（物理化学专业论文）基因体系中若干非线性问题的理论研究.pdf

摘要 随着2 1 世纪科学技术的发展，人们已经能够完成生物全基因组的序列测定。 然而，对于基因之间是如何相互调控以实现复杂的生物功能的，人们并没有得到 统一的规律。认识并解析复杂基因调控网络的构成及其动力学机制，已成为后基 因组时代生命科学中最具有挑战性的前沿课题之一。复杂基因调控网络常呈现出 非线性动力学行为。基因可以出现高表达和低表达的多稳态特性，从而实现灵敏 的“开关”功能；表达产物也可以表现出浓度振荡行为，它们是生理时钟等生命 功能的分子机制。另外，基因表达过程是在非平衡条件下进行的介观尺度上的化 学反应过程，转录和翻译过程都伴随着很大的内涨落。近年来，在生命系统中特 别是基因表达过程中的内噪声引起了人们的广泛重视，产生了一大批研究结果。 正如m c a d a m s 等人指出的那样，基因表达过程是“噪声的事情”。目前，大部 分工作还是集中在基因体系中噪声的来源，如何表征噪声和噪声的效应等问题 上，不过，近来也有的工作研究了噪声如何促进体系的某些性质。因此，在本文 中，我们着重探讨在处于介观层次的基因表达过程中，环境涨落和内涨落是否可 以起到一定的积极作用。 在本论文中，我们用4 f 线性方法研究了基因体系中的几个动力学问题。发现 环境涨落、内涨落等复杂性困素对基因体系的动力学行为有积极的调控作用，另 外还对简单基因网络中的噪声特性作了初步研究。 我们首先研究了环境涨落对基因体系反应动力学的影响。研究结果显示，外 噪声可以在体系的分岔点附近诱导反应振荡，并且，在一定的噪声强度下能够出 现随机共振现象。这种随机共振现象可能会增强分子机器的能最传输作用，或者 提高基因网络对外界微弱信号的响应能力，表现出一定的实际意义。 然后，我们研究了内涨落对处于介观层次的基因体系的动力学行为的影响。 分别研究了内涨落对原核的合成基因网络、真核的哺乳动物生理时钟振荡的调控 作用。研究结果表明，适当的内涨落叫以刘基因体系振荡行为具有积极作用，内 涨落的存在可以使基因体系在确定性方程不发生振荡的区域发生振荡，并且可以 通过内噪声随机麸抵使反应振荡达到最佳状态。同时，由于内涨藩与体系尺度密 切相关，它和体系非线性动力学机制的耦合作用，使反应具有“尺度共振”效应， 这从非线性动力学角度说明了最佳尺度的存在。此外，我们还说明了两种合成基 因网络模型，振子和双稳开关，经过耦合之后可以作为一个随机共振子来工作， 具有利用内噪声来增强基因体系性能的能力。 最后，我们还利用振荡信号研究了一种基因网络模体中的噪声特r 眭。研究结 果显示，不同反馈类型的模体的噪声特性各不相同，这使得我们可以很简单的利 用基因网络单元对振荡信号的响应来获得其网络结构的一些基本性质。 a bs t r a c t t h ef l u r r yo fg e n o m i cr e s e a r c hh a sl e dt od e t a i l e dl i s t so ft h eg e n e st h a ta r ea tt h e h e a r to fc e l l u l a rf u n c t i o n t h e s eg e n e sa n dt h e i rp r o t e i np r o d u c t sf o r mac o m p l e xw e b o fj n t e r a c t i o n s ，w h e r e i nt h ep r o t e i n ss e l v et oa c t i v a t eo rr e p r e s st h et r a n s c r i p t i o no f t h eg e n e s t h ed i s s e c t i o na n da n a l y s i so f t h ec o m p l e xd y n a m i c a li n t e r a c t i o n si n v o l v e d i ng e n er e g u l a t i o ni st h u san a t u r a ln e x ts t e pi ng e n o m i cr e s e a r c h c o m p l e x g e n e r e g u l a t o r yn e t w o r k so f t e ns h o ws o m en o n l i n e a rd y n a m i c a lb e h a v i o r g e n e sm a ys h o w m u l t i s t a b l ep r o p e r t i e si n c l u d i n gh i g ha n dl o we x p r e s sl e v e l ，l e a d i n gt ot h ef u n c t i o no f s e n s i t i v eg e n e t i c “s w i t c h ”；p r o t e i n sc a no s c i l l a t ew i t ht i m e ，s e r v i n gf o rt h em e c h a n i s m o fs o m ei m p o r t a n tb i o l o g i c a l p r o c e s s e ss u c h a sc i r c a d i a nc l o c k m o r e o v e r ，g e n e e x p r e s s i o np r o c e s s e sa r em e s o s c o p i cc h e m i c a lr e a c t i o n st h a ta r eo u to fe q u i l i b r i u m s t a t e ，t h e r ea r el a r g ei n t e r n a ln o i s ei n v o l v e di nt h ep r o c e s s e so ft r a n s c r i p t i o na n d t r a n s l a t i o n r e c e n t l y ，t h es t u d yo fi n t r i n s i cn o i s ei nl i f es y s t e m ，s p e c i a l l y ，i ng e n e e x p r e s s i o np r o c e s s e sh a sd r a w ne v e r g r o w i n gi n t e r e s t sa n dav a l i e t yo fi m p o i t a n t r e s u l t sw e r er e p o r t e d a sp o i n t e do u t b ym c a d a m se ta 1 ，g e n ee x p r e s s i o np r o c e s si sa “n o i s yb u s i n e s s ”c u r r e n t l y ，m o s ts t u d i e si nt h i sf i e l df o c u so nw h e r et h en o i s ec o m e s f i o m ，h o wt oc h a r a c t e r i z ei ta n dw h a ti t se f f e c ti s h o w e v e r ，s o m er e c e n ts t u d i e s c o n s i d e rh o wt h ei n t r i n s i cn o i s e s y s t e m a t i c a l l y f a c i l i t a t e st h e s y s t e mp l o p e r t i e s t h e r e f m e ，i nt h i sw o r k ，w ea r ei n t e r e s t e di nw h e t h e rt h e r ea r ea n yc o n s t r u c t i v er o l e s o fe x t e r n a la n di n t e r n a ln o i s ei nm e s o s c o p i c g e n ee x p r e s s i o np r o c e s s e s i nt h e p r e s e n tw o r k ，u s i n gs o m en o n l i n e a ra p p r o a c h e s ，w eh a v es t u d i e d s e v e r a l d y n a m i cp r o b l e m si ng e n es y s t e m w ef o u n dt h a ts o m ec o m p l e xf a c t o r ss u c ha s e n v i r o n m e n t a ln o i s eo ri n t e r n a ln o i s em a yh a v ec o n s t r u c t i v er o l e so nt h ed y n a m i c b e h a v i o ro fg e n es y s t e m m o r e o v e r ，w eh a v ee l e m e n t a r i l ys t u d i e dt h en o i s ep r o p e r t i e s i ns i m p l eg e n en e t w o r k s f i r s t ，w eh a v es t u d i e dt h ei n f l u e n c eo fe x t e r n a ln o i s e o nt h ed y n a m i c so fg e n es y s t e m i ti ss h o w nt h a to s c i l l a t i o nc a nb ei n d u c e db yn o i s ew h e nt h es y s t e mi sn e a l t i l e b i f u , 1 c a t i o np o i n t ，a n ds t o c h a s t i cr e s o n a n c e ( s r ) a p p e a r e da tac e r t a i nn o i s el e v e l t h r o u g ht i l em e c h a n i s mo fs r ，t h ee n e r g yt r a r i s d u c t i o no fm o l e c u l a rm a c h i n e l ym a y b ee n h a n c e d ，o rt h er e s p o n s eo fg e n en e t w o r k st oe x t e r n a lf e e b l es i g n a l c a l lb e i m p r o v e d ，w h i c hs h e dl i g h to hs o m ep r a c t i c a lf u n c t i o n so fs r s e c o n d ，w eh a v ei n v e s t i g a t e dt h ee f f e c to fi n t e r n a ln o i s eo nd y n a m i c so fm e s o s c o p i c g e n ee xp 1 e s s i o ns y s t e m s t h es y s t e i n sw eh a v es t u d i e di n c l u d ep r o k a l y o t i cs y n t h e t i c ， g e n en e t w o r k sa n de u k a r y o t i cm a m m a l i a nc i r c a d i a nc l o c ks y s t e m 0 u rr e s u i t ss h o w t h a tp r o p e ri n t e r n a ln o i s ew o u l dp l a yc o n s t r u c t i v er o l e si nt h eb e h a v i o l o ft h es y s t e m s ： b yc o n s i d e r i n gt h ei n t e r n a ln o i s e ，t h eo s c i l l a t i o n sc a no c c u ri nt h er e g i o nw h e r et h e d e t e r m i n i s t i cd e s c r i p t i o nw o u l dn o to s c i l l a t e ；i tc a nm a k eg e n e t i co s c i l l a t i o nr e a c ha n o p t i m a l s t a t eb yam e c h a n i s mo f “i n t e r n a jn o i s es r ”；m e a n w h i l e ，d u et oi n t e r n a l n o i s e sc l o s er e l a t i o nt ot h es y s t e ms i z e ，t h ec o u p l i n gi n t e r p l a yo fi n t e r n a jn o i s ea n d n o n l i n e a rd y n a m i c sm a k et h e g e n es y s t e mp e r f o r m s i z er e s o n a n c e ”，w h i c h ，f r o m n o n l i n e a rd y n a m i cp o i n to fv i e w ii n d i c a t e s t h ee x i s t e n c eo f “o p t i m a ls y s t e ms i z e ” f u r t h e r m o r e ，w ec o u p l e dt w oc o m m o n l yu s e ds y n t h e t i cg e n em o d e l s a no s c i l l a t o r a n dab i s t a b l es w i t c h ，a n dm a k et h e mw o r ka sas t o c h a s t i cr e s o n a t o r ，w h i c hh a st h e a b i l i t yt ou s et h ei n t e r n a jn o i s ef o re n h a n c i n gt h ep e r f o r m a n c eo fg e n es y s t e m f i n a l l y ，w eh a v eu s e do s c i l l a t o r ys i g n a lt os t u d yt h en o i s ep r o p e r t yo fag e n e t i cm o t i f t h er e s u l t ss h o w st h a tt h en o i s ep r o p e r t i e sd i f f e rb yt h ef e e d b a c kt y p e si n v o l v e di n t h em o t i f , i tf a c i l i t a t es o m eb a s i cp r o p e r t i e st ob ed i s c o v e r e db ys t u d y i n gt h er e s p o n s e o ft h eg e n en e t w o r kt oa no s c i l l a t o r ys i g n a l 第一章基因体系中的随机性和介观动力学简介 第一章基因体系中的随机性和介观动力学简介 基因表达过程是生命的基本过程。生命的信息储存在基因中，而生命过程主 要是由各种蛋白质完成的，蛋白质的结构和功能在原则上都是由基因储存在 生物体d n a 中的信息决定的，因此，基因表达过程需要极高的精确性。然而， 涨落在生命过程中不可避免。一方面，细胞是一个极其复杂的反应器，在其中温 度、压力和各种物质的浓度分布具有很大的不均匀性，这些因素为基因表达过程 引入了外噪声；另一方面，很多参与基因表达的分子的数目很少，这导致了在同 样的环境中，不同时刻发生的同一反应之间或者同时刻在不同的细胞中发生的 同样的反应可能有完全不同的结果，这方面的涨落被称为内噪声。在前人所做的 工作当中，大部分工作立足于研究基因体系如何利用自身机制，尽可能克服各种 涨落带来的不利影响。但我们同时也看到，涨落也可能会起到积极作用，例如， 涨落的存在可以给生命带来多样性，涨落的存在可以使基因体系自身形成各种开 关，从而控制基因体系中一些现象的发生。在本论文中，我将使用一些非线性的 方法来研究生命过程特别是基因体系中的涨落问题。通过对一些较为成熟的生命 模型的数值模拟，我们可以发现，涨落在基因体系中完全是可以起到积极作用的。 本章首先介绍一下基因体系的基础知识，同时简单介绍基因工程中的一些基 本方法，以及如何构建一些小型的基因网络的数学模型；然后介绍有关基因网络 中的随机性的理论和验证这些理论的实验结果，并对随机性的生物学意义作一定 的阐述；最后，由于本论文旨在利用数理方法处理基因网络中涉及随机性的理论 问题，简单介绍一些和本工作有关的非线性知识，包括分岔理论、噪声的效应和 随机共振现象、如何在数值模拟中考虑外噪声和内噪声的效应以及如何表征所得 结果等： 1 1 基因体系的建模概述 系统生物学研究的中心问题是建立能够将生物体内单个分子的行为与整个 系统的特征和功能联系起来的一般规律或普遍方法。要完成这个任务，单纯依靠 实验研究是不够的，必须再结合工程化的模块的研究，再辅助以理论模型的研究， 才能演绎出较为可靠的一般规律。近些年来，基因工程发展迅速，科学工作者们 设计了一大批工程化的基因网络，希望得到生物体内自然基因网络的性质，为了 方便处理工程化基因网络所得到的数据，科学工作者们提出了不少基因网络的数 理模型，用它们可以解释已有的实验数据，并且可以预言某些新的现象。这些工 作在基因体系的研究中发挥了重要的作用。j 第一章基因体系中的随机性和介观动力学简介 本节主要有三个方面的内容，首先简单介绍_ 下基因表达过程中的基本生物 学问题，并且对原核生物和真核生物中现有的基因调节理论作简单的讨论；然后 介绍一下工程化的基因系统，说明它是如何支持前面所说的基因调节理论，以及 如何用它们从系统层次上研究基因网络的特征和功能；最后介绍一些基于基因网 络的数学模型，说明它们是如何把定性的模型转换成定量的数学模型的。 1 1 i 基因体系中的一些分子生物学概念1 2 4 i 生命控制系统的层次非常丰富，各种调节作用可以在许多层次上同时发生。 随着实验技术的提高，生命各个层次上的细节不断被揭示，因此，在没有充分了 解那些还没有被揭示的可能是非常重要的细节的情况下，人们很难对生命的一般 特征作全面的概括。但至少有一点是公认的，因为生命信息储存在细胞内的d n a 中，大多数工程化的细胞控制系统的实质就是对储存在细胞内的d n a 的操纵。 因此，有必要了解一些基因表达的基本过程和一般规律。 核苷酸和d n a 的结构 蛋白质参与了绝大部分的生命调节过程，重要性不言而喻，它的结构和功能 是由储存在细胞内的d n a 的信息决定的。d n a 分子通过四种核苷酸，即腺嘌呤 ( a ) ，鸟嘌呤( g ) ，胞嘧啶( c ) 和胸腺嘧啶( t ) 来编码信息。核苷酸的分子结构可以 参见图1 1 。图1 1a 所示为d n a 的分子结构，如果它的2 位置是o h 而不是h 的话，它就是r n a 。多核苷酸链是由多个核苷酸之间由磷酸二酯键形成的一维 链，它的一个尽头是5 端的磷酸基，另一个尽头是3 端的羟基，一般所指的d n a 单链的方向是从5 端到3 端。双链d n a 由两条碱基互补配对的单链d n a 所组 成f 图1 1b ) ，在a 和t 、g 和c 之间由氢键连接。而在空间上，双链d n a 呈双 螺旋结构( 图1 1c ) 。 ab 0 hh 魏馥核蘸梭酸 c 图：( a ) 脱氧核糖核酸( d n a ) 的分子结构。核糖核酸( i 矾a ) 的结构只有一处不同：2 位置的 h 变成0 h 。在d n a 中，连接在1 位置的碱基可以是腺嘌呤( a ) ，鸟嘌呤( g ) ，胞嘧啶( c ) 或 胸腺嘧啶( t ) ，而在r n a 中，胸腺嘧啶被尿嘧啶( u ) 所取代； ( b ) d n a 的双链。在a 和t 或者g 和c 之间的虚线代表氢键，它们连接了两条互补单链上的d n a 分子；( c ) d n a 的双 螺旋结构。 第一章基因体系中的随机性和介观动力学简介 转录和翻译 基于d n a 编码的氨基酸顺序的蛋白质合成至少需要两个步骤。首先，基因 组信息必须从d n a 顺序中转录到信使r n a ( m r n a ) 分子中，这一步骤是由r n a 聚合酶完成的。所得的r n a 分子与d n a 分子类似，除了它的糖基是核糖而不 是脱氧核糖，另外胸腺嘧啶由尿嘧啶取代，此外，m r n a 通常是单链。在转录 过后，包含在m r n a 中的信息必须被翻译到蛋白质上。这一步骤是由核糖体完 成的，该过程包含了另外两种r n a 分子i 核糖体r n a ( r r n a ) 和转运r n a ( t r n a ) ， 其中r r n a 是核糖体的组成部分之一，而t r n a 则为正确的氨基酸插入蛋白质提 供了专一性。 一旦翻译过程结束，整段由d n a 编码的多肽形成后，要形成有功能的蛋白 质还需要完成其他一些步骤。这些步骤有：共价修饰，如磷酸化、乙酰化、糖基 化等，将蛋白质导入多蛋白复合物中或者到合适的细胞位置去等。当前的观点认 为从转录到翻译的基因表达调控的每个过程都是一个连续过程的细分。每一个过 程在生理和功能上都与下一过程紧密联系，从而保证所有操控之间有足够的物质 能量转移( 图1 2 ) p j 。 图1 2 ：基因表达过程。现代的观点认为从转录到翻译的基因表达调控的每个过程都是一个 连续过程的细分。在上图所示的基因奉达的现代观点中，每_ 个过程在生理和功能上都与下 一过程紧密联系，从而保证所有操控之间有足够的物质能量转移。 。 第一章基因体系中的随机性和介观动力学简介 等位基因和t a t a 框 基因通常是指被转录成m r n a 进而被翻译成蛋白质的d n a 序列，但这一规 则也有例外，例如，编码类似于r r n a 或者t r n a 的d n a 序列也是基因，但是 其r n a 分子并没有被翻译成蛋白质。基因通常是由细胞内的染色体携带的，每 条染色体至少包含一个复制的起始位点，这些区域决定了d n a 聚合酶开始复制 遗传物质的位置。基因在染色体上的特定位置被称为基因座。单倍体细胞包含每 条染色体的一份拷贝，所以基因座唯一的决定了基因的位置。二倍体细胞包含同 源染色体对，同一基因的两种不同的形式被称为等位基因。 除了包含基因编码的序列之外，d n a 还包含与基因转录调节有关的区域。 r n a 聚合酶沿着5 到3 的方向阅读遗传密码，它结合在d n a 上的初始位置位 于基因的上游，就是说，比5 ：端还要远( 图1 5 ) 。r n a 聚合酶与d n a 接触的初 始区域叫做基因的启动子。基因表达可以同时在多个启动子上开始发生，也就是 说，基因上游区域可以存在多个独立的r n a 聚合酶结合位点。第一个被转录的 核苷酸通常被标记为+ 1 ，其他核苷酸相对于这个转录起始位置沿着d n a 的5 到3 的方向来计数。因此，在基因编码区域的核苷酸标记为正整数，而在启动子 区域之内的核苷酸则是负整数。例如，在细菌中，启动子区域大约有6 0 个碱基 对的长度，其中4 0 个碱基对位于+ 1 位置的上游，另外2 0 个位于下游，而在酵 母中，启动子区域包含大约2 0 0 个碱基对。 应该说没有两个启动子是相同的。然而，统计分析显示，在不同的启动子里 面存在着高度保守的区域。比如在细菌中，有这样的区域在一1 0 位置存在一致的 序列t a t a a t ，这个区域叫做t a t a 框，在很多情况下对r n a 全酶相对于基因 编码序列的正确排列有着重要的作甩。t a t a 框序列的突变，比如其中一个核苷 酸被另一个所取代，能显著影响d n a 转录到m r n a 的速率。在真核生物的基因 中也存在类似t a t a 框的序列。在真核生物中，经常可以在离d n a 序列很远的 地方发现可以影响转录的增强序列。在蛋白质编码的基因中，还存在能够决定 m r n a 翻译成蛋白质的序列( 图1 3 ) 。翻译起始密码子通常是a t g 。在转录起始 位点和翻译起始位点之间的d n a 序列被称为非翻译区( u t r ) ，u t r 可以通过决 定核糖体与m r n a 的结合等方式显著影响基因表达的效率。 5 3 启动子 【 一。 。 i 5 - u t r 3 u t r d l a m r n a l 萧漏一 碱白质 编码序列 图1 3 ：典型的基因构成，j 其中包含了合成蛋白质所需的信息。启动子是r n a 聚合酶一开始 结合的区域。终止于是r n a 聚合酶从d n a 中释放的区域。d n a 还包含了在转录为m r n a ： 时，控制翻泽起始( 51 u t r ) 和终止( 3 u t r ) 的区域j 补配对的核糖核苷酸之间形成磷酸二酯键，这样的结果就是形成了包含全酶， d n a 和r n a 的三重复体( 图1 4d ) 。其它核糖核苷酸也开始不断加入到r n a 链中，直到达到9 碱基的长度。在此阶段，返回到开放复体的转变也可能发生， 短的核苷酸链从三重复体中被释放，这叫做无效起始。为了合成超过9 到1 0 个 碱基的r n a 链，r n a 聚合酶必须在d n a 上沿着5 到3 的方向移动，这需要。 因子从全酶上被释放，然后形成一个延长复体，它由r n a 聚合酶核心酶，d n a 和r n a 组成( 图1 4e ) 。此复体可以沿着d n a 移动，从而合成整条m r n a ，当 转录起始之后，一般需要一段时间( 1 到2 秒) 来使得核心酶能够清理启动子区 域，使下_ 个全酶又可以结合。m r n a 的翻译过程是由核糖体加速的，在细菌 中，翻译和转录中的延长过程同时发生( 图】4e ) 。 第一章基因体系中的随机性和介观动力学简介 a c e 鼢澎嘶嵫嘞嗡踺翩蚴鼢嘞屯鹇勰 5 0t a t a d n a 融解 删一 全酶结翕 # = 鲰 # 镣 扛一 昏因子释放 o 灞一 绷凇蝴懒潲蝴蕊魏满雪 多肽箩妒裂m r 眦 转录和翻译 图1 4 ：原核生物转录起始过程。( a ，b ) r n a 全酶结合到启动子上的过程由。因子加速；( c ) d n a 处于开放态，露出一个单链d n a 区域：( d ) 单链d n a 被用来合成短的r n a ；( e ) ( 3 - 因子的释放使得r n a 可以沿着基因向下游移动，从而产生整条m r n a ，当m r n a 从延长 复体中释放出来的时候就立即翻译形成蛋白质。 真核生物转录的步骤 与原核基因转录相比，真核生物基因表达起始要复杂一些。真核生物有三种 不同的r n a 聚合酶，r n a 聚合酶l 和l j j 分别转录编码r r n a 和t r n a 的基因。 只有r n a 聚合酶i i ，它包含1 2 个亚单元，才转录编码蛋白质的基因( 第1 i 类基 因) 。真核基因表达比原核基因表达更复杂的一大原因在于它包含了更多的蛋白 质，其中许多蛋白质的功能目前还不是特别清楚。例如，在酵母中，转录过程就 包括了至少5 0 种蛋白。虽然我们对它的表达细节还不是特别清楚，表达过程的 主要图像还是清楚的。一些蛋白质复体，成为转录因子( t f ) ，与d n a 相结合形 成一个骨架，使得聚合酶全酶可以结合。这些复体包括t f i i a 和t f i i d 。t f i i d 复体包括t a t a 框结合蛋白( t b p ) 和t b p 相关因子( t a f ) 。在第1 i 类基因中， t a t a 框调节表达是_ 卜分常见的。 图1 5 所示的是r n a 聚合酶i i 全酶在包含t a t a 框的启动子上的募集过程 和合适定位过程的主要图像。在第一步中，t f i i a 和包含t b p 的t f i i d 以及复 体与d n a 相结合。t f i i d 复体与其中包含t b p 的复体在t n r a 框附近与d n a 相结合f 图1 5b ) 。t b p t f i i d 的结合通常被认为是转录起始过程中的限速步骤， 因此通常需要启动子附近存在其它的因子。接着t f i i b 复体被募集( 图1 5c ) ， 形成了一个可以结合r n a 聚合酶1 1 全酶的骨架，包括调节复体和t f i i f 等( 图 1 5d ) 。然后t f i i e 和7 e f i i h 被加入其中，形成一个封闭复体( 图1 5e ) 。现在还 不清楚这其中哪些是独立的复体，哪些是r n a 聚合酶i i 全酶的组成部分。在一 第一章基因体系中的随机性和介观动力学简介 些情况下，也可能出现许多因子同时被募集到一起的情况，这样就可以从一个预 起始骨架( 图i 5b ) 直接转化成封闭复体( 图1 5e ) 。t f i i h 复体有解旋作用， 可以解开d n a 。它同时有激酶作用，可以r n a 聚合酶i i 的最大的亚基的c 末 端区域加入磷酸基。这个磷酸化作用是很重要的，它可以促进开放复体的形成， 转录延长的发生和r n a 合成的开始( 图1 5f ) 。转录起始到延长的过程中要释放 出t f i i e 和t f i i h ，剩下的复体可以在下一轮转录继续使用。另外，组蛋白和核 小体等也与真核基因的转录有着重要的关联。核小体与染色质纤维的紧密的结构 也可以阻止d n a 结合蛋白与d n a 的结合。 蕾够。| | 油 眵 糖 厨删睫萨哳她跳觎嘶叫蝴隐疹曝挚* e 食昌厶酶绪合 f 多e 9 r n a 聚合酶金酶 ：一 转录起始 溯 一未 图1 5 真核生物转录起始的步骤。( a ，b ，c ) 一开始结合的因子是t f i i a ，t f i l d 和t f i i b ， t f i i d 复体包含t a t a 框结合蛋白( t b p ) ：( d ) t f i i b 复体的结合可以加速募集i 州a 聚合酶 r r n a p l 全酶和伴随它的t f i i f ，紧接着它们与t f i i e 和t f i i h 结合，形成转录前复体；( e ) t f i i h 可以激发开放复体形成和转录的起始；( f ) 延长复体包含r n a p 和t f i i f ，t f i i a 和 t f i i d 在转录起始后仍然可以留在启动子区域，r n a 聚合酶全酶也可能包含大多数的复体， 从而在t f i i d 结合之后仍然包围着一部分的步骤。 转录后处理 一旦转录过程结束后，m r n a 必须被修饰，然后从细胞核内运送到细胞质 内进行翻译过程。一般有三种m r n a 处理的类型。第一种是在r n a 刚刚从延长 复体中出。现的时候，在它相反连接方向上加入甲基化鸟嘌呤核苷酸j 这个5 甲基 第一章基因体系中的随机性和介观动力学简介 帽子对接下来r n a 分子的处理和翻译有很大作用。在真核基因中通常存在着非 编码区( 内含子) 和编码区( 外显子) ，非编码区必须在形成蛋白质之前去除，这 是由r n a 剪接来完成的，在剪接后，内含子被去除，剩下的外显子重新组合在 一起。最后，m r n a 要在3 末端加入大约2 0 0 个腺嘌呤( p o l y ( a ) 尾部) 。这样处 理过的m r n a 就可以被输运到细胞质中进行翻译过程了。 顺式作用元件 真核基因的转录首先要受到启动子、增强子以及沉寂子等顺式作用元件的渊 节。例如，真核生物的r n a 聚合酶i 负责转录r r n a ，酶i i 转录m r n a 和某些 s n r n a ，酶i i i 转录t r n a 、5 sr r n a 及另一些s n r n a 。由于不同基因具有不同 结构的启动子以及其它转录因子的配合，转录时就能选择适合的r n a 聚合酶。 增强子由约1 0 0 2 0 0 个特定的非编码核苷酸序列构成，常远离转录起始点1 4 k b ，可位于5 上游、3 下游或内含子中，能作用于启动子而大大提高转录速率。 某些基因的5 或3 侧翼还存在称为沉寂子的特殊序列，与增强子的作用相反， 它们对基因的表达起抑制作用，是一类负调控元件。 顺式作用元件的功能常受到不同细胞、细胞中特异d n a 调控蛋白的影响。 这类d n a 调控蛋白称为反式作用因子，它们能够识别并结合到特定顺式作用元 件的核心序列上，参与目标基因转录速率的调控。因此，真核基因的转录是通过 顺式作用元件与反式作用因子相互作用而受到控制的。反式作用因子有很多种， 按照其与d n a 结合的功能区结构即结构域大致可以分成3 大类：螺旋一转角一螺 旋结构域、锌指结构域和亮氨酸拉链结构域。它们以各自独特的方式与d n a 特 定的区域结合，在转录水平上影响基因的表达。 1 1 2 工程化的基因网络概述7 。9 1 自然的基因网络可以用相互关联的功能模块的回路来描述，在其中包含着蛋 白质，d n a ，r n a 和小分子之间的特定相互作用。一个最简单的基因调节网络 至少要包括一个启动子，它所表达的( 一些) 基因和能够影响该基因表达的调节蛋 白( 或者它们的同源d n a 结合位点) 。虽然有好几种方法可以使调节蛋白和小分 子调制基因表达，但现在对自然基因回路的最通用的手段还是调节基因转录的频 率。例如p 肠。启动子的表达可以由反作用蛋白质c a p 和l a c r 来调制，p 胛月m 启 动子可以由c 1 和c r o 来调制，在半乳糖调节子中的许多启动子可以由g a l 4 和 m i g l 来调制等等。转录的频率也是一个最容易在实验中调控的参数。在顺调节 元素、启动子区域和m r n a 转录的非翻译区域中的核苷酸顺序改变起来相对比 较容易，而通过改变转录因子结合的稳定性和改变其它转录和翻译中的器件来改 变基因表达的水平则相对较为困难。另外，可以通过一组转录因子使得转录过程 可控制的顺调节元素可以被另一些顺调节元素所替代。这种混合和匹配活细胞中 第一章基因体系中的随机性和介观动力学简介 顺反调节元素的能力使得建立符合特定性质和特点的人工基因网络变得容易。 建立人工基因回路与分子生物技术最近的发展和顺调节元素和它们的转录 因子蛋白可供使用的的d n a 序列是分不开的。例如，限制酶可以用来去除特定 位置的d n a 分子，d n a 连接酶可以用来使得d n a 片断连接在一起，克隆载体 可以用来在活体中表达所需的基因，也可以放大包含在载体中的d n a 序列。另 一个经常使用的技术是聚合酶链式反应，它可以用来在活体外放大d n a 序列。 下面介绍几个典型的工程化基因调节模块【1 m 1 9 j ，包括大肠杆菌内的基因开 关，酵母中的基因开关，哺乳动物的基因拨动开关和简单的基因调节回路等。 许多用来控制基因表达的基因开关都是基于类似于天然细菌操纵子的结构。 l u t z 和b u j a r d 1 7 】构造了两个大肠杆菌中常用的开关，他们在个修改后的p i 启 动子上分别用t e t o 和l a c o 操纵子来取代c i 抑制子的结合位点。在基因工程中 另一个经常使用的天然系统是t e t r 抑制子t e t o 一操纵子模块。它是通过研究一个 有关细菌对含四环素的抗体的抵御性的系统得到的。两个基因t e t r 和t e t a ，通过 类似于基因在半乳糖操纵子内的作用的方式来操纵四环素抵御性。具体的说，在 不存在四环素( t c ) 时，t e t 抑制子在控制t e t a 表达的启动子内与把f 操纵子结合。 t e t a 蛋白是位于细胞膜上的双向转运体，可以将四环素运出细胞。抗体与t e t r 抑制子的结合降低了把f d 结合位点的亲和性，使上游的t e t a 表达开始，从而就 可将四环素运出细胞。t e t r ，t e t o 和诱导子的相互作用被广泛研究，其中的过程 已经在分子生物学中被很好的描述。 与上述大肠杆菌的原核生物的基因相比，真核生物基因表达的调节的不同在 于真核基因般都是处在一个沉寂态。因此，一般来说，在其基因被表达之前， 还需要一定的机制来激活它。利用这一点，很多工程化基因表达系统发展了诸如 酵母双杂交技术来探测蛋白与蛋白之间的相互作用。双杂交技术( 图1 6 ) 的理 论在于，g a l 4 具有可以从含有g a l 4 上游激活序列( u a s g ) 的启动子上激活基因 能表达的能力。然而，除了在一个蛋白( g a l 4 ) 上具有d n a 结合域( b d ) 和激 活域( a d ) 之外，编码这两个域的d n a 顺序还与两种不同蛋白质的序列融合在 一起。因此，细胞会表达两种杂交蛋白，一种叫诱饵，它包含g a l 4b d ，另一种 则叫做猎物，包含a d 。因为诱饵包含b d ，它会与u a s g 结合，但是不会激活 转录，因为这种杂合蛋白缺少俘获转录因子到启动子上的能力。然而，如果诱饵 可以与猎物结合，则两种杂合蛋白的结合可以使含有a d 的猎物被带到启动子的 附近，从而通过促进转录因子的整合来激活转录。换句话说，转录仅在两种蛋白 相互作用时发生，转录的水平取决于两种蛋白相互作用的强度。双杂交表达系统 的成功说明了转录调控中的一个重要原则。g a l 4 种的激活和结合域所占的序列 仅仅占到原来的g a l 4 基因的序列的1 0 长度。就是说，对整段长度的g a l 4 基因 的蛋白质产物作为转录激括子也没有一点特别的。转录的激活看起来仅仅需要激 活域被启动子俘获到其附近即可。根据这个思想，人们又设计了不少工程化的双 杂交系统，例如s h i m i z u s a t o 等人提出的光敏表达系统【1 8 1o 除了酵母体系外，在 哺乳动物体系等较为高等的真核基因表达中也存在不少这样的双稳开关。 第章基因体系中的随机性和介观动力学简介 a 猎物 诱饵和猎物不相互作用诱饵和猎物相巨作用 图1 6 ：基本的酵母双杂交体系。在g a l 4 基因中的激活域( a d ) 和d n a 结合域( b d ) 中的 序列与两个不同的蛋白质编码序列融合，分配给两个不同的杂交蛋白，诱饵和猎物。诱饵蛋 白在g a l 4u a s 位置上与d n a 结合。如果诱饵和猎物可以相互结合，则a d 与猎物的融合 可以将转录的因子结合到启动予上，那么指示基因的表达就可以被探测到。 大部分的双稳开关所代表的系统一般只包含单个调节启动子，但实际上一般 的系统都是小网络，其中的调节启动子从由转录因子和它们的诱导子组成的生化 反应网络中接收输入。这些网络的功能相对简单，诱导子通过上或下调控转录 因子蛋白的活性来操纵转录。因为其简单性，最好还是将这些系统归类为输入 输出模块，或者调节模体，而不是网络。输入输出模块或者调节模体也可以被 用来作为更复杂调控的基因表达回路的基本单元。这方面的系统比较多，这里主 要讨论两种：细菌的拨动开关和环状振子。复杂系统的行为可以通过组合这些简 单元件来得到。 拨动开关首先是由g a r d n e r 等人构造出来的引，他们将两个抑制性启动子模 体组合起来，其中一个启动子的表达能抑制另一个启动子的表达。它构造在高拷 贝数的质粒上( c o l e i 复制起始点) ，使用l a c r 和t e t r 抑制子( p i k e ) 或者l a c r 和x c i 抑制子( p t a k ) ( 图1 7a ) 。t e t r 或者c ，基因是从l a c r 抑制性启动子( p 。2 ) 上被表达的，l a c i 基因是从p l t e t o 1 启动子( p t a k 拨动) 或者从由九c i 抑制的改进 的j p i 启动子( p i k e ) 上被表达的。在p t a k 系统中使用的c ，基因是- , c o 变异版 本，叫做c i 8 5 7 ，它产生一种在温度上升时失活的九抑制蛋白。i p t g 或a t e ( p i k e 系统) 以及有关i p t g 或高温( p t a k 系统) 的瞬时跳动可以产生各态之间鲁棒的 转换。图1 7b 中就说明了一种拨动的变体，p t a k l l 7 中的i p t g 的污导作用。 实验开始的时候，通过是细胞在上升的温度下生长或者在i p t g 的存在下分别得 到了l a c r 态( 低荧光强度) 和x c i 态( 高荧光强度) 。这些态当i p t g 被去除后 或者温度降低后还是稳定的。当i p t g 被加入细胞后，它能在一个高水平表达 l a c rf 图1 7b 1 ，则低荧光在一个临界点突然增加，对应于一个鞍点分岔。这种 转变可以与一种i p t g 诱导的开关( p t