（茶学专业论文）两种非水相环境下芳香醇基葡萄糖苷的生物合成及其应用.pdf

摘要 糖苷类化合物是植物在生长发育过程中形成的次级代谢产物，是水果、鲜花 以及许多经济作物如茶叶和烟草等的香气源。在这些植物组织中，挥发性气味物 质以键合态糖苷的形式合成并积累下来，并在失水、离体、机械损伤、病虫侵染 等特定条件下，糖苷键被水解并释放出苷元，表现出气味、抗病虫等生命特征。 糖苷的合成和应用研究在化工、食品、农业和医药等领域都广受关注。化学 合成糖苷化合物技术相对成熟，但是由于反应过程中需要进行糖羟基的保护与脱 保护，步骤繁琐，而且容易产生化学残留，应用范围受到很大限制。酶法合成糖 苷化合物反应条件温和、选择性高并可直接以非保护的游离糖作为底物，近年来 引起人们广泛关注。 本文以苦杏仁苷酶为生物催化剂，在非水相有机溶剂体系下探讨了芳香醇基 葡萄糖苷和脂肪族醇葡萄糖苷的生物合成，并对合成产物进行分离纯化和鉴定； 比较了在非水相体系下的有机溶剂介质和无介质系统中，芳香醇基葡萄糖苷生物 合成产率的差异；研究了有机溶剂种类以及体系的含水量对酶促合成糖苷的影 响；采用蚕丝素蛋白膜为载体，对苦杏仁苷酶进行了固定化，研究了固定化苦杏 仁苷酶的水解和合成活性；探索了芳香族醇和芳香醇基葡萄糖苷对茶云纹叶枯病 致病菌生长的抑制作用。 研究结果表明，微水无介质环境下合成糖苷的产率为6 0 0 , 6 ，显著高于微水相 有机溶剂环境下的合成反应；在含有机溶剂的非水体系中，含8 0 - 氧六环以及 含9 0 乙腈的体系酶促糖苷产率比较接近，分别为1 8 和1 4 5 ；而含1 0 d m s o 的反应体系相对较低，为7 8 ；而含9 0 d m s o 和5 0 d m s o 的反应体系均未 能合成糖苷；将苦杏仁苷酶固定到蚕丝素蛋白膜载体上后，固定化的苦杏仁苷酶 具有p 一葡萄糖苷酶的水解活性，但不具有p 一葡萄糖苷合成酶活性。 苯甲醇和苯乙醇对茶云纹叶枯病致病菌都具有明显的抑制作用，其中，苯乙 醇的抑制作用较好，e c s o 为0 7 1 灿m l ，u i c 为1 8 t t l m l ；而苯甲醇的抑制作用 相对较弱，e c 5 0 为0 7 2 p l m l ，1 4 i c 为2 4 i 灿l n l 。苯甲醇基d 葡萄糖苷在浓度 5 - 4 0 m g m l 之间，对茶云纹叶枯病致病菌表现出明显的抑菌活性。 关键词：糖苷，非水相，酶促合成，抑菌 a b s t r a c t g l y c o s i d e sa r es e c o n d a r ym c t a b o l i t e si np l a n t sd u r i n gg r o w t ha n ds e l v e a st h e p o t e n t i a la r o m as o u r c oo ff r u i t , f l o w e r s ，a n ds o m ee c o n o m i cc r o p ss u c ha st e aa n d t o b a c c o v o l a t i l ec o m p o u n d si np l a n t sa r eo f t e ns y n t h e s i z e da n da c c u m u l a t e da s g l y c o s i d i c a l l yb o u n dc o m p o n e n t s t h ea g l y c o n e sw i l lr e l e a s e df r o mt i l e i rr e s p e c t i v e g l y c o s i d e sb ye n z y m a t i ch y d r o l y s i sw h e nt h ep l a n t sa r es u f f e r i n gw a t e rd e f i c i ts t r e s s ， p l u c k i n g , t i s s u ed a m a g e ，m a l a d yi n f e c t i o na n ds oo n ，a n ds e r v e d a sa r o m a c o m p o n e n t sa n da n t i f u n g a ls u b s t a n c e r e s e a r c h e so nt h es y n t h e s i sa n da p p l i c a t i o no fg l y c o s i d e sa r eg e t t i n gm o r ea n d m o r ea t t r a c t i o ni nb r o a df i e l d s ，s u c ha sc h e m i c a li n d u s t r y , f o o di n d u s t r y , a g r i c u l t u r e a n dm e d i c i n e t h et e c h n o l o g yo fc h e m i c a ls y n t h e s i si sr e m a r k a b l yd e v e l o p e d ，b u tt h e a p p l i c a t i o ni sg r e a t l yr e s t r i c t e db e c a u s eas e r i e so fs t e p ss u c ha sp r o t e c t i o na n d d e - p r o t e c t i o na r en e e d e dd u r i n gt h es y n t h e s i sp r o c e s s ，a n dt h ep r o b l e mo fc h e m i c a l r e s i d u ei sa l s oo n eo ft h ed i s a d v a n t a g e so fc h e m i c a ls y n t h e s i s r e c e n t l y , s t u d yo n e n z y m a t i cs y n t h e s i si sg e t t i n gp o p u l a rb e c a u s eo fi t sm i l dr e a c t i o nc o n d i t i o n sa n d 1 l i g hs e l e c t i v i t y b e s i d e s u n p r o t e c t e da n df r e eg l u c o s ec a nb et r e a t e da ss u b s t r a t e d i r e c t l yi nt h ep r o c e s so f e n z y m a t i cs y n t h e s i s a r y la l c o h o l i cg l u e o s i d e so fb e n z y ia l c o h o l ，2 - p h e n y l e t h a n o la n d ( z ) 一3 - h e x e n o l w e r eb i o s y n t h e s i z e du s i n ga l m o n dp - g l u c o s i d a s ei nn o n - a q u e o u sm e d i a t h e r e s u l t i n g p r o d u c t sw e r ep r e l i m i n a r i l yp u r i f i e da n di d e n t i f i e db yl c - m s a sar e s u l t ，t h ey i e l d s o fp - d - g l u c o s i d e sb e t w e e nw a t e r - o r g a n i ct w op h a s e ss y s t e ma n dn o n - o r g a n i cm e d i a a r ec o m p a r e d b o t ht h et w ok i n d so fo r g a n i cs o l v e n t sa n dt h ew a t e rc o n t e n ti n r e a c t i o ns y s t e mh a v ee f f e c t so ne n z y m a t i cs y n t h e s i si nu o n - a q u e o u sm e d i a u s i n gs i l k p r o t e i na st h em a t r i x ，a l m o n dp g l u c o s i d a s ew a si m m o b i l i z e df o rt h es y n t h e s i so f 1 3 - d - g l y c o s i d e s ，a n dt h ee l l z y l l l ea c t i v i t yw a sd e t e c t e d t h er e s u l t i n gf l - d - g l u e o s i d e s w e r ea p p l i e dt oe v a l u a t et h ep o s s i b i l i t i e so fi t si n h i b i t i o na g a i n s tc o l l e t o r i c h u m c a m e l l i a em a s s e i td e m o n s t r a t e dt h a tt h ey i e l d so f g l u c o s i d e si nm i c r o - a q u e o u sm e d i aw e r en o t a b l y h i g h e rt h a nt h a ti nw a t e r - o r g a n i ct w op h a s e ss y s t e m t h ey i e l d sw e f ec l o s ei nt h o s e t w on o n - a q u e o u ss y s t e m sw h i c hc o n t e n t8 0 d i o x a n ea n d9 0 a c e t o n i t r i l e y i e l d si n s y s t e mw i t h l 0 d m s ow e l er e l a t i v e l yl o w e ra n dt h ee n z y m a t i cs y n t h e s i sc a nn o tb e r e a l i z e di nt h et w or e a c t i o ns y s t e m sw h i c hi n c l u d e9 0 d m s oa n d5 0 d m s o a f t e ra l m o n d 3 - g l u c o s i d a s ew a si m m o b i l i z e do nt h es i l kp r o t e i nm a t r i x ，t h e h y d r o l y s i sa c t i v i t yo fa l m o n di j - g l u c o s i d a s er e m a i n e db u tt h es y n t h e t i ca c t i v i t y d i s a p p e a r e d b e n z y l a l c o h o la n d2 - p h e n y l e t h a n o le x h i b i t e d a n t i f u n g a l a c t i v i t i e s a g a i n s t c o l l e t o t r i c h u mc a m e l l i a em a s s e e o b v i o u s l y 2 - p h e n y l e t & a n o ls h o w e ds t r o n g e r a n t i f u n g a la c t i v i t yt h a nb e n z y la l c o h o lw i t ht h ee c s 0o f0 7 1l i i m i ，a n dam j n i m u m i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ( m i c ) o f1 8u u m l a sf o rb e n z y la l c o h o l ，t h ee c 5 0a n d m i cw e t 0o 7 2 帅la n d0 5 1 a l m lr e s p e c t i v e l y b e n z y l1 3 - g l u e o s i d ea l s oe x h i b i t e d a n t i f u n g a la c t i v i t i e so b v i o u s l yi nc o n c e n t r a t i o n sb e t w e e n5 m g m lt o4 0 m g m li n p d ac u l t u r em e d i u m k e yw o r d s ：g l u c o s i d e s ，n o n - a q u e o u s ，e n z y m a t i cs y n t h e s i s ，a n t i f u n g a l i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：掣 时间：2 7 年矿日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：二拉必 第一导师签名：c 塾堑兰 时间：z 伊一7年7 月孑日 时间：洳啼7 年6 旯舀日 一、文献综述 糖苷( g l y c o s i d e s ) 是指具有环状结构的醛糖或酮糖的半缩醛羟基上的氢被烷基 或芳基所取代的缩醛衍生物。广义上讲，是糖或糖的衍生物如氨基糖、糖醛酸等称为 糖基( a g l y c o n e ) 与另一非糖物质称为苷元或配基( a g l y c o s e 或g e n i n ) ，二者通过其 糖的端基碳原子连接而成的化合物，即所谓糖苷或叫做配糖体，如果配基部分是糖， 这样的糖苷一般称为低聚糖，或寡糖【1 】。苷的共性部分在糖的部分，而苷元部分几乎 包含各种类型的天然成分，性质也各异。糖苷的分类，可根据是否为生物体内原存在 的，还是次生的，分为原苷或次级苷；根据连接单糖的个数分为单糖苷、二糖苷等； 根据配糖体与糖环碳原子相连的原子类型可把糖苷化合物分为氧苷、氮苷、硫苷和碳 苷等，其中以氧苷最为常见，即配基是以氧原子与端基碳结合形成的糖苷；由o d 勾型 半缩醛羟基形成的糖苷称为0 【一糖苷；由p 一构型半缩醛羟基形成的糖苷成为b 一糖苷。 一般自然界中存在的糖苷多为b 一糖苷。 1 1 生物体内的糖苷化合物 二十世纪八十年代以来，对植物中糖苷类香料前驱体的研究日益加深，已发现糖 苷在葡萄、非洲芒果、西红柿、杏、桃、黄梅、风梨、香蕉、茶叶、胡椒等植物中是 重要挥发性芳香化合物的前驱体。目前大约有5 0 属的1 7 0 种植物中存在的糖苷类化 合物已被检t 2 1 。 糖苷化合物是植物体内的次级代谢产物，植物的叶、籽粒和树皮中存在有数目众 多的糖苷。在叶子中通过生物合成作用生成糖苷键合态的芳香物质前体，然后输送到 花中，花开放时通过植物体内源酶的水解作用而释放出各种芳香物质组分。由于糖苷 组分的不同和含量的差异，会形成各具特色的各种水果及蔬菜香气。因此，这类糖苷 是水果等植物组织中部分挥发性香味化合物的前驱体。 早期的研究就曾发现茶叶中糖苷化合物对茶叶的色、香、味有重要影响。目前已 经发现的茶叶里重要的糖苷化合物主要有脂肪醇糖苷、芳香醇糖苷、肌醇糖苷、酚化 苷、萜烯醇苷、茶皂苷等。糖苷类物质是茶树在生长发育过程中形成的次级代谢产物， 茶鲜叶在采摘、水分亏缺、叶片损伤或病虫害侵染等胁迫环境下，糖苷类物质容易酶 解释放出苷元。以单萜烯醇和芳香族醇苷元为主的糖苷类物质水解后，配基呈现出花 果香，是构成茶叶香气品质的物质基础【3 1 。g r e e n 等【4 】发现，烟草中的非挥发香气前 体以糖苷形式存在，通过水解，能够释放出一些香气物质，如3 一羟基二氢大马酮和 3 - - 酮基紫罗兰酮。 除了作为香气前体物质存在以外，不少糖苷经过糖苷酶的水解，能产生消毒剂( 如 苯酚) 和毒性物质( 如氢氰酸) ，植物体遭受损伤时，能籍此保护受伤部分，避免微生物 的侵入。比如树皮中常含有苯酚糖苷，籽粒中常含有扁桃苷，前者能产生苯酚，后者能 产生氢氰酸。糖苷也具有储存糖的功能，特别是在籽粒中，在生长的一定阶段能随需要 而释放1 5 j 。许多高等植物的花朵和果实呈现的鲜红、绯红、紫、紫红以及蓝色等大多 数是由某些深色的植物色素花色苷【6 】所引起的。花色苷是糖苷化合物，存在于花 色昔里的糖可以是葡萄糖、乳糖、鼠李糖、木糖或阿拉伯糖等。其主要功能是为植物 提供花果颜色，在绿叶衬托下，引诱昆虫和动物为其传授花粉和散播种子。从植物体 中提取的花色苷已广泛用于食品工业。 中草药中有许多有效成份属糖苷化合物。苦杏仁之所以能止咳是由于它有一种有 效成份苦杏仁苷 _ ”，它是一种羟腈化合物( 旷羟基苯乙腈) 的羟基与一种糖的苷 羟基缩合而成的糖苷。甘草之所以有抑制溃疡作用也是因为甘草中含有甘草苷。天麻 是著名中药，天麻针剂临床上用来治疗偏头痛、美尼尔氏综合症和阗痫病，对天麻有 效成份研究表明，天麻苷是天麻中的主要成份，也是有效成份【8 】。熊果苷是从植物中 分离得到的一种成份，据报道具有低毒性镇咳、利尿、抗菌和尿道消毒作用等生物活 性，由于熊果苷水溶性好，便于机体吸收，有希望成为临床的新型镇咳鲥们。中药 桔梗被用作镇咳祛痰剂，从桔梗中分离得到的桔梗皂苷，具有镇痛、退热以及镇咳作 用。人参自古以来就作为长寿以及治疗百病的珍贵药材，现代医学证明，人参中主要 成分是人参皂苷，目前已分离鉴定的人参皂苷达4 0 多种，各种人参皂苷都有其独特的 药物疗效，其中人参皂苷r h 2 在低浓度下能改变癌细胞的性质，使其向正常细胞转化， 高浓度下则能杀灭癌细胞【”，1 1 】。研究表明大豆皂苷具有多种生理活性和药理作用，如 抗癌、调节免疫功能、防治心血管疾病、降血压、抗菌、抗病毒、降低血清胆固醇含 量以及抗血栓等作用。洋地黄叶及其它强心性生药的有效成份为甾体糖苷【1 2 】，蟾蜍的 皮肤分泌物中也含有类似物质。黄芩根具有抗菌作用，可用作清热解毒类药，其有效成 分为黄芩苷。甘草甜素在体外能抑制痘苗、n d v 、h s v - 1 等病毒增殖，用它治疗慢性 迁延性肝炎取得了满意效果。水仙苷( n a r c i s s i n ) 能抑制淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒【1 3 】。 金叶树苷( m o n e n s i n ) 贝) j 能通过影响糖蛋白的合成、转录和成熟，使单疮和口疤炎病毒 的释放受阻、病毒颗粒减少。 在一些微生物的代谢物中，人们也发现了许多糖苷类化合物。如具有抗肿瘤活性 的3 - d e a z a u r i d i n e 及1 ，3 - d i d e a z a u r i d i n e ，具有杀菌活性的f o r m y c i n ，l a u r s m 以及心血管药 物如c g b c o s y l f l a v o n o i d s 中的葛根素。而一些植物生长激素物质也是糖苷化合物，比 如细胞分裂素一玉米素的活性部分就是玉米素苷。赤霉素中也有以糖苷形式存在的 g a 14 1 。 植物体内的一些糖苷类化合物还是其抵御害虫侵食的化学防御物质。以糖苷类香 气前体为互利素的植物一害虫一天敌食物链化学通讯机制，一直以来是生态学家们感兴 2 趣的课题之一。许宁等人( 1 9 9 8 ) 【l5 】以茶树一茶尺蠖一单白绵茧蜂三级营养关系为模式， 从寄主选择行为和茶树一茶尺蠖交互作用的角度，探讨了茶树借助天敌绵茧蜂间接防 御茶尺蠖为害的机制。茶尺蠖取食茶树后，口腔分泌物( 含b 一葡萄糖苷酶) 作用于 损伤部位，致使茶树释放出与新梢完全不同的挥发物，从而强化了天敌昆虫的寄生效 率，减轻了茶树的受害程度。此后，韩宝瑜( 1 9 9 9 ) 【1 6 】又将这一研究进一步延伸到茶 树一茶蚜一蚜茧蜂三级营养的化学通讯机制中。 此外，许多糖苷是用来研究相关糖苷酶的基质。例如对硝基苯苷( p n p g ) 和2 ， 4 一二硝基苯苷( d n p g l y ) 就是研究糖苷酶的水解和动力学原理的底物【1 。n 。若将它们 修饰以合适的脂类、磷脂蛋白也能使我们拓展有关糖分子的行为和物化性能的知识。 1 2 糖苷酶催化合成糖苷的研究 1 2 1 糖苷合成的研究进展 随着全球能源的日益耗竭，碳水化合物作为一种可再生资源有望成为解决人类能 源危机的能源之一。其中，对糖类衍生物的研究尤其引人注目，包括对自然界中存在 的天然产物的分离和提纯，新物质的合成以及各种可生物降解的新型材料的开发等。 烷基糖苷是一种新型的无公害非离子表面活性剂【1 8 】，因具有许多优良性质，受到 洗涤业、化妆业、食品加工业以及制药业等众多领域的特殊青睐。国内外在烷基糖苷 的合成方面研究取得的进展也比较多。作为一种医药中间体和抗癌药物，大多数芳香 苷从生物体内提取，但是由于从生物体内提取糖苷化合物含量比较低，而且往往是混 合糖苷，分离纯化较为困难，不适用于工业化生产。鉴于此，使得人们开始将注意力 转移到人工合成的途径上来。 1 9 0 1 年，k o e n i g s 1 9 等最先以银盐为催化剂在酸性条件下合成芳基和烷基2 种糖 苷。该法后来被称为k o e i n g k n o r r 法，是一种沿用至今的合成糖苷经典方法【2 0 】，但其 缺点在于反应过程中卤代糖基不稳定以及使用了价格昂贵的重金属盐( 主要是银盐和 汞盐) 。 但此方法不但产率低而且金属盐对环境与人体危害严重，因而几乎不再采用，后 来在此基础上不断有人开发出新的合成方法。化学合成的劣势在于，反应过程中需要 进行糖羟基的保护与脱保护，步骤繁琐，而且容易产生化学残留，应用范围受到很大 限制。酶法合成糖苷化合物反应条件温和、选择性高并可直接以非保护的糖作为底物， 近年来引起人们广泛关注。而且利用固定化技术，可以设计生物反应器，提高酶促合 成得率和效率，降低生产成本，便于工业化生产。 日本有用蔗糖磷酸化酶生物合成简单儿茶素和酯型儿茶素葡萄糖苷的报道，但合 成的都为o 一型葡萄糖苷，不易被植物内源糖苷酶水解【2 1 - 2 3 。1 9 9 6 年，n o g u c h i 2 4 】等 以s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 的铲糖苷酶( e c3 2 1 2 0 ) 作催化剂，麦芽糖作糖苷载 体，在柠檬酸盐一磷酸盐缓冲溶液中合成了卜薄荷醇一a d - 吡喃葡萄糖苷，产率4 5 。 i g o r j e r k o v i e 和j o s i pm a s t e l i c ( 2 0 0 4 ) 用苦杏仁苷酶催化合成了苯甲醇、苯乙醇基葡 萄糖苷并进行了结构鉴定【2 5 】。 1 2 2 常用糖苷酶的来源及活性 生物体内存在两类分别催化糖苷的合成与分解的酶。一类是在合成代谢过程中起 作用的糖基转移酶( g l y c o s y lt r a n s f e r a s e s ，e c2 4 ) ，另一类是在分解代谢过程中起作 用的糖苷水解酶，简称糖苷酶( g l y c o s i d a s e s ，e c3 2 1 ) 。在自然界中，天然糖和糖苷 多由各种糖基转移酶使用糖核苷酸等底物合成，该过程需要a t p 水解来供能。这些酶 只负责糖基的转移，而不会引起底物或产物的水解，是理想的催化剂。但是由于反应 所需要的活性糖苷中间体十分昂贵，需要辅酶的参与，同时酶容易失活，一般不接受 非天然底物，导致其应用的成本高、难度大。目前工业化应用较多的主要有妒葡萄 糖基转移酶、d 一葡萄糖基转移酶、果糖基转移酶等。相比较而言【2 ”，糖苷酶能催化 合成端基异构纯的糖苷。在体内，它们催化糖苷水解；在体外，它们可催化糖苷逆水 解( 热力学控制) 或转糖苷化( 动力学控制) 合成糖苷，所需的酶容易获得且不昂贵， 并且能以廉价的单糖或聚糖为原料，也不需要辅酶的参与，更适合用于工业化生产。 虽然反应中会伴有底物或产物的水解，但通过对酶源的适当筛选以及对反应条件的优 化，反应的选择性会大大提高【2 ”。 糖苷酶是一大类催化糖苷键水解的酶，在自然界普遍存在，有的来源于细菌、放 线菌、霉菌，也有来源于杏仁、大豆、动物脏器等【2 引。1 3 葡萄糖苷酶 ( 1 3 g l u c o s i d a s e 。e c 3 2 1 2 1 ) 分布非常广泛，特别在植物的种子和微生物里尤为普遍。 l i e b i ga n dw b t d 一2 9 1 首次在苦杏仁汁中发现该酶。苦杏仁p 葡萄糖苷酶也成为p - 葡萄 糖苷酶的经典来源，另外常用的也有来自微生物如黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 的b 一 葡萄糖苷酶。 d u e r e t 掣3 哪通过大量实验，比较了十三种来源于微生物的糖苷酶和从杏仁中提取 出的1 3 一糖苷酶在辛基糖苷合成中的催化效果，结果表明杏仁d 一葡萄糖苷酶的活性虽然 并不是最高的，但由于其活性不会被糖所抑制，因此最适用于以葡萄糖为原料的聚合 反应。然而在转糖基化反应中，由泰国红木中提取的b 一葡萄糖苷酣3 1 】的活性优于杏 仁1 3 一糖苷酶，产率最高可以达到9 0 9 6 。上述酶的高催化活性仅适用于伯醇的糖苷化， 对于仲醇糖苷化的活性就有大幅度下降，而对于叔醇根本不具备反应活性。s v a s t i 等 【3 2 】从木薯中提取了一种d 一葡萄糖苷酶，其催化仲醇转糖基化反应的产率接近1 0 0 ， 大大超过了前述的两种酶；经过一系列反应条件的优化，其催化c 5 、c 6 叔醇转糖基 化的产率分别达到了8 2 和5 6 ，此酶的不足之处在于其需要以芳基糖苷为底物，而 不能以单糖或二糖为底物。 4 1 2 3 非水相催化反应中影响酶活性的主要因素 酶在非水介质中进行的催化作用称为非水相催化( e n z y m ec a t a l y s i si nl i o na q u e o u s p h a s e ) 1 9 8 4 年，美国麻省理工学院z a k sa 和k l i b a n o va m 等人成功地实现了猪 胰脂肪酶在9 鲋的有机溶剂中催化三丁酸甘油酯和醇之间的转酯反应，并证实了酶在 1 0 0 高温下，不仅能够在有机溶剂中保持稳定，而且酶还显示出很高的催化转酯活 力。酶在微水或几乎无水的不同有机溶剂中表现出不同的立体选择性和稳定性【3 3 1 ，这 一研究结果开辟了酶工程领域中新的研究方向非水酶学。 2 0 世纪8 0 年代以来，国外科学家通过大量的研究总结出了有机介质中的酶催化 反应具有如下优点 3 4 1 ：( 1 ) 大多数有机底物在有机溶剂中有较大的溶解度；( 2 ) 在非水 介质中酶的热稳定性与储存稳定性比在水中明显提高；( 3 ) 使许多热力学平衡反应由 加水分解转化为其逆反应过程；( 4 ) 能抑制因水而产生的副反应；( 5 ) 酶与介质不相溶， 易于回收；( 6 ) 从低沸点的溶剂中分离纯产物比从水中分离更方便；( 7 ) 无微生物污染。 由于酶在非水介质中反应具有水溶液介质中酶促反应无法比拟的优点，人们对非 水溶液的酶催化反应研究也就越来越感兴趣，此后不断有新的研究成果报道，其中比 较有代表性的酶催化反应有f ”】：脂肪酶粗提物在非极性有机溶剂完成的酯合成、肽合 成和大环内酯合成；蛋白酶在乙酸乙酯和戊醇里的肽合成反应；固定化多酚氧化酶在 氯仿中将酚氧化为喹咛等。因而非水介质酶催化反应的研究也日显重要。 以苦杏仁苷酶作为生物催化剂，i g o rj e r k o v i c 和j o s i pm a s t e l i c 在含微水的水一乙 腈反应体系中，合成了芳香醇基b 一葡萄糖苷，并进行了结构鉴定【2 5 1 。 1 2 3 1 水对酶活性的影响 传统酶学认为酶在水溶液中以一定构象存在，和蛋白质的结构一样。整个分子有 相对刚性和柔性的两部分，其活性部位保持一定的柔性是酶表现其催化活性的关键。 酶的催化反应是在环绕着酶分子表面的水层内进行的。当有机溶剂中含水量低于最适 含水量时酶构象过于“刚性”而失去催化活性；含水量高于最适水量时，酶结构的柔 性过大，酶的构象将向疏水环境下热力学稳定的状态变化，引起酶结构的改变和失活； 只有在最适水量时蛋白质结构的动力学刚性( k i n e t i cr i g i d i t y ) 和热力学稳定性 ( t h e r m o d y n a m i cs t a b i l i t y ) 之间达到最佳平衡点，酶表现出最大活力。因此，最适水 量是保证酶表现活力所必需的，即“必需水”( e s s e n t i a lw a t e r ) ，只要这层“必需水” 不丢失，其他大部分水即使为有机溶剂所替代，酶的催化活性仍然维持。 水的含量、浓度和活度都可用来作为描述水对酶催化行为的影响参数。当水加入 到非水酶催化的反应体系中时，反应系统的含水量分布在酶、溶剂、固定化载体及杂 质中。对不同的酶来说，在有机溶剂中催化反应所必需的水量有很大差异。为了排除 溶剂对最适含水量的影响，h a i l i n g 建议用反应系统的热力学水活度( t h e r m o d y n a m i c a c t i v i t yo f w a t e r , 口。) 来描述有机溶剂中酶催化活力与含水量的关系。口。表示e t n 了 5 催化剂周围含水层中水的浓度大小，而不是整个体系的含水量大小。维持酶蛋白分子 结构的几种非共价相互作用( 静电引力、范德华力、氢键和疏水问作用力) 都与水有关， 因而在反应中控制水活度很重要。 目前，关于控制水活度的方法以用盐盐水合物控制的报道较多。h a i l i n g 等指出 用盐盐水合物控制水活度的两种方法：一种是将酶及底物分别与盐的饱和水溶液混 合，得到一水活度，再将两者混合得等水活度的体系p 6 】；另一种是在体系中直接加盐 盐水合物，而在一定的温度、压力条件下获得一水活度【3 ”。 各种酶因为结构不同，维持酶具有活性的构象所必需的水量也不同。大部分酶需 要比较高的水活度才能表现出较好的活性。例如d 葡萄糖苷酶和酪氨酸酶需要超过 o 7 的水活度才能测出催化活性。杏仁b 一葡萄糖苷酶对于c 3 醇需要的最小水活度 ( ) 范围为0 4 至0 5 ，对卜辛醇、乙腈与叔丁醇则水含量要求较高，最小水活度 为0 8 1 3 s 。 1 2 3 2 有机溶剂对酶活性的影响 酶在不同的有机溶剂中活性差别很大，酶活性与溶剂的属性之间可能存在着某种 定量的关系。为了衡量酶与有机溶剂分子兼容性，以寻找能使酶发挥最高活性的有机 溶剂，人们提出了多种表达溶剂性质的参数，如h i l d e b r a n d t 溶解度参数、介电常数、 偶极距等，但最常用和最可靠的方法是用分配系数的对数值l 妒。 表1 1 常用有机溶剂的l g p 值 t a b l e1 - 1l g pv a l u eo f u s u a lo r g a n i cs o l v e n t s l g p 是描述有机溶剂极性大小的参数，p 值是溶剂在正辛醇和水中的分配系数比， l g p 越大，溶剂的疏水性越强。常用有机溶剂的l g p 值见表1 - 1 。可以看出，常用有机溶 剂如d m s o 、d m f 、丙酮、低级醇等溶剂的l 妒值小，能与水互溶。而与水不互溶的 亲脂性溶剂如烷类、醚、芳香族化合物、卤代烃等则l g p 较大【3 9 1 。溶剂极性对酶活性 的影响见表1 2 。 6 囊卜2溶剂与酶活性的兼容性 t a b l e1 - 2c o m p a t i b i l i t yb c t w l ls o l v e n t sa n de n z y m a t i ca c t i v i t y 从表1 2 可以看出，l g e 值介于中间值( o 3 ) 的溶剂不宜作为酶催化反应的非水 介质溶剂。在这些溶剂中，除极少数特别稳定的酶如枯草杆菌蛋白酶外，绝大多数酶 都会失活。一般认为，酶在疏水性大的介质中反应活性高。许多实验都符合这一规律， 例如胰凝乳蛋白酶的活性随溶剂的疏水性减弱而明显降低，它在辛烷中的反应速度比 在吡啶中快1 0 4 倍。但是也有不完全符合i a a n d 4 0 等提出的酶活性与l g p 的关系，因此 酶活性可能也与溶剂的其他一些性质有关。 除了与有机溶剂的种类有关以外，溶剂对酶稳定性的影响也与有机溶剂在反应 介质中的浓度有关。研究 4 q 发现：杏仁b _ 葡萄糖苷酶在4 0 c ，9 0 $ 丙酮水溶液或叔丁 醇水溶液( a w = 0 8 ) 较稳定，几天后仍能保持活力；当溶剂体积百分比大于6 0 9 6 ， 以乙腈、丙酮和叔丁醇分别作为介质时，2 4h 后酶的残余活力分别为7 5 、9 0 0 5 和9 4 ； 而在二甲基甲酰胺及二甲基亚枫的介质中酶几乎丧失了所有的活力。相同条件下，溶 剂的体积百分比为3 0 9 6 时，结果恰好相反，在乙睛、丙酮和叔丁醇中的酶很快失去活 力；而在二甲基甲酰胺及二甲基亚枫中的酶残余活力分别为6 6 和9 7 。与许多酶一样， 糖苷酶在两相体系中不稳定。如：来自只向r e s u s 的十分稳定的b 一葡萄糖苷酶在两相体 系中迅速失活。 有机溶剂对酶稳定性的影响和对合成反应的影响并不完全一致。尽管稳定性高， 酶的活力保持好，合成反应的产率应该更高，但许多研究事实却与此不符。在应用a _ 半乳糖苷酶合成抗生素糖苷化合物( 氯苯甘油醚和氯霉素) 的研列4 2 】中发现，酶在乙睛 中产量最高，但对酶活力保持最好的溶剂是二氧六环。提高酶在有机介质中的稳定性 对酶有机介质反应的发展前景至关重要。 1 2 3 3p h 对酶活性的影响 有机溶剂中进行酶催化反应也依赖于酶周围吸附水层( 必需水) 的p h 。酶分子活性 中心周围的离子基团只有在特定的酸碱度条件下才具有酶催化反应的最佳离子态，而 且此必需水的最佳p h 与在水溶液中反应时的最适p h 是一致的。 1 2 3 4 温度和酶浓度及其他因素对酶促反应的影响 7 影响酶催化反应的其他因素还包括反应温度和酶的浓度。适当提高反应温度可以 提高底物的溶解度，降低介质粘度，增加多相反应体系中各相的相容性，使反应容易 进行，然而过高的温度则会使得催化剂酶由于变性而失活，从而导致产物浓度和转化 率下降，所以一般理想的反应温度在4 0 一5 0 范围内【4 3 1 。同时温度对反应的影响也依 赖于介质的成分。例如，同样是b 一葡萄糖苷酶，在与己醇反应时，6 0 时的产率高于 3 7 的，而在与十二醇反应时，超过4 0 c 即失去反应活性。一方面酶浓度增加有利于 产物浓度和转化率的提高，另一方面，如果酶浓度过高，也会导致产物的水解加剧。 此外，处于溶剂中的酶预先达到的状态对其在溶剂中的稳定性也有显著的影响。 当酶预先处于“湿态”时，由于水的预先存在使酶分子构成其柔韧性的“开放”构象， 刚性降低，与“干态”酶相比，在有机溶剂中更易于受到破坏，产生热失活。 1 2 4 糖苷酶催化机理 在自然界中，糖苷水解反应的离去基团是一种寡糖，亲核试剂( 糖基受体) 是水， 但醇或单糖也可作为亲核试剂取代水，这就为这类酶由水解作用转而用于合成提供了 可能。酶催化糖苷化反应有两种，一种是受热力学控制的聚合反应，聚合反应即逆水 解反应，于1 9 1 3 年首次报道，是单糖与醇的缩合反应，其中水是离去基团。反应由热 力学控制，朝平衡方向进行，这一过程以游离单糖为底物，被称为“直接糖基化”和 或者“逆水解”( 见反应式( 1 ) ) 。另一种是受动力学控制的转糖基化反应，离去基团 通常是( 单) 糖基，而且反应受动力学控制，但是水作为竞争性亲核试剂会引起反应物 部分水解。 1 2 4 1 逆水解反应 逆水解反应受热力学控制，最终产率受平衡限制，由于反应的平衡常数偏向于水 解方向，因此必须通过热力学的方法促使反应向合成方向进行。通过加入高浓度的单 糖和亲核部分( 醇) 。可使反应向合成方向进行。当底物醇在5 0 为液体，能够与 1 0 札2 0 的水互溶，且不会对酶有强烈的抑制作用时，可采用无溶剂的体系；而当底 物醇数量有限或者在5 0 为固体时，可采用与水互溶性的有机溶剂溶解底物，并使反 应平衡有利于糖苷的合成1 4 4 。 反应原理见下图，以单糖为底物，以不同碳链的醇为亲核试剂，使醇糖直接聚合 生成糖苷，反应过程中水是离去基本团。 g b i c o s 仆o h + r 1o h ；! 些! 呈墅竺! = g h c o s o r l + h 2 0 反应式( 1 ) m a t t h e u s 掣4 5 】用苦杏仁p 一葡萄糖苷催化合成了甘油基葡萄糖苷，并通过优化反 应条件使糖的转化率达到5 4 ，产物浓度达到0 4 5 加m o l l 。由于逆水解反应直接采用 未活化的糖作为底物，且操作简单，因此受到了很高的重视。v i c d 、组【4 6 1 就利用逆水 解反应，使用苦杏仁糖苷酶在9 0 7 , 腈体系中催化合成了一系列糖苷，其中葡萄糖浓 8 度为o 1 9m o l l ，各种醇浓度为0 8 0m o l l ，质量浓度在l s g l 范围内 要想达到理想的平衡产率，可以提高反应物浓度或降低产物浓度。理论上底物糖 浓度的提高应有利于推动反应向右进行，而且可以提高产物浓度，但事实证明【4 ”，增 加糖浓度反而会使产物浓度和转化率均降低。产物浓度降低可能是因为糖的浓度过高 会对酶的活性起到抑制作用，而转化率的下降则是因为过高的糖浓度导致了副产物聚 糖的产生量加大。醇浓度的改变一般不会对酶活性有太大影响，所以通常都采用加入 过量醇的方法，醇的过量既可以推动反应向右进行，又可以作为反应介质。 理论上及时除去生成的水，使反应体系一直保持无水状态会使底物的转化率达到 1 0 0 ，所以化学合成方法中多采取减压或加入带水剂的方法使反应体系保持无水状 态。然而在纯有机介质中酶并不能表现出活性，反应时必须存在一定量的水来维持酶 的活性，但是水的存在确实会导致产物的水解，从而降低反应的产率【凋，这就产生了 矛盾。目前的解决方法主要是开发能在低口。下具有高催化活性的酶，或将其固定化以 保持其稳定性。 1 2 4 2 转糖基化反应 转糖基化反应是利用糖基转移酶把糖基供体上的糖基转移到受体醇上的过程( 见 反应式( 2 ) ) ，该反应的供糖基物质大多是蔗糖或乳糖，也有一些预先合成的具有活性 的糖基衍生物如芳基糖苷或乙烯基糖苷m 捌。反应受动力学控制，大多数糖苷酶都能 催化合成这种反应。典型的反应如：d 一半乳糖苷酶在丁醇中以乳糖为底物合成丁基半 乳糖苷，丁醇是转糖基反应的受体。 k o r l + r 2 0 h h 2 0 g l y c o s y i - o h + r 1o h g u c o s i d a s e 反应式 ( 2 ) 转糖苷化反应里与酶一糖苷中间体作用的亲核试剂是醇，而不再是水，而一般利 用的糖基供体，其糖基配体部分也具有适合转糖苷化反应的特性( 亲核性较弱) 。良 好的糖基供体包括：双糖、寡糖、糖基氟化物、糖基叠氮化合物、芳香基糖苷、乙烯 基糖苷和烷基糖苷。例如，葡萄吡喃糖甲基苷，能在铲d _ 半乳糖苷酶的存在下，被 旷矿半乳吡喃糖对硝基苯基苷糖基化，得到旷半乳糖基葡萄糖。与此类似，也能用 糖基转移酶及复杂的糖基磷酸酯( 如u d p 6 ) 来合成寡糖。 由于这种途径形成的产物糖苷同时又是酶水解作用的底物，因而要成功应用这一 途径合成糖苷，必须要注意几个关键点【5 1 1 ：首先转糖苷化必须比糖苷水解要快；其次， 产物水解速率比糖基供体的水解速率慢。在转糖苷反应过程中，当反应物耗尽，产物 9 内 如 + 盹 。 卅 仳 邺 叫j 4 唧 娜 咖 叫0l 卿 浓度达到最大，此时合成速率与水解速率相等，失去动力学控制。应当在热力学控制 的产物酶促水解之前停止反应。因此，转糖苷化反应的糖苷产率一方面是由供体合成 速率与水解速率之间的精细平衡所决定，另一方面是由产物水解来控制的。 尽管转糖苷化反应需要活化的糖苷作为糖基供体，但反应的产率高，因而也是一 种经常采用的方法。 1 2 4 3 逆水解反应和转糖苷化反应的比较 就反应速度而言，转糖苷化反应明显优于逆水解反应，逆水解反应几十个小时甚 至几天的产率只等同于转糖苷作用几个小时内的产率；但就副产物而言，转糖苷化反 应中一分子二糖参与反应的同时会放出一分子单糖，此单糖也可能被糖苷化，从而为 产物分离纯化带来