（分析化学专业论文）氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响.pdf

氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响 氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长 及硝酸还原酶活性的影响 摘要 本文选择我国东海几种典型浮游植物，分属于硅藻门和甲藻门，采用实验 室一次性培养，对藻细胞硝酸还原酶活性( 砜) 的离体法测定条件进行了优化。 并以此实验结果为基础，对几种浮游植物在不同氮磷浓度梯度及氮磷比的环境 中，藻的生长及藻细胞队的变化情况进行了研究。其中，氮磷浓度梯度的设 定是参考实验室培养较为常用的眈营养液配方及东海赤潮高发区的实测营养盐 浓度来设定的( s i 、维生素及微量元素的浓度同铊，固定n p ，只改变氮磷的浓 度) ；氮磷比结构实验是固定p 0 4 p = 7 2p z n o ll 以或n 0 3 - n - 1 7 6t u n o ll ，将n p 分别设定为0 、8 、1 6 、3 2 、6 4 。本文研究初步得出以下主要结论： 1 离体法测定条件的优化： ( 1 ) 在本文实验条件下，锥状斯氏藻、塔玛亚历山大藻、东海原甲藻、尖刺拟 菱形藻、中肋骨条藻及旋链角毛藻的1 风存在着种属差异，在酶促反应速 度恒定时间、k m - n o ，、k m - n a d h 及f a d 的响应等方面都有所不同。 ( 2 ) 根据各因素对测定值的影响结果，最终确立了提取液研磨时间为5 m i n ，底物k n 0 3 浓度为1 0n u n o l l ，n a d h 浓度为0 3 0n u n o l l 的通用n r a 实验室离体法测定条件。除锥状斯氏藻外，其余实验所选藻种的酶促反应 时间可定为3 0m i n 。 2 不同营养盐浓度下，浮游植物的生长趋势、硝酸还原酶活性的变化以及二者 之间的关系 ( 1 ) 实验所选藻种，在接种第二天便迅速进入了指数生长期，这表明其对氮磷 浓度的变化具有一定的适应能力，在环境适宜时，能迅速占据数量优势， 甚至诱发有害水华或赤潮。 ( 2 ) 不同n p 的实验结果表明，在固定n 0 3 - n 浓度为1 7 6 9 m o l l 1 时，除未添 加磷酸盐的培养组外，其余各组藻的最大生长速率及终止生物量有很大差 异；而固定p 0 4 p 浓度为7 2 1 a m o l l _ 1 时，除未添加硝酸盐的培养组外，二 者差异相对较小。因此，东海原甲藻和中肋骨条藻的生长更易受到磷酸盐 浓度的影响。 氨礴营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响 ( 3 ) 各培养组藻细胞n r a 变化趋势相似，即接种后受硝酸盐诱导持续增大，并 在指数生长期内出现最高值，之后逐渐下降并停留在一个较低的水平。但 是同种藻在不同营养盐浓度下的酶活力值不同，一般随着营养盐浓度的增 大，n r a m 旺也有逐渐增大的趋势，而且对于东海原甲藻，藻细胞n r a 在 浓度梯度实验和不同n p 的实验中均出现了阚值；相同营养盐条件下，不 同藻种之间的酶活性也存在差异，塔玛亚历山大藻 中肋骨条枞刺拟菱 形藻 东海原甲藻。 ( 4 ) 硝酸还原酶活性与藻的生长之间存在相关性，表现为在一定的营养盐浓度 范围内，认m 缸与础随营养盐浓度的变化趋势一致，但不同藻种有所差 异。氮磷浓度梯度实验表明：对于东海原甲藻和塔玛亚历山大藻，当固定 n p = 2 4 ，1 7 6 n 0 3 - n 、8 8 0l a m o l - l - 1 时，二者变化趋势一致；对于中肋骨条 藻，当固定m - 2 4 ，1 7 6 p r o r o c e n t r u md o n g h a i n a s e ( 4 ) i th a dac e r t a i nc o r r e l a t i o nb e t w e e nn r aa n dt h ea l g a eg r o w t h t h ec h a n g eo f n r a m 缸a n d 默w a sc o n s i s t e n ta l o n g 、i t ht h en u t r i e n tc h a n g et e n d e n c y ，b u ti t h a dad i f f e r e n c ei nd i f f e r e n ta l g a es p e c i e s t h er e s u l t so fd i f f e r e n tn i t r a t e & p h o s p h a t ec o n c e n t r a t i o n se x p e r i m e n ts h o w e dt h a t ：f o rp r o r o c e n t r u md o n g h a i n a s e a n da l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ，t h ec h a n g et e n d e n c yo fb o t hn r a m 戤a n d 积w e r e 氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响 c o n s i s t e n tw h e nt h en pv a l u ew a ss e t t e da s2 4a n d17 6 n 0 3 - n 8 8 0l m a o l l 。1 ； f o rs k e l e t o n e m ac o s t a t u m ，t h ec h a n g et e n d e n c yo ft h et w of a c t o r sw e r ec o n s i s t e n t w h e nt h en pv a l u ew a ss e t t e da s2 4a n d17 6 n 0 3 - n 、 ” p h = 7 童谴鼍通 a r m - 1 0 0 静_ 2 鞫m v 图1 1 硝酸盐的同化过程 f i g1 1 t h ea s s i m i l a t i o np r o c e s so f n r i t r a t e 在这些酶中，硝酸还原酶( n i t r a t er e d u c t a s e ，n r ) 是最初始的酶，它是一种 底物诱导酶，广泛存在于包括浮游植物在内的光合自养生物中，当外界环境中存 在硝酸盐时会受诱导产生。硝酸还原酶根据其所需的电子供给体的不同主要分为 2 氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响 三种类型，其中两种存在于藻类及维管植物中：n a d h ( 还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸) 特异型硝酸还原酶( e c1 6 6 1 ) 及m h 和n a d p h ( 还原型烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸磷酸) 一非特异型硝酸还原酶( e c1 6 6 2 ) ，另一种存在于真菌中 的为n a d p h 一特异型硝酸还原酶( e c1 6 6 3 ) 。硝酸还原酶可将硝酸盐还原成 亚硝酸盐，是硝酸盐转化为氨氮的酶促过程中的限速酶，其活力的大小直接影响 了硝酸盐的生物利用度，其具体的催化方式见图1 2 ( b o bb b u c h a n a n ，瞿礼嘉 等译，2 0 0 4 ) 。 图1 2 亚硝酸盐的生成 f i g1 2t h ef o r m a t i o no f n r i t r a t e 1 2 硝酸还原酶活性的测定方法 k o 童 l x t o ，- 硝酸还原酶是胞内酶，可在电子供给体( n a d ( p ) h ) 的参与下将硝酸盐 还原成亚硝酸盐，因此，酶的活力可用单位时间内所生成的亚硝酸盐量或n 0 3 - n 及n a d h 的消耗量来表征。文献报道的硝酸还原酶活性( n i t r a t er e d u c t a s e a c t i v i t y ，n r a ) 测定方法总体上可分为两种：离体法( c e l l f r e em e t h o d ) 和活体 法( 即：原位测定法，i ns i t um e t h o d ) 。 1 2 1 离体法 19 6 9 年，e p p l e y 等人( e p p l ye ta 1 ，19 6 9 ) 首先报导了可广泛应用于各种海洋 浮游藻类的n r a 测定方法，即所谓的“离体法 。n r a 的测定分为以下三个步 骤：1 ) 提取硝酸还原酶；2 ) 加入适量的底物进行反应：3 ) 终止反应，测定n 0 2 - n 的生成量。该方法首先将藻细胞收集于w h a t m a ng f c 玻璃纤维膜上，以添加了 氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响 1 0 m m d t t ( 二硫苏糖醇) 及s - 2 0 m g p v p ( 聚乙烯吡咯烷酮) 的p h = 7 9 的磷酸 缓冲溶液( o 2 m ) 为提取液，应用玻璃特富龙匀浆机破碎藻细胞，来提取细胞 内的硝酸还原酶。整个提取过程中，必须保持在4 c 下进行，以避免酶的失活。 粗酶提取液经低温离心后，以含有k n 0 3 、n a d h 、m g s 0 4 的反应液为底物，反 应3 0 m i n ，以乙醇和醋酸锌终止反应，采用磺胺q 萘乙二胺显色法测定了n 0 2 - n 的生成量。但该方法不能避免由于提取过程中酶部分失活而导致的酶活性的降 低。 有研究表明，重金属、酚类物质及蛋白水解酶是导致硝酸还原酶失活的主要 原因( h a g e m a ne ta 1 ，1 9 8 0 ) 。随之，相继有学者针对这些影响因素对该方法进行 了改进。1 9 8 4 年e v e r s e s t 等人发现，2 - - 4 m m 的e d t a 能够使某些藻种的n r a 有显著的提高( e v e r s e s te ta l ，1 9 8 4 ) ：t h o m a s 和h a r r i s o n1 9 8 8 年注意到对墨角藻 来说，p v p 能够保持较高的藻n r a ，于浒苔来讲却降低了其n r a ( t h o m a se l ：a l ， 1 9 8 8 ) 。 1 9 9 5 年b e r g e s 等人( b e r g e se ta 1 ，1 9 9 5 ) 设计了不同提取液，并比较了不同 提取液对海洋浮游藻类n r 提取结果，最终确立了以含有0 1 t r i t o n x - 1 0 0 ，5 m m e d t a ，l m md t t ，0 3 ( w v ) p v p 及3 ( w v ) 的p h 7 9 ( 2 0 0 m mp 0 4 3 ) 的磷酸缓冲溶液做为提取液的“离体法”。其中，e d t a 可通过络合作用去除重 金属的影响；d 1 v r 可保护酶的半胱氨酸残基不被氧化；p v p 能够键合可以影响 酶活性的酚类物质；t r i t o nx 1 0 0 的加入可以将残存于滤膜碎屑中的n r 提取出 来。此后，此种改进方法被视为标准的离体法而应用广泛。 在建立了离体法的同时，e p p l e y 等人也考察了酶促反应液p h 、p 0 4 3 。浓度、 n 0 3 - n 浓度、n a d h 浓度对布氏双尾藻n r a 的影响( e p p l e y e ta 1 ，1 9 6 9 ) ，结果 表明：n r 的最适p h 值为8 左右；在其所设定的浓度范围内( 1 0 - 8 0 m m ) ，n r a 随着p 0 4 3 浓度的增加而增大；在n 0 3 - n 浓度低于2m m 时，n r a 随着n 0 3 - n 浓度的增大而增大，高于2m m 时，则随浓度增大n r a 增大的幅度较小；n a d h 的浓度的变化同样可以影响到n r a ，在浓度为o 2m m 时，可使n r a 达到最大。 事实上，n a d h 对藻n r 影响表现出了明显的种属差异。当其浓度大于o 2m m 时就已经抑制了海链藻属的n r a ，而0 4m m 的浓度却对中肋骨条藻和强壮前 沟藻的n r a 没有影响( b e r g e se ta 1 ，1 9 9 5 ) 。s e r r a 等于1 9 7 8 年的研究结果表明， 4 氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响 中肋骨条藻的n r 在n a d h 浓度大于0 6r a m 时受nt 抑n ( s e r r ae ta 1 ，1 9 7 8 ) 。 1 9 8 4 年e v e r s e s t 等人( e v e r s e s te ta 1 ，19 8 4 ) 在考察海洋单细胞藻类的粗酶提取液 与底物反应情况时发现，适量的添加硝酸还原酶的另一辅酶f a d ( 黄素腺嘌呤 二核苷酸) 可使某些藻类的n r a 大幅度的提高( 从1 3 - - 2 0 0 ) 。这与1 9 6 9 年e p p l e y 的研究结果有所不同，e p p l e y 的研究表明f a d 的加入不会对n r a 的 测定产生影响( e p p l e y ，1 9 6 9 ) 。b e r g e s 等人于1 9 9 5 年也进行了f a d 对n r a 影响 的研究( b e r g e se ta 1 ，1 9 9 5 ) ，f a d 可以使中肋骨条藻的n r a 提高，但即使在最 优化的条件下，其提高的程度也存在很大的差异( 从0 - - 一2 5 0 ) ；对于海链藻， f a d 的加入无影响；但对于强壮前沟藻，f a d 显著地抑制了其n r a 。由于f a d 对n r a 影响具有不确定性，因此，b e r g e s 等人认为，除非已经确定了f a d 的 影响结果，否则，在以离体法进行n r a 测定时应避免盲目地添加f a d 。 1 2 2 活体法 1 9 8 4 年e v e r s e s t 等人曾指出，对于现场原位调查来说，由于自然水体中浮 游藻类的多样性，很难保证所有的藻类n r a 都可在实验条件下达到最大值，因 此，采用离体法可能会低估n r a ( e v e r s e s tc ta 1 ，1 9 8 4 ) 。为了避免这种情况， h o e h m a n 等于1 9 8 6 年建立了另外一种方法即“活体法，以期能同时应用于实 验室及现场原位的n r a 研究( h o c h m a ne ta 1 ，1 9 8 6 ) 。 该方法将藻细胞收集在w h a t m a ng f c 玻璃纤维膜上后，不需要破碎藻细 胞，将滤膜置于装有l m lp h = 7 6 的磷酸缓冲液及5 0 此甲苯的烧杯内，于漩涡 振荡器上振荡l m i n 。加入6 5m mn a d h 和0 1mk n 0 3 各0 2 珊并开始酶促反 应，间或振摇，反应2 0 - 4 0 m i n ，以9 7 的z n s 0 4 终止反应。该方法中，甲苯 的主要作用是增加藻细胞膜的通透性，以便能够使底物( 特别是k n 0 3 ) 及反应 产物即n 0 2 - n 能够自由地进出藻细胞。 h o e h m a n 将“活体法”与e p p l e y 等人和p a c k a r d ( p a c k a r de ta 1 ，1 9 7 8 ) 的“离 体法 进行了比较，活体法表现出更高的酶活。在他们的实验中还发现，e p p l e y 和p a c k a r d 等人所采用的乙醇一醋酸锌的终止方法对活体法并不适用，当酶促反 应终止后，乙醇的存在会使5 4 0 n m 的吸光度会随时间的增加而增大，无法客观 地表征n r 活性。同时，活体法的精度也较离体法有所提高( 活体法：8 1 l ； 氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响 离体法： 2 0 ) 。 b r u n e t t i 及d a v i s 曾以表面活性剂( t r i t o nx 1 0 0 ，t e r g i t o ln p - 1 0 及n e u t r o n i x 6 0 0 ) 、正丙醇做为细胞膜增透剂对高等植物的n r a 进行了原位测定，结果显示 表面活性剂更为有效( b r u n e t t ie ta 1 ，1 9 7 6 ；d a v i se ta 1 ，1 9 8 5 ) 。但c o r z o 等人以石莼 为研究对象进行了表面活性剂和正丙醇对其n r a 活性影响的实验，研究表明表 面活性剂与正丙醇对n r a 并没有显著的差异( c o r z oa a n dn i e l lfx ，1 9 9 1 ) 。 h o c h m a n 在建立活体法时曾考察了甲苯和正丙醇对海洋浮游植物的n r a 的作 用，最终结果表明甲苯优于正丙醇，但另有研究表明对于单壳缝藻和多甲藻，得 到了相反的结果。 2 0 0 0 年，h u n g 等对1 9 8 6 年h o c h r n a n 的活体法中酶促反应条件进行了改进， 将装有反应液的烧杯置于漩涡振荡器上振荡5 m i n 后即终止反应，取得了满意效 果( h u n ge ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 在进行海洋藻类n r a 测定时，无论是采用离体法还是活体法，n a d h 都是 最常用的外源还原辅酶，但n a d h 的存在会干扰磺胺一q 一萘乙二胺与n 0 2 - n 生成偶氮化合物的显色反应，进而影响到n r a ，因此，需要消除n a d h 的影响。 m e d i n a 和h o c h m a n 都对此进行了研究( m e a i n ae ta 1 ，1 9 5 7 ；h o c h m a ne ta 1 ，1 9 8 6 ) 。 但c o r z o 在实验过程中发现，当反应介质中n 0 2 n 的浓度低于3 0um 时，采 用m e d i n a 和h o c h m a n 方法都没有取得良好的效果( c o r z oe ta 1 ，1 9 9 1 ) 。为此， c o r z o 采用葡萄糖作为n a d h 的来源，避光进行了n r a 的测定( 以活体法) ， 葡萄糖的加入可使n r a 提高了6 9 ( 与无外源性n a d h 相比) 。s c h o l l 等人采 用了另外一种方法来消除n a d h 的影响( s c h o l le ta 1 ，1 9 7 4 ) 。在酶促反应终止后， 电子偶联体p m s ( 吩嗪硫酸甲酯) 被加入到反应液中，通过氧化n a d h 来免除 其对n 0 2 - n 含量测定的影响，效果较好，目前有很多学者采用这种方法来消除 n a d h 的影响。表1 列出了部分学者采用离体法测定硝酸还原酶的实验条件。 6 氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响 表1 1 9 6 9 2 0 0 7 年硝酸还原酶活性实验列表 t a b1 t h en i t a a t er e d u c t a s ea c t i v i t ya s s a yl i s tf i o m19 6 9t o2 0 0 7 e p p l e ye t a l 一一 g t l4 c ，2 曲7 91 00 0 8 9 砰，3 0z n o a c 3 ，e n n l o l ( 1 9 6 9 & 1 9 7 0 ) h a r r i s o n g t ( 1 9 7 3 ) p a c k a r dc ta l ( 1 9 7 8 ) h o e h m a n ( 1 9 8 6 ) g a oe t a l ( 1 9 9 2 ，1 9 9 3 ) t i m m e r m a n se t a l ( 1 9 9 4 ) b e r g e sa n d h a r r i s o n ( 19 9 5 ) h u n g e t a l 2 0 ，4 5 4 ，5 m i n8 11 10 0 4 7 ( 避光) g t4 ，2 m i n7 93 50 1 0 61 5 ，2 0z n o a c ，e n t h o l t o l u e n e t o l u e n e 2 5 ， i m i n 1 6 ( 未振荡) l ( 未振荡) 7 61 0 50 6 8 2 5 ，2 09 7 的z n s 0 4 7 61 00 0 5 7 81 0 06 5 g t4 ，5 r a i n7 91 00 2 1 5 ，3 0 ( 避光) r t ， 1 0 、2 0 r t 1 0 、1 5 无试剂 沸水 r t ，( 持 t o l u e n e7 81 0 50 6 8r t ，5 9 7 c 的z n s 0 4 续振荡) c h o w fe ta l g t4 7 960 0 22 0 ，1 0 ( 2 0 0 4 ) s h i n i c h i r o k a m a k oe t a l ( 2 0 0 5 ) f r e n c h p r e s s z n s 0 4 ， e n t h o l 4c，zns04， 8 56 6 70 0 2 8 r t , 1 5 3 0 r a i nn a o h 7 氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响 s u l f a n i l - a m i d e ， y us u ne ta l v i g o r o u s 2 5 c ， n - ( 1 - n a p h t h y l ) 2 m i n7 42 50 8 5 ( 2 0 0 6 ) v o r t e x i n g 3 0 r a i n e t h y l e n e d i a m i n e h y d r o - c h l o r i d e m a t t h e w g t ( 2 0 0 7 ) 2 5 5 m i n 7 81 00 2h c l 3 0 m i n 1 ：g 卜以玻璃特富龙匀浆机破碎藻细胞2 ：r 卜室温3 ：z n o a c 一醋酸锌 1 3 营养盐等因子对硝酸还原酶活性的影响 硝酸盐的同化是植物( 包括海洋藻类) 生长发育需要的氮素主要来源之一。硝 酸还原酶( n i t r a t er e d u c t a s e ，n r ) 是n 0 3 。还原过程第一步反应的催化酶，也是关键 的限速酶，它是一种多亚基的金属蛋白酶，利用n a d h ( 还原型辅酶工) 或n a d p h ( 还 原型辅酶i ) 作为电子供体将硝酸盐还原，并最终转化成为氨氮后合成其它有机物 质，在海洋生态系统氮循环过程中占有极其重要的地位( s o l o m o n s o nl p b a r b e rh j 1 9 9 9 ) ，从而引起了国内外海洋工作者的广泛关注。1 9 6 8 年，e p p l y 和c o a s t w o r t h 第一次用硝酸还原酶活力指示浮游植物对氮源的吸收，随之，e p p l ye ta 1 ( 1 9 7 0 ) 和p a c k a r de ta 1 ( 1 9 7 1 ) 建议在现场实验中也可以用硝酸还原酶的活力来估测硝酸 盐的吸收速率。m a t t h e w ( 2 0 0 7 ) 通过检测北太平洋东部海域( e t n p ) 细菌的硝酸还 原酶、碱性磷酸酶等细胞酶活性，研究了该海域细菌的营养盐代谢机制。此后， 国内外的海洋研究工作者逐渐对海洋浮游植物体内的硝酸还原酶展开了广泛的 研究。研究表明，硝酸还原酶的活性易受诸如营养盐的浓度、存在形态，光照强 度、时间、光质以及光周期，藻种等多种因子的影响多种因子的影响，从而导致 浮游植物对营养盐的利用率有很大不同( e p p l ye ta 1 ，1 9 7 0 ；p a c k a r da n db l a s c o ， 1 9 7 4 ；c o l l o sa n ds l a w y k ，1 9 7 6 ；d o r t c he ta 1 1 9 7 9 ；b l a s c oe ta 1 ，1 9 8 4 ) 。 8 氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响 1 3 1 营养盐对硝酸还原酶活性的影响 在营养盐影响海洋浮游植物硝酸还原酶活性的研究中，大多数文献实验中涉 及的营养盐主要是指无机氮盐，包括无机氮盐的浓度、形态及相对比例等。 早在2 0 世纪6 0 年代，就有国外学者研究发现，在硝酸盐限制，氨氮充足的条 件下，细胞内的n r a 受到明显的抑制( e p p l ye ta 1 ，1 9 6 9 ) 。接着，又有很多研究 表明，硝酸还原酶虽然受外界硝酸盐的诱导，但浮游植物对硝酸盐的吸收速率和 还原速率常常不一致，并且在一定条件下，酶活力与细胞内而非外界硝酸盐浓度 存在正相关性，因此，c o l l o s 等人认为硝酸还原酶活力是导致胞内硝酸盐减少的 主要原因，在某种条件下，硝酸还原酶的活性与硝酸盐的同化率存在相关性，因 此，有学者建议将硝酸还原酶的活力测定做为硝氮同化程度的定性标志和定量指 标( c o l l o se ta 1 ，1 9 7 7 ；d o r t c hc ta 1 ，1 9 7 9 ；b l a s c oc ta 1 ，1 9 8 4 ) ；另一些学者的 研究结果则表明，藻类硝酸还原酶活力主要受环境中各种无机氮的相对比率调控 ( n o gn i 或n wn i ) ，而不是硝酸盐或铵盐的绝对浓度( p a c k a r de ta 1 ，1 9 7 4 ) 。9 0 年代末，l e a n n ej o s e p h ( 1 9 9 8 ) 在对根管藻r h i z o s o l e n i a f o r m o s a ( h p e r a g a l l o ) 的实 验中发现，较高的外源硝酸盐浓度有利于细胞内硝酸盐的积累，其酶活力的值也 比较高。与此相反，较低的外源硝酸盐浓度，即使细胞内硝酸盐浓度很高，其细 胞酶活力的最大值只有前者的1 3 。t o u c h e t t e ( 2 0 0 1 ) 研究了在不同时间添加不浓度 的硝酸盐对z o s t e r am a r i n a 硝酸还原酶活性的刺激作用 从上世纪末开始，国内学者对此也展开相关研究及探索。有学者在未加 n a n 0 3 的化培养液中添加了不同浓度的硝酸盐和铵盐，对高盒形藻( b i d d u l p h h 7 r e g i a ) 的n r 进行实验，结果发现高盒形藻n r 活性受硝酸盐诱导，铵盐则会抑制其 表达( 胡忻，王伟，1 9 9 9 ) 。将威氏海链藻( t h a l a s s i o s i r aw e i s s f l o g i i ) 和盐生杜氏藻 ( d u n a l i e l l as a l i n a ) 两种海洋微藻培养在两种不同浓度的硝酸盐培养基中，高硝 酸盐浓度( 8 0 0 1 a m o l l 1 ) 有利于藻细胞的生长；而在低硝酸盐浓度t ( 2 0 m o l l 1 ) ， 培养液中的硝酸盐在培养的第二天即被耗尽，且细胞叶绿素冶量很低。培养液中 亚硝酸盐的变化在高浓度呈现逐渐增加的趋势，而在低浓度则呈现先增加后减 少的趋势；两种微藻的硝酸还原酶活力在培养的第二天即达到最大值，随后迅速 下降并维持一低值，但威氏海链藻的硝酸还原酶活力要略高于盐生杜氏藻。研究 结果表明，在不同硝酸盐浓度下藻类细胞内部的硝酸盐的吸收同化机制不同， 9 氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响 从而导致营养盐的变化也各不相同( 吕嘉扬，2 0 0 4 ) 。王艳等( 2 0 0 5 ) 在硝酸盐对球 形棕囊藻( p h a e o c y s t i sg l o b o s a ) 生长和硝酸还原酶活性的影响的实验中发现：在 培养基中添加不同浓度的硝酸盐，对球形棕囊藻细胞硝酸还原酶的活性和藻细胞 的生长有极显著的影响，含有较高硝酸盐的富营养化海域有利于球形棕囊藻细胞 的持续生长。 1 3 2 光照对硝酸还原酶活性的影响 l e a n n ej o s e p he ta 1 ( 19 9 7 ) 研究了昼夜因子对根管藻r h i z o s o l e n i a f o f m o s a ( h p e r a g a l l o ) 硝酸还原酶活性的影响，研究发现，在高外源硝酸盐浓度( 8 洲) 和低 外源硝酸盐浓度( 1 吣d 两种条件下，昼夜因子对硝酸还原酶活力的影响都很明 显，其中高外源硝酸盐浓度的夜间平均n r a 只有最大n r a 的3 2 ，低外源硝酸盐浓 度的夜间平均n r a 是最大n r a 的2 0 。胡忻等人( 2 0 0 0 ) 研究了光因子对海洋硅藻高 盒形藻硝酸还原酶( n r ) 活性的影响，结果表明，光对n r 活性的诱导具有昼夜节律 现象，在光( h ) ：暗( h ) 分别为8 ：1 6 、1 2 ：1 2 和1 6 - 8 的光周期下，随着光照时间 的延长，n r 活性最大值在照光后出现的时间逐渐后移。光强度在1 0 0 0 - - 2 0 0 0 i x 范围内时，n r 活性较高。不同光质对n r 活性的诱导效果以蓝光最大，白光次之， 红光最小。f u n g y ic h o w e ta 1 ( 2 0 0 3 ) 在培养光暗比为1 2 - 1 2 h 的实验条件下对红藻 ( g r a c i l a r i ac h i l e n s i s ) 硝酸还原酶进行研究，结果表明在光相条件下硝酸还原酶的 活力以及光合作用是暗处的两倍多。在暗相条件下，施加光脉冲持续l o m i n 、 6 0 m i n ，硝酸还原酶的活性分别增长3 0 和4 5 。研究表明，该藻硝酸还原酶的 活性以及光合作用受光照时间及光照强度的影响。 1 3 3 其它因子对硝酸还原酶活性的影响 除上述提到的研究外，还有学者围绕其它因子( 如胞内硝酸盐浓度，藻种， 金属离子等) 对n r a 的影响进行了不同程度的研究。 b e r g e s 等( 1 9 9 7 ) 发现硝酸还原酶的活力因藻种而异，导致藻类对硝酸盐的利 用存在差异；除了受营养盐调控外，硝酸还原酶活力还会受到外界环境中金属离 子( 如f e 3 + ，m g + ，c d 2 + 等) ( t i m m e r m a n s e ta 1 ，1 9 9 4 ；h u b e re ta 1 ，1 9 9 2 ；r i f tt h a p a r ， 2 0 0 8 ) 、光( p a c k a r dtt ，1 9 7 3 ，h e r s e y e ta 1 ，1 9 7 6 ) 、温度( g a oe ta 1 ，1 9 9 3 ) 及昼 l o 氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响 夜节律( m a r t i n e ze ta 1 ，19 8 7 ，r a m a l h oc be ta 1 ，19 9 5 ) 盐度( m o h a m e dd e b o u b a ， 2 0 0 6 ) 等因子的调控。也有学者研究了不同培养条件下n r 以硝酸钾为底物的米 氏常数f r m ) ( p a l l a v is h a r m a , 2 0 0 5 ) 在对根管藻肋i z o s o l e n i a f o r m o s af f i p e r a g a l l o ) 的实验中发现，与胞内硝酸盐浓度相比，外部硝酸盐浓度对该藻n r a 的影响更大 一些( l e a n n ej o s e p he ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 受多种因子的共同影响，以上研究结果不尽相同，但都表明，浮游植物的 n r a 与营养盐等因子之问存在着一定的关系，有必要对其展开进一步的研究。 1 4 营养盐等因子对浮游植物生长的影响 氮、磷等营养元素是浮游植物生长所必需的物质，它们构成浮游植物细胞的 结构分子，并参与植物生长的新陈代谢( 李文权等，1 9 9 3 ) 。研究表明，在许多 海域，海水富营养化程度和营养盐结构等虽然不是赤潮爆发的充分条件，但却共 同决定着赤潮发生的物质基础，构成了赤潮爆发的必要条件之一( p a e r lhw ， 1 9 9 7 ；陈翰林，2 0 0 6 ) 。因此，海洋中营养盐的浓度、存在形态及其组成结构对 海洋浮游植物的生长都具有重大的影响。相继有许多学者围绕氮、磷单因子及氮 磷双因子对具体赤潮浮游植物生长的影响进行了研究和探索，以期为进一步研究 赤潮发生的生态学机制提供依据。 1 4 1 氮素对浮游植物生长的影响 海洋环境中的氮具有多种形态，而能被海洋浮游植物直接利用的主要是溶解 无机氮( d ) 。其中，n h 4 十和n 0 3 吸收的相互作用在微藻中研究非常多( d o r t c h ， 1 9 9 0 ；f l y n n ，1 9 9 1 ) ，结果表明，介质中n h 4 + il a m o l l 时，很少或没有n 0 3 的吸收。它们之间的相互作用复杂多变，与生长率、氮源种类以及碳代谢都有关 系( f l y n n ，1 9 9 1 ) ，而且受环境因子的影响较大。m c c a r t h y 等( 1 9 7 5 ) 在关于溶 解无机氮的摄取的研究指出，在高浓度的硝酸盐和氨氮共存的沿岸海域，浮游植 物对硝酸盐的摄取受氨氮含量的控制，它们对氨氮和尿素作为氮源进行选择性摄 取，二者不足时才摄取硝酸盐。张诚等( 1 9 9 7 ) 研究尖刺拟菱形藻对不同形态氮 氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响 的吸收时发现，在n h 4 - n 和n 0 3 0 n 浓度相等的条件下，尖刺拟菱形藻能更有效 的吸收利用n h 4 - n 。冯士笮等学者( 1 9 9 9 ) 也认为n h 4 n 无须改变氮的价态即 可在酶的作用下合成为氨基醵因此，浮游植物通常首先吸收n h 4 - n ，当海水中 山- n 几乎被耗尽时才会大量吸收n 0 3 - n 。但是，有学者在对海洋原甲藻的研 究中发现，加入不同浓度的硝酸盐，1 0 天后，海洋原甲藻有明显增长，且与n 0 3 - n 的浓度呈正相关( 齐雨藻等，1 9 9 4 ) 。之后，在利用正交实验法研究海洋原甲藻 和锥状斯克里普藻生长因子关系中，也证实了n 0 3 - n 对海洋原甲藻和锥状斯克 里普藻都有着明显的促进生长作用( 朱从举等，1 9 9 4 ；秦晓明等，1 9 9 7 ) 。实际 上，海洋浮游植物对n 0 3 - n 和n h 4 - n 的吸收竞争不仅决定于浮游植物的种类及 其营养状态，还受制于介质中n h 4 - n 和n 0 3 - n 的相对浓度。另外，许多研究还 表明，浮游植物体内可积累n 0 3 - n 和n h 4 - n ( d e m a n c h e ，1 9 7 9 ) ，以缓冲营养 盐的变化。一般情况下，n 0 2 - n 在海洋中的浓度比较低，它主要是硝化和反硝化 过程及浮游植物体内被摄取的n 0 3 0 n 在硝化酶的作用下转化为氨及氨基酸过程 的中间产物，n 0 2 - n 在赤潮发生时浓度有时会升高，则是与藻类存在的n 0 2 - n 释放机制有关。 一般情况下，近岸海域无机氮以n 0 3 - n 为主，其它形态只占较小的比例。 但近年来，由于沿岸陆源输入的工农业污染物、特别是近海养殖业迅猛发展而带 来的自身污染，使得特定海域水环境( 如养殖区、沿岸浅水区域) 中n h 4 - n 成 为总溶解无机氮( d i n ) 主要部分。海洋浮游植物对各形态氮吸收、转化机理非 常复杂，具体的营养、生态机制还需进一步研究。 1 4 2 磷对浮游植物生长的影响 海洋环境中的磷包括有机态和无机态，藻类主要吸收无机磷，对有机磷几乎 不吸收；当无机磷耗竭时，才吸收有机磷( 陈慈美等，1 9 9 0 ) ，事实上，大多数 赤潮生物都有这种能力( 1 w a s a k i ，1 9 7 9 ；c e m b r e l l a ，1 9 8 3 ) 。有学者对海洋原甲 藻进行研究，发现无机磷对其有增殖作用，增殖的最适浓度为0 8l u n o l l ，而低 于0 8l x m o l l 时，随无机磷浓度的增大，海洋原甲藻细胞迅速增殖，高于5l u n o l l 时，海洋原甲藻最终细胞密度略有下降，但仍保持较高的密度( 王正方等，1 9 9 6 ) 。 这说明，磷也是海洋原甲藻增殖的必需营养源。此外，对拟尖刺菱形藻吸收利用 1 2 氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响 不同浓度无机氮、无机磷的研究结果表明，随着p 0 4 p 浓度的增高，尖刺拟菱形 藻的吸收速率也呈上升趋势，与m o n o d 方程描述的曲线相符( 张诚等，1 9 9 7 ) ； 锥状斯克里普藻的生长速率也随p 0 4 p 浓度的升高而增大( 秦晓明，1 9 9 7 ) 。在对 微小原甲藻的实验中发现，随着培养基中磷浓度的升高，该藻最大细胞密度和比 生长速率也增加，在高磷( 0 1 0 8m m o l lk h 2 p 0 4 ) 条件下达到最大值( 石岩峻， 2 0 0 4 ) 。候继灵等( 2 0 0 6 ) 采用围隔生态实验方法研究了磷酸盐对东海典型赤潮 藻种( 东海原甲藻和中肋骨条藻) 生长的影响，研究结果表明，在高磷条件下， 中肋骨条藻快速增殖，稳定期缩短，细胞密度很快下降，而东海原甲藻由于氮源 的限制生长期明显缩短；在磷限制条件下，中肋骨条藻细胞增殖受到明显抑制， 生物量偏低，而东海原甲藻受到的影响较小，因此认为，磷可能是东海原甲藻及 中肋骨条藻生长的限制因子。 1 4 3 营养盐结构对浮游植物生长的影响 营养盐结构指的是宏观上不同类型营养盐之间的组成比例，即水体中氮、磷、 硅的相对量。海洋中营养盐结构的研究来源于浮游植物营养盐限制因子的探索， 多数情况下海洋环境中的氮与磷的比值不仅可以影响海洋浮游植物的种群结构 ( h e c k y ，1 9 8 8 ) 也是水体中浮游植物受磷或氮限制的重要指标，同时也是决定 特定海区赤潮发生的限制因子( r i e g m a n ，1 9 9 1 ；h o d g k i s s ，1 9 9 8 ；l i uh ，2 0 0 1 ) ， 而硅酸盐很少被认为能对浮游植物生长形成限制因素( d o r t c h ，1 9 9 2 ) 。 r e d f i e l d ( 1 9 5 8 ) 提出海水中平均n p l 是1 5 ：1 ，而浮游植物在生长时，n p 比1 5 ：1 的比例被消耗。后来实验室统计分析结果表明，浮游植物n p 比的组成为 1 6 ：1 ，很多学者的研究进一步支持了这一结果，故目前多以此值作为浮游植物生 长的最适氮磷比例( h e c k yr e ，1 9 8 8 ) 。但此统计方法忽略了不同物种的浮游植 物在其生长过程中，对营养盐有各自不同的需求( 蒲新明，2 0 0 0 ) ，正是这种对资 源不同的需求在某种程度上决定了浮游植物不同物种之间的竞争和共存，保持了 生物的多样性基础。不同浮游植物因对营养盐的需求不同，其出现最佳生长状态 的氮磷比值往往也不遵循r e d f i e l d 仁l 值，某些海洋浮游植物可能低于r e d f i e l d l 匕值 ( h e c k y ，1 9 8 8 ：刘玉生，1 9 9 5 ；h o d g k i s s ，1 9 9 8 ) ，某些也可能高于r e d f i e l d e l 值( r h e e ，1 9 7 8 ；胡明辉，1 9 8 9 ：姜建国，1 9 9 9 ) 。后来，很多学者通过对单种 氮磷营养盐对东海典型浮游植物生长及硝酸还原酶活性的影响 的m o n o d 型培养方式来揭示不同物种营养特征的分类趋势，如蓝藻、绿藻对磷有 较高的需求，而对s i 没有明显的需求；硅藻中f r a g i l a r i a e e a e 的物种对磷的需求很 低o c s = o 0 0 3 - 4 ) 0 2l a m o l l - 1 ) ，但对s i 的需求较高o q = 1 5 - 1 9 7 岬o l l 1 ) ；而中心硅 藻纲的物种对磷的需求较高做= 0 1 3 o 2 5l - l x n o l l 。1 ) ，对s i 的需求较低 ( 1 ( ：；= 0 1 2 1 4 4l a m o l l 1 ) ( 孙军，2 0 0 4 ) 。还有实验表明，相对低的n p 比有利 于微小原甲藻细胞的分裂繁殖，过高的n p 比不利于微小原甲藻细胞对营养盐 的吸收与利用，所以在磷源充足的条件下过高的氮浓度会抑制微小原甲藻细胞的 生长( 石严峻，2 0 0 3 ) 。一些现场调查结果也表明，浮游植物群落结构沿营养盐比 例的梯度发生变化，例如硅藻在s i ：p 和n ：p 较高的时候生长繁盛；绿藻喜欢生 长在s i 浓度较低、n p 比较高的条件下；蓝藻则喜欢生长在低氮浓度下( j r g e n s e n s e ，1 9 7 9 ：t i l m a nd ，1 9 8 2 ；s o m m e ru ，1 9 8 6 ) 。j u s t i c 等( 1 9 9 5 ) 提出评估一个海 洋生态系统的评估