（生物化学与分子生物学专业论文）外消旋体雌马酚体外抗癌作用研究.pdf

摘要 大豆异黄酮是大豆在其生长过程中形成的次生代谢产物，主要由黄豆苷原和染料 木素组成。摄入机体内的大豆异黄酮被胃肠道内的微生物菌群降解为各种不同的代谢 产物，其中雌马酚是大豆异黄酮及其所有代谢产物中生理活性最高的物质。本实验探 讨外消旋体雌马酚( + e q u 0 1 ) 对不同肿瘤细胞的体外抑制作用。结果表明，雌马酚 对供试的七种肿瘤细胞均表现不同程度的抑制作用，其中对肝癌细胞株s m m c 一7 7 2 1 的抑制作用最为明显，可诱导肝癌细胞株s m m c 一7 7 2 1 细胞凋亡。与黄豆苷原和染料木 素相比，相同浓度下，雌马酚对供试七种肿瘤细胞的抑制作用均小于染料木素而大于 其前体黄豆苷原。此外，通过对雌激素受体不同的两种乳腺癌细胞株进行抗癌机理的 研究，发现高浓度雌马酚可诱导雌激素受体阳性的乳腺癌细胞株凋亡，却不能对雌激 素受体阴性的乳腺癌细胞产生相同作用；但雌马酚可使这两种细胞细胞周期均阻滞在 s 期。随后，本实验选取了阿霉素耐药型乳腺癌细胞株与低浓度雌马酚和阿霉素进行 共同培养，结果发现雌马酚与阿霉素的联合用药可提高对阿霉素耐药型乳腺癌细胞的 抑制率。 关键词：大豆异黄酮；雌马酚；m t t 法；乳腺癌，i 肝癌 s t u d y0 1 1 1a n t i - t u m o ra c t i v i t yo fr a e e m i ee q u o li nv i t r o a u t h o r ：l ij i n g m a j o r ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y a d v i s o r ：w a n gx i u l i n g a b s t i 。a c t s o y b e a ni s o f l a v o n e s ( s i ) f i l et h es e c o n d a r ym e t a b o l i t e sm a i n l yc o m p o s e db yi s o f l a v o n ed a i d z e i n a n dg e n i s t e i n s la r ed e g r a d e di n t od i f f e r e n tm e t a b o l i t e sb yi n t e s d n a lm i e r o f l o r aa f t e rb e i n ga b s o r b e db y o r g a n i s m s e q u o li s0 1 1 1 eo ft h em o s tb i o l o g i c a l l ya c t i v ec o m p o u n da m o n gi sa n da l lt h eo t h e r m e t a b o l i t e s i nt h i ss t u d y , r a c e m i ee q u o l ( _ e q u 0 1 ) w a st e s t e di t s c a p a c i t yt oi n h i b i tt h eg r o w t ho f d i f f e r e n tc a n c e l e e l l ll i a e si nv i t r o t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg r o w t ho fa l lo ft h es e v e nt e s t e dc a n c e l e e l l l i n e sw e 他i n h i b i t e db ye q u 0 1 t h ei n h i b i t o r yr a t eo fe q u o lo nl i v e rc a n c e re e l ll i n es m m c 7 7 2 1 w 弱h i g h e s t e q u o lc a ni e a dt ot h ea p o p t o s i so fl i v e rc a n c e l e e l ll i n es m m c 7 7 21 t h ei n h i b i t i o n c a p a c i t yo fe q u o lw 硒w e a k e rt h a nt h a to fg e n i s t e i nb u ts t r o n g e rt h a ni t sp r e c u r s o rc o m p o u n dd a i d z e i n u n d e rt h es a m ec o n c e n t r a t i o n m o r c o v c l r , i tw i l l ss h o w nt h a te q u o lc a l ll e a dt h ea p o p t o s i so fe r ( + ) b r e a s t c a n c e rc e l l s ，w h i l es i m i l a rr e s u l tw 私n o tf o u n dw h e ne q u o lw 笛i n e u b a t e dw i t he r ( 一) b r e a s tc a n c e l c e l l s h o w c v e i , e q u o lc 锄b l o c kb o n le r ( + ) a n de r ( - ) b r e a s tc a n c e l - c e l l si nsp h a s e t h e r e f o r e ，b o t h a d r i a m y e i na n de q u o lw e 他i a e u b a t e dt o g e t h e rw i t ha d r i a m y c i n r e s i s t a n tb r e a s tc a n c e l c e l l st ot e s t e d t h e i ru n i o ni n h i b i t i o nc a p a c i t y t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ei n h i b i t i o nc a p a c i t yw a si n c r e a s e dw h e n a d r i a m y e i n1 , v a 8u s e dt o g e t h e rw i t hl o w e rc o n c e n t r a t i o no fe q u 0 1 k e yw o r d s ：s o yi s o f l a v o n e s ；e q u o l ；m t ra s s a y ；b r e a s tc a l l c e r ；l i v e rc a n c e l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得泣韭壅业太堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：d g 年6 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解洹j 匕壅些太堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权通j 匕壅些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 签字日期：o 苫年月c 日 学位论文作者毕业后去向：考傅 工作单位： 通讯地址：自蛀i 右心窍? 俺目 导师魏艿伶 签字日期：j 越年石月c 7 日 电话：l ，1 0 2 稠g 铷 邮编：0 5 0 0 0 0 外消旋体雌马酚抗癌作用的体外研究 1 1 肿瘤的危害性 1 前言 肿瘤是正常细胞在不良因素长期作用下出现的过度增生或异常分化而形成的 局部肿块。肿瘤与正常组织和细胞不同之处在于，一是肿瘤细胞不按正常细胞新 陈代谢规律生长，不会正常死亡，从而使细胞呈现异常形态，细胞功能和代谢发 生紊乱，以致可以破坏正常组织器官结构并影响其功能；二是肿瘤细胞还能向周 围侵润蔓延，甚至扩散转移到其他组织器官，继续成倍增生，给人体或生命带来 极大威胁。根据肿瘤生物学特性及其对机体危害性的不同，一般分为良性肿瘤和 恶性肿瘤两大类，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。 有资料表明，在美国，癌症死亡占据了死亡人群的四分之一，其中8 5 岁以下 的癌症死亡率甚至超过了心脏病死亡率【l 捌。我国目前有癌症患者约4 5 0 万人，死 亡率在3 0 以上，而且每年新增的患者人数高达2 0 0 万人以上。癌症严重威胁着 人类生命。据世界卫生组织统计，全世界每年死于癌症的患者约7 0 0 万，美国每 年用于肿瘤治疗费用高达1 0 2 0 亿美元比1 ，因此癌症的预防与治疗任务十分艰巨。 2 0 世纪以来，由于自然科学的发展、基础理论研究与新技术的应用，肿瘤学 研究有了长足的进步。尤其近1 0 年来，几种作用机制新颖的抗癌药物进入临床， 受到了人们的广泛关注，其中最重要的是抑制微管蛋白解聚的紫杉类和拓扑异构 酶抑制剂喜树碱类衍生物。因此，植物类抗肿瘤药物已经越来越受到了人们的关 注。 1 2 植物雌激素的作用 雌激素在生长、发育、分化及生殖系统中发挥着重要作用，另外，雌激素还 具有一系列的药理学作用，如保存骨质以及对心血管和大脑有一定的保护作用 等。因此，目前绝经期妇女忿忿通过补充外源性雌激素的方法来改善绝经期的症 状，即传统的雌激素替代疗法( e s t r o g e nr e p l a c e m e n tt r e a t m e n t , e r t ) 。但是临床实 验的结果表明，雌激素替代疗法有使乳腺癌和子宫内膜癌的发生概率上升的趋 势。近年来，临床上广泛采用选择性雌激素受体调节剂( s e l e c t i v ee s t r o g e nr e g u l a t e m e d i a t o r , s e l w ) ，如他莫西酚和雷洛西酚，虽然在治疗乳腺癌及骨质疏松症的 过程中达到了预期的治疗效果，但均显示有潜在副作用，如他莫西酚可增加子宫 内膜癌的发病概率而雷洛西酚则可促进潮热的发生。 植物雌激素( p h y t o e s t r o g e n ) 是一类存在于植物中的非甾体类化合物，其结构 及生物活性与内源性雌激素相似，但又有不同特点。近年来发现，一些激素依赖性 疾病的发病率与膳食中低植物雌激素含量有关，同时，因为激素替代治疗( h r t ) 存 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 在一定的风险，由此引发了人们对植物雌激素的极大兴趣。 植物雌激素可存在于多种植物中，根据其分子结构主要分为【4 】：( 1 ) 异黄酮类 ( i s o f l a v o n e s ) ：主要包括黄豆苷原( d a i d z e i n ) 、染料木素( g e 舳_ i s t e i n ) 、芒柄花黄素 ( f o r m o n o e t i n ) 、鸡豆黄素( b i o c h a n i na ) 等。异黄酮主要存在于大豆中，有些中药如 葛根、芦荟中也含有异黄酮类。( 2 ) 木质素类( 1 i g n a n s ) ：木质素类存在于油籽和谷 物中，以亚麻籽中含量最高，也存在于中药五味子、细辛、连翘等。( 3 ) 香豆素类 ( c o u m e s t a n s ) ：食物中含香豆素最丰富的是三叶草、黄豆芽等，中药如补骨脂、白 芷、前胡和茵陈等也含有这类成分。( 4 ) 其他：真菌雌激素类( m y c o e s t r o g e n ) ，如 玉米赤霉烯酮【5 】。目前仍以研究异黄酮类为多，尤其对染料木素的研究较为深入。 近年来已证实植物雌激素对机体具有类雌激素和抗雌激素活性的双重作用。 一方面，植物雌激素在体内能够与雌激素受体相结合，当植物雌激素使用足够的 剂量，它可以产生与体内雌二醇相似的效能。植物雌激素还可刺激肝脏合成性激 素结合球蛋白，以此调节体内激素的活性，另一方面，植物雌激素也可对靶细胞 产生抗雌激素作用。这一作用的主要机制被认为是竞争性抑制的结果。此外，一 些异黄酮和香豆素可减少体内雌激素的生成，所以，植物雌激素既能作为雌激素 又能作为抗雌激素使用。 其在疾病方面的作用如下： ( 1 ) 在生殖系统中的作用：植物雌激素能够促进雄性动物生殖系统发育，可提 高血清睾酮水平。而在妇科疾病中的应用目前经过多因素分析后认为，豆制品中 丰富的植物雌激素有效地降低了血管舒缩症状的发生频率和严重程度，同时还能 促进阴道黏膜上皮细胞的成熟，缓解潮湿，防止阴道干涩，情绪波动和焦虑。( 2 ) 在心血管系统中的作用：植物雌激素具有降脂，抗脂质过氧化，抑制血小板聚集 和血管平滑肌增生，改善内皮功能等多种功能，从而干预动脉粥样硬化( a s ) 的形 成和发展，对心血管系统具有保护作用【6 】。( 3 ) 在中枢神经系统中作用：基础和临 床研究发现用雌激素替代治疗可降低或延缓老年性痴呆( a 1 z h e i m e rd i s e a s e ，a d ) 的 发生。( 4 ) 在骨骼系统中的作用：植物雌激素在中枢神经系统以外的相关疾病和骨 质疏松症，心血管疾病以及肿瘤方面有许多报道，医学研究以及动物实验确证大 豆异黄酮具有明显的预防骨质疏松症效果。( 5 ) 在防癌，治癌中的作用：目前，大 豆异黄酮的抗癌研究已成为世界抗癌研究的焦点，取得了很大的进展。 1 3 大豆异黄酮的研究进展 作为植物雌激素中最为瞩目的大豆异黄酮的作用和机制近年来成为业内研究 热点。流行病学调查研究资料显示，亚洲国家相对于欧美国家居民的乳腺癌、前 列腺癌、结肠癌等的发病率、死亡率均较低，同时激素依赖性疾病发病率也较低， 通过研究发现原因与豆制品中中摄取的大豆异黄酮量有关【刀。1 9 9 0 年，美国国家癌 2 外消旋体雌马酚抗癌作用的体外研究 症研究所( a m e r i c a n c a n c e r l n s t i t u t e ，a c i ) 邀请有关专家证明了大豆异黄酮是较佳的 抗癌防癌物质，这在医药界引起了极大轰动，旋即被列为大豆精深加工和医药产 品重点开发项目【8 】。目前有关大豆异黄酮的抗癌作用研究主要是围绕染料木素进行 的；对黄豆苷原以及其次生代谢产物的研究较少。 1 3 1 大豆异黄酮的主要成分 大豆异黄酮( s o y b e a r li s o f l a v o n e s ，i s ) 主要存在于豆粕中，它与内源性雌激 素有着相似的分子结构，能与雌激素受体q 、1 3 ( e r 啦、e 蚴结合，但它的雌激素 活性很弱，一般为雌二醇的1 0 0 0 3 0 0 0 0 0 ，仅能发挥微弱的雌激素样作用，称之 为植物雌激素( p h y t o e s t r o g e n s ，p e ) 。其主要包括染料木素( g e n i s t e i n ，染料木黄酮， 三羟基异黄酮) 、黄豆苷原( d a i d z e i n ，黄豆甙原，大豆黄素) 和6 一甲氧基大豆素 ( g l y c i t e i n ，黄豆黄素) 等3 种主要生物活性形式。 染料木素黄豆苷原黄豆黄素 1 3 2 大豆异黄酮的抗癌作用 近年来的研究表明，大豆异黄酮具有雌激素与抗雌激素、抗增生、诱导细胞 凋亡、抗氧化、诱导解毒酶、调节宿主免疫功能和改变细胞信号传导等广泛的生 物学作t 9 1 ，其对人乳腺癌细胞株、前列腺癌细胞株等均具有体外抗肿瘤作用1 啦! 2 1 。 在乳腺癌的体外实验中，使用最多的是人类乳腺癌细胞( m c f - - 7 ) 系。1 9 9 0 年，b a m e s 等【l3 1 建立s d 大鼠乳腺癌模型探讨大豆对乳腺癌的作用，结果显示含分 离大豆蛋白的饲料喂养的大鼠乳腺癌的发生数目显著低于不含大豆组，且其乳腺 癌的雌激素受体数目明显减少。1 9 9 1 年，l 甜1 4 】等对生活在新加坡的中国女性进行 了膳食与乳腺癌的病例一对照研究，结果表明，进食富含异黄酮的食物明显降低了 乳腺癌的发病风险，相对风险0 2 9 。c o n s t a n t i n o u 等【l 别发现染料木素在1 5 1 m o l l 、 3 0 1 a m o l l 、4 5i m n o l l 浓度下均能抑制e r ( + ) 的m c f 7 和e r ( 一) 的m d a m b - 4 6 8 细胞的生长，同时在裸鼠接种试验中也发现染料木素能减少裸鼠肿瘤的形成。余 增丽掣1 6 】也证实染料木素可调节人乳腺癌细胞m c f - 7 的增殖和凋亡。张艳【r 7 】等 发现各剂量染料木素均可抑制m c f 7 细胞分裂并呈量效关系，细胞形态学观察及 t u n e l 检测发现染料木素处理m c f 7 细胞4 8 h 及9 6 h 后有明显的凋亡细胞出现， 并呈现量效关系。 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 9 8 9 年，s e v e r s o n 等对生活在美国夏威夷的7 9 9 9 名日裔男性进行了1 8 至2 1 年的调查研究，结果显示日裔男性的前列腺癌发病率显著低于美国男性，这可能 是因为日裔男性的膳食习惯中大豆摄入量较高的缘故。1 9 9 8 年，j o a n n 等【l8 】在对 人前列腺癌细胞p c 3 和l n c a p 研究后发现，染料木素能抑制培养的前列腺癌细胞 生长，使细胞阻滞于g 2 i v 期，诱导细胞发生凋亡。c a r d o s o 1 9 j 等对雄性家兔的研 究表明，长期服食大豆异黄酮对其精子质量和性行为均无不利影响。而b u s b ，2 0 j 的研究则证实大豆异黄酮饮食对健康男性安全。郑薇等 2 1 1 的研究显示大豆异黄酮 可抑制w i s t a r 雄性大鼠前列腺平滑肌细胞生长，对抗高雄激素诱导的小鼠前列腺 指数增高。曹锋掣冽研究发现染料木素和黄豆苷原对前列腺癌p c 3 ，l n c a p 细胞 具有明显的抑制生长作用，其抑制效应具有时间和剂量依赖性。 虽然大豆异黄酮是作为一种植物雌激素来发挥它的抗癌作用的，但是它除了 对性激素相关癌症有预防作用外，其对胸肌癌【2 3 1 ，皮肤癌【2 4 1 ，膀胱癌 2 5 1 ，结肠癌 【2 6 1 ，肝癌【2 7 1 ，胃癌【12 1 ，食管癌【2 引，白血病【2 9 1 ，子宫癌【3 0 1 ，卵巢癌，睾丸 癌3 2 1 等的抑制作用均有报道，所以它的抗癌机制可能不只是通过性激素调节来发 挥其作用的。 1 3 3 大豆异黄酮的抗癌机理 到目前为止，虽然关于大豆异黄酮的抗癌机理仍不能完全清楚阐明，但是大 量的实验结果已经证实了它对癌症的预防确实有一定的效果，而且其抗癌机理方 面的研究已经取得了很大的进展，目前已经提出了数种可能的机制，主要有雌激 素样作用，抗氧化作用，抑制酪氨酸蛋白激酶( p t k ) 活性，抑制拓扑异构酶i i 活性， 诱发癌细胞凋亡，抑制新生血管的生成和提高抗癌药药效等等数十种。 雌激素样作用 有关大豆摄入量与乳腺癌的流行病学调查最多，多细胞系培养实验的研究结 果也进一步证实了其对乳腺癌的抑制作用。就目前的研究来看，大豆异黄酮( 主 要是染料木素) 对性激素相关癌症的抗癌机制主要是由于它的雌激素与抗雌激素 作用。大豆异黄酮带有两个或三个羟基和芳香环，与人工合成的雌二醇( o e s t r a d i 0 1 ) 结构相似，可以与雌激素受体( e r ) 结合发挥微弱的雌激素效应，也可与雌二醇竞 争性结合于细胞核上的e r ，从而避免雌二醇与d n a 形成诱变性加合物，表现出雌 激素拮抗作用，其与e r 结合后的潜在健康效应表现为u 型剂量一效应关系，因其 作用效果取决于受体对象本身的雌激素代谢状态，因此被称为女性雌激素水平的 调节器。 性激素与球蛋白的结合能够调节血浆性激素的生物学作用，s h b g 合成增加可 降低游离的、有活性的性激素浓度，故可减弱雌激素的促细胞增殖活性，从而减 少性激素相关癌症发病危险。m o u s a v i 掣2 1 1 在体外研究中证实染料木素和黄豆苷原 4 外消旋体雌马酚抗癌作用的体外研究 均能增加性激素结合球蛋白( s e xh o r m o n eb i n d i n gg l o b u l i n ，s h b g ) 的合成，从而抑 制人类肝癌细胞株h e p g ：细胞增殖。 抗氧化作用 活性氧( r o s ) 尤其是被激活的免疫系统细胞在肿瘤的发生中始终是一个重 要因素，大豆异黄酮分子中含有的酚羟基可作为供氧体能够与体内的自由基反应， 降低氧自由基对细胞的d n a ，r n a ，蛋白质等生物大分子的氧化应激损伤，减少 细胞突变和癌变发生。 1 9 9 3 年，w e i 等研究发现染料木素可显著抑制促癌剂1 2 一沪十四烷酰法佛醋酸 酯- 1 3 ( t p a ) 诱导的中性多形核白细胞( p m n ) 及h l 6 0 细胞的h ：o ：生成。1 9 9 5 年 w e i 等【3 3 】报道，染料木素能中等强度抑制h l 6 0 细胞中超氧阴离子自由基( 0 2 ) 的 产生。1 9 9 6 年，他们【2 6 】又发现，染料木素和鸡豆黄素a 均能有效消除紫外线引起 的8 一羟基一27 一脱氧鸟苷( 8 o h d g ) ，即d n a 氧化应激损伤的标志分子。刘英华【3 4 等体外培养血管内皮细胞，测定细胞外及细胞内丙二醛( m d a ) 含量，超氧化物歧 化酶( s o d ) ，谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 活性，乳酸脱氢酶( l d h ) 释放情况及 一氧化氮( n o ) 生成量，结果显示，大豆异黄酮可以减轻氧化低密度脂蛋白对血管 内皮细胞的氧化损伤，起到一定的抗氧化保护作用。 抑制酪氨酸蛋白激酶( p t k ) 活性 许多原癌基因都编码受体或非受体p t k ，1 9 8 3 年b i s h o p 3 5 】提出，p t k 的活性 与s r e 基因家族的原癌基因产物有关，也与逆转录病毒转化细胞的能力有关，而缺 乏酪氨酸激酶的突变是无法转化的。 1 9 8 7 年，a k i y a m a 掣1 0 】首次报道染料木素是一个专一而强力的p ，r k 活性的强 抑制剂，他们发现染料木素能特异性地抑制酪氨酸激酶活性，但仅微量抑制丝氨酸 和苏氨酸激酶的活性。 在非肿瘤细胞，p t k 级联反应受到严格的调控，然而，当细胞损伤时，就会 引起p t k 活性提高，并可能使正常细胞转化成失控肿瘤细胞，而一旦生长因子受 体p t k 活性受到抑制，就会影响到促有丝分裂信号的转导，从而抑制癌细胞的生 长增殖。n a k a n i s h i 掣3 q 在1 9 9 9 年研究发现，染料木素可作为酪氨酸激酶抑制剂抑 制肝癌细胞的转移。 抑制拓扑异构酶i i 活性 1 9 9 1 年，y a m a s h i t a 等研究表明染料木素抑制拓扑异构酶i i 活性是通过稳定 d n a 拓扑异构酶复合物而抑制酶活性来实现的，g e w i r t z 的研究则证实肿瘤细 胞中d n a 一拓扑异构酶i i 复合物的稳定化可导致胞内d n a 的双键或单键断裂，进 而引起细胞生长抑制或死亡。 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 v a nr i j n 等研究发现，染料木素能增加x 线诱导的肝癌细胞的损伤，抑拓 扑异构酶的活性，减少x 线辐射损伤后d n a 的修补。而后，在1 9 9 9 年，j i t 3 8 1 等 研究也表明染料木素是通过稳定d n a 拓扑异构酶复合物而实现抑制细胞生长作用 的。 诱发癌细胞凋亡 诱导凋亡是各种作用机制的抗癌药物发挥作用的共同通路【3 引，因为肿瘤细胞 可能失去细胞凋亡的功能，恢复这一功能可用于肿瘤的治疗，另外，肿瘤细胞相 对于正常细胞而言，对细胞凋亡的诱导更为敏感，因此药物诱导凋亡是当前肿瘤 研究热点之一。 s p i n o z z i d 9 】研究发现大豆异黄酮对体外培养细胞的细胞周期有干扰作用。 n a k a g a w a 等m 】以高浓度染料木素( 1 8 5 1 u n o l l ) 对乳腺癌细胞系c d d 7 6 2 、 s m m t 、m c f 7 和m d a m b 2 3 1 及乳腺上皮细胞系h b l - 1 0 0 培养7 2 h 后，结果 有剂量和时间相关的生长抑制作用，并发现高浓度主要是上调b a x 蛋白、下调 b c l x l 蛋白及激活c a s p a s e 3 ，使肿瘤细胞凋亡。p a r k 等【4 l 】在研究染料木素诱导肥 大细胞瘤细胞株p 8 1 5 细胞凋亡中也发现其在凋亡过程中显示出许多凋亡现象：线 粒体膜功能下降，细胞色素c 释放到胞质，c a s p a s e - 3 的激活，核聚集，d n a 断 裂，也发现染料木素可导致b a x 蛋白表达的增加，而b c l 一2 蛋白的表达水平没有变 化( b c l 2 是凋亡抑制因子，b a x 为凋亡促进因子) 。s u e 等【4 2 j 研究发现，染料木素 能使肝癌细胞周期阻滞于g 2 m 期，并通过激活c a s p a s e - 3 酶，下调b c l 2 和b c l x l 的 表达而诱导凋亡。马吉祥等【4 3 】还报道大豆异黄酮可诱导胃癌细胞发生凋亡，大豆 异黄酮可能是通过下调b c l 2 的表达和上调b a x 的表达而胃癌细胞发生凋亡。 抑制新生血管的生成 肿瘤组织生长快，需要新生血管提供营养。z h o u 等m 】实验结果表明染料木素是 血管新生抑制剂。其能降低多种血管生成因子的水平，如血管内皮生长因子，碱 性成纤维细胞生长因子，组织因子，表皮生长因子，转化生长因子，血小板衍生 生长因子等，有效的抑制癌组织中血管新生，从而阻断对其所需营养物质的供给， 阻止癌细胞的发育。其作用机制可分为调控血管生长因子的水平和阻断血管生长 因子的信号传递两个方面【4 5 1 。河福金等【倒也报道大豆异黄酮可抑制裸鼠移植瘤的 生长以及减少肿瘤的血管生成，大豆异黄酮可能通过减少肿瘤的血管生成，从而 抑制裸鼠移植瘤的体内生长。 提高抗癌药药效 当大豆异黄酮与抗癌药物联合使用时，二者会产生叠加协同效应。p a r k 等 4 7 1 研究发现，染料木素可以诱导肝癌细胞和结直肠癌细胞p 2 1 蛋白的大量表达，且 与地塞米松有协同作用。经用耐药癌细胞系研究发现，染料木素通过降低细胞内 a t p 浓度而显著抑制肿瘤细胞的药物转运活性，增加瘤细胞中的药物浓度，提高 6 外消旋体雌马酚抗癌作用的体外研究 药物疗效。z h a l l d 4 8 j 的研究发现植物黄酮能够抑制乳腺癌耐药细胞系( m c f 一7 和 m d a 4 3 5 l c c 6 ) 中抗肿瘤蒽环类药物的外排，并认为其作用机制可能是直接与 p g p 蛋白结合影响蛋白a t p a s e 活性。 抑制缺氧诱导因子h i f 1 a 的表达 缺氧是实质性肿瘤微环境的基本特征之一，缺氧导致肿瘤细胞快速增殖，对 放、化疗的抗拒性增加【4 9 1 。实质性肿瘤发生过程中，由于血管生长的相对滞后和 肿瘤细胞的快速增殖导致肿瘤细胞缺氧。肿瘤的缺氧是导致实质性肿瘤微环境中 缺血缺氧状态下的肿瘤细胞对包括阿霉素，氟尿嘧啶等许多化疗药产生耐受性的重 要原因之一。 缺氧诱导因子一l a ( h y p o x i a - i n d u c i b l ef a c t o r , h i f l a ) 是细胞适应缺氧过程中起 中枢作用的调节基因，广泛存在于人类多种肿瘤细胞中而在正常组织中无表达【5 0 1 ， 它的缺失可明显减慢肿瘤的生长速度【5 l 】。 张俊文等【5 2 】的研究显示，不同浓度的大豆异黄酮在常氧和缺氧条件下都对人 胃癌细胞株s g c 7 9 0 1 生长有抑制作用，并呈剂量效应关系，缺氧条件下大豆异 黄酮组抑制作用增加，细胞凋亡率增加。透射电镜观察常氧下大豆异黄酮处理后 细胞出现凋亡，缺氧条件下出现凋亡和坏死。而稍后，段红等【5 3 】以人食管癌细胞 株e c a l 0 9 作为体外实验模型，探讨大豆异黄酮对不同氧浓度下培养的e c a l 0 9 细 胞生长抑制作用，结果显示不同浓度大豆异黄酮不同氧条件下对人食管癌细胞株 e c a l 0 9 生长均有抑制作用，并呈剂量效应关系，缺氧条件下大豆异黄酮对人食管 癌细胞株e c a l0 9 生长抑制作用增加，缺氧大豆异黄酮组凋亡率增加，透射电镜观 察常氧下及缺氧条件下大豆异黄酮处理后细胞出现凋亡和坏死细胞的形态学改 变。 调控细胞因子 转化生长因子p ( t g f p ) 是一类具有多种生物学功能的细胞因子，也是一类重 要的生长负调节因子，它参与并调节许多生物学反应过程，并可引起细胞内c - m y c 基因表达的下调。它的重要生物学功能之一就是抑制肿瘤细胞增殖，目前已进入 临床试用的抗雌激素药物他莫西芬( t a m o x i f e n ) 治疗乳腺癌的作用机制之一就是诱 导乳腺癌细胞自分泌t g f p ，刺激t g f p 受体表达，从而抑制乳腺癌细胞增殖， 阻止乳腺癌进一步发展m 】。t g f d 受体是组成型具有丝氨酸蛋白激酶( s p k ) 活性的 受体，在调控细胞增殖过程中有重要作用。杨镇洲【5 5 】等研究表明大豆异黄酮通过 诱导t g f b 和t g f 1 3 受体表达的增加而抑制人乳腺癌细胞b c a p 3 7 增殖是一可能 的重要分子机制。 免疫调节作用 机体的免疫调节作用在预防肿瘤方面所起到的作用也日益为人们所关注。体 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 外培养淋巴细胞发现，大豆异黄酮会促进t 淋巴细胞产生白介素i 和白介素i im j 。 而z l l 锄d5 7 】等对s w i s s 小鼠的研究也发现，大豆异黄酮可增强其一系列的免疫功能。 徐璐掣5 8 j 研究大豆异黄酮对大鼠免疫细胞的体外作用时发现，大豆异黄酮中的黄 豆苷原体外能剂量依赖性的刺激c o n a 诱导的淋巴细胞转化，增强n k 细胞活性， 这种增强的免疫功能可能是大豆制品抗肿瘤作用的机制之一。 1 4 雌马酚的研究进展 1 4 1 雌马酚的发现和命名 1 9 3 2 年，m a r t i a n 等在怀孕的雌性马的尿液中分离到了一种分子式为c 1 5 h 1 4 0 3 的物质，由于雌马酚的发现源于马( e q u i n e ) 的代谢产物，且属于有雌激素作用的二 元酚( d i p h e n 0 1 ) ，所以它被命名为“e q u o l 。后来，在未怀孕的雌马和雄马的尿液中 也发现了雌马酚的存在。1 9 4 6 年，在澳大利亚西南部牧场的绵羊因长期食用一种 富含芒柄花黄素( f o r m o n o n e t i n ) 的三叶草，而引发了不孕，人们称之为“三叶草病， 并发现这种导致动物生殖紊乱的病，与过量摄入的芒柄花黄素在体内代谢产生大 量的雌马酚有关。1 9 8 2 年，a x e l s o n ”】等首次在人尿中也发现了雌马酚，说明人也 能代谢产生雌马酚。1 9 8 4 年，s e t c h e l l 删等首先提出了雌马酚在激素依赖型疾病的 预防和治疗方面的重要作用，人们开始了对雌马酚做进一步的深入研究。 1 4 2 雌马酚在人体内的代谢特点 雌马酚是黄豆苷原在特定的肠道微生物菌群作用下的最终代谢产物之一，具 有比其前体黄豆苷原和染料木素更高的药理活性，特别是在预防心血管疾病、乳 腺癌和前列腺癌方面能发挥重要作用。然而，并非所有摄入大豆异黄酮的个体都 能产生雌马酚，雌马酚仅能在大概三分之一的人群的肠道内产生。近年来，在亚 洲地区的日本和韩国，年轻人能够产生e q u o l 的比例还在下斛6 1 】。以前的研究表明， 亚洲人中能将异黄酮代谢为雌马酚的比例明显高于西方人，最近有学者对欧洲地 区产雌马酚者做了调查，结果显示欧洲的十六个地区的人产雌马酚的量也是不同 的【6 2 j ，所以说，饮食习惯、种族、性别、年龄、肠道微生物菌群等等这些因素都 会影响异黄酮在肠道内代谢为雌马酚的能力。 雌马酚的代谢动力学研究较少。有人对去卵巢小鼠采用皮下注射和饲料添加 两种方式给药，观察雌马酚的吸收情况。以每天0 、4 、8 、1 2 m g k g 的剂量皮下注 射雌马酚，1 2 天测定小鼠血清雌马酚浓度分别为0 、1 4 0 1 、2 6 0 3 、5 1 0 2 、 7 5 1 1i lm o l l ，游离型雌马酚所占比例分别为2 0 、1 7 、2 5 、1 7 ，饲料中 分别添加0 0 5 和0 1 的雌马酚，1 2 天测定血清雌马酚浓度分别为5 9 4 - 0 7 、8 1 0 8um o l l ，游离型雌马酚所占比例仅为2 【6 引。一名成年女性一次性口服2 5 m g 雌马酚，4 6 h 血浆浓度达到最大值，消除半衰期为8 8h ，药物代谢动力学与其它 8 外消旋体雌马酚抗癌作用的体外研究 类黄酮相似，与其前体黄豆苷原相比，血浆清除率明显减慢( 雌马酚为6 8 5 珧黄 豆苷原为1 7 5 l 伽畔】。雌马酚主要在结肠中产生，故它被吸收并进入血液中的时 间晚于染料木素和黄豆苷原。在摄入大豆异黄酮后4 h ，血浆中才开始出现雌马酚， 并不断增加，2 4 h 后达到峰值，随后血浆中雌马酚的浓度开始下降，但在4 8 h 后， 血浆中雌马酚的浓度仍然保持较高水平，表明雌马酚在血浆中的滞留时间长于染 料木素和黄豆苷原。在摄入黄豆苷原后4 8 h 内，血浆中雌马酚的浓度均明显高于 摄入黄豆苷原后血浆中雌马酚的浓度【6 5 1 ，这说明雌马酚性质稳定，排出缓慢，有 利于其作用的发挥。 1 4 - 3 雌马酚抗癌作用的研究进展 目前为止，雌马酚对肿瘤的研究多侧重于乳腺癌以及前列腺癌等性激素相关 癌症。有资料表明，雌马酚是大豆异黄酮的主要成分及其代谢产物中，雌激素样 活性最强的m j 。雌马酚的雌激素样作用发现较早。与其前体物质黄豆苷原不同，雌 马酚是手性分子，有s ，r 两种异构体，体内代谢产物均为s 型，人工合成的雌马 酚则为二者混合物，即消旋e q 。这两种异构体与雌激素受体( e r ) q 、b 的亲和力 有所不同。s 型与e r 。的亲和力较强；r 型与e r 。的亲和力较弱，与e r 。的亲和 力更弱。两种异构体与雌激素受体的亲和力均高于黄豆苷原。尿液中的雌马酚浓 度与性激素结合球蛋白性激素结合球蛋白( s e xh o r m o n eb i n d i n gg l o b u l i n ，s h b g ) 的 浓度成正比【67 1 ，性激素与球蛋白的结合能够调节血浆性激素的生物学作用，s h b g 合成增加可降低游离的、有活性的性激素浓度，故可减弱雌激素的促细胞增殖活性， 从而减少性激素相关癌症发病危险。另外，研究发现，血液和尿中的雌马酚水平 与前列腺癌的发病呈现负相关水平，以雌马酚处理前列腺上皮肿瘤细胞，可以显 著降低肿瘤细胞的增殖能力嘲】。并且，c a r d o s o 6 9 1 等对雄性家兔的研究表明，长期 服食大豆异黄酮对其精子质量和性行为均无不利影响，大豆异黄酮饮食对健康男 性安全。这可能归功于雌马酚独特的抗雄激素作用，而不是它的雌激素活性。它 可以与5 a - - - 氢睾酮特异性结合，从而阻止5 a - - - 氢睾酮与雄激素受体结合【1 加l 。在 所有植物雌激素和异种雌激素中，只有雌马酚具有这种特性【7 0 】，这使得它在预防 和治疗男性前列腺癌方面越来越受到人们的重视。 活性氧( r o s ) 尤其是被激活的免疫系统细胞在肿瘤的发生中始终是一个重 要因素，大豆异黄酮分子中含有的酚羟基可作为供氧体能够与体内的自由基反应， 降低氧自由基对细胞的d n a ，r n a ，蛋白质等生物大分子的氧化应激损伤，减少细 胞突变和癌变发生。而研究表明，雌马酚的抗氧化能力是大豆异黄酮及其代谢物 中最强的【j 。在异黄酮分子结构的主链上，取代羟基的数目和位置是决定其抗氧 化活性强弱的主要因素 7 2 j 。c 掣位羟基对异黄酮抗氧化活性的贡献最为显著，c 5 羟基对抗氧化活性有一定的贡献，而c 7 位羟基的影响可以忽略。染料木素在c 5 ， c 7 和c _ 4 位共有3 个羟基，故在脂质体中是有效的抗氧化剂。由于在黄豆苷原 结构中缺少c 5 位羟基，故黄豆苷原的抗氧化活性弱于染料木素。虽然在雌马酚 9 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 结构中也缺少c 5 位羟基，但与黄豆苷原不同的是，雌马酚结构中的c 2 位与c - 3 位间不存在双键，c - 4 位也无氧基，表明消除异黄酮结构中c 2 位与c 3 位之间 的双键和c - 4 位的氧基能提升其抗氧化活性。雌马酚还可以通过提升n o 的水平 来减轻氧化低密度脂蛋白( l d l ) 对血管内皮细胞的氧化损伤，起到一定的抗氧 化保护作用【7 2 1 。以裸鼠为实验对象的研究表明，雌马酚对皮肤癌有很强的抑制作 用，以1 0 2 0um o l l 的防护作用最好。 另外，雌马酚还对于缓解更年期症状【7 3 1 ，预防骨质疏松7 4 1 ，抗心血管疾病【7 5 】 等方面都有着一定的作用。 由于雌马酚来源匮乏，且价格昂贵，所以尽管国外对雌马酚的研究已经取得 了令人瞩目的成果，但在国内，对于雌马酚的研究尚属空白，所以本实验采用了 化学合成的外消旋体雌马酚，选取了七种肿瘤细胞系，对雌马酚的体外抗肿瘤活 性进行了研究。 1 0 外消旋体雌马酚抗癌作用的体外研究 2 1 实验材料 2 1 1 实验细胞 实验材料和方法 人乳腺癌细胞系m c f 7 ( e i h ) ，m d a m b 2 3 1 ( e r 一) ：购自中国协和医科大学 细胞库。 人卵巢癌细胞株o v c a r 3 ：河北医科大学药理实验室保存。 人肺癌细胞株a 5 4 9 ：河北农业大学制药工程系保存。 人宫颈癌细胞株h e l a ：河北农业大学制药工程系保存。 人肝癌细胞株s m m c 7 7 2 1 ：河北医科大学药理实验室保存。 小鼠肉瘤癌细胞株s 1 8 0 ：河北医科大学药理实验室保存。 人乳腺癌耐药型细胞株m c f 7 a ：河北农业大学制药工程系保存。 2 1 2 主要试剂 r p m i 1 6 4 0 培养基美国g i b c o 公司 胰蛋白酶1 ：2 5 0美国a m c l e $ o o 公司 青霉素和链霉素华北制药股份有限公司 胎牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司 m t r美国s e r v a 公司 d m s o美国a m 潞c 0 公司 无水乙醇天津市标准科技有限公司 其他试剂皆为国产分析纯。 2 1 3 主要试剂的配制 p h 7 4 的等渗p b s 的配制( 0 0 1 m o l l ) n a c i 8 0 9 k h 2 p 0 4 o 2 9 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 n a 2 h p 0 4 12 h 2 0 2 9 9 k c i o 2 9 将上列试剂按次序加入定量容器中，加适量双蒸水溶解后，再定容至1 0 0 0 m l ， n a o h 调p h 值至7 4 ，高压消毒灭菌1 1 2 k p a ，2 0 m i n ，冷却后，保存于4 冰箱 中备用。 f c s 5 6 水浴灭活3 0 m i n ，2 0 c 保存。 r p m i 1 6 4 0 培养液的配制 r p m i 一1 6 4 0 粉末 3 9 双蒸水 9 0 0 m l 4 n a h c 0 3 调p h 值至7 4 青霉素1 0 0 u m l 1 5 m l 链霉素1 0 0 u m l 1 5 m l 灭活f c s3 5 m l 双蒸水定容至1 0 0 0 m l ，锡纸封闭瓶口，于磁力搅拌器上搅拌3 0 m i n 。在超净 工作台内用0 4 5 1 n 微孔滤器过滤除菌，4 。c 保存。 d h a n k s 缓冲液的配制 n a c l 8 0 0 9 l k c l 0 4 0 9 l n a 2 h p 0 4 12 h 2 01 5 2 9 l k h 2 p 0 40 0 6 9 l n a h c 0 30 3 5 9 l 将上列试剂按次序加入定量容器中，加适量双蒸水溶解后，再定容至1 0 0 0 m l ， 调p h 值至7 4 ，高压消毒灭菌1 1 2 k p a 2 0 m i n ，冷却后，保存于4 c 冰箱中备用。 0 2 5 的胰蛋白酶的配制 胰蛋白酶( t r y p s i n ) 0 2 5 9 e d t a 2 0 0 m g d h a n k s 缓冲液 1 0 0 m l 1 2 外消旋体雌马酚抗癌作用的体外研究 先用少量d h a n k s 溶解胰蛋白酶，然后将e d t a 粉末和剩下的液体加入，混 合，置3 7 c 水浴中1 h 左右( 待彻底溶解，液体呈透明为止) ，用0 4 5 i t m 微孔滤器 过滤除菌，分装，置4 。c 冰箱中保存。 四甲基偶氮唑盐( m 丌) 的配制 m t t 2 5 0 r a g d h a n k s 缓冲液 5 0 m l 在电磁力搅拌3 0 m i n ，用0 2 2 p r o 的微孔滤器过滤除菌，分装于1 0 m l 的 e p p e n d o r f 管中，一2 0 。c 避光保存。使用时以无血清培养液稀释成l m g m l ，2 周内 有效。