（无机化学专业论文）核酸识体荧光光谱法研究及其关联数据库的构建.pdf

摘要 核酸识体荧光光谱法研究及其关联数据库的构建 无机化学专业 博士生周翠松指导教师赖琼钰教授 核酸识体( a p t a m e r ) 是近年来发展起来的一类经体外人工进化程序筛选出 的寡聚核苷酸。它能高效、特异地结合各种配体，具有易合成、易储存、易修 饰等优点。核酸识体的出现突破了传统意义上关于核酸的功能只是遗传信息存 储和转运载体的认识，以及与蛋白质特异识别的配体通常只能由抗体来完成的 现状核酸识体藉自身折叠成特有的空间结构与蛋白质，药物分子等特异高效 地结合，其解离常数很小，可达n m 或p m 级因此，越来越多的入关注核酸识 体在分子检测、药物分子设计以及医疗诊断等方面的应用。目前，发展无须分 离洗脱样品、在均相溶液中快速实时检测混合组分中靶分子的信号核酸识体是 较为活跃的研究方向之一荧光方法因其简单易行、灵敏度高、选择性好等优 点逐渐成为最常用的分子检测方法。目前常用的是通过单标记及双标记荧光基 团两种方法。例如通过检测靶分子诱导的荧光各向异性或荧光能量共振转移 ( f r e t ) 变化来检测生理条件下癌蛋白p d g f - b b ( p l a t e l e t - d e r i v e dg r o w t h f a c t o rb b ) 但是标记荧光基团有可能会削弱核酸识体对配体的识别能力，而 且实验的成本也会较高，尤其对于r n a 核酸识体，标记荧光基团是较困难的。 但是目前筛选出的核酸识体，大部分都是r n a 核酸识体，使核酸识体在蛋白质 的检测及生物传感器的应用方面受到限制。这样就非常需要发展各种非标记的 分析方法目前这方面的报道很少，而且方法也不具有普遍性。 随着化学信息、生物信息如蛋白质序列等的持续增长，如何更好地表示， 存贮，检索，传递、挖掘和利用这些信息资源已成为我们不可回避的问题。目 摘要 前研究的热点大致分两个方面：一方面是开发具有用户界面统一、使用方便、 易扩充，易于检索等特点的数据库，以实现信息资源的提取、转化与共享国 内这一领域虽然起步较晚，但已经有7 一定的发展。如我们实验室先后构建了 西部植物资源数据库、西部天然药物网络数据库和常用化学资源数据库，并对 西部天然药物网络数据库中的中药活性成分进行了数据库的二次开发另一方 面是加强大规模处理数据和信息的能力，从中获得物质结构、功能的相关信息， 揭示化学和生物等信息的内在实质与内在联系，在分子水平上为人体生理、病 理过程提供理论依据如在生物学中，由蛋白质序列到功能或从结构到功能的 研究是理解蛋白质分子进化及开展蛋白质工程研究的有利工具目前蛋白质序 列及结构分析方法主要分为两类，一类基于统计模型，如根据氨基酸进化概率 建立的p a m 、b l o s u m 矩阵和由此提出的序列比对方法以及数据库检索方法。另 一类是结合信号处理的学习器用于蛋白质序列分析，如基于小波交换神经网络 方法、基于傅立叶变换神经网络方法，以及基于傅立叶变换支持向量机方法等 等己被广泛的用于生物信号处理上其中支持向量机作为基于统计学习原理的 学习器，它的优点主要表现在总是寻找全局最优，避免过拟合，以及善于处理参 数多、样本少的数据集，并有较好的泛化能力，已经成为蛋白序列分析的重要 工具。 本文围绕核酸识体的应用和化学生物数据库的设计与实现两方面开展了以 下工作： 1 信号核酸识体能简便，快速地实时检测疾病相关的蛋白，因为信号核酸 识体引起了研究者越来越多的兴趣。本文拟发展一种用商业化d n a 插入型染料 的信号核酸识体的新蛋白检测方法。以检测一种潜在的癌标记物，癌蛋自 p d g f - 明为例。利用核酸识体与p d g f - b b 的高亲和力以及a p t a m e r t o t o 信号复 合物对蛋白成键前后荧光变化的敏感，在生理条件下高选择性和高灵敏度地检 测p d g f - b b 。检测限0 1n m o l l - 优于已报道的基于核酸识体的其他方法。该 方法非常简便，无需共价标记的核酸识体或合成探针，为癌探针或其他蛋白的 分析和检测的信号转换机理提供广泛的应用 z 发展了一种利用r n a 核酸识体和光开关化合物 r u ( p h e n ) ：d p p z ”高灵敏 检测药物分子的荧光分析新方法以药物分子托普霉素为靶分子，实现了在生 h 摘要 理条件下高选择性和高灵敏度地检测，检测限可达1 0n m o l l 该方法能在 溶液中实现无需分离的实时检测这种无标记检测方法有利于不稳定r n a 核酸 识体在分析检测中的应用。简化实验操作，为其他药物分子的检测提供了新思 路 。 3 利用荧光光谱法研究了药物与核糖核酸的相互作用利用光开关化合物 r u ( p h e n ) 2 d p p z ”作为荧光探针试剂，以药物分子托普霉素为研究对象，在模 拟体液p h 条件下( p h 7 4 ) ，讨论药物分子托普霉素与其r n a 核酸识体的相互作 用及作用机理。结果表明，在模拟体液p h 条件下，药物分子托普霉素可直接与 其r n 核酸识体相互作用，其作用方式表现为沟槽方式和静电作用的混合模式。 这一研究结果为托普霉素的药用机理提供了一定的理论参考和临床应用依据 4 设计并实现化学网络数据库以m y s q l 作为数据库管理系统，选用中 药数据( 天然药物) 为数据源，采用p e r l 为c g i 开发工具，利用化学计量学算 法和三维结构搜索开发了化学软件包，建立了w e b 中的化学网络数据库。 5 p d g f 族一直被认为是调控胚胎发展、异化、细胞增长和包括恶性肿瘤 在内许多疾病的重要因子本文拟利用快速傅立叶变换与支持向量机学习器对 p d g f 家族进行分类与预测。讨论了傅立叶变换数据点( 1 0 2 4 个点，5 1 2 个点， 2 5 6 个点，1 2 8 个点) 、氨基酸参数( c p - v 模型、疏水参数模型( f hc b ，k d h $ ， 删中) 以及e i i p 模型) 等对预测能力的影响。利用优化得到的最佳氨基酸序列 一疏水性替代模型和5 1 2 个点作为傅立叶变换数据点建立p d g f 蛋白频率谱，用 留一法建立四个支持向量机分类器用于p d g f 家族的预测，得到全局准确率和 t i c c 分别为o 8 6 和o 9 1 ，证明该方法能较准确预测p i ) g f 四类家族。由于目前 还没有对p d g f 家族进行分类与预测方法报道，我们的工作希望能为p d g f 家族 结构功能预测提供新思路 关键词：核酸识体，p i ) g f - b b ，托普霉素，荧光光谱法，快速傅立叶变换， 支持向量机 i i i s t u d y i n ga p a m e r s b a s e do nf l u o r e s c e n c ea n dt h e c o n s t r u c t i o no f r e l a t e dd a t a b a s e s d o c t o r a lc a n d i d a t ec u i s o n gz h o us u p e r v i s o r ：p r o f q i o n g y ul a i 一即 a p t a m e r s 眦an e w c l a s so fs y n t h e t i cd n a r n ao l i g o n u c l e o t i d e sg e n e r a t e d f r o mi nv i t r os e l e c t i o n t h e yc a l ls e l e c t i v e l yb i n dw i t hv a r i o u sm o l e c u l e s t h e e m e r g i n go fa p t a m e r sc h a n g e s t h e g e n e r a l v i e wt h a tb i o l o g i c a le f f e c to f o l i g o n u c l e o t i d e i saf u n c t i o no ft h ed n a r n ac o d e si n v o l v e di n g e n e t i c t r a n s c r i p t i o na n d t r a n s l a t i o n d u et oa p t t a r n c ts e l f - f o l d i n gi n t os p e c i a lt e r t i a r y s t r u c t u r e sf o rs p e c i f i cp r o t e i n sa n ds m a l ld r u gm o l e c u l e sw i t hh i 【g ha f f i n i t y ( k d - - n m o rp m ) ，m o r oa n dm o r ea t t e n t i o n sh a v eb e e np a i dt ot h ea p p h c a f i o n so fa p t a m e r si n d e t e c t i o n , n e wd r u gd e v e l o p m e n t , m e d i c a ld i a g n o s t i c sa n ds oo i ln o w , i th a sb e e n o fi n c r e a s i n gi n t e r e s tt od e v e l o pt h es i g n a l i n ga p t a m e r sw i t ht h ec a p a b i l i t yo f r e a l - t i m ed e t e c t i o no ft a r g e t si nas i m p l ea n dr a p i dw a y f o ri 乜c o n v e n i e n c e , h i g i l s e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y , f l u o r e s c e n c es p e c t r u mh a sb e e no n eo f t h em o s tp o p u l a r d e t e c t i o ns t r a t e g i e s o n e - l a b e l i n ga n dd o u b l e - l a b e l i n ga r et h ec o l m n o nw a y s f o r e x a m p l e , o n c o p r o t e i np d g f - b b ( p h l e l e t - d e r i v e dg r o w t h f a c t o rb 8 ) h a sb e e n d e t e c t e db yc a p t u r i n gt h ec h a n g eo ft h ea n i s o t r o p yo rf r e tr e s u l t i n gf r o mt a r g e t s h o w e v e r , t h eh b e t i n gp r o b a b i l i t yw e a k e n st h ei d e n t i f i c a t i o nc a p a c i t y , a n dc a s t s m u c h i ti s e s p e d a l l yd i f f i c u l tf o rm e l m gr n aa p t a m e r t h ef a c t t h a tm o s t a p t a m e r sf r o mt h es e l e x ( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb ye x p o n e n t i a l e n r i c h m e n t ) a 腭r n ab l o c k sa p p l i c a t i o n so fa p t a m e r si np r o t e i n sd e t e c t i o na n d b i o s e n s o t d , w h i c hn e e d sh a r d l ya n a l y s i sm e t h o d sw i t h o u tl a b e l i n g h o w e v e r , t h e r e w e 他f e wr e l a t e dr e p o r t s 摘要 w i t ht h ei n c r e a s i n g l ym e r g i n go fi n f o r m a t i o no nc h e m i s t r ya n db i o l o g ys u c h 鹪d n aa n dp r o t e i ns e q u e n c e s , i ti s 觚u n a v o i d a b l eq u e s t i o na b o u th o wt os h o w , s t o r e , s e a r c ha n dm i n et h e s ei n f o r m a t i o nl e u r c e sb e t t e r t h ei n v e s t i g a t i o n sh a v e m a i n l yf o c u s e do nt w oa s p e c t s ：t h eo n ei st od e v e l o pd a t a b a s ew i t hu n i f i e du s e r i n t e r f a c ew h i c hi se a s yt ob eu s e d , e x p e n s e da n ds e a r c h e d , i no r d e rt or e a l i z ep i c k i n g u p ，t r a n s f o r ma n dc o m m o ns h a r ef o ri n f o r m a t i o n 地山嘲a l t h o u g ht h i sf i e l di n c h i n as t a r t e dl a t e l y , s o m ep r o g r e s sh a sb e e nm a d e f o re x a m p l e , am o l e c u l a r s o f t w a r e c h a r a c t e r so fn i pm o l e c u l a r d e v e l o p e db yx i a n z h e n gy a n ge ta 1 ，a c o m p u t a t i o n a la s s i s t e dd r u g sd e s i g ns y s t e m a p e x3 d ”b ys o n gl i 吼a 1 ，h a t c h i n g 3 ds t l u c t u r e sb ys h u oy a n ge ta 1 ，a n ds oo i lw eh a v ea l s od e v e l o p e dw e s t e r n p l a n t sd a t a b a s e , c o m i n o r tc h e m i c a ld a t a b a s ea n dw 鹊t e r nn a t u r a ld r u gd a t a b a s ei n w h i c ha c t i v ec o m p o n e n t so f t r a d i t i o n a lm e d i c i n eh a v e b e e nc o l l e c t e da sa s e c o n d a r y d a t a b a s e t h eo t h e ri st 0g e tt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o ni n f o r m a t i o nb yi m p r o v i n gt h e a b i l i t yo fd e a l i n gw i t l ll a r g em o u n to fd a t aa n di n f o r m a t i o n i tc o u l dr e v e a lt h e e s s e n t i a lo fc h e m i s t r ya n db i o l o g y , t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e ma sw e l l ，w h i c h c o u l dp m v i d at h em o l e c u l a rt h e o r yb a s i sf o rt h eb o d yp h y s i o l o g ya n dp a t h l o g i c p r o c e s s f o re x a m p l e ，i ti sq u i t ef e a s i b l et os t u d yt h ef u n c t i o nb a s e do ns e q u e n c eo r b a s e do ns t r u c t u r ei mb i o i n f o r m a t i c s , w h i c hi sa v a i l a b l et oj n s i g h ti n t ot h ee v o l u t i o n o fp r o t e i n sa n dt op r o t e i ne n g i n e e r i n gr e s e a r c h b yn o w , t h e r ea 地t w ow a y st o a n a l y z ep r o t e i ns e q u e n c ea n ds t r u c t u r e ei sb a s e do nt h es t a t i s t i c s , e g s e q u e n c e a l i g n m e n tm e t h o da n dd a t a b a s es e a r c hb a s e d0 1 1p a m 、b l o s u m m a t r i xt h a ti s d 盯i v 谢毓t h e p r o b a b i l i t yo f t h e 2 0a m i n ea c i d s ；a n dt h eo t h e ri sl e a r n i n gm a c h i n e b a s e dm e t h o d s , e g n e u r a ln e t w o r kb a s e do nw a v e l e tt r a n s f o r m ，n e u r a ln e t w o r k b a s e do f ff o u r i e rw , m s f o r n lg i ) a n ds u p p o r tv e c t o rm a c h i n e ( s v m ) m e t h o db a s e d o nf o u r i e rt r a n s f o r ma n ds of o r t h a m o n gt h e m , s u p p o r tv e c t o rm a c h i n eh a sb e c a m e 缸i m p o r t a n tt o o lf o rp r o t e i ns e q u e n c ea n a l y s i s ，f o ri l sa d v 雒血曙酪i ns e a r c h i n g g l o b a lo p t i m u m , a v o i d i n go v e r f i t t i n 舀d e a l i n gw i t hd a t a s e t s 、i t hm o r ep a r a m e t e r s t h a ns a m p l e s ，g o o dg e n e r a l i n ga b i l i 哆 v 摘要 t h ed i s s e r t a t i o nm a i n l yi n c l u d e st h ef o l l o w i n gt w op a r t sa b o u tt h ea p p l i c a t i o n s o f a p t a m e r sa n dd e v e l o p m e n to f c h e m i c a ld a b b l e a n db i o l o g i c a ld a t a b a s e ： 1 t h ed e v e l o p m e n to fs i g n a l i n ga p t s m e rw i t ht h ec a p a b i l i t yo fr e a l - t i m e d e t e c t i o no fd i s e a s er e l a t e d p r o t e i n i nas i m p l ea n dr a p i dw a yh a sa t t r a c t e d i n c r e a s i n gi n t e r e s t w eh a v ed e v e l o p e dan o v e lp r o t e i nd e t e c t i o ns t r a t e g yo fu s i n g t h es i g n a l i n ga p t a m e rb a s e do nt h ec o m m e r c i a la v a i l a b l ed n a i n t e r c a l a t i n gd y e ， t o t o ，f o rp r o t e i nd e t e c t i o n ap o t e n f i a lc a n c e l m a r k e r , o n c o p r o t e i np d g f b bw a s am o d e li nt h i sp a p e r t a k i n gt h ea d v a n t a g eu s i n gt h eh i g l la f f m i t yo ft h ea p t a r n e r t o w a r d sp d g f - b ba n dt h es e n s i t i v i t yf l u o r e s c e n c ec h a n g eo ft h ea p t a m 甑t o t o s i g n a l i n gc o m p l e xu p o np r o t e i nb i n d i n g , p d g f - b bw a sd e t e c t e di np h y s i o l o g i c a l b u f f e r 诵t l lh i g hs e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i t y 0 1 n md e t e c t i o nl i m i tw a sa c h i e v e d w h i c hw a sb e t t e rt h a nt h eo t h e rr e p o r t e da p t s m e rb a s e dm e t h o d sf o rp d c 港b b , i n c l u d i n gt h a t 商n g r u ( p h e n ) 2 ( d p p z ) ”t h i sm e t h o di sv e r ys i m p l ea n dd o e sn o t r e q u i r ec o v a l e n t l yl a b e l i n ga p l a m e ro rp r o b es y n t h e s i s i tf a c i l i t a t e st h e 硒d e a p p l i c a t i o no f t h es i g n a l i n gm e c h a n i s mt ot h ea n a l y s i sa n ds t u d i e so f c a n c e rm a r k e r s a n do t h e rp r o t e i n s 。 2 a p t a m e r sa r ean o wc l a s so fo l i g o n u c l e o t i d e sg e n e r a t e df r o m n y i t r o s e l e c t i o n t h e yh a v eh i g ha f f m i t yh i g ha f f m i t ya n ds p e c i f i c i t y i nt h ep a p e r , w e 。n a v e d e v e l o p e dan o v e ll u m i n e s c e n c ed e t e c t i o nm e t h o du s i n gr n aa p t a m e r sa n dad n a l i g h ts w i t c h i n gc o m p l e x , r u ( p h c n ：h ( d p p z ) 2 + ，a sas i g n a l i n ga p t a m e rf l o rt h c d e t e c t i o no fd r u gt o b r a m y c i n t h er e s u l t sh a v es h o w nt h a tt h em e t h o di sh i g b l y s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v ew i t ht h ed e t e c t i o nl i m i td o w nt o1 0 h m i ti sa l s ov e r ys i m p l e 、 e n dc o u l dr e a l i z ed i r e c td e t e c t i o nw i t h o ms e p a r a t i o ni n l t i o l lt h em e t h o do f f e r sa n 钾a p p r o a c hf o r t h ee x p l o i t a t i o na n da p p l i c a t i o no f a p t a m e r si nd r u ga n a l y s i s 3 an o v e lm e t h o df o rs t u d y i n gt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd u g sa n dr n aw a s d e v e l o p e d l i g h t - s w i w hm o l e c u l a r r u ( p h e n h d p p z 4 勰f l u o r e s c e n tp r o b e , t o b r a m y c i na 3t a r g e t , t h ei n t e r a c t i o na n df u n c t i o n a lm e c h a n i s mb e t w e e nd u g m o l e c u l a r - t o b r a m y c i na n dr n aw e r ed i s c u s s e d a st h e r e s u l t s s h o w n , i n p h y s i o l o g i c a lb u f f e r , t o b r a m y c i ni n d e e db i n d sw i mr n aa p t a m e r , w h i c hh a sa v i 摘要 m i x t u r eo ft w ow a y s , g r o o v eb i n d i n ga n di n t e r c a l a t o rb i n d i n g t h er e s u l tp r o v i d e s s o m e s u p p o r t si nt h e o r ya n dc l i n i ca p p l i c a t i o n 4 t h ec h e m i c a lw e bd a t a b a s ew a sd e v e l o p e du s i n gm y s q la sd a t a b a s e m a n a g e m e n ts y s t e m , t r a d i t i o n a lm e d i c i n e ( n a t m ld r u g s ) a sd a t ar c s o u l - c 君, p e r la s d e v e l o p m e n tt o o l sf o rc g i c h e m i c a l $ o f w a r ep a c k a g ew a sa l s od e v e l o p e du s i n g c h e m i m e t r i c sa l g o r i t h m sa n d3 ds t r u c t u r a ls e a r c h 5 af f t - b a s e dm e t h o df o rp r e d i c t i o no f p d g f sw a sd e v e l o p e d t h r e ek i n d so f 舡n i n oa c i d ss u b s t i t u t i o nm o d e l s ( c 州h y d r o p h o b i c i t ys c a l e ( f h e ，k d h o ，m h e ) , e x m ) a n dd i f f e r e n tf f rf r e q u e n c yp o i n t sw e r ec o m p a r e db a s e do nt h e i re f f i c i e n c y o np r e d i c t i o np e r f o r m a n c e u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n , j a c k - k n i f ew a su s e dt o t r a i nf o u rs v mc l a s s f i e r s a st h er e s u l t ss h o w n , t h ea c c u r a c y ( a c c ) a n dm a t t h e w s c o n e l 砒i o nc o e f f i c i e n t ( m c c ) i so 8 6a n do 9 1 ，r e s p e c t i v e l y , w h i c hp r o v e dp d g f s w e r ec l a s s i f i e de x c e l l e n t l y k e y w o r d s ：a p t a m e gp d g f b b ；t o b r a m y c i n ；f l u o r e c e n c es p e c t r u m ；f f t ；s v m 第一章引言 第一章引言 i 。i 核酸识体的研究及应用 长期以来，核酸分子一直被认为是生命体内重要的遗传物质，它是基因表 达的物质基础，控制着蛋白质的合成，也是许多药物的靶向分子。直至i 1 9 9 0 年。 核酸识体的出现突破了传统意义上关于核酸的功能只是遗传信息存储和转运载 体的认识，以及与蛋白质特异识别的配体通常只能由抗体来完成的现状。核酸 识体最先出自美国的s z o s t a k j w 和g o l dl 【l ，2 等实验室他们各自独立地 建立核酸文库，并逐步发展成一种能从超过1 0 1 5 个核酸分子文库里筛选出具有 高特异性、高亲和力结合配体的指数富集的配体系统进化( s y s t e m a t i c e v o l u t i o no fl i g a n db ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ，s e l e x ) 技术。筛选出来的 d n a 或r n a 寡聚核苷酸被称为核酸识体( a p t a m e r ) ，其d p a p t a m e r 来源于拉下字 “a p t u s ”( 适合) 。核酸识体是人工合成的一段由2 0 - 6 0 个碱基组成的单链寡聚 核苷酸，它藉自身折叠成特有的空间结构与靶分子特异高效地结合它的靶分 子范围非常广泛，有蛋白质、多肽、有机物、金属离子、药物甚至细胞等。其解 离常数很小，可达n m 或p m 级 3 _ 9 】核酸识体识别的高度特异性在于它与配体之 间有较大的接触面积( 3 0 4 0 n 哟 5 】，因此能感知配体方面极其细微的变化。 核酸识体易与靶蛋白功能区域作用，调控分子的生物功能等证实了它明显优于 抗体 1 0 - 1 8 由于核酸识体具有易合成，易储存，易修饰等优越性，它在核酸 结构的多样性、蛋白质d n a 相互作用，药物分子r n a 相互作用等的研究及医学 诊断和治疗、传感器等方面的应用引起了人们的广泛兴趣 1 9 - 5 5 目前关于核 酸识体的研究主要集中在核酸识体的筛选，核酸识体与配体的相互作用以及核 酸识体的应用等方面 1 1 1 核酸识体的筛选 核酸识体的筛选过程起始于组合化学合成的随机寡聚核苷酸库与其它类 型的文库相比，随机寡聚核苷酸库库容量大，多样性高我们知道核酸分子在 一级结构上就存在着核苷酸大量不同顺序的排列组合。利用合成化学可以将一 定长度的核苷酸的不同组合都合成出来，构建成一个包含了这一长度核酸分子 第一章引言 所有可能突变的文库，这样可以在试管里模拟大自然的进化，有目的地施加选 择压力( 结合靶目标) ，在很短的时间里筛选出具有特定性质的分子 以r n a 核酸识体的筛选为例说明利用s e l e x 技术筛选核酸识体的过程( 见图 1 1 ) 5 6 1 ：首先利用自动固相合成法建立一个碱基数为n 的随机d n a 文库理论 上，碱基数为n 的随机d n a 文库就会含有数目为4 的不同d n a 序列例如碱基个数 为2 0 的这样一个随机d n a 文库则会含有1 2 l 旷个不同序列的d n a ( 4 1 2 x l o 舶) 图 典型的s e l e x 技术路线图 寡聚核苷酸库中核酸分子中间部分是随机序列，两端为固定序列，固定序 2 第一章引言 列内含p c r 及其它酶学反应相关引物的结合位点5 端引物里包含一段t 7 启动 子序列，以便t 7p , n a 聚合酶识别，并转录为随机r n a 文库p , n a 随机库在特定缓 冲体系和温度下与靶分子温育，初始时只有少量的核酸能与靶分子结合，通常 利用硝酸纤维素滤膜法、变性凝胶电泳法或亲和层析法等物理方法分离与靶分 子结合的r n a 能结合靶分子的r n a 经洗脱、纯化后，进行反转录一p c r 扩增，即 可得到数量较大的核酸文库作为下一轮筛选使用的d n a 模板，这样就完成了筛选 过程的一个循环然后进行相同的步骤继续循环。随着筛选轮数的增加，施加 到每一个循环的严谨度( 温度，p h 值、金属离子、靶目标浓度，温育，时间等) 也不断增加，筛选出的核酸亲和力逐渐增强通常需要经过8 - 1 5 个循环，周期一 般为2 3 个月( 最快2 周) ，最后得到亲和力和特异性很高的核酸识体将筛选 得到的产物克隆入载体，并将选出的克隆产物进行测序和结构分析，可以获知 高亲和力核酸识体的序列和结构特征 原则上通过s e l e x 技术可以筛选出能结合任意靶分子的核酸识体目前已经 筛选出核酸识体的靶分子范围很广，包括金属离子 5 7 - 6 0 ，核苷 6 1 ，6 2 、多 肽 6 3 ，6 4 等等但是在研究最多，发展最迅速的是以蛋白质( 包括酶 6 5 - 6 9 、 生长因子 7 0 - 7 3 、抗体 7 4 ，7 5 、基因调控因子 7 6 - 8 0 3 、细胞粘附分子【8 l - 8 4 、 选择蛋白1 8 5 等) 和小分子( 有机配体 3 ，8 6 - 8 8 、氨基酸 8 9 - 9 2 。生物协同因 子 9 3 - 9 9 、抗生素 1 0 0 - 1 0 3 】等) 为靶目标的核酸识体广泛的核酸识体的筛选 为研究核酸识体与靶分子的相互作用及探索核酸识体的应用奠定了良好的基 础 1 1 2 核酸识体与配体的相互作用 溶液中的单链d n a 或r n a 的空间构像一般是不确定的，当核酸分子与配体结 合时，通常会通过构型适配形成发夹( h a i r p i n ) 、假结( p s e u d o k n o t ) ，凸环 ( b u l g e ) 、6 - - 四分体( g - - q u a r t e t ) 等特殊三维空间结构决定这些结构中的碱 基往往是与配体结合的重要位点采用核磁共振删r 及x - r a y 等手段可以从结构 上对核酸识体与配体间的作用进行较为深入的研究从获得的一些高分辨的核 酸识体与配体复合物的三维结构研究中发现，核酸识体与配体主要通过。假碱 基对”的堆积( s t a c k i n g ) 作用、氢键作用，静电作用和形状匹配等产生高特 第一章引言 异性的结合力r i 0 4 “假碱基对”的堆积是指配体的芳香环部位与核酸分子的碱基平面平行， 并有重叠，类似于核酸分子里的碱基堆积作用由于核酸识体与配体之间有较 大的接触面积( 3 0 4 0 n 曲。识体能够识别配体方面极其细微的变化，因而形成 了识别的高度特异性，包括分辨不同配体上一个基团的差别，甚至同一蛋白分 子的不同构像、不同功能状态如茶碱分子( 结构式见图1 2 ) 中的芳香环能与 其核酸识体分子里的碱基重叠( 见图1 3 ) r l o s ，但茶碱分子里的7 - n 上的h 被 甲基取代后( 即咖啡因) ，能结合茶碱的核酸识体就不能识别咖啡因分子，亲合 力相差了几乎1 0 0 0 0 倍这种类似的碱基一配体互相识别的现象也存在于黄素单 核苷酸( f 蜊) 与其r n a 核酸识体的复合物中r 9 6 3 图1 2 茶碱分子结构式 图1 3 茶碱分子与其r 核酸识体作用示意图 4 第一章引言 在多数的核酸识体配体复合物里，尤其是核酸识体蛋白质复合物，堆积 作用扮演一个关键角色，其次是氢键作用如在精氨酸分子中，带正电荷胍基的 长柔性侧链通常在配体与核酸识体的识别中起着重要作用在与精氨酸结合的 d n a s 和r n a 9 1 核酸识体中，均发现精氨酸中的胍基团和核酸识体中的胞嘧啶 碱基共平面而形成两个氢键而在另一个d n a 核酸识体与精氨酸的复合物中 1 0 4 ，精氨酸分子的侧链进入核酸分子折叠部位的深处，与核酸的碱基形成较 强的氢键是核酸识体识别精氮酸的原因核酸识体特异识别氨基葡糖苷的主要 原因是形状匹配和静电作用，如托普霉素( t o b r a m y c i n ) 1 0 5 _ 1 0 7 和新霉素 b ( n e o m y c i nb ) 1 0 8 带正电的托普霉素分子结合在r n a 核酸识体分子环一茎连 接附近的大沟处( 见图1 4 ，1 5 ，1 6 ) 图1 4 托普霉素结构示意图【5 】。 图1 5 托瞢霉素分子与其r n a 核酸识体作用示意图【5 】 第一章引言 圈1 6 托普霉素分子与其r n 核酸识体作用示意图【5 】 1 3 核酸识体的应用 1 1 3 1 蛋白质分析和生物传感器 随着人类基因组计划的完成和功能基因组学、蛋白组学研究的不断深入， 发展能对重要蛋白质进行实时检测跟踪的高灵敏度分析方法成为后基因组时期 一个重要的研究领域蛋白质的检测通常利用抗体一抗原的特异性相互作用核 酸识体对蛋白质的结合力和特异性相当于、甚至优于蛋白质的抗体 1 1 - 1 4 如 核酸识体是人工化学合成的，合成简单，稳定性、重现性好，可以按需要对序 列中的核苷酸定点标记功能基团和报告基团( 如荧光分子) ，且不涉及任何动物 和细胞( 当面对免疫原性差或有毒的靶分子时优势更明显) ，便于蛋白质的检测 等等蛋白质研究的重要性和理想的蛋白质抗体型探针的缺乏使核酸识体在蛋 白质分析检测上的应用倍受关注。 研究人员已开发了一种类似于e l i