果糖。 3 广西大学硕士掌位论文高纯度低聚果糖单组分的凝胶层析制备和结构表征及其应用研究 第二类是以蔗糖为原料经蔗糖经p 果糖基转移酶( f t s ) 作用而生成低聚果糖4 0 1 主要 有固定化酶法，固定化细胞法，发酵菌丝体法等。 p - 果糖基转移酶( f r u c t o s y l t r a n s f e r a s e ，f t s ) f l 皂催化蔗糖( g f ) 生成蔗果低聚糖，其酶 促反应机理可用图2 表示。 g f 警g 弓警g 弓譬g 磐 其中：g f 一蔗糖，g - 葡萄糖，f t s 果糖基转移酶，g f 2 蔗果三糖，g f 3 一蔗果四糖，g f 4 蔗果五糖，g f 5 - 蔗果六糖 图1 - 2 f 胁c 的酶假反应 f i g 1 - 2t h ee n z y m e sr e a c t i o no f f t a s e 1 2 低聚果糖的分离纯化 目前市场上的f o s 产品大多是以蔗糖为原料，通过1 3 果糖基转移酶的催化作用而生 成的，由于副产物葡萄糖的反馈抑制作用，只能生产纯度为5 0 左右的低聚果糖混合物 ( 指g f 2 + g f 3 + g e 4 t + g f 5 的总含量5 0 左右) ，尚有大约5 0 的可消化糖是非有效成分， 其中葡萄糖占2 5 - 3 8 ，蔗糖占约1 0 - - 2 5 。葡萄糖和蔗糖是消化性糖，不利于某些人 群( 如糖尿病、肥胖患者) 的健康，所以属于功能性低聚糖的非有效成分。 为了去除或转化产品中的葡萄糖和蔗糖，从而制备纯度9 0 的高纯度低聚果糖混 合物，这就需要对低聚果糖进行第一步分离纯化，这是工业上生产高纯度低聚果糖混合 物所必需的。第二步分离纯化是指将纯度 9 0 的高纯度低聚果糖混合物分离纯化成为 g f 2 、g f 3 、g e 4 、g f 5 各个单组分，这是本研究的目标。 可以采用的分离纯化方法如下所述。 1 2 1 层析分离 层析( 又名色谱) 始于二十世纪初，为俄国植物学家茨维特所发现，他将从植物色 素提取的石油醚提取液倒入一根装有碳酸钙的玻璃管顶端，然后用石油醚淋洗，结果使 不同色素得到分离，在管内显示出不同的色带，层析法( c h r o m a t o g r a p h y , ) 的命名就是由 此得名。 将混合物各组分能彼此分开是层析分离技术的目的所在，要达到最佳的分离效果， 须具备两层析峰之间的距离相隔足够远；层析峰的峰底宽尽量窄，如两层析峰虽有一定 的距离，但两峰的峰底很宽，会造成两峰的重叠，即达不到完全分离的效果【4 l 】。 层析方法有液相层析、吸附层析、离子交换层析、排阻层析、亲和层析、金属鳌合 层析、疏水层析、聚焦层析和灌注层析等。其中常用几种层析方法如下： 1 2 1 1 排阻层析 排阻层析，又称为凝胶过滤层析、凝胶渗透层析和分子筛层析等，凡是利用生物大 分子的相对分子量( r e l a t i v em o l e c u l a rm a s s ，m r ) 差异进行层析分离的方法，统称为排 4 广西大掌硕士掌位论文高纯度低聚果糖单组分的凝胶层析制备和结构表征及其应用研究 阻层析。排阻层析的原理为相对分子质量大的物质优先被洗脱出来，相对分子质量小的 物质后被洗脱出来。排阻层析的基本分离原理如图1 3 所示。 1 井目对分子量大小不同混合物上柱；2 洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大 小分子分开：4 大分子路径较短，己洗脱出层析柱，小分子尚在进行中 图1 - 3 排阻层析的分离示意图 f i g 1 - 3t h es c h e m a t i cd i a g r a mo f e x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y 由于排阻层析法操作方便，凝胶不需再生，分离物质不会变性，因此，此法已在功 能性低聚糖的分离纯化中得到普遍应用【4 2 】。 在几种的排阻层析中，聚丙烯酰胺凝胶层析是分离纯化低聚糖的主要技术之一 4 3 】。 合成聚丙烯酰胺凝胶( b i o g e l ) 的单体是丙烯酰( c h 2 = c h c o n h 2 ) ：和n ，n 亚甲基双 丙烯酰胺( 交联剂) 在氧自由基的诱发下发生聚合，得到聚丙烯酰胺凝胶珠。其部分的 结构式如图1 - 4 i h 2 昌_ ：i ! 一9 2 一占一字一 c = = = o l h c 一一 i c = = = = o i n h 2 4u酬胃； 3训劂圈vvr ，u圈圈vv， 在排阻层析中，用于分离纯化低聚糖的凝胶介质，使用聚丙烯酰胺凝胶( b i o g e l ) 中p 2 型号较多。它可用于低聚果糖m j 、龙胆低聚糖【4 5 1 、甘露低聚糖 4 6 1 和低聚麦芽糖 4 7 1 的分离分析，另外它还可用于酸性低聚糖的分离【4 8 】，此外，也有将聚丙烯酰胺凝胶 ( b i o g e lp 2 ) 用于其它功能性低聚糖组分分离的研究报道【4 9 1 。魏远安等【5 0 1 ，利用聚丙 烯酰胺凝胶( b i o g e lp 2 ) 柱对蔗果低聚糖浆的分离纯化的研究。他们是将蔗果低聚糖 浆用水稀释成浓度约为4 0 ，为层析b i o g e lp 2 介质，柱型为以4 8x 6 0c mi d ，以蒸馏 水为洗脱液，示差折光检测器( d ) 检测得到少量的蔗果三糖到蔗果五糖的粗组分。 魏远安等【5 l j 采用柱型为4 8 x 1 2 0c m 的b i o g e lp 2 凝胶层析柱，以去离子水为洗脱剂，从 银叶粉虱蜜露得到一种新型五糖的低聚糖( d i g l u c o m e l e z i t o s e ) 。彭红等【5 2 】以柱型2 5 x1 2 5 c m ，b i o g e lp 2 为层析介质，对纤维低聚糖进行分离纯化，并考察洗脱速度、上样浓度、 上样体积对分离效果的影响。j e a n - f r a n c o i s 掣4 8 】采用以聚丙烯酰胺凝胶( b i o g e lp 2 ) 为层析介质的凝胶柱，进行分离纯化半乳糖醛酸低聚糖纯化，考察了柱温、离子强度以 及上样量对分离效果的影响。 聚丙烯酰胺凝胶( b i o g e lp 4 ) 在分离纯化低聚糖方面用的也很多。比如：葡低聚 糖、低聚木糖以及低聚麦芽糖等，m i c h a e l 掣4 3 采用的分离条件：b i o g e lp - 4 为层析介质， 柱型为2 5 4 x 2 0 1c m ，柱温6 0 ，去离子水为洗脱剂可以将d p 4 0 的低聚麦芽糖很好的 分离。h y e o n 等【5 3 】通过串连聚丙烯酰胺凝胶b i o g e lp - 4 和t o y o p e a r l h w 4 0 f 凝胶两根层 析柱，以蒸馏水为洗脱剂，可以得到低聚木糖单一组分。张军华等l 5 4 】以聚丙烯酰胺凝胶 b i o g e lp 4 为层析介质，柱型为3 0 x 1 2 0c m ，柱温4 8 ，洗脱剂为超纯水的分离条件， 可以把低聚木糖各组分分开。 以b i o 。g e lp 6 为层析介质的凝胶柱也可以用于低聚糖的分离。m i c h a e lj o h n 等【4 3 】研 究发现可以用b i o 。g e lp - 6 凝胶分离出d p 6 0 的聚麦芽三糖。除了聚丙烯酰胺凝胶( b i o g e l ) 分离低聚糖外其它的凝胶也可以用于分离低聚糖。冯咏梅等【5 5 】利用葡聚糖凝胶 ( s e p h a d e xg 2 5 ) 为层析介质，柱型1 o x l 0 0c m ，柱温7 0 ，去离子水为洗脱液，流速 2 0m l r a i n1 的分离条件可以得到低聚半乳糖( g o s ) 三糖以及三糖以上的低聚糖组分。 n a s i a u d d i n 等【5 6 】利用琼脂糖凝胶为层析介质分离纯化低聚糖得到很好的效果。 综上所述，排阻层析具有以下特点：。凝胶柱所需设备简单，一根层析柱便可以进行 工作；凝胶介质不需要再生可重复使用、凝胶不与待分离的物质发生化学反应，不影响 被分离物质原有的性质、凝胶颗粒上不存在获存在极少的离子团，不与溶液中的离子化 合物发生离子交换、吸附或亲和反应、凝胶颗粒具有一定的机械强度，在允许的操作范 围内，柱床体积保持稳定，在层析的过程中流速不发生改变、凝胶颗粒相对于温度具有 较好的耐受性，在高温下( 1 0 0 左右) 不发生熔融。 1 2 1 2 离子交换层析 离子交换层析以待分离的物质与离子交换剂的亲和力和吸附能力能力差异，再通过 改变洗脱剂的离子强度以及p h 值使其从离子交换剂上依次被洗脱下来。其优点，比凝胶 层析分离时间短。许多盐类结构的阴离子和金属铵盐类结构的阳离子交换树脂可以用来 6 广西大掌硕士学位论文 高纯度低聚果糖单组分的凝肢层析制4 t - 和结构表征及其应用研究 分离糖类。s c o b e l lh d 等【5 7 】在分析低聚异麦芽糖等功能性低聚糖时利用阳离子交换树 脂。另外，还可以将强碱性阴离子交换树脂用于酸性和中性低聚糖的分离分离纯化中， 可以达到理想的效果。此外，在低聚糖脱盐、脱色方面也可以用离子交换树脂，其效果 十分好。 1 2 1 3 吸附层析 吸附层析是利用对不同溶质吸附能力的差异而进行分离的一种方法。用于层析的吸 附剂种类有活性炭、膨润土和酸性粘土等。应用最广是活性炭，其分离糖类研究早在上 世纪就开始了，虽该法分离容量大，适用范围广，但是由于其存在填料需要再生、分离 效率低、洗脱液成本高、需要采用梯度洗脱的方式等原因。因此，该法在分离低聚糖方 面不宜采用。 1 2 2 膜分离 膜分离是一种新兴的分离技术，它是以选择透过性膜作为分离介质，在膜的两则施 加某种动力，使原料组分有选择性地透过膜，从而达到分离的目的。根据分离介质孔径 的大小可以分为微滤( m f ) 、超滤( u f ) 、纳滤m ) 、反渗透( r 0 ) 。在低聚糖分离方 面主要有超滤、纳滤和反渗透。超滤一方面可以除去原溶液中大分子或固体微粒，另一 方面，还可以用于物质的分级分离，它可以分离相对分子量数千万乃至数百万的物质。 纳滤( n f ) 是一种新型膜分离技术，其膜截留分子量介于反渗透膜( r o ) 和超滤膜( u f ) 之间，截留分子量约为1 0 0 1 0 0 0 ，由此推测纳滤膜可能拥有ln m 左右的微孔结构，故称 之为“纳滤”。它是以压力差作为推动力，用复合于微孔基膜上，具有纳米级孔径的超薄 分离层对大分子和小分子物质进行分离，可通过一种操作同时完成渗析和浓缩的两个工 艺过程，可通过膜的筛选和操作条件的选择分离单糖、二糖与三糖以上高分子的功能性 低聚糖。比如选择合适的膜型可以将低聚果糖中的蔗果三糖至蔗果六糖截流而相对分子 量小的葡萄糖+ 果糖和蔗糖会通过膜从而使低聚果糖得以分离纯化出来。把f o s ( g 5 0 ) 产品加入几倍体积纯净水稀释至浓度2 0 左右，选用n f 3 0 0 型膜组件，操作压力4 - 6p s i ， 一次纳滤后把分量在3 0 0 d a 以下的葡萄糖+ 果糖( 1 8 0 ) 及蔗糖( 3 4 2 ) 分子透过，而使大部分 的蔗果三糖至蔗果六糖组分被截留，这样可以分离纯化得到纯度达9 0 以上的低聚果 糖。 目前，在低聚糖的分离纯化方面，超滤纳滤两种膜分离技术结合有着很好地应用。 t a k e ok 等【5 8 】在研究菊苣根的水抽提物时，利用了超滤纳滤联用，结果发现糖类的含量 有所降低，而透过液中的盐浓度有所增加，最终产品中的低聚果糖得到纯化。因此，采 用超滤纳滤法纯化低聚果糖是可取的。 1 3 低聚果糖的应用与前景 低聚果糖由于其增殖双歧杆菌乳酸菌等有益菌的效果好，是一种公认的益生元，因 此在食品行业、饲料行业具有广阔的应用前景。2 0 0 0 年已通过美 虱f d a 备案作为公认安 7 广西大学硕士学位论文离纯度低聚果糖单组分的凝胶层析制备和结构表征及其应用研究 全级( g r a s ) 的功能性低聚糖，因此普遍地被用作保健食品配料【3 j 。 在食品行业，f o s 己通过美 蚕f d a 备案作为公认安全级( g r a s ) 的功能性低聚糖，因 此普遍地被用作保健食品配料【3 】，在我国，获得卫生部颁发的保健食品证书的食品中， 含低聚果糖的代表食品有茵子口服液、娃哈哈饮料、天元甘露液、乐百氏健肠型奶饮料 竺 5 9 1 寸， 在饲料行业，抗生素在饲料中已经用了许多年，在国内使用的范围和剂量已达到 泛滥的程度，由于抗生素在饲料中的滥用，导致禽畜免疫功能下降，药物残留甚至通过 食物链对人类健康造成严重的威胁，功能性低聚糖作为抗生素的替代品，低聚果糖将成 为饲料添加剂的主要新品种，因为低聚果糖的使用，可以增加工业饲料的新品种，特别 是在出口动物的饲养中将必不可少，为改变饲料产品结构起促进作用。 1 4 本课题的立题意义及研究内容 1 4