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酶免疫技术免疫室周清,免疫标记技术,定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素等标记已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。2.分类：放射免疫技术荧光免疫技术酶标记技术发光免疫技术金标免疫技术,酶免疫技术概述,1、概念以酶作为标记物标记试剂抗原或试剂抗体，抗原抗体反应后，通过检测酶促反应产物，以检测相应抗体或抗原的分析方法。,酶免疫技术概述2、分类,酶免疫组化用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体酶免疫技术均相酶免疫测定酶免疫测定固相酶免疫测定异相酶免疫测定（ELISA）液相酶免疫测定,酶免疫技术概述,3、酶免疫测定的特点几乎所有的可溶性抗原系统均可以检测酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性，它的最小可测定值达ng甚至pg水平标记试剂比较稳定，且无放射性危害操作简便，可进行大批量标本的测定，自动化程度高既可定性测定又可定量测定,概述,一、常用的酶及其底物：（一）酶选择的要求活性高，纯度高作用专一性强性质稳定，易与抗原或抗体偶联测定方法简便易行、敏感、精确酶和底物对人体无害酶和底物价廉易得,（二）常用的酶和底物1.辣根过氧化物酶（HRP）和底物（1)来源:HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。（2）催化反应:D2H+H2O2D+2H2OD2H为色素原，D为色素。（3）底物:四甲基联苯胺（TMB）、邻苯二胺（OPD）等。,TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明，加酸终止反应后变黄色，可在比色计中定量。(450nm)OPD灵敏度高，比色方便，其缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性。,2.碱性磷酸酶（ALP）和底物（1)来源大肠杆菌提取，最适PH为8.0；牛肠粘膜提取，最适PH为9.6。（2）催化反应及底物对硝基苯磷酸酯+H2O对硝基酚+磷酸(405nm),ALP系统敏感性高于HRP系统，空白值也低。但由于ALP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，国内在ELISA中一般均采用HRP。,二、酶标抗体(抗原)的制备,1、制备要求：,抗原要求纯度高、抗原性强。,抗体则要求特异性强、效价高、亲和力强、易于分离纯化和批量生产。,2、酶标记抗体（抗原)的方法（1）改良过碘酸钠标记法本法只适用于HRP的交联。（2）戊二醛交联法戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与抗体或抗原的氨基通过它而偶联3、酶标记物的纯化及鉴定,酶联免疫吸附试验ELISA,一、基本原理将抗体（抗原）包被在固相载体上，加入待测抗原（抗体）和酶标抗体（抗原），待反应后充分洗涤，使固相上形成的抗原抗体复合物与其他物质分离，最后加入底物，根据酶对底物催化的显色反应程度，而对标本中的抗原（抗体）进行定性或定量。,二、技术类型,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。,（一）双抗体夹心法1.概念用同一种抗体分别作为酶标抗体和固相抗体以检测抗原的方法2.应用：检测抗原最常用的方法,3.原理,5.操作步骤,1）包被抗体。将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。,（+）,双抗体夹心法测抗原,双抗体夹心法中，应注意类风湿因子(RF)的干扰。如果待检标本中含有RF，可能产生假阳性结果。使用抗体的F(ab)2或Fab片段作为酶标抗体可消除RF的干扰。,6注意事项,4、特点：非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测,（二）双位点一步法,1.概念用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，以检测抗原2.应用检测抗原，较双抗体夹心法更为简便省时,3.原理,3.加酶作用的底物显色,2.加待检抗原和酶标抗体,1.已知抗体包被载体,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,（+）,3.加酶作用的底物不显色,2.加待检物（无抗原）和酶标抗体,1.已知抗体包被载体,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,（-）,Y,Y,Y,4.操作步骤,如果待检标本中抗原浓度过高，容易形成“钩状效应（hookeffect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。,5注意事项,（三）竞争法,1.概念受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比2.应用可用于测定抗原或抗体,3、原理,4.操作步骤,5、特点：用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag（Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力。反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与非标记Ag（Ab）的分子数量和。反应后，结合在固相载体上的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记Ag（Ab）的浓度成反比。,（四）间接法,1.概念用固相抗原及酶标记抗抗体检测抗体的方法2.应用间接法是检测抗体最常用的方法。只要更换不同的固相抗原，可以用同一种酶标抗抗体检测各种抗体。,3.原理,4.操作步骤,（五）双抗原夹心法检测抗体,用同一种抗原分别作为酶标抗原和固相抗原以检测抗体的方法,用于抗体的检测,1原理,2应用,3.原理,4.加酶作用的底物不显色,4.操作步骤,（六）竞争法检测抗体,同竞争法结合抗原。,HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。,1原理,（1）竞争法检测HBcAb：将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。,2技术要点,竞争法检测HBcAb,（2）竞争法检测HBeAb：将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。加入酶标HBeAb，温育，洗涤。加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。,竞争法检测HBeAb,（七）捕获法,1.概念先用固相化的抗人IgM抗体捕获IgM，再用特异性抗原及其酶标抗体检测相应的IgM2.应用血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法,3.原理,采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF（IgM类）能与固相抗人链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导致假阳性反应。,4注意事项,非特异IgM由于其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测IgM，必须对临床样本进行适当稀释。,三、技术要点,（一）常用的固相载体1.聚苯乙烯目前最常使用（1）蛋白质吸附性能较强，保留免疫活性，价格低廉，不参与化学反应。,（2）形状小试管、小珠和微量反应板。最常使用的载体是微量反应板，也称为ELISA板。国际通用标准板形是812的96孔板，也有86的48孔板。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特定的比色计上迅速读出结果。,微量反应板,返回章目录,2.聚氯乙烯与聚苯乙烯类似，特点为质软板薄，可切割，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。3.微孔滤膜如硝酸纤维素膜、尼龙膜等。4.含铁的磁性微粒,四、测定方法,（一）加样加液体ELISA中一般需进行1次加样和4-5次加液。在定性测定中虽不特别强调加液量的准确性，但也需要标准化。例如规定为加液一滴，加液时加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出现气泡。在定量测定中则加样加液量应力求准确。,（二）温育1.在ELISA中一般有2次抗原抗体反应，一次酶促反应，反应的温度和时间应按规定的要求进行。2.一般采用水浴，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡，为避免蒸发，可用塑料贴封纸覆盖板孔。,微量反应板,返回章目录,（三）洗涤决定着实验的成败1.洗涤的目的是洗去没有与固相抗原或抗体结合的物质以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。2.洗涤方式：自动洗板机和手工操作。,（四）显色,1.显色是ELISA中最后一步温育反应，此时酶催化无色底物生成有色产物，反应的温度和时间仍是影响显色的因素，定量反应中，温度和时间力求准确。2.显色反应结束时加入终止液终止反应。,（五）比色定性测定可采用目视比色或比色计（酶标仪）测定结果。定量测定用比色计测定结果。结果准确性取决于ELISA板底的平整与透明度和比色计的质量。比色结果的表达以往通用光密度（opticaldensity，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。,其他酶免疫技术,一、均相酶免疫测定基本原理：利用酶标抗原结合抗体形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗原分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。主要用于小分子抗原或半抗原的检测.,分类,非竞争性结合法均相酶免疫测定抗体能抑制酶的活性竞争性结合法抗体能增强酶的活性,酶扩大免疫测定技术:（enzyme-multipliedimmunoassaytechnique，EMIT）,基本原理:半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受影响而活性被抑制。,二、斑点ELISA,基本原理斑点ELISA是用吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜（NC膜）为固相载体，酶催化底物形成不溶性有色沉淀沉积在NC膜上。其检测原理与普通ELISA相同，在NC膜上出现肉眼可见的染色斑点为阳性反应。,斑点ELISA(以间接法测抗体为例),斑点-ELISA的优点,NC膜吸附蛋白质能力很强，故检测灵敏度较普通ELISA高6-8倍试剂用量较ELISA节约约10倍操作简便，试验及结果判断不需要特殊设备吸附抗原（抗体）或已有结果的NC膜可长期保存,三、免疫印迹法（immunoblottingtest，IBT）,亦被称为酶联免疫电转移印斑法分三个阶段进行:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电转移酶免疫显色定位,基本原理,将不同分子量的抗原经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离到不同的区带，再转移到NC膜上，NC膜上的抗原分别与后加入的特异性抗体和酶标抗抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗抗体复合物，酶催化底物形成不溶性有色产物，使区带染色。,免疫印迹法原理示意图,四、BAS-酶联免疫吸附试验,（一）BAS生物素（biontin，B）由卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD生物素分子有两个环状结构环为咪唑酮环，与亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构，经化学修饰后成为活化生物素。,亲和素（avidin，AV）1.卵白亲和素：由卵白蛋白中提取，耐热、耐多种蛋白水解酶，4个相同亚基组成的碱性糖蛋白每个亲和素能结合4个分子的生物素，二者之间的亲和力极强，比抗原与抗体间的亲和力至少高1万倍，因此二者的结合特异性高和稳定性好2.链霉亲和素由4条系列相同的肽链组成，毎条肽链都可结合1分子生物素，在检测中出现的非特异性结合少于卵白亲和素,（二）BAS-ELISABAB法原理：也称桥连亲和素-标记