（微生物学专业论文）一种细菌胞外多糖的初步研究.pdf

摘要 摘要 近些年来，在微生物多糖的研究和应用方面，具有生物活性的多糖 日益引起了人们的关注，活性多糖是一类天然制剂，具有很多方面的功 能，例如，它能够增强机体的免疫力，抗肿瘤，抗辐射，抗衰老等。因 此，开发生物活性多糖是一项意义深远的课题。 我们在研究中发现，一株根瘤菌( r h i z o b i u ms p n 6 1 3 ) 在培养时能 产生丰富的胞外多糖( r e p s ) ，目前，国内外尚无相关报道。本论文研 究了r e p s 的药理活性，在确定其生物活性的基础上，进一步优化了根 瘤菌( r h i z o b i u ms p n 6 1 3 ) 生产r e p s 的培养基和培养条件，在1 0 l 发 酵罐上进行了分批发酵和补料分批发酵，构建了分批发酵动力学模型， 并对下游加工进行了初步研究，具体内容如下： 1 将r e p s 制成针剂，以大、中、小3 个剂量( 4 0 、2 0 、1 0m e ( k g d ) ) 给小鼠连续腹腔注射( i p ) 1 0 d ，1 0 d 后检测胸腺指数、脾脏指数、碳粒廓 清速率和廓清指数、血清抗绵羊红细胞( s r b c ) 抗体凝集效价和淋巴细胞 转化值。与对照组相比，高剂量组的影响最显著，其各数值分别为o 3 2 ， 0 6 5 ，3 4 1 1 0 ，5 1 0 ，2 2 3 和1 3 6 ，分别是对照组的1 5 2 ，1 3 5 ，1 5 4 ， 1 1 1 ，1 1 8 和1 3 6 倍。证明了r e p s 对小鼠的非特异性免疫，体液免疫 和细胞免疫均有显著的增强作用。另外，以相同的剂量和方式，将r e p s 注射给s 1 8 0 荷瘤小鼠，1 0 d 后检测结果，与对照组相比，抑瘤率最高可 达4 5 ，并且血常规检测结果显示其作用机制很可能与增强小鼠的免疫 功能有关。 2 通过多因素的正交试验，在摇瓶培养水平上，确定了根瘤菌 ( r h i z o b i u ms p n 6 1 3 ) 生产r e p s 的最佳培养基成分( g l ) 为：葡萄糖 2 0 ，硫酸铵1 0 ，豆芽汁2 0 0 ，磷酸盐0 4 ，硫酸镁0 4 。最适生产r e p s 的条件为：初始p h 值7 0 ，温度为3 0 。c ，摇瓶的装液量为1 0 0m l 培养 基2 5 0 m l 摇瓶。 3 在1 0 l 发酵罐上进行了分批发酵，并构建了分批发酵动力学模型。0 h - 6h 为延滞期，6h - 2 0h 为对数生长期，2 0h - 3 0h 为稳定期，3 0h 进 入衰亡期。多糖的最高产量可达8 2 9 l 。基于l o g i s t i c 方程和l p 方程， 得到了描述发酵过程的动力学模型，菌体生长动力学模型，产物合成动 一种细菌胞外多糖的初步研究 力学模型和底物消耗动力学模型分别为： 坝f ) 20 3 7 7 e x p ( 0 _ 3 1 3 0 ( 1 一( o 3 7 7 1 4 4 ) 1 一e x p ( 0 3 1 3 t ) ) p ( 幻2o 2 7 3 x ( t ) 一0 3 7 7 + 0 0 2 1 x ( 1 4 4 0 3 1 3 ) l n ( 1 一( 0 3 7 7 1 4 4 ) 1 一e x p ( 0 _ 3 1 3 0 ) s ( o23 0 3 1 3 8 x ( 0 0 3 7 7 一o 0 4 x1 4 4 0 4 0 - 31 3 1 n ( 1 一( 0 3 7 7 1 4 4 ) 1 一 e x p ( 0 _ 31 3 t ) ) 4 在1 0 l 发酵罐上进行了补料分批发酵，r e p s 的最高产量可达到 1 2 6 9 l ，是分批发酵的1 5 倍。 5 初步建立了r e p s 的下游提取工艺路线，多糖的提取率在9 5 以上， 纯度可达9 9 2 ，为大规模工业化生产的下游加工奠定了基础。 关键词：多糖；药理活性；发酵；动力学模型；下游加工 1 i 摘要 a b s t r a c t r e c e n t l y , i nt h ef i e l do fr e s e a r c h a n da p p l i c a t i o no fm i c r o b i a le x t r a p o l y s a c c h a r i d e s ，g r e a t a t t e n t i o n s h a v eb e e n i n c r e a s i n g l yp a i d t o p o l y s a c c h a r i d e s o f b i o l o g i c a la c t i v i t y w h i c ha r en a t u r a l p r o d u c t s p o l y s a c c h a r i d e so fb i o l o g i c a la c t i v i t y h a v em a n yf u n c t i o n s ，f o re x a m p l e ， e n h a n c i n g t h e o r g a n i s m o f i m m u n i t y ，a c t i v i t y o f r a d i o r e s i s t a n c e ， a n t i n e o p l a s t i ca c t i v i t y , a n t i s e n s c e n c e ，a n ds o0 n a sar e s u l t ，i ti sap r o f o u n d p r o j e c tt or e s e a r c hp o l y s a c c h a r i d e so fb i o l o g i c a la c t i v i t y i nt h er e s e a r c h i n g ，w ef o u n dt h a tas t r a i n ( ? h i z o b i u ms p n 613 ) c o u l d p r o d u c ea b u n d a n te x t r ap o l y s a c c h a r i d ew h i c h i sc a l l e dr e p s a n dn o w i n l a n da n da b r o a dl i t e r a t u r ed on o th a v ea n yr e p o r ta b o u tr e p s t h i sp a p e r f o c u s e do nt h ep h a r m a c o l o g yo f r e p s ，s t u d y i n gt h ec u l t i v a t i o ns u b s t r a t ea n d c u l t i v a t i o nc o n d i t i o n o ft h es t r a i n ，s t u d y i n gt h eb a t c hf e r m e n t a t i o na n d f e d b a t c hf e r m e n t a t i o ni nio lf e r m e n t a t i o nt a n k ，f a b r i c a t i n gk i n e t i cm o d e l s o fb a t c hf e r m e n t a t i o n ，a n dp r i m a r yr e s e a r c h i n go nd o w n s t r e a mp r o c e s s i n g t h ed e t a i l e dc o n t e n t sw e r ea sf o l l o w e d ： 1 t h r e ed o s a g eo fr e p s ( 4 0 ，2 0 ，10m g ( k g d ) ) w e r e g i v e nb y i n t r a p e r i t o n e a l ( i p ) a d m i n i s t r a t i o nf o rt e nd a y s i n d e x e so ft h y m u sa n ds p l e e n i nn o r m a lm i c e ，v e l o c i t ya n di n d e x o fc a r b o l i c p a r t i c l ec l e a r a n c e ，t h e a n t i b o d y t i t e ro fs e r u m a g a i n s ts r b c ，a n d t h e s t i m u l a t i n gi n d e xo f l y m p h o c y t et r a n s f o r m a t i o nw e r ed e t e r m i n e da f t e rt e nd a y s c o m p a r e dw i t h t h ec o n t r o lg r o u p ，t h eg r o u po fh i g hd o s ew a st h em o s ts i g n i f i c a n ta n dt h e r e s u l t sw e r e0 3 2 ，0 6 5 ，3 41xl0 。，5 10 ，2 2 3a n d1 3 6r e s p e c t i v e l y , w h i c h w e r e1 5 2 ，1 3 5 ，1 5 4 ，1 1 1 ，1 1 8a n d1 3 6t i m e so ft h ec o n t r o lg r o u p r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tr e p sc o u l de n h a n c en o n - s p e c i f i c i m m u n i t y , h u m o r a li m m u n i t ya n dc e l l u l a ri m m u n i t yi nt h en o r m a lm i c e i n a d d i t i o n ，m i c ew i t hs18 0t u m o rw e r ea l s og i v e nr e p si nt h es a m ed o s ea n d m e t h o dw i t hw h a th a v em e n t i o n e da b o v e c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ， t h eh i g h e s tr a t eo ft u m o ri n h i b i t i o nc o u l dr e a c h4 5 a n dt h er e s u l t so ft h e r o u t i n eb l o o de x a m i n a t i o ni n d i c a t e dt h a tt h em e c h a n i s mo fi n h i b i t i n gs18 0 i l l 一种细菌胞外多糖的初步研究 t u m o rm i g h tr e l a t et ot h ei m m u n ef u n c t i o no fm i c e 2 t h eo p t i m a lc u l t i v a t i o nm e d i u ma n dc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n so ft h es t r a i n ( r h i z o b i u ms p n 613 ) w i t hah i g hy i e l do fr e p sw e r es t u d i e db ym e a n so f t h e o a h o g o n a ld e s i g n f r o m t h es h a k e f l a s k e x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m a l c u l t i v a t i o nm e d i u mc o n s i s t e do ft h ef o l l o w i n gc o m p o s i t i o n ( g l ) ：g l u c o s e2 0 ， ( n h 4 ) 2 8 0 41 0 ，j u i c eo fb e a ns p r o u t2 0 0 ，p h o s p h a t e0 4 ，m g s 0 40 4 t h e o p t i m a lc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sw e r e ：t h ep r i m a r yp h7 0 ，3 0 。c ，1 0 0 m li n 2 5 0 m lt o t a lv o l u m e 3 t h eb a t c hf e r m e n t a t i o nw a sc o n d u c t e di n10 lf e r m e n t a t i o nt a n ka n dt h e f e r m e n t a t i o nk i n e t i c so fr e p sw a sd e s i g n e d t h el a gp h a s ew a s0h - 6h ， e x p o n e n t i a lp h a s e6h - 2 0h ，s t a t i o n a r yp h a s e2 0h - 3 0h ，a n dd e c l i n ep h a s e w a sa f t e r3 0h t h em a x i m a ly i e l do fr e p sr e a c h e d8 2 9 l t h ek i n e t i c m o d e l sf o rc e l lg r o w t h ，r e p sp r o d u c t i o na n ds u b s t r a t ec o n s u m p t i o nw e r e o b t a i n e db a s e do nl o g i s t i ce q u a t i o na n dl u e d e k i n g - p i r e te q u a t i o n t h e k i n e t i cm o d e l sw e r ea sf o l l o w s ： 坝0 20 3 7 7 e x p ( 0 3 1 3 t ) ( 1 一( 0 3 7 7 1 4 4 ) 1 一e x p ( 0 3 1 3 t ) ) p ( t ) = o 2 7 3 x ( t ) 一o 3 7 7 + 0 0 2 1 x ( 1 4 4 0 3 1 3 ) l n ( 1 一( o 3 7 7 1 4 4 ) 1 一e x p ( o 3 1 3 t ) ) s ( t ) = 3 0 3 1 3 8 i x ( t ) 一o 3 7 7 一0 0 4 x 1 4 4 0 4 0 3 1 3 1 n ( 1 ( o 3 7 7 1 4 4 ) 1 一 e x p ( 0 31 3 0 ) 4 t h ef e d b a t c hf e r m e n t a t i o nw a sc o n d u c t e di nlo lf e r m e n t a t i o nt a n k t h e m a x i m a ly i e l do fp e p sr e a c h e d1 2 6 9 m ，w h i c hw a s1 5t i m e so ft h eb a t c h f e n n e n t a t i o n 5 t h ep r i m a r yt e c h n o l o g yo fd o w n s t r e a mp r o c e s s i n gw a se s t a b l i s h e d t h e r e c o v e r yr a t eo fr e p sw a sa b o v e9 5p e rc e n ta n dt h ep u r i t yr e a c h e d9 9 2p e r c e n t k e y w o r d s ：p o l y s a c c h a r i d e s ；p h a r m a c o l o g y ；f e r m e n t a t i o n ；k i n e t i c m o d e l s ；d o w n s t r e a mp r o c e s s i n g i v 文献综述 第一章文献综述 当前，生命科学的研究已进入一个新的时代，即系统生物学时代。人们不仅在 分子水平上继续着核酸和蛋白质的研究，而且已将研究范围拓展到了多糖等生物物 质，从统一生物学的角度深入阐述这些生物物质在生命活动的作用与规律。与核酸、 蛋白质相比，多糖类物质的研究起步较晚，但一些研究结果已经表明多糖及其缀合 物在生命活动中有着极其重要的生物功能。许多高层次奥妙的生物现象，如受精、 发育、分化等，均与密布于细胞表面的多糖及其缀合物的糖链密切相关 】。总之，多 糖类物质在生命活动中发挥着很重要的作用。 多糖，除了其对生物体自身的生物学意义之外，更重要的在于它有着广泛而重要 的用途。近年来，愈来愈多的微生物多糖被开发出来，依照其不同的性质与功能， 分别作为药剂、食品添加剂、增稠剂、凝固剂、润滑剂、絮凝剂、悬浮剂、凝胶剂 等应用于医药、食品、石油、化工等多个领域，在经济建设与人民生活中发挥着重 要作用。目前，世界上微生物多糖的产量每年都保持1 0 的增长速度，其年产值可 达5 0 一1 0 0 亿美元【2 j o 多糖作为药物应用开始于2 0 世纪4 0 年代，人 f l 3 十h 继发现许多植物中草药多糖和 微生物多糖具有生物学活性，如抗辐射、抗凝血、降血糖、抗感染、预防和治疗肿 瘤、艾滋病等，通常将这类多糖称为活性多糖。近些年来，开发具有生物活性的多 糖开始不断加强，主要得益于人们对其免疫功能的认知。在过去的几十年中，用化 学药物，尤其是用抗生素，杀死病原菌成为治疗传染性疾病的主要途径，然而人们 逐渐发现化学药物有两大缺陷，其一是长期反复使用会诱发病原菌的抗药性，导致 治疗失败；其二是对机体副作用大，容易引起不良反应，甚至会降低机体的免疫功 能。研究结果表明，活性多糖是一类无毒、高效、无残留的免疫增强剂，能够提高 机体的免疫功能，并通过提高机体的免疫力达到抗肿瘤的效果，具有良好的防病治 病效果。 在生物活性多糖的研究开发中，微生物多糖之所以 - 3 1 起人们的重视，是因为它们 大多可以通过液态发酵获得，比起真菌子实体的栽培和植物中草药的种植，液态发 酵的生产周期短，提取工艺简单，不受季节、地域和病虫害条件限制，具有较强的 市场竞争力。因此，研究年n y l - - 发具有生物活性的微生物多糖成为糖类科学工作者竞 相参与的课题。 目前在l 临床上正式应用的微生物多糖有香菇多糖、云芝多糖、茯芩多糖等3 1 ，这 一种细菌胞外多糖的初步研究 些真菌多糖一定剂量时可治病，少剂量时可健身防病，是抗衰老的理想佳品。所以 各种活性多糖不但可作为药物进行研究，还可作为保健品进行开发。随着研究的深 入，具有生物活性的细菌胞外多糖也开始引起人们的兴趣，有关其生物活性的报道 也日益增多，其中研究较多的是乳酸菌胞外多糖，人们发现，用于发酵牛奶中的一 些乳酸菌所产生的胞外多糖，不仅能够替代外源添加剂来改善乳制品的质构和风味， 广泛用于各种食品的增稠、稳定、乳化、胶凝及保湿【4 】，而且还具有一定的生物活性， 能够增强机体的免疫力，可以作为天然的保健品。这些多糖和黄原胶不同，不是添 加到食品中去的，而是乳酸菌在发酵牛奶的过程中产生的，尤其对于不允许使用来 自植物和动物的稳定剂的国家( 如法国、荷兰) 更具有特别意义【5 j 。顾笑梅等 6 中报道 了一种乳酸菌胞外多糖具有增强细胞免疫功能的作用。顾笑梅等【_ 7 】又报道了种乳酸 菌胞外多糖对荷瘤小鼠具有增强免疫功能的作用。另外，公告号c n l l 0 4 5 0 4 c 专利 公开了一种利用土壤杆菌1 2 0 2 菌株生产胞外多糖的方法，该多糖具有免疫增强和抗 肿瘤活性【8 。 综上所述，微生物多糖的开发研究已取得一定进展，其现状与特点如下：( 1 ) 己 开发的真菌多糖，多数具有免疫增强作用。然而从野生真菌子实体中直接提取多糖 受到自然资源的严格限制，通过人工栽培予实体的方式生产多糖，周期长、产量低、 成本高，致使每支多糖含量仅0 1 9 的针剂售价达4 0 2 0 0 元。( 2 ) 细菌胞外多糖可 通过发酵方式大规模： 业化生产，已投入生产的主要有黄原胶、热凝多糖和结冷胶 等，但未报道有免疫活性作用，目前主要用在食品与化工等方面。( 3 ) 已报道叫。合 成具有免疫活性的细菌胞外多糖有乳酸菌和土壤杆菌1 2 0 2 菌株的胞外多糖，但尚处 在摇瓶试验阶段，且产量偏低。因此，开发具有免疫活性和可以实施大规模工业化 发酵生产的细菌胞外多糖，无论对于保障人们身体健康，还是对于促进经济建设都 是当务之急。 本实验室在研究中发现，一株与植物柠条锦鸡儿共生的根瘤菌( r h 拓o b i u ms d n 6 1 3 ，己保藏于中国典型培养物保藏中心保藏号为，c c t c cm2 0 5 1 0 8 ) 在培养时 能产生丰富的胞外多糖( r e p s ) ，初步的药理实验证明，该菌株所产生的胞外多糖 对小鼠的免疫功能具有一定的增强作用，而且国内外尚无该方面的报道，因此对该 多糖的研究具有十分诱人的前景。 1 1 多糖的种类和应用 多糖种类繁多，来源广泛，它们广泛存在于动物、植物、海藻和微生物中。以 文献综述 下是有关各种类多糖及其应用的介绍。 11 1 动物多糖 动物多糖中，糖胺聚糖和蛋白聚糖是动物细胞外基质的重要成分，动物组织特 别是结绨组织的主要成分是糖胺聚糖，糖胺聚糖有透明质酸、硫酸软骨素、硫酸乙 酰肝素、肝素等。另外，存在于无脊椎动物的壳多糖也是一类应用较为广泛的多糖。 透明质酸是糖胺聚糖中结构最简单的，它的二糖重复单位由葡萄糖醛酸和n 乙 酰葡糖胺通过b 1 ，3 糖苷键连接，商品透明质酸一般为钠盐形式，为白色纤维状或 粉末状固体，有较强的吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂，对人体及动物无抗原活 性。在化妆品和医学领域透明质酸具有广泛的用途。由于其特殊的保水作用，国际 上公认其为高档化妆品的天然保湿因子。透明质酸的润滑与缓冲作用可用于骨关节 炎、肩周炎、类风湿关节炎的治疗；透明质酸可作为药物缓释剂，或者可作为一种 载体，将各种药物导向到各病理部位，具有诱导靶向作用一j 。 硫酸软骨素是一类糖胺聚糖，有多种异构体，它们均由d 葡糖醛酸、n 一乙酰一d 氨基半乳糖硫酸酯为单位组成。一般硫酸软骨索约含5 0 7 0 个双糖基本单位，链长 不均一，相对分子质量为1 00 0 0 3 00 0 0 d a 。硫酸软骨素用途广泛，可用做药物， 主要用在治疗头疼、偏头痛、冠心病、心绞痛等的药物中。在国外用鲨鱼硫酸软骨 素来治疗和预防癌症及疑难症，效果明显。据报道，硫酸软骨素可治疗牛皮癣、减 轻关节炎疼痛、降低血液中胆固醇的含量、防止动物和人的动脉硬化，且能防止冠 状动脉心脏病的发作【l 。 硫酸乙酰肝素和肝素，两者具有相同的主链结构，二糖单位由葡糖醛酸或l 一艾 杜糖醛酸和葡糖胺组成。肝素是一种天然的抗凝血剂，临床上用作抗凝血酶i i i 的增 强剂，经化学修饰后的肝素具有更多的生理功能 1 【】。 壳多糖也称几丁质，分子量达数百万，是大多数真菌和一些藻类的成分，也发 现于正在分裂的酵母细胞的胞间中隔中，但壳多糖主要存在于无脊椎动物，如昆虫、 蟹虾等。壳多糖去乙酰化形成脱乙酰壳多糖，由于脱乙酰壳多糖的阳离子性质和无 毒性，近来被广泛地应用于水和饮料处理、化状品、制药、食品等领域【1 2 】。 1 1 2 植物多糖 植物多糖，按照传统习惯可分为细胞内贮存多糖、果胶类物质、半纤维素、纤 维素、树胶和粘胶【i ”。 细胞内的贮存多糖，是代谢底物的备用材料，除淀粉形成颗粒外，均以溶液或 高度水合状态存在于液泡中，可以通过聚合或解聚而改变大分子的聚合度和性状。 - - j f l 细菌胞外多糖的初步研究 细胞内的非淀粉贮存多糖，主要是果聚糖和甘露聚糖。前者在双子叶和单子叶植物 细胞中都有，后者只发现于单子叶植物营养组织。 果胶类物质主要存在于植物的初生细胞壁和细胞之间的中层内，从结构角度看， 果胶物质包括两种酸性多糖和三种中性多糖，酸性多糖为聚半乳糖醛酸和聚鼠李半 乳糖醛酸，中性多糖为阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。羧基不同程度被 甲酯化的线形聚半乳糖醛酸或聚鼠李半乳糖醛酸称为果胶，完全去甲酯化的果胶称 为果胶酸，羧基大部分被甲酯化的果胶称为果胶酯酸。果胶的相对分子量随来源而 异，一般为2 5 0 0 0 5 0 0 0 0 d a 。果胶溶液是亲水胶体，在适当的酸度和糖浓度下形成 凝胶，在糖果和食品工业被用作胶凝剂。 半纤维素被定义为碱溶性的植物细胞壁多糖，也即除去果胶物质后的残留物能 被1 5 n a o h 溶液提取的多糖，大多数都具有侧链，分子大小为5 0 4 0 0 个残基， 在细胞壁中与微纤维非共价结合成为细胞壁的另一类基质多糖，大量存在于植物的 木质化部分。属于这类多糖的有木聚糖、葡甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖、木葡聚糖 等，半纤维素就是这些多糖的总称。 纤维素是线形葡聚糖，残基间通过d ( 1 ，4 ) 糖苷键连接的纤维二糖可看成它的 二糖单位。天然纤维素在工业上主要用于纺织和造纸，改型纤维素有更多的用途， 例如醋酸纤维素是最重要的纤维素酯，可用于制造胶片和薄膜，其薄膜在生化实验 中用作电泳支持物：羧甲基纤维素在食品工业中用作粘稠剂和填充剂。 树胶和粘胶，是根据其外观而进行的习惯性分类，其化学本质没有严格的区分， 主要来源于植物的根、皮、叶、种子和花朵，史前已用于食品和药物。工业上被广 泛地用作粘和剂、增稠剂、悬浮剂、成型剂等，最为重要的树胶是阿拉伯胶。历史 上，我国人民就利用植物中草药的提取物来治疗疾病，其提取物中含有多糖成分， 至今已报道了一百多种具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、延缓衰老等多种 生理活性的植物中草药多糖，有的已在临床上使用。 11 3 海藻多糖【1 4 j 海藻多糖系海藻中所含的各种分子碳水化合物，它们都是水溶性的，具有高粘 度或凝固能力，这些海藻多糖也统称为海藻胶。 海藻按照所含色素不同可分为多种，其中以藻体大、数量多、生长于近海、采 集较易而又具有工业利用价值的褐藻和红藻为主。从褐藻中分离出来的褐藻多糖有 褐藻淀粉、褐藻糖胶、褐藻胶等，从红藻中分离出米的有卡拉胶、红藻淀粉、木糖 胶、甘露糖胶等，但至今能进行工业化生产的海藻多糖只有褐藻胶、琼胶、卡拉胶 4 文献综述 等。 褐藻胶是褐藻的一种细胞间多糖，由b 一1 ，4 一d 甘露糖醛酸和c 【1 ，4 - l 一古罗糖醛 酸不规则地连接起来的线形长链分子。它主要用于纺织工业中作印花浆，食品工业 中作稳定剂、增稠剂，医药工业中做赋型剂、弹性印模等。 按照化学组成分类，红藻多糖可分为琼胶和卡拉胶两大类，以d 一和l 一半乳糖为 基本结构单位者属琼胶族；只以d 一半乳糖为基本构成单位者属卡拉胶族。目前琼胶 和卡拉胶构成了红藻工业的主体。 琼胶是由琼脂糖和琼脂胶混合而成。琼脂糖是由d 一半乳糖和3 ，6 - 内醚一l 一半 乳糖构成的中性不带电荷的多糖，而琼脂胶除这两种单糖外还有少量葡萄糖醛酸， 有时在半乳糖残基上不同程度地连有硫酸基、甲氧基和丙酮酸基，构造比琼脂糖复 杂，是带电荷的多糖。琼胶为亲水性胶体，分有条状和粉末状，不溶于冷水，易溶 于热水。琼胶在工业上具有独特的重要性，琼胶的浓度即使低至1 仍能形成相当稳 定的凝胶( 冻胶) ，是食品工业、化学工业、医学科研所必需之原料。尤其在食品工 业的应用中，琼胶由于其独特的性质和特点( 凝固性、稳定性，能与一些物质形成 络合物等物理化学性质) ，可用作增稠剂、凝固剂、悬浮剂、乳化剂、保鲜剂和稳定 剂。广泛用于制造粒粒橙及各种饮料、果冻、冰淇淋、糕点、软糖、罐头、肉制品、 八宝粥、银耳燕窝、羹类食品、凉拌食品等。 卡拉胶主要用于食品工业中作乳化剂、分散剂、增稠剂、固定化酶载体等。 1 1 4 微生物多糖 微生物多糖可分为胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖，其中胞外多糖由于其易于 发酵生产和提取，并具有广泛的应用价值，因此在人们的生产生活中发挥着极其重 要的作用。据d e e v e l e i g h 统计，已经发现4 9 属7 6 种微生物产生胞外多糖，但 真正有应用价值并已进行或接近工业化生产的不多。到目前为止，已大量进行商业 化生产的微生物胞外多糖主要有黄原胶( x a n t h a ng u m ) 、结冷胶( o e l l a n g u m ) 、小核菌 葡聚糖( s c l e e r o g l u c a n ) 、短梗霉多糖( p u l l u l a n ) 、热凝多糖( c u r d l m l ) 等。 微生物多糖包括真菌多糖和细菌多糖。真菌多糖中，除了小核菌葡聚糖、短梗 霉多糖等用于工业化生产和应用外，许多真菌多糖作为药剂在保健领域和癌症患者 的辅助治疗中发挥着重要的作用，目前在临床上正式应用的多糖有香菇多糖、云芝 多糖、获芩多糖等，它们均来源于真菌，另外，正在研制的或非正式在临床应用的 有虫草多糖、灵芝多糖、银耳多糖等1 5 1 。 细菌多糖主要应用于医疗和工业。在医疗领域，一些病原菌的荚膜多糖可制成 s 种钏菌胞外多糖的初步研究 化学疫苗，例如肺炎链球菌的荚膜多糖或脑膜炎球菌的荚膜多糖都可制成多糖化学 疫苗，在疾病的预防中发挥着重要的作用。近些年来有报道显示，少数细菌多糖同 真菌多糖一样能够提高机体的免疫力，具有保健功能，目前尚处于研究阶段，具有 广阔的开发前景。目前，细菌多糖最主要的是作为乳化剂、增稠剂、稳定剂、胶凝 剂、成膜剂、悬浮剂和润滑剂等应用于石油、化工、食品和制药等多个领域m j ，已 经规模化生产并应用的细菌多糖有：黄原胶、结冷胶、热凝多糖等。以下是几种重 要的细菌多糖的介绍。 1 1 4 1 黄原胶( x a n 血a ng u m 、 黄原胶又名黄单胞菌多糖、汉生胶、苫顿胶等，是黄单胞杆菌产生的胞外杂多 糖的统称，其主链与纤维素相同，是由a 一1 ，4 一糖苷键连接的葡萄糖，每隔一个葡萄糖 有一个侧链相连接，侧链由甘露糖、葡萄糖醛酸和甘露糖组成，连接主链的甘露糖 被乙酰化，在末端的甘露糖的羟基与丙酮酸的羰基形成缩醛。 黄原胶是目前世界上生产规模最大、用途最广的微生物多糖之一。早在2 0 世纪 5 0 年代，j e a n e s 等对黄原胶的产生菌进行了大量筛选，获得了许多黄原胶产生菌， 并进行了大量研究，于1 9 6 0 年k i l c o 公司开始进行工业性批量生产。1 9 6 1 年实现了 半商品化生产，1 9 6 4 年实现了火规模商品化生产。之后，法国、英国、前苏联电相 继生产。我国于1 9 7 9 年南开大学赵大健等开始进行菌种筛选、产物鉴定和发酵条件 研究，于2 0 世纪8 0 年代中开始进行小批量生产。随后，中国科学院微生物研究所、 山东食品发酵研究设计院等也开展了有关研究。目前我国有黄原胶年产量近4 0 0 0 吨， 但仅能满足国内市场的三分之一。由于黄原胶具有良好的增稠性、假塑流变性、水 溶性、悬浮性、乳化稳定性、耐酸耐碱、抗盐、抗温、优良的兼容性等性能，其应 用覆盖面多达2 0 多个行业，用于3 0 4 0 种产品 1 7 j 8 。 1 1 4 2 结冷胶( g e l l a ng u m ) e 悖 结冷胶是由沼假单胞菌生产的一种线性阴离子杂多糖结冷胶于1 9 7 8 年发现， 由k e l c o 公司生产制造，在1 9 8 1 年已投入商业化生产，其商品名为g e l r i t 。在日本， 于1 9 8 8 年将其应用于食品中，1 9 9 0 年f d a 对其给予了认可，目前已广泛应用于食 品工业中。 通过增加离子浓度和提高温度，结冷胶能得到热可逆性胶。结冷胶有两种类型， 其中藻酸盐胶是唯一的食品级结冷胶，结冷胶的优点是在金属离子存在日j 也可形成 透明胶体，所以它可应用于食品工业，它可以使食品稳定、增强食品结构和增加风 味等。除了在食品中广泛应用外，它还应用于其他许多领域，例如它可以作为琼脂 文献综述 的替代品制备生物培养基，特别是可以用于澄清度要求高的培养基。在园艺和农业 中，其使用前景也很广阔 2 ，它被认为是植物组织培养的良好培养基。 1 1 4 3 热凝多糖( c u r d l a n ) 刚 热凝多糖，又叫凝结多糖，是由旺一1 ，4 一糖昔键构成的的水不溶性葡聚糖，是一类 将其悬浊液加热后既能形成硬而有弹性的热不可逆性凝胶，又能形成热可逆性凝胶 的多糖类的总称。 1 9 6 4 年，原田等从土壤中分离出的一种细菌，该菌株产生的多糖为凝结多糖， 后发现a g r o b a c t e r i u m 属的许多菌株可以产生该多糖。凝结多糖是继黄原胶、结冷胶 之后又一种新的细菌发酵生产的多糖。该多糖由美国t a k e d a 股份有限公司，从1 9 8 9 年起在日本、韩国、台湾广泛使用。美国f d a 于1 9 9 6 年准许将其作为食品的稳定 剂、增稠剂用于食品配料中。目前，我国江苏省食品发酵研究所采用微生物发酵法 生产热凝多糖的工艺已基本完成工业性的试验，正致力于实际工业化生的前期准备 工作。 1 2 多糖的药理研究 多糖的药用研究始于1 9 4 3 年，6 0 多年来，人们从动物、植物、微生物中提取分 离了大量多糖和多糖类物质用作治疗或辅助治疗药物。作为一种免疫调节剂，多糖 能起到刺激机体的各种免疫活性细胞的成熟、分化和繁殖，增加巨噬细胞非特异性 细胞毒，诱导白细胞介素一1 、白细胞介素一2 、肿瘤坏死因子、干扰素等细胞因子 的和细胞因子受体的表达，促进抗体的形成，活化补体系统的经典途径及变更途径 等作用口“。而且多糖是通过宿主中介起作用，所以多糖药物没有细胞毒性，不影响 正常细胞。目前，多糖药物的研究集中在它们的结构和免疫调节活性的关系、分子 水平的作用机制和如何通过化学修饰增强其生物活性上【2 3 1 。 l2 1 免疫调节作用 1 2 1 1 对巨噬细胞的作用 巨噬细胞是多糖作用的最主要的靶细胞。灵芝多糖能增强巨噬细胞的吞噬功能， 能引起小鼠巨噬细胞c a 2 + 浓度和p h 升高，增加巨噬细胞内三磷酸肌醇和二酰基甘油 以及环磷酸酰苷、环磷酸鸟苷的生成量，在转录水平上促进小鼠巨噬细胞分泌细胞 因子并影响其蛋白激酶的活性，从而提高小鼠非特异免疫机能。李明春口4 峙民道，灵 芝多糖( g l b 7 ) 能剂量依赖性地引起小鼠腹腔巨噬细胞c a m p 浓度的升高，从而引 起蛋白激酶a 的活化，激活巨噬细胞。这可能是其通过影响巨噬细胞的活性增强机 一种细菌胞外多糖的初步研究 体免疫功能的机制之一。在此基础上，李明春等 2 5 采用竞争性蛋白结合分析法测定 培养的小鼠腹腔巨噬细胞中c g m p 含量的影响，研究了灵芝多糖( g l b 7 ) 对巨噬细 胞中c g m p 含量的影响。结果显示，g l b ，能剂量依赖性地引起小鼠腹腔巨噬细胞 c g m p 浓度的升高，1 0 r a i n 达到峰值，之后缓慢下降，至3 0 r a i n 时基本恢复至原来水 平。一般认为c g m p 可通过激活c g p k 、活化a d p 一核糖环化酶等途径发挥其渊控细 胞功能的作用。因此认为g l b 7 对巨噬细胞内c g m p 含量的影响可能是其增强巨噬细 胞功能、发挥免疫调节作用的机制之一。 1 2 1 2 对、淋巴细胞功能的影响 淋巴细胞是构成免疫器官的基本单位，在免疫应答过程中起核心作用。淋巴细 胞分为t 、b 、n k 、k 、l a k 细胞等，其中，接收抗原刺激后能发生特异性免疫应 答的淋巴细胞成为抗原特异性淋巴细胞，即t 细胞和b 细胞。t 细胞在机体的细胞 免疫和体液免疫诱导中均有重要作用，作为免疫效应细胞主要由两方面的功能：即 作为t d t h 介导迟发型超敏反应和作为r 细胞直接杀伤靶细胞。b 细胞通过其分泌的 抗体行使其免疫功能，另外，活化的b 细胞还具有加工和呈递抗原给t 细胞的作用。 n k 细胞即自然杀伤细胞，它既不需经抗原刺激，也不需要抗体参与就能杀伤某些靶 细胞。同时n k 细胞也是一类重要的免疫调节细胞，它对t 细胞、b 细胞、骨髓干 细胞等均有调节作用，并通过释放细胞因子激活杀伤细胞，其最突出的特征是具有 广谱的抗肿瘤作用【2 6 j 。 在体外，灵芝多糖能促进混合淋巴细胞反应( m l r ) ，促进未经分化的脾细胞增 殖，增强d n a 多聚酶n 的活性，并促进白细胞介素2 的分泌陀7 ，2 柏。香菇多糖对环磷 酰胺( c p ) 诱导的免疫功能低下的小鼠脾细胞溶血素抗体( i g m ) 的生成，以及对 刀豆蛋白( c o n a ) 诱导的脾淋巴细胞增殖反应和白细胞介素一2 的生成均产生正向作 用“。香菇多糖能恢复或增强宿主对淋巴细胞、激素及其他生物活性因子的反应， 通过刺激免疫活性细胞的成熟、分化和繁殖，大量增加机体的淋巴细胞，从而提高 机体的免疫能力。香菇多糖是一种典型的t 细胞激活剂，可提高肿瘤患者c d 4 c d 8 比值而逆转免疫抑制状态，具有调节细胞功能的作用。另外，有人报道香菇多糖对 肿瘤及慢性肝炎有免疫调节作用，主要是促进t 细胞活性，对辅助性t 细胞及杀伤 性t 细胞的促进作用尤为显著，具有抗病毒及诱生干扰素保护肝脏的作用 3 0 1 。 俞发等【3 1 采用竞争性蛋白结合分析法研究了螺旋藻多糖( p s p ) 对小鼠脾细胞中 第二信使c a m p 浓度的影向。实验证明，p s p 可以剂量依赖性引起小鼠脾细胞中 c a m p 浓度的升高，这可能是p s p 免疫调节作用的重要机制之一。曲显俊掣3 2 1 以m t t 文献综述 法检测p s p 对荷瘤小鼠淋巴细胞转化和对n k 细胞杀伤靶细胞的作用，对脾淋巴细 胞t n f 一的诱生作用有较好的剂量一效应关系，治疗后的荷瘤小鼠其脾淋巴细胞产 生i l - 2 的功能增强。p s p 可能主要通过作用于淋巴细胞和n k 细胞来增强和恢复机 体的免疫功能，从而达到杀灭肿瘤细胞的目的。 用于淋巴细胞转化实验的主要方法有形态学计数法、核素掺入法 ( 3 h - t d r 尸h l e u 掺入法，以胞浆内r n a 的及核内d n a 合成代谢水平作为检测淋巴 细胞活化程度的指标) 和m t t 法。 121 3 对抗体生成的影响 b 细胞分泌的抗体可执行多种免疫功能。抗体与抗原特异结合，可直接中和具 有毒性的抗原分子；抗体结合抗原后形成的复合物，易被吞噬细胞清除；抗体又可 与抗原结合后，再结合补体，使补体活化，杀伤病原体。 1 2 1 4 对细胞因子分泌的影响 细胞因子是由活化的免疫细胞和某些机质细胞分泌的，介导和调节免疫、炎症 反应的一类小分子糖蛋白，包括由淋巴细胞产生的淋巴因子和由单核一巨噬细胞产 生的单核因子等。细胞因子具有多样性的生物学作用，包括促进靶细胞增殖、分化， 增强对感染抵抗力，参与调节机体的免疫应答和炎症反映，影响其反应强度和反映 的持续时间，影响细胞代谢等。 灰树花多糖具有较明显的抗流行性感冒病毒和单纯疱疹病毒的作用，其抗病毒 作用与其促进i f n 的产生有关 3 3 1 。另外，多糖对免疫器官也有影响。胸腺和脾脏作为 中枢和外周的免疫器官对机体的免疫功能调节具有重要的作用。研究表明，淫羊藿 多糖对胸腺的免疫药理作用，主要表现在激活胸腺细胞的免疫功能，增强胸腺细胞 产生i l - 2 的能力和细胞增殖能力，并使胸腺成熟细胞向脾脏转移，使胸腺萎缩，说 明多糖物质加强胸腺细胞“排空”效应是增强t 细胞功能的主要环科孙35 1 。 1 2 2 抗肿瘤作用 恶性肿瘤是严重威胁人类生命的常见病和多发病，是除一t j , f m 管疾病外的人类第 二大杀手，在发展中国家已成为第一死因。我国每年肿瘤新发病人数约1 6 0 万，死 亡1 2 0 万【3 6 1 。 放、化疗是目前有效治疗肿瘤的方法，但这些方法对机体有较大的毒副作用， 表现为对机体免疫系统与造血系统的损害，n n 许多患者不能耐受，致使较优的放 化疗方案完成率只有7 0 7 左右，造成放化疗不能达到正规的疗程剂量或根治性剂量， 因而肿瘤易于复发和转移，直接影响治疗效果。以真菌多糖为代表的天然抗肿瘤药 一种细菌胞外多糖的初步研究 物强调扶正固本，通过增强人体的免疫系统功能达到抑制肿瘤，延长病人生存期， 弥补放化疗的缺陷。 多糖抑瘤作用主要是通过调节宿主免疫功能起作用。多糖的抑瘤率多低于治疗 量的细胞毒药物的抑瘤率口“。在抑制肿瘤生长的同时不出现细胞毒药物的毒性反应， 反而出现不同程度的免疫增强作用。没有很好的量效关系，多数在中小剂量的疗效较 佳。细胞毒性试验表明，药理剂量的多糖对体外培养的s 1 8 0 、k 5 b 2 等肿瘤的细胞 生长无明显的抑制作用 3 83 9 。吕晓英等h 0 1 研究了红毛五加多糖( a g p ) 体外抗肿瘤的 机制，表明a g p 有诱导肿瘤细胞s g c 一7 9 0 1 凋亡的作用