（物理化学专业论文）旋转激光扫描共焦荧光检测式毛细管阵列电泳的研制与应用研究.pdf

摘要 摘要 本论文主要包括旋转激光扫描共焦荧光检测式毛细管阵列电泳的研制及 其在组合化学方面的应用，此种新型的毛细管阵列电泳采用圆形毛细管阵列， 扫描式激光诱导荧光共聚焦检测方法。一方面利用了高速直流电机旋转反射 镜柬进行激光扫描，加快了采样速率：另一方面采用了旋转编码器来定位每 根毛细管的位置，同时将获得毛细管的位置信号传递给数据采集系统，解决 了以前的毛细管阵列电泳中存在的毛细管定位不准确的问题。 我们利用此毛细管阵列电泳对手性氨基酸进行了分离条件的筛选，实验 结果证明了我们自行研制的毛细管阵列电泳是可行的。 我们还利用我们自行研制的毛细管阵列电泳对l 一氨基酸的西夫碱型消 旋化反应迸行了研究，对影响l 一氨基酸西夫碱型消旋化反应的各种条件进 行了筛选研究。 最后我们利用我们自行研制的毛细管阵列电泳对l 一脯氨酸到d 一脯氨 酸的不对称转化反应与【。一组氨酸到d 一组氨酸的不对称转化反应分别进行 了反应条件的筛选研究，对于氨基酸不对称转化反应所需的催化剂种类、浓 度、溶剂种类等条件进行了筛选，筛选出这两个不对称转化反应较佳的反应 条件。实验结果表明此毛细管阵列电泳对于不对称转化反应的筛选不仅减少 了反应的操作步骤，并且由毛细管阵列电泳的谱图可以直接获得不对称反应 产物的手性过量值。证明了毛细管阵列电泳在组合不对称催化方面的应用潜 力。 关键词：毛细管阵列电泳，旋转编码器，手性分离，手性过量值，不对称转 化反应，高通量筛选 a b s t r a c t a b s t r a c t j u nw a n g ( p h y s i c a lc h e m i s t r y ) d i r e c t e db yp r o f j i l i n gb a t an e wc a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s ( c a e ) u s i n gc o n f o c a l r o t a r y s c a l l n e rw a ss e tu pa n da p p l i e df o r t h eh i g ht h r o u g h p n t f l u o r e s c e n c e s c l e e n m go 。 c o m b i n a t o r i a lc h e m i s t r y w eh a v ec o n s t r u c t e dar o t a r yc a es c a n n e rc o n t a i n i n gr o t a u , - e n c o d e ra n c h i g hs p e e dd cm o t o rb a s e do n l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ( l i f ) d e t e c t i o nt h “ c a es c a n n e rs y s t e mc a na c c u r a t e l yo r i e n tt h ep o s i t i o no fe a c hc a p i l l a r ya n ( m e a s u r et h ef l u o r e s c e n c ed a t af r o mt h eb e i n gs c a n n e dc a p i l l a r y ，a c c o r d i n gt h e p o n t i o n ( a n g u l a r ) t r i g g e rs i g n a lo u t p u t f r o mt h e r o t a r ye n c o d e lt h ei o t a m a x i m u mn u m b e ro ft h ec a p i l l a r i e si sd e t e r m i n e db yc h er e s o l u t i o no ft h er o t a r e n c o d e r , a n dt h eh i g h e rs a m p l i n gr a t ef o rc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i si sd e c i d e db ) t h em o t o rs p e e d t h eh i g ht h r o u g h p u tc h a r a c t e r n t i cm a k e st h i ss e t u pp r o m i s i n l a p p l i c a t i o n si na n a l y t i c a lf i e l ds e p a r a t i o no ft h ee n a n t i o m e r so fs e v e r a la m i m a c i d si nc u r r e n t1 6 一c h a n n e ic a ew i t hd i f f e r e n ta d d i t i v e si nd i f f e r e n tc h a n n e l s d e m o n s t r a t e di nt h i sr e p o r t t h eo n e - t o o n er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ef l u o r e s c e n o s i g n a la n de a c hc a p i l l a r yi sw e l le s t a b l i s h e di nt h i sc a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i ! s y s t e m o u ri n i t i a le x p e r i m e n t sa l s o d e m o n s t r a t et h ei n s t r u m e n tp o t e n t i a a p p l i c a t i o n i ns e l e c t i o na n do p t i m i z a t i o no fs e p a r a t i o nc o n d i t i o n sf o r 抽i a b s t r a c t e n a n t i o m e r so fa m i n oa c i d s w es c r e e n e dt h e a l d e h y d ec a t a l y z e dr a c e m i z a t i o nr e a c t i o n o fs e v e r a l l - a m i n oa c i d sb yt h i sh o m e m a d ec a e ，w es c r e e n e dd i f f e r e n tc o n d i t i o n ss u c ha s c o n t e n t so rt y p e so fa l d e h y d e so rs o l v e n t sf o rt h er a c e m i z a t i o nr e a c t i o n t h e e x p e r i m e n t a l a l s o p r o v e d t h a tc a ec a nb e p o t e n t i a l f o r h i g h t h r o u g h p u t s c r e e n i n g w ea l s os t u d i e dt w oa s y m m e t r i ct r a n s f o r m a t i o nr e a c t i o no fl - p r ot od p r o a n dl - h i st od _ h i sb yt h i sc a ef o rt h ef i r s tt i m e ，w er a p i d l yo b t a i n e dt h e e n a n t i o m e r i ce x c e s sv a l u e s o fa s y m m e t r i ct r a n s f o r m a t i o np r o d u c t sf r o mp e a k h e i g h t so fc a ee l e c t r o p h e r o g r a m ，w er a p i d l yo b t a i n e dt h eb e t t e r c a t a l y s t s ， s o l v e n t sa n do t h e rb e t t e rr e a c t i o nc o n d i t i o n sf o rt h ea s y m m e t r i ct r a n s f o r m a t i o n r e a c t i o n f r o mt h e s er e s u l t sw ec o n f i r m e dt h a to u rh o m e m a d ec a ei sa d a p t e df o r o p t i m i z a t i o n o fr e a c t i o nc o n d i t i o n sa n d h i g h - t h r o u g h p u ts c r e e n i n g f o r c o m b i n a t o r i a lc h e m i s t r y k e y w o r d s ：c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s ，r o t a r ye n c o d e r , e n a n t i o m e r i c s e p a r a t i o n ，e n a n t i o m e r i c e x c e s s v a l u e ，a s y m m e t r i ct r a n s f o r m a t i o nr e a c t i o n ， h i g h - t h r o u g h p u ts c r e e n i n g 第一章毛细管电泳与毛细管阵列电泳的发展及应用 第一章毛细管电泳与毛细管阵列电泳的发展及应用 1 1 毛细管电泳 毛细管阵列电泳，即多通道毛细管电泳，是在毛细管电泳的基础t 发展 起来的。 毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、高压直流电场为驱动力的一种 色谱分离分析技术，其仪器部分包括高压电源、缓冲液池、毛细管、检测器、 数据采集与处理系统等，图1 1 是毛细管电泳简单装置图。含有缓冲液的石 英毛细管在高压直流电场的作用下，缓冲溶液中带正电荷的离子会从正极往 负极移动，带负电荷的离子会从负极向正极移动，从而达到带不同电荷离子 的分离。实际上，石英毛细管内缓冲液的p h 3 时，其毛细管表面带有负电荷， 与缓冲液形成双电层，当外加高压直流电场时，双电层中的水合阳离子层会 导致整个缓冲液向负极流动，形成电渗流( e l e c t r o o s m o t i cf l o w ，e o f ) ，因 此离子在毛细管内的实际迁移速率为其电泳速率与电渗流的矢量和。 广 l 数据采集与处理系统l 图1 1 毛细管电泳仪器示意图 f i g 1 1s k e t c ho fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i si n s t r u m e n l 旋转激光扫描共焦荧光检测式毛细管阵列电泳的研制与应用研究 1 9 6 7 年h j e r t e n ”嫜冼提出在高电场强度，内径为3 2 u t t 的毛细管中进行 了自由溶液的区带电泳，他利用紫外吸收检测的方法分离了小到无机离子、 核苷酸大到蛋白质、病毒颗粒等多种物质。随后在1 9 7 4 年，v i r t a n e n 2 1 使用 内径更小的p y r e x 管( 2 0 0 “m ) 一加快焦耳热的散热效率，从而在更大程度上 消除对流对分离的影响，采用电位法分离并定量分析了几种碱性阳离子， v i r t a n e n 还提出了电渗流对电泳分离的重要作用。在1 9 世纪七十年代末n ) l 十年代初的几年问，由于m i k k e r s ”、j o r g e n s o n 和l u k a c s 等人【4 6 1 的工作， 现代意义上的毛细管电泳得到了飞快的发展。j o r g e n s o n 和l u k a c s 首次采用 了内径小于l o o u m 的毛细管进行电泳分离，使用了3 万伏的分离电压与荧光 检测方法，其分离效率可达到4 1 0 5 个塔板数，并且较好的抑制了焦耳热的 产生。在之后近十年的时间里，村：t e r a b e 7 1 、h j e r t e n i ”、c o h e n 和k a r g e r 9 1 、 r o s e 和j o r g e n s o n 1 0 1 等一批先驱者的努力，使现代意义上的毛细管电泳得到 了突飞猛进地发展，发展出了多种分离模式。 111 毛细管电泳操作模式 毛细管电泳的多样化部分是由于它有多种操作方式，各种方式的分离机 理是不相同的，它们能够提供互不相关而又相互补充的信息，而且有可能同 时分析所有不同带电状况的溶质。这是毛细管电泳技术在出现后不久，就被 广泛地接受并逐步应用于生命科学各个领域的原因之一。其基本操作模式大 体有下述几种。 11 1 1 毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ；c z e ) c z e 以自由溶液为分离介质，也称为毛细管自由溶液区带电泳，是毛细管 电泳中最基本，应用最广的一种操作模式。它以电场中溶质的迁移速度差异 作为分离基础，也是其他各种操作模式的母体。c z e 的应用范围很广 1 1 , t 2 1 ，包 第一章毛细管电泳与毛细管阵列电泳的发展及应用 3 括氨基酸、多肽、蛋白质的分析鉴定、药物对映体的分析、糖类、离子及小 分子等样品的定性定量分析。 1 1 1 ，2 胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a re l e e t r o k i n e t i c c a p i l l a r y c h r o m a t o g r a p h y ；m e k c 或m e c c1 m e k c 是电泳技术与色谱技术的的交叉，是一种既能分离中性溶质又能分 离带电组分的电泳技术，在m e k c 中，通常是将离予型表面活性剂加入自由溶 液中，在临界胶束浓度( 例如对s d s 为8 - 9 m m o l l ) 以上，单个表面活性剂分 子之间聚集而形成胶柬，其分离机理是基于胶束与溶质分子间的相互作用。 m e k c 对于带电的和不带电的物质以及很大一部分具有亲水性或疏水性的物 质，都可以进行分析，应用范围包括氨基酸、核酸、蛋白质、维生素、药物， 尤其适用于手性化合物的拆分m ”】。因此在各个领域特别是生物药物领域显 示了广泛的应用前景。 1 1 1 3 毛细管筛分电泳( c a p i l l a r ys i e v i n ge l e c t r o p h o r e s i s ；c s e ) 此种电泳方式是在分离介质中加入适当的起“分子筛”作用的聚合物， 依据分子大小将样品分离开。这种模式主要用于分子生物学上分离大分子物 质，包括寡核苷酸纯化、p c r 产物的分析、d n a 测序及蛋白质分离。由于核酸 分子的荷质比相近，所以对它们的分离一般均采用c s e 模式。根据所是的聚 合物的不同。又可将c s e 进一步分为毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e l e l e c t r o p h o r e s i s ：c g e ) 和毛细管无胶筛分电泳( c a p i i l a r yn o n g e l e 1 e c t r o p h o r e s i s ：c n g e ) 。 1 1 13 1 毛细管凝胶筛分电泳( c g e ) 目前，在毛细管凝胶电泳中使用的凝胶物质主要是聚丙烯酰胺凝胶。其 分离机理与平板凝胶电泳样，并且分离更快速，具有灵敏、高效、易于定 量、可以自动化的特点。但凝胶毛细管柱制各困难，重复性差，寿命短等缺 4 旋转激光扫描共焦荧光检测式毛细管阵列电泳的研制与应用研究 点限制了其应用，因此人们将日光更多地转向了c n g e 的研究。 1 1 1 32 毛细管无胶筛分电泳( c n g e ) 这种模式是在自由溶液中加入低粘度不交联的线性聚合物溶液( 如甲基 纤维素等) ，起到类似凝胶的筛分作用，以达到筛分目的。尽管它的分辨率略 低于c g e ，但这种柱子寿命长，操作简单，重复性好，因此，它在生物大分 子的分离，尤其是在核酸分离方面有着广阔的应用前景。 11 1 4 毛细管等电聚焦电泳( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ；c l e f ) c i e f 是一种依据两性电介质等电点( p i ) 不同对它们进行分离的技术。 在自由溶液中加入两性电解质，在一定条件下可以在毛细管内形成一个p h 梯度，使不同等电点的样品各组分分别聚焦在不同的位置上而达到分离的目 的。c i e f 已被用于测定蛋白质等电点，分离异构体，分离免疫球蛋白和血红 蛋白等。 1 1 1 5 毛细管等速电泳( c a p i l l a r yi s o t a c h o p h o r e s i s ；c i t p ) c i t p 是一种“移动界面”电泳技术，它采用两种不同的缓冲液体系，即 前导电解质和尾随电解质，前者的淌度高于任何样品组分，后者低于任何样 品组分，造成所有被分离的组分夹在其中，按其不同的淌度以相同的速率迁 移，实现分离，多用于同时分离正、负离子。 1 1 1 6 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y , c e c ) c e c 是c e 与高效液相色谱相结合的一种方法，将色谱固定相引入毛细管 内，以电渗流代替压力来驱动流动相，分析样品的色谱保留机制真正发生在 两相之间，样品的分离既有电泳的作用，又具有色谱分配机制的作用1 1 5 , 1 6 。 11 2 毛细管电泳的检测方法 随着高灵敏度检测器、高性能毛细管柱、电子技术的发展以及商品化仪器 第一章毛细管电泳与毛细管阵列电泳的发展及应用 5 的出现，毛细管电泳在实际工作中的应用越来越多。相对于传统的平板凝胶 电泳技术，毛细管电泳显示出极大的优越性，如高速度、高效率、高分离度、 低样品需要量和消耗量以及可以自动化操作等。相对于同样现代化的分离技 术，如高效液相色谱，毛细管电泳同样具有相当的优势，诸如低进样量、低 溶剂消耗量、多操作模式及小的环境危害性等。基于此，自毛细管电泳诞生 起，在不长的时间里就被广泛接受并逐步应用于环境分析、药物分析、临床 检验和刑事诊断等领域。毛细管电泳更是以其独特的优越性在生物物质的分 析领域，特别是在诸如蛋白质、多肽、糖类、寡核苷酸和核酸等生物大分子 的分离分析领域占有举足轻重的地位。 由于毛细管电泳采用细内径的毛细管，进样量较少，因此需要高灵敏度 的检测方法，现在应用于毛细管电泳的检测方法主要分为三类：光学、电化 学、质谱。其中光学检测方法广泛应用于商业的毛细管电泳与实验室自制的 毛细管电泳系统，主要是因为光学检测器具有以下几个优点：首先，光学检 测系统与毛细管没有接触，从而高压电源对其的影响可以降到最低。第二， 光学检测系统检测范围广，可以应用到毛细管电泳的各种模式( c z e ，m e k c ， c e c ，e t c ) 。 1 1 21 光学吸收检测器( o p t i c a la b s o r b a n c ed e t e c t o r ) 尽管由于毛细管内径小的原因造成用于光学吸收检测的路径短，吸收 检测灵敏度不高，紫外可见吸收检测器依然是毛细管中最常用与方便的检 测方法，其检测限为l o 一1 0 一m o l l 。为了提高吸收检测器的检测限，很多人 做了大量的工作，提出了许多方法来改善其灵敏度，例如使用矩形毛细管或 “z ”型毛细管可以解决这一问题 ，而且矩形毛细管比相同表面积的圆柱 形毛细管具有更好的散热能力。另一个方法是使用光热吸收检测器 ( t h e r m o o p t i c a la b s o r b a n e ed e t e c t i o n ，t o a d ) 。采用两束激光交叉通过 分离毛细管的检测端：束与被测物的吸收轮廓相匹配，另一束长波用于监 6 旋转激光扫描共焦荧光检测式毛细管阵列电泳的研制与应用研究 测毛细管内溶液的折射指数变化。当样品进入检测端时，吸收第一束激光的 辐射，导致折射指数发生变化，被第_ 柬激光检测。比起其他光学检测器， t o a d 检测不会发生区域展宽。y u ”1 等用此j 去检测蛋氨酸，检出限为3 7 a m o ： b r u n o 等2 1 1 用2 5 u m 的毛细管检测了 3 5 0 p g 的样品。 1 1 ，2 ，2 荧光检测器( f l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n ，f d ) 由于普通荧光光源是非相干光源，传统光学设计中荧光的采集效率较低 并且毛细管的管散射干扰也很大，荧光检测的检测限仅是紫外吸收的1 0 1 0 0 倍( 1 旷i o 9m o l l l ) f 2 越。激光诱导荧光检测采用相干光源为激发光源，极大 的提高了荧光检测的灵敏度0 0 - 1 4 1 0 。m o l l ) ，并越来越多地应用于各个方 面“。激光诱导荧光检测器( l a s e r i n d u c e df u o r e s c e n c ed e t e c t o r ，l i f d ) 是毛缅管电泳技术中最灵敏的一类检测器。l i f d 采用的激光可以聚焦至微米 级大小的范围，从而减少榆测器造成的峰扩展，同时1 。i f d j 一分灵敏，适用于 小内径毛细管。曾有人采用l i f d 毛n 管电泳对单个分子进行测定【2 4 。但是 l i f d 的局限在于大部分的化合物都不具有荧光性，因此需要使用衍生试剂 对分析物进行荧光标记后才可分析，并且可选择的激光波长较少，且大多数 激光器比较昂贵。 1 1 ，2 3 电化学检测器( e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ，e d ) 安培检测器( a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n ，a m d ) 是电化学中较常用的一种 方法，这主要是具有电化学活性的分子在电极表面发生电化学反应导致检测 电流的变化而被检测出来，并且a m d 具有很高的灵敏度，并且可用于特定电活 性分子的检测2 酿。但是需要考虑的是电极大小、毛细管的连接( 离柱检测) 及毛细管与电极的放置( 柱端检测) 所造成的区带展宽问题。使用芯片技术结 合电化学检测是实现快速分离的一种较好形式。w 0 0 1l e y 口7 等用阵列的p t t 作电极在1 0 0 s 内分离t 3 种电活性小分子。a m d 的局限在于电泳电流较高， 第一章毛细管电泳与毛细管阵列电泳的发展投应用 7 产生的嗓音较大。 11 24 质谱检测器( m a s ss p e c t r o m e t r yd e t e c t i o n m s d l e q d 能够提供试样的结构信息，为解决复杂体系中痕量或微量物质的分 析提供广阉的前景，m s d 用于毛细管电泳一个需要解决的阀题是毛细管电 泳与m s 的接口。理想的c e m s 接口应该能够既维持毛细管电泳高的色谱分 离效率，又能够将解决毛细管电泳与质谱的压力差别丽将分析物传递到质谱 仪中。对于质谱来说，电喷雾电离( e l e c 仃o s p r a yi o n i z a t i o n ，e s i ) 2 9 - 3 h 是最佳 选择，实践证明飞行时间( t i m eo ff i 曲t ，t o f ) 质谱最适用于毛细管电泳， 因为t o f - m s 可以在毫秒级的时间范围内获得光谱信息，可以满足i s c e 的分 析要求。l a z a rf 3 2 j 等采用毛细管电泳与t o f - m s 连用检测多肽，获得飞摩尔级 ( 1 0 1 5 ) 的检出限。而电动力学离子质谱j f n f o u r i e r 变换离子回旋加速响应质谱 在提供极高的灵敏度和分辨率的同时，还具有多维质谱的功能。尽管目前 c e - m s 仍有价格和技术方面的种种制约，但人们预期c e m s 的大范围使用将 会对生物学领域的发展产生极其重要的影响。 1 2 毛细管阵列电泳 尽管毛细管电泳具有许多优点，并且可以应用于人类基因测序的研究， 但是对于单通道毛细管电泳，一次只能分离分析一个样品，虽然现在由于毛 绍管的进样自动化程度较高。并且随着流动注射技术的成熟。可以实现连续 的串行进样，实现多个样品连续进样分析。但是要想同时测量多个样品，那 还是要求具有多通道的毛细管电泳，即毛细管阵列电泳。 毛细管电泳仪器装置简单，与其他的分离方法例如高效液相色谱相比较 可以提高毛细管数目来进行高通量的分析。几十根甚至几百根毛细管可以束 在一起，用个检测器即可检测所有根毛细管的信号。 1 9 9 2 年由美国科学家m a t h i e s 3 3 ”1 等人提出并研制开发一种“毛细管阵 旋转激光扫描其焦荧光检测式毛细管阵列电泳的研制与麻用研究 到电泳”( c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s ，c a e ) ，采用多通道毛细管凝胶电 泳技术进行t d n a 测序工作。毛细管阵列电泳的出现加速人类基因组计划的完 成【3 5 】。现在人类基因测序工作已经基本完成，但是毛细管阵列电泳在其它物 种的基因测序与基因研究的方面继续发挥着重要作用。 图i 2 是m a t h i e s 等人首次提出的毛细管阵列电泳仪器的示意图，图1 3 为这种毛细管阵列电泳中阵列毛细管的排列方式。这个毛细管阵列电泳仪将 2 5 根毛细管排列在一个可前后移动的电控平台上，其移动速度与方向可被程 序精确控制，每根毛细管中的荧光信号通过共聚焦检测方式传递给数据检测 系统。 图1 2 毛细管阵列电泳仪 第一章毛细管电泳与毛细管阵列电泳的发展及应用 图1 3 毛细管的排列方式 f i g 1 3a r r a yc a p i l l a r y 1 2 1 毛细管阵列电泳的检测方法 随着电子科学技术的发展，在过去的二十年里，各种毛细管阵列电泳仪 不断出现，应用也越来越广泛，不但应用于基因测序，还应用于单核苷酸多 态性分析、高通量的聚合酶链反应( p c r ) 分析、组合化学分析等。 过去研发的各种毛细管阵列电泳仪的差别关键于其检测方式的不同，其 检测系统要求光源发出的光要照射到所有根毛细管上并收集所有根毛细管的 信号。用于毛细管阵列电泳检测的主要方法有紫外一可见吸收检测方法、激 光诱导荧光检测方法、激光诱导荧光时间分辨检测方法等，其中激光诱导荧 光检测方法是最灵敏的检测方法，商业的毛细管阵列电泳大多采用激光诱导 荧光检测。 下面我们将根据毛细管阵列电泳检测方式的不同来介绍一下各种毛细管 阵列电泳仪器。 1 2 。1 1 紫外一可见吸收检测的毛细管阵列电泳仪 1 9 9 9 年，美国爱荷华州立大学a m e s 国家实验室的e d w a r ds g e u n g 研究小 组首次将吸收检测器应用于毛细管阵列电泳f 3 6 l ，图1 4 是他们研制开发的毛 1 0 旋转激光扫描共焦荧光检测式毛细管阵列电泳的研制与应用研究 细管阵列电泳的仪器装置示意图，此毛细管阵列电泳仪器采用汞灯或钨灯为 吸收光源，9 6 通道毛细管阵列，采用1 0 2 4 个光二极管阵列检测，对几种中 性化合物采用胶束电动色谱的电泳模式进行了分离检测，获得了很好的结果。 对罗丹明6 g 的检测限可达到1 0 b m o l l 。这种用于毛细管阵列电泳的吸收检 测方法具有较大的应用范围，但是它同样存在检测灵敏度不够高等缺点。 一。仃1 ，么甚 、z 产 一 柱透镜 图1 4 毛细管阵列电泳仪示意图 f i g 1 4s k e t c hd i a g r a mo fc a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s 瓯习阐 堕型l 1 2 1 2 毛细管阵列电泳一时间分辨荧光检测方法 2 0 0 0 年，德国海德堡大学的m n e u m a n n 研究小组首次将时间分辨荧光 检测技术应用于毛细管阵列电泳【3 7 】，此毛细管阵列电泳仪器采用了重复频率 为5 0m h z ，波长为6 4 0 n m 的半导体激光器为激发光源，将1 6 根毛细管固定 在一个可前后移动的平台上，采用共聚焦荧光检测、时间相关的单光子计数 系统，对超过4 0 0 个碱基d n a 片段进行了分离检测，获得了较好的效果。图 1 5 为此种毛细管阵列电泳仪器装置的示意图。 第一章毛细管电泳与毛细管阵列电泳的发展及应用 图1 5 毛细管阵列电泳一时间分辨荧光检测 f i g 1 5t i m e - r e s o l v e dd e t e c t i o no f c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s 1 2 13 毛细管阵列电泳一激光诱导荧光检测方法 激光诱导荧光检测方法是毛细管阵列电泳检测方法中最常用的方法 【3 “，激光诱导荧光检测方法又可根据其在毛细管阵列电泳中的不同检测方 式分为两种：第一种是扫描式检测，扫描式检测是指检测系统与毛细管阵列有 2 旋转激光扫描共焦荧光检测式毛细管阵列电泳的研制与应用研究 榍对的移动，激光逐根扫描聚焦到每根毛细管上，依次将每根毛细管中化合 物荧光信号传递给检测系统。成像式检测是指柬激光同时照射到所有根毛 缅管上，所有毛细管中化合物的荧光信号同时由一个长焦透镜收集，接着将 信号同时传递给c c d 检测系统。这两种检测方式各有优缺点，成像式检测要求 激发激光的强度高，另外照射到每根毛细管的激光强度要求均匀一致。扫描 式检测对激光强度要求不高，但是由于扫描式检测方法需要有活动的部件， 因此受到机械方面的制约并且毛细管的定位比较困难，毛细管定位不准确， 容易出现采集数据出现偏差，并且同时受到扫描速度的限制，采样率不高。 下面介绍几种成像式激光诱导荧光检测与扫描式激光诱导荧光检测的毛 细管阵列电泳仪。 1 2 ，l 。3 1 成像式检测的毛细管阵列电泳。 1 9 9 3 年，日本日立公司中央研究室的h i d e k ik a m b a r a 研制开发出一种成 像式检测的毛细管阵列电泳 r 1 4 3 , 4 4 1 ，采用的检测方式是毛细管柱后液体鞘流 池的检测方式，这种检测方法被k a m b a r a 与d o v i e h i 4 5 1 两个研究小组分别研 制开发出来，图1 6 是这种成像式毛细管阵列电泳装置的示意图，此毛细管 阵列电泳仪采用氩离子激光器( 4 8 8 n m ) 与y a g 激光器( 5 3 2 n m ) 为激发光源照 射到毛细管阵列上，所有根毛细管的信号经由透镜收集传递给c c d 检测器。图 1 7 是阵列毛细管的排列方式，毛细管末端采用鞘流池形排列以利于检测灵 敏度的提高。简单来说，毛细管末端被排列在一个石英池内，在柱后与石英 池的死体积中流有缓冲液，毛细管外缓冲液的流动使从毛细管末端流出的液 体威锥形，降低了毛细管内液体的直径，柬激光同时照射到所有根毛细管 的柱后流出的锥形液体上，垂直于激光照射平面的荧光信号被同时收集，经 过光栅传递给检测器。基于这种设计的检测器已经有商业的毛细管阵列电泳 仪采用，其具体型号是由p e a p p l i e db i o s y s t e m ( f o s t e rc i t y ，c a ) 构建的a b i p r i s m3 7 0 0d n a a n a l y z e r 。 第一章毛细管电泳与毛细管阵列电泳的发展及应用 1 3 图1 6 毛细管阵列电泳示意图 f i g 1 6s k e t c ho f c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s 图1 7 鞘流池检测方式 f i g 1 7s h e a t h f l o wd e t e c t i o no f c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s 4 旋转激光扫描共焦荧光检测式毛细管阵列电泳的研制与应用研究 1 9 9 4 年，j o w a j i 立大学a i e s 国家重点实验室的e d w a r ds y e u n g 教授所 领导的研究小组研制开发出一种柱上激光诱导荧光成像式检测的毛细管阵列 电泳仪f 4 ”。图1 8 是这种毛细管阵列电泳装置的示意图，图1 9 是在这种毛 细管阵列电泳仪上毛细管采用的阵列排列方式。此种毛细管阵列电泳仪是以 氯离子激光器为激发光源，采用双色激光( 4 8 8 n m 、5 1 4 n m ) 同时照射到阵列 毛细管上，所有根毛细管的荧光信号同时经过一个大透镜采集传递给c c d 检测 器。基于这种检测器设计的商业毛细管阵列电泳是由s p e c t r u m e d i x ( s t a t e c o l l e g e ，p e n n s y l v a n i a ) 公司构建的s c e9 6 0 0 。 m l r r o r 图1 8 毛细管阵列电泳示意图 f i g 1 8s k e t c hd i a g r a mo f c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s 第一章毛细管电泳与毛细管阵列电泳的发展及应_ | = l j 图1 9 阵列毛细管的排列方式 f i g 1 9a r r a yc a p i l l a r y 1 9 9 6 年，美国的m a r ka q u e s a d a 研究小组m 增次采用光纤作为毛细管 阵列电泳中激光照射与荧光检测的通道，图1 1 0 为此种毛细管阵列电泳的8 通道毛细管阵列电泳装置的示意图，照射激光通过8 根光纤分别照射到8 根 毛细管上，8 根毛细管又分别用8 根光纤作为荧光收集通道，将信号传递给 一个成像光谱仪，获得荧光光谱信号，适台于多波长荧光检测的d n a 测序等方 面。但是光纤校正等操作比较费时费力，不易实现更高通量的毛细管阵列电 泳。 1 9 9 9 年，德国的c h r i s t o p hh e l i o r 教授所带领的研究小组研制开发出一种 激光诱导荧光成像式检测的毛细管阵列电泳仪c 4 ”，图1 1 1 是这种毛细管阵 列电泳装置的示意图。此仪器采用氢离子激光器为激发光源，一根光纤作为 激发光通道，经过光学元件后产生的光同时照射到阵列毛细管上，所有根毛 细管的信号经过透镜同时传递给c c d 检测器。 】6 旋转激光扫描共焦荧光检测式毛细管阵列电泳的研制与应用研究 图1 1 0 毛细管阵列电泳示意图 f i g 1 1 0s k e t c hd i a g r a mo f c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s 图1 1 1 毛细管阵列电泳示意图 f i g 1 11s k e t c hd i a g r a mo f c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s 最初世界上研发的各种毛细管阵列电泳最多的是采用9 6 根毛细管阵列 第一章毛细管电泳与毛细管阵列电泳的发展及麻用 1 7 为了加大毛细管阵列电泳中毛细管的数量，2 0 0 1 年，加拿大的k 。r m nj d o v i c h i 教授的研究小组研制开发了一种新型的：维成像检测的毛细管阵列 电泳仪删它采用毛细管二维阵列方式，尽量降低毛细管阵列的截面积，在 同样截面积下增大了所能检测毛细管的数量，最多可检测到上千根毛细管。 此毛细管阵列电泳的捡测方式为鞘流池型检测方式，降低了噪音信号。图 1 1 2 是此毛细管阵列电泳的简单示意图。图1 1 3 是二维鞘流池的截面示意 图。 l a s e p l i l i | c n p i l ： | _ 受骚羹兰 s h e s n p f l o wc e l l 图1 1 2 二维毛细管阵列电泳的简单示意闺 f i g 1 1 2s k e t c hd i a g r a mo f c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s 1 8 旋转激光扫描共焦荧光检测式毛细管阵列电泳的研制与应用研究 圈1 1 3 毛细管阵列电泳鞘流池的截面示意图 f i g ，1 ，1 3s k e t c hd i a g r a mo f s h e a t hf l o wc e l l 121 3 2 扫描式检测的毛细管阵列电泳 扫描式检测的毛细管阵列电泳仪是采用激光逐根扫描阵列毛细管中的毛 细管，同时记录每根毛细管中化合物的荧光信号。扫描式的检测器最初是由 i j z a g u r s k y 与r m m c c o r m i c k 研制开发的h ”，这种检测方法接着被 m a t h i e s 研究小组进一步的改进发展成为成熟的毛细管阵列电泳的检测方式。 1 9 9 2 年，美国加州大学b e r k l y 分校的m a t h i e s 研究小组研制的世界上 第一台的毛细管阵列电泳就是一台激光诱导荧光扫描式检测的毛细管阵列电 泳仪前边的图1 ，2 是此种毛细管阵列电泳仪装置的示意图，图i 3 是毛细 管的排列方式。它将阵列毛细管放在一个可前后移动的电控位移平台上，以 氩离子激光为激发光源，经过一个长通的双色镜反射，经透镜聚焦到每根毛 细管上，每根毛细管随着平台的移动依次将信号由透镜聚焦、透过双色镜传 递给检测器光电倍增管( p h o t om u l t i p l i e rt u b e ；p m t ) 。其检测系统采用扫描共 聚焦原理及采用四色荧光检测系统。这种检测方式的缺点在于其扫描速度受 第一章毛细管电泳与毛细管阵列电泳的发展及应用 到限制，不能达到高的采样率。基于这种设计的毛细管阵列电泳己经被 a m e r s h 锄b i o s c i e n c e ( p i s c a t a w a y ，n j ) 构建出来，仪器型号是m e g a b a c e1 0 0 0 。 1 9 9 9 年，美国的t u a nv o - - d i n h 研究小组开发出一种简单的扫插式检 测毛细管阵列电泳仪，图1 1 4 是此毛细管阵列电泳仪的示意图，其采用集成 电路微芯片作为阵列电泳的数据采集单元，将信号采集、滤波、放大、储存 等功能单元集成到小块微芯片上，大大简化了实验装置。但是此毛细管阵 列电泳现在仅采用四根毛细管阵列，更高通量的仪器未见报道。 图1 1 4 毛细管阵列电泳的简单示意图 f i g 1 1 4s k e t c h d i a g r a mo f c a p i l l a r y a r r a ye l e c t r o p h o r e s i s 同样是为了增加毛细管阵列电泳仪中毛细管的阵列通量，1 9 9 9 年，美国 加州大学b e r k l y 分校的m a t h i e s 研究小组研制开发了一种新的扫描式检测的 毛细管阵列电泳”1 ，图1 ，t 5 是此种毛细管阵列电泳装置的示意图。此毛细 旋转激光扫描共焦荧光检测式毛细管阵列电泳的研制与应用研究 管阵列电泳采用毛细管圆形排列，采用共聚焦四色荧光检测，采用光二极管 信号来触发数据采集，采用步进马达来控制反射物镜旋转来扫捕圆形的毛细 管阵列，同时荧光经过共聚焦荧光检测方法在经双色镜透过、反射镜反射传 递给光电倍增管( p m t ) ，光电倍增管产生的电信号再传递给数据采集系统来 获得阵列电泳数据。基于这种设计，毛细管阵列电泳所采用的毛细管数目可 达到上千根。 图1 1 5 毛细管阵列电泳装置 f i g 1 1 5c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i si n s t r u m e n t 13 芯片毛细管阵列电泳系统 第一章毛细管电泳与毛细管阵列电泳的发展及应用 2 由于毛细管电泳仪器绚单，不需要特别复杂的附属设备，囡此毛细管电 泳技术可以进一。少的微型化。芯片毛细管电泳是指将常规毛细管电泳技术移 植到平方厘米量级大小的芯片上，将样品进样、反应、分离、检测等过程集 j 点到一起的多功能化的快速、高效、低耗的微型实验室技术。微型化的毛细 管阵列电泳技术即是将多个电泳通道集成到平方厘米量级大小的芯片上，可 同时进行多个样品分析的高通量微型实验室技术。毛细管电泳芯片与毛细管 阵列电泳芯片的制造基于半导体