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中国科学技术大学硕士学位论文谷胱甘肽转移酶的分离纯化、荧光光谱以及外源物质对其活性影响研究 摘要 谷胱甘肽转移酶( g s t ) 是生物体中广泛存在的蛋白酶，其功能是催化谷胱甘肽 ( g s h ) 亲核性的巯基与亲电性底物结合，从而降低亲电性物质对生物机体的伤害。 从二十世纪七十年代发现谷胱甘肽转移酶至今，对它的研究不断深入，其在生物 体中的功能也不断被揭示，本文主要研究了谷胱甘肽转移酶的光谱学性质、分析 方法以及外化学物质对昆虫的谷胱甘肽转移酶的影响。全文共分五章，主要内容 如下： 第一章系统综述了谷胱甘肽转移酶研究进展，包括谷胱甘肽转移酶的分类、 解毒机理、结构、纯化、与昆虫抗药性的关系。 第二章通过亲核层析纯化分离了谷胱甘肽转移酶，分离后得到电泳纯产品， 考察了谷胱甘肽转移酶的荧光光谱学性质以及不同酸碱条件下荧光变化；通过荧 光性氨基酸荧光移动，揭示了其所处的微环境；初步研究了在不同物理处理条件 酶活性的变化。 第三章研究了谷胱甘肽转移酶活性测定方法，传统方法是测定催化产物的吸 光度，利用吸光度的变化来定义酶活性。本文尝试用电化学方法，机理与光度法 相似，但是以氯离子浓度变化来表示酶活性，氯离子浓度用氯离子选择性电极进 行测定。 第四章通过在食物中添) j n n 关化学药剂，研究了植物次生物质烟碱、柠檬酸 烟碱、芸香苷对斜纹夜蛾体内的谷胱甘肽转移酶活性的影响，并测定了相关处理 的斜纹夜蛾体内谷胱甘肽转移酶的普通荧光、同步荧光光谱，结果表明不同次生 物质对谷胱甘肽转移酶的影响不一样，有的具有诱导作用，有的具有抑制作用， 在分子行为上表现为色氨酸残基微环境极性变化。 第五章烟碱是烟草中含量较为丰富的次生代谢物，吸食烟草目的是获取烟 碱，本文从光谱学角度研究了烟碱对牛血清蛋白的影响，烟碱能够猝灭牛血清蛋 白荧光，通过荧光滴定法得到猝灭机理，猝灭常数。 中国科学技术大学硕士学位论文谷胱甘肽转移酶的分离纯化、荧光光谱以及外源物质对其活性影响研究 a b s t r a c t g s t sa r eau b i q u i t o u sf a m i l yo fp r o t e i n st h a tc a t a l y z et h en u c l e o p h i l i ca t t a c ko ft h e t h i o lg r o u po fg s h ( v g l u t a m y l c y s t e i n y l g l y c i n e ) t ot h ee l e c t r o p h i l i cs i t eo fal a r g e v a r i e t yo fs u b s t r a t e s f r o mw h i c hw a sf o u n d i n19 7 0 st on o w ，1 ef u n c t i o n so fg s tw a s u n c o v e r e dw i t ht h er e s e a r c hd e v e l o p i n g i nt h i sa r t i c l e ，w es t u d i e dg s t ss p e c t r o s c o p y a n da c t i v i t yc h a r a c t e rw h i c hi n f l u e n c e db ys e c o n ds u b s t a n c e t h e r ea r ef i v ec h a p t e r si n t h i sd i s s e r t a t i o n ，t h em a i nc o n t e n ti sa sf o l l o w ： t h ec h a p t e ris u m m a r i e dt h ep r o g r e s so fg s to nt h ec l a s s i f i c a t i o n 、c a t a l y t i c d e t o x i f e a t i o nm e c h a n i s m 、s t r u c t u r e 、s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n 、t h ea c t i o ni ni n s e c t r e s i s t a n c e t h ec h a p t e rl it oo b t a i ns i n g l eg s t ，a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yw a su s e dt op u r i f y g s tf r o mc r u d ep r o t e i n t h er e s u l ts h o w e dt h a to n l yo n ep r o t e i nb o n dw a sf o u n do n t h e1 2 p 0 1 y a c r y l j m i d eg e l t h ep u r i f i c a t i o nd e g r e em e e tt oe l e c t r o p h o r e t i cg r a d e f l u o r e s c e n c et i t r a t i o nw a se m p l o y e dt os t u d i e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np ha n d g s t ，t h r o u g hw h i c hw ec o u l di d e n t i f yt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao fg s t a n dt h es p e c t r a v a r i e t y w i t h a d d i n g a c i do r b a s e c o m p a r e d a r o m a t i ca m i n o a c i dr e s i d u e f l u o r e s c e n c es p e c t r ai ng s tw i t hd i s s o c i a t i v et ok n o wr e do rb l u es h i f to ft h e f l u o r e s c e n c ep e a k ，t ok n o wt h em i c r o e n v i r o m e n tc h a n g eo fa r o m a t i ca m i n o a c i d r e s i d u ei ne n z y m e p r i m a r yi n v e s t i g a t ew a sd o n et of i n dt h eg s ta c t i v i t yu n d e r d i f f e r e n tp h y s i c st r e a t i n g t h ec h a p t e ri i i s e a r c han e wm e t h o dt od e t e r m i n eg s t sa c t i v i t y t r a d i t i o n a lm e t h o d s s u c ha sp h o t o m e t r i ca n a l y s i sa n df l u o r o p h o t o m e t r i ca n a l y s i s ，t h e ya l ld e f i n et h eg s t a c t i v i t yb yv a r i a b i l i t yo fp r o d u c ta b s o r b a n c e i nt h i sp a p e r ，a t t e m p tae l e c t r o c h e m i c a l m e t h o d ，t h ep r i n c i p l ei sb a s e do nh a b i gsm e t h o d ，g s ta c t i v i t y w a sd e t e r m i n e d t h r o u g ht h ev a r i a b i l i t yo f c h l o r i d ei o nc o n c e n t r a t i o n ，w h i c hw a sd e t e c t e db yc h l o r i d ei o n s e l e c t i v ee l e c t r o d e t h ec h a p t e ri v t h ee f f e c t so ft h r e ep l a n ta l l e o c h e m i c a l sn i c o t i n e 、n i c o t i n ec i t r a t e , r u t i no nl a r v a ld e v e l o p m e n ta n dd e t o x i c a t i o ne n z y m ea c t i v i t yw e r ei n v e s t i g a t e dw i t h n e o n a t es p o d o p t e r al i t u r a ( f a b ) l a r v a e t h er e s u l ts h o w e dt h a ta l lt h r e ep l a n t a l l e o c h e m i c a l sa tt h r e ec o n c e n t r a t i o n ss i g n i f i c a n t l ye f f e c tl a r v a l t h ef l u o r e s c e n c ea n d s y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c es p e c t r aw a se m p l o y e dt os t u d yt h ee f f e c t so fa l l e o c h e m i c a l s tt 中国科学技术大学硕士学位论文谷胱e 问女转移酶的分离纯化、荧光光谱以及外源物质对其活性影响研究 o ng s tw h i c hw a sp u r i f i e dt h r o u g ha f f i n i t yc h r o m a t o g t a p h y ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h e c h a n g eo fg s t s u r f a c ea n dt h em i c r o e n v i r o m e n tc h a n g eo ft r y p t o p h a nr e s i d u ei n e n z y m e t h ec h a p t e rvn i c o t i n ei so n ea b u n d a n c eo fa l l e o i ：h e m i c a l si nt o b a c c o t h ea i mo f s m o k i n g i st og a i nn i c o t i n e i nt h i sa r t i c l e ，w es t u d yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nn i c o t i n ea n d b s ai ns p e c t r o s c o p ya n g l e n i c o t i n ec o u l dq u e n c ht h ef l u o r e s c e n c eo fb s a ，o b t a i n m e c h a n i s mo fq u e n c h i n gp r o c e s sa n dc o n t a n tb yf l u o r e s c e n c et i t r a t i o n 中国科学技术大学硕士学位论文谷胱甘肽转移酶的分离纯化、荧光光谱以及外源物质对其活性影响研究 第一章谷胱甘肽转移酶研究进展 1 1 引言 谷胱甘肽转移酶( g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e s ，g s t ) ( e c 2 5 1 1 8 ) 是一类 催化还原型谷胱甘肽( g l u t a t h i o n e ，g s h ) 与各种亲电化合物亲核加成反应的酶。 这类酶广泛存在于动物、植物、昆虫、酵母、真菌和各种细菌中。它们是一类在 外源化合物生物转化、药物代谢和保护免受过氧化作用损害中的一类极为重要的 多功能蛋白质【1 。 生物体内的谷胱甘肽转移酶与多种疾病的病因有重要的关系，德国k u h n l 2 峙艮 道谷胱甘肽转移酶u 基因缺陷与p d ( p a r k i n s o n p sd i s e a s e ) 相关，认为该酶基因 缺陷可能是p d 的一个危险因素。另外，一些学者发现谷胱甘肽转移酶( g s t ) 在代 谢外来化学物质、对抗r o s 损伤等方面起着重要作用，尤其是g s t 同工酶中的g s t u 活性最强口】。谷胱甘肽转移酶( g s t ) 的同功酶g s t m l 与环氧化物有高度结合活性， 能解除致突变原剂黄曲霉素的毒性【4 l ，因此，酶的活性与致癌物的解毒是化学致 癌问题上的主要因素。 g s t 催化g s t l 与其亲脂性的亲电化合物反应生成硫醚化合( t h i o e t h e r ) ，因此 这一过程称为s 一轭合( sc o n j u a t i o n ) 。这种代谢化合物比最初的化合物的毒性 低，但水溶性大。这步反应是硫醚氨酸途径的第一步，是最重要的解毒过程之一。 第二步y 谷氨酰基转移酶催化脱去谷氨酸，再经过一系列酶的催化形成硫醚氨酸 化合物。 近年来随着分子生物学的发展，首先对哺乳动物的细胞质g s t 进行了较为深 入的研究【5 1 6 】。在2 0 世纪7 0 年代初发现g s 也是昆虫体内杀虫剂的主要解毒酶之 一。一般认为g s t 在细胞免受活泼的亲电基团攻击方面起作用，g s t 催化g s h 对许 多外源或内源疏水分子的亲电中心的亲电攻击，g s t 的功能是在细胞内使诱变剂、 致癌剂【7 、重金属】、铝元素及其他类型的有毒化合物解毒。另外，g s t 具有 依赖g s h 的过氧化氢酶活力，保护机体免受内源的过氧化物的损害。 g s t 也是烷基化合物代谢中最重要的一个酶系。产生的谷胱甘肽s 轭合物可 通过膜a r p 依赖泵系统( m e m b r a n ea t pd e p e n d e n tp u m ps y s t e m s ) 从细胞内输送 出去，此后经巯基尿酸盐( m e r c a p t u r a t e ) 途径代谢这些轭合物，最后排出体外。 在对抗癌药物有抗性的肿瘤细胞和昆虫抗药性种群中发现g s 1 活性明显变化 j ，这说明它们的抗药性均与g s t 有关。 中国科学技术大学硕士学位论文谷胱甘肽转移酶的分离纯化、荧光光谱以及外源物质对其活性影响研究 g s t 在植物体中具有多种多样的功能，表现在以下几个方面f 1 2 】：( 1 ) 植物 中g s t 的主要功能在于解除外界毒素以及内源有毒代谢物的侵害，能催化还原型 谷胱甘肽( g l u t a t h i o n e ) 的巯基与多种亲电、亲脂底物的结合，生成水溶性的产 物，从而降低底物的毒性 1 3 , 1 4 , 1 5 】，这是g s t 最为典型的作用。( 2 ) 一些g s t 是非 催化载体，例如：其中的生长素、细胞分裂素载体在激素的稳定中起作用，花色 素苷载体在液泡花色素苷的汇集中起作用。玉米tg s t 基因突变体( a n 9 ) 不能在 液泡中储藏类黄素衍生色素，研究表明，g g t 涉及类黄素的细胞内结合和稳定， 而不是催化它们谷胱甘肽化 1 5 , 1 6 , 17 】。( 3 ) 具有过氧化物酶活性，能解除羟基过 氧化物( h y d r o x y p e r o x i d e ) 的毒性。该还原作用在阻止有机氢过氧化物降解成 细胞毒素的醛衍生物中起作关键作用 1 4 , 1 5 , 1 8 , 1 9 】。( 4 )还有些g s t 在细胞的氧化 还原稳态和调节细胞程序衰老方面起作用。来自于西红柿的一g s 能抑$ 4 b a x 蛋 白诱导的程序死亡，这是通过阻止氧化伤害的结果1 1 4 , 1 5 , 2 0 】。( 5 ) g s t 的也可作为 胁迫信号蛋白。西芹中被紫外光诱导的编码类黄酮生物合成酶的基因需要g s f i 和 特异的一g s t 的表达，表明g s t 也作为细胞信号在胁迫耐受方面起作用 1 4 , 15 , 2 1 】。 最近有研究表明g s t 对盐胁迫也有一定的防御功能g s t 也可能只充当植物外源 化学物质的载体而不扮演催化角色2 2 1 ( 6 ) g s t 在b 一酪氨酸( t y r ) 代谢中催化 异构化作用。 1 2 谷胱甘肽转移酶的分类 在几乎所有器官中发现的g s t 都是由一些数目不等的同工酶组成，它们具有 广泛的底物专一性。这些同工酶都是由双亚基组成的，两个亚基可以是同源 ( h o m o d i m e r s ) 、也可以是异源( h e t e r o d i m e r s ) 二聚体，亚基的分子量在1 7 2 8 k d a 之间。 目前了解最清楚的是哺乳动物谷胱甘肽转移酶，按照这些g s t 的蛋白质或基 因序列、底物特异性、对抑制剂的敏感性和免疫交叉反应等将它们分成五类o 【、 6 、u 、丌、0 。谷胱甘肽转移酶既可以是同源二聚体，也可以是异源二聚体， 至少有7 个亚基组成，可根据亚基对谷胱甘肽转移酶进行命名，j a k o b y w b 对大 鼠胞液g s t 进行了命名如下表l l ： ! 里型兰垫查查兰堡主兰些堡茎查些旦鉴堕堡堕塑坌堕丝些：篓堂垄堂坠墨丛塑塑堕翌茎堡壁墅堕型! 壅 亚基命名亚基命名 植物g s t 研究起步较晚，但对植物g s t 基因结构和外界因素对g s t 基因表 达的影响有了初步了解，植物体内谷胱甘肽转移酶能在还原型谷胱甘肽参与下代 谢多种除草剂 2 4 2 7 】，除草剂对谷胱甘肽转移酶有诱导作用网。根据g s t 基因核苷 酸序列或g s t 氨基酸序列为依据，将植物g s t 划分为3 类，分别定为ii i 和i 型，对不同的植物g s t 进行了归类 2 9 , 3 0 。另外也有人根据蛋白同源性和基因组织 结构，将植物g s t 分成五类，其中t 和士是植物特异性的i l 。 胞液g s tf 3 i j 有膜结合和胞液两种形式，胞液g s t s 为主，膜结合和胞液g s t 分别由不同的超基因家族编码，前者至少包含6 个基因，后者至少包含1 6 个基因， 胞液g s t 也是广泛存在于各种生物体内的由多个基因编码的、具有多种功能的一组 同工酶。依据酶活性、序列、基序和结构特征，膜结合g s t s ( 如微粒体g s t s ) 现归 于类花生酸类物质和谷胱甘肽代谢的膜相关蛋白一个新的超家族。胞液6 s t s 以同 或异二聚体形式存在，是多种生物体内的主要解毒系统，与许多生理及异源物质的 排泄有关，此外，它们还具有过氧化酶和异构酶的活性。目前哺乳动物胞液g s t 分 类清楚，非哺乳动物g s t s 定性不及哺乳动物，但得到了大量的三维结构，为研究整 个超家族结构与功能之间的关系提供了基础。根据氨基酸核苷酸序列、免疫、 动力学和三四级结构特征等不同标准，6 s t 分为不同型( 表) 口“，其中前五型是 胞液g s t s ，同型的亚单位间才可以形成同或异二聚体。 中国科学技术大学硕士学位论文谷胱甘肽转移酶的分离纯化、荧光光莆以及外源物质对其活性影响研究 拟g s t 的一些有用的分类标准 分类标准型别 一级结构比较 d 、u 、i f 、( ) 、o 、k 、 免疫印记d 、u 、m i f 3 、昆虫i 及i i 型、肝片形吸虫 底物特异性亲合力 o 、u 、n 、0 抑制敏感性d、p、h 三级结构：活性中心a 、u 、0 、( i ) 、k 、o 四级结构：杂合成二聚体的能力o 、u 四级结构：亚单位问的接口 n u n 0 型的疏水的锁与钥匙结构、b 型的极 性接口 注：m i f 2 m i g r a t i o ni n h i b i t o r yf a c t o r 免疫抑制因子 各型按序列相似性和免疫交叉反应分为不同的皿型，不同亚型的表达水平具 有组织特异性。g s t 对g s h 的结合有很高的特异性，但对第二个亲电子底物的特异性 在不同型和型内差别显著【3 3 1 。a 、u 、和0 型g s t 基因在其大小、内含子外 显子结构上明显不同，并且同型基因有成簇的趋向，如人类g s t 基因存在特异性簇 3 4 1 。比较基因组学也显示，冈比亚按蚊g s t s 比果蝇膨胀，也是局部重复基因形成 簇的结果。许多胞液g s t 具有多态性。 1 3 谷胱甘肽转移酶解毒机理 酶的解毒过程有i 相和i i 相之分，i 相通常不会改变底物分子的水溶性和分 子大小，但是对于相进一步的化学反应有重要促进作用【3 ”，谷胱甘肽转移酶解 毒属于1 i 相反应3 6 l 。谷胱甘肽转移酶的解毒作用是通过催化一一系列的化学反应来 实现的，催化亲电子物质与内源的还原型谷胱甘肽( g s h ) 反应，并在与g s h 结合 以后把它们排出体外，这样就保护了体内其他的亲核物质，如蛋白质和核酸”。 谷胱甘肽转移酶根据把基团从底物分子移到g s h 的s 原予上的情况分成五类p 副： 谷胱甘肽s 一烷基转移酶该酶转移的烷基包括硝基烷基、卤代烷或烯烃和卤 环烷等有机磷化合物，例如使对氧磷转化为s 一甲基谷胱甘肽和去甲基对氧磷，也 可使敌敌畏去甲基生成去甲基敌敌畏。 中国科学技术大学硕士学位论文 谷胱甘肽转移酶的分离纯化、荧光光谱以及外源物质对其活性影响研究 吣+ 磬 | 岔“。：+ g s ch 。 谷胱甘肽s 一芳基转移酶此酶转移的芳基包括简单的和复杂的芳环，硝基呋 喃、二嗪和三嗪等。 w 。 谷胱甘肽s 一链烯转移酶 i i h c o o c 2 + g s h c h c o o c 2 h 5 z s h 簿 主卜 g s h s 一蝴 雨磊虿矿 c l h 2 c o o c2 h 5 g s - - c h c o o c2 h 5 谷胱甘肽s - 芳烷基转移酶 伊d h 筹伊s h c 谷胱甘肽s - 环氧基转移酶 h 2 。g s h s - 研4 职i + 6 8 h 功獗薪 h 2 s g 谷胱甘肽s 一烷基转移酶和谷胱甘肽s 一芳基转移酶之问有一定的联系，两个作用 0lsi0 一 汕 舭 帅 一 。 帅 扎 。s。 嚣 + 一 忆 中国科学技术大学硕士学位论文谷胱甘肽转移酶的分离纯化、荧光光谱以及外源物质对其活性影响研究 可能同时发生，其中可能会有竞争作用 3 9 1 。 1 4 谷胱甘肽转移酶结构 每个可溶性g s t 是由约2 6 k d a 亚基组成的二聚体，形成疏水的5 0 k d a 的 蛋白，等电点在p h 4 5 的范围内。g s t 可以是同源二聚体，也可以是异源二聚体。 由于亚基间界面残基的不相容性，不同类型的g s t 亚基间不能二聚化。在同类亚 基中，即使氨基酸序列差异很大，也能形成二聚体 1 4 , 4 0 , 4 1 1 。异源二聚体的形成大 大增加了g s t 在植物中的多样性【1 3 , 1 4 】。研究不同类型的g s t 的结构表明：尽管 不同类型的g s t 序列差异很大，但g s t 的二级结构及高级结构是非常相似的， g s t 的一些结构特征在其它的g s t 中也存在。 谷胱甘肽转移酶的活性位点包括两个结合部位，即g 位和h 位。g 位与谷胱甘 肽结合，h 位与另一底物结合，谷胱甘肽转移酶对一系列结构不同的化学物质表现 出催化活力，但对谷胱甘肽有很高的特异性。一般认为不同亚基的h 位是不同的， 而g 位具有类似的结构【4 ”。因此在催化反应中，谷胱甘肽转移酶可将不同的亲电物 质与谷胱甘肽结合。g 位点也促进g s h 的巯基与临近的羟基形成氢键而离子化， 产生硫醇盐阴离子。在哺乳动物中，a 、 在植物中，酶的这个残基被丝氨酸( s e r ) ug s t 是由一个t y r 残基提供羟基，而 替代。细菌的g s t 是由半胱氨酸( c y s ) 替代s e r t y r ，从而与g s h 形成二硫化合物，导致该酶具有与其它g s t 有不同的 催化活性。可变的h 位点负责接受疏水性底物，然后由硫醇盐阴离子驱动一系列 反应。 1 5 谷胱甘肽转移酶纯化 蛋白质是组成生命的基础物质，将蛋白质纯化分离是生命科学研究的必然要 求，只有将要研究的蛋白质分离出来，才能有针对性研究蛋白在生命过程中的作 用、它自身的各种性质以及外界物质对其的影响。蛋白质分子不同于一般的小分 子物质，它是由数量不等的2 0 种氨基酸通过肽键结合在一起，又通过氢键、疏水 作用、范德华力、金属配位等作用使肽链折叠、旋转形成一定的空间立体结构， 它的立体结构决定着蛋白质分子的功能，结构改变将伴随着蛋白质分子生物活性 的变化，因此蛋白质特别是酶的纯化，对纯化条件要求严格如：温度、缓冲溶液 体系、p h 值。另外酶在生物体内含量较少，所以应寻找酶含量较高的组织进行提 中国科学技术大学硕士学位论文谷胱甘肽转移酶的分离纯化、荧光光谱以及外源物质对其活性影响研究 取，如解毒酶多在肝脏，消化酶多在消化系统。 纯化蛋白质的方法有离子交换层析。它对蛋白质的分辨率高，操作简易，重 复性好，成本低。此法尤适于蛋白质粗提物的初始纯化。对于大量的谷胱甘肽转 移酶可先用此法，然后进一步纯化m 。 凝胶过滤层析是一项重要的蛋白质纯化技术，又称为体积排阻、凝胶排阻、 分子筛或凝胶过滤层析 4 5 , 4 6 , 4 7 】。这种方法利用分级分离，而不需要蛋白质的化学 结合，这就降低了因不可逆结合所致的蛋白质损失和失活。 普通纯化谷胱甘肽转移酶方法可以下步骤【4 8 】： 样品 l 硫酸铵分级( 取沉淀) s e p h a d e xg 一2 5 脱盐 + a 2 5 柱层析 丙酮沉淀 s e p h a d e xg 一7 5 及s e p h a d e xg 一2 0 0 目标产物 纯化谷胱甘肽转移酶最佳的方法是亲和层析，目前对谷胱甘肽转移酶的纯化大 都采用此法 2 8 , 4 9 - 5 3 1 。 亲和层析是一类纯化方法，它包含各种各样的形式，但其共同特征是均以蛋 白质和结合在介质上的配基问的特异亲和力为工作基础。配基可以是生物学特异 的，例如一个肽、抗体、底物、抑制剂、辅酶或核酸：配基也可以是具有相对特 异相互作用的凝集素，染料或疏水分子【5 4 , 5 5 1 。亲水层析就是利用这种相互作用来 分离纯化的。通过偶联配基的凝胶捕集住蛋白分子，而其他物质则流出，然后改 变流动相的条件将蛋白质洗脱下来。 1 6g s t 的诱导性及其与昆虫抗药性的关系 g s t 的诱导性一些植物次生物质及杀虫药剂已被证明对昆虫g s t 有诱导作 用，因植物种类不同，植物次生物质对昆虫产生的诱导程度也不尽相同。由于植物 次生物质诱导g s t 活性，因而不同程度地导致了昆虫对杀虫剂的抗性增强。一些植 中国科学技术大学硕士学位论文谷胱甘肽转移酶的分离纯化、荧光光谱以及外源物质对其活性影响研究 物次生性物质如吲哚一3 一乙腈、吲哚一3 一甲醇及黄酮能提高g s t 活性，但槲皮 素及棉子酚对g s t 有抑制作用。对g s t 的诱导作用在家蝇中也有发现。在p b ( 苯巴 比妥) 、d d t 诱导后，家蝇中g s t 活性增加，引起家蝇g s t 活性增加，由于诱导的转 移酶活性对杀虫剂的代谢作用，从而增加了对有机磷类杀虫剂的耐受性，但诱导酶 的k m 值没有明显变化，说明诱导剂对g s t 无专一性，同时增强了所有g s t 的活性 扫g s t 与昆虫抗药性的关系知道，有机磷杀虫剂，尤其是二甲基磷酸酯和二甲 基硫代磷酸酯的脱烷基作用中，g s t 相当重要。已报道的能发生g s h 与o 烷基结 合的有机磷类化台物有甲基对硫磷、对硫磷、速灭磷、保棉磷、敌敌畏、杀虫畏 和对甲酰二甲苯磷酸酯等【5 6 】。g s t 对甲基保棉磷、二嗪农、碘甲烷、3 ，4 一二氯 硝基苯( d c n b ) 都表现出较高的代谢活性1 5 ”。g s t 与昆虫抗药性关系方面的研究最 早是针对二嗪农进行的。首先发现在有g s t 存在的情况下，具有多种抗性的 r u t g e r s 家蝇降解二嗪农的速度比敏感品系高，l 1 g s t 的基因都位于染色体l i 上。 小菜蛾抗性品系及敏感品系的g s t 总活力随虫体的生长发育显著增加。抗性小菜 蛾各发育期g s t 总活力及比活力均高于敏感品系。用甲胺磷和水胺硫磷预处理后， 由于虫体内g s t 能将多种有机磷杀虫剂的基团转移到内源性的g s i i 上形成共轭解 毒物，对杀虫剂进行解毒代谢，从而显著地降低了抗性小菜蛾的g s h 质量摩尔浓 度。因此抗性小菜蛾g s t 的高活力及g s h 的高质量摩尔浓度应是小菜蛾对有机磷 类杀虫剂产生抗药性的重要机制之一。用竞争性荧光光谱与h p l c 柞i 结合进行抑制 作用研究表明，杀虫齐t j c d n b 可能竞争性结合g s t 的抑制活性位点，但不与g s h 结 合。据此认为，对于拟除虫菊酯类农药，g s t 以隔离( 螯合) 机理通过与农药分子结 合而起被动保护作用，导致抗性增加【3 8 j 。 中国科学技术大学硕士学位论文谷胱甘肽转移酶的分离纯化、荧光弗谱以及外源物质对其活堡墅堕! 堕塑 参考文献 1 唐振华，毕强杀虫剂作用的分子行为上海远东出版社2 0 0 2 ：2 0 0 2 k u h nw ，k e m p k e sm ，m u ll e rt h ，e ta 1 g l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s e ( g s t t l a n dg s t m l ) p 0 1 y m o r p h i s mi np a r k i n s o n p sd i s e a s e m o vd i s o r d ，1 9 9 7 ，1 2 ( s u p p l 1 ) ：2 7 3 k e t t e r e rb p r o t e c t i v er o l eo fg l u t a t h i o n ea n dg l u t a t h i o n et r a n s f e r a s e i nm u t a g e n e s i sa n dc a r c i n o g e n s i s m u t a t i o nr e s e a r c h ，1 9 8 8 ，2 0 2 ：3 4 3 3 6 1 4 马韵，韦义萍，邓卓霖广西肝细胞癌g s t m i 基因多态性研究癌症，2 0 0 0 ， 1 9 ：8 6 88 7 0 5 m i c h a e ls ，f r a n c km ，e s t e l l e l ，r o m a i nb ，m a r i od ，c h a n t a lt a n dm a r c d i e d e r i c h t r a n s c r i p t i o n a l a n d p o s t t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f g l u t a t h i o n e s - t r a n s f e r a s ep 1e x p r e s s i o nd u r i n gb u t y r i ca c i d i n d u c e dd i f f e r e n t i a t i o no f k 5 6 2c e l l s l e u k e m i ar e s e a r c h ，2 0 0 6 ，3 0 ( 5 ) ：5 6 1 5 6 8 6 s o p h i ep v ，m a r t i nj l ，a n n ar m m m - i s s aj s ，m e t t eg g ，r h o n d aj r c u r c u m i nm o d u l a t e sd r u gm e t a b o l i z i n ge n z y m e si nt h ef e m a l es w i s sw e b s t e rm o u s e l i f es c i e n c e s ，2 0 0 6 ，7 8 ：2 3 9 1 2 3 9 8 7 r e e mh e ，j o h nd ，a y m a no s e 1 一k a d i a s c o r b i c a c i dd i f f e r e n t i a l l y m o d u l a t e st h ei n d u c t i o no f h e m eo x y g e n a s e - 1 ，n a d ( p ) h ：q u i n o n eo x i d o r e d u c t a s e1a n d g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s ey ab ya s 3 + ，c d 2 + a n dc r 6 + c a n c e rl e t t e r s ，2 0 0 6 ，i np r e s s 8 m a u c hf ，d u d l e rr p l a n tp h y s i o l o g i c a l 1 9 9 3 ，1 0 2 ：1 1 9 3 1 2 0 1 9 e z a k i8 ，y a m a m o t oy ，m a t s u m o t oh p l a n th y s i o l o g i c a l 1 9 9 5 ，9 3 ：1 卜1 8 1 0 】p r a g y as ，k a u s h a l ap m a l u m i n u m i n d u c e dm a t e r n a la n dd e v e l o p m e n t a l t o x i c i t ya n do x i d a t i v es t r e s si nr a tb r a i n ：r e s p o n s et oc o m b i n e da d m i n i s t r a t i o no f t i r o na n dg l u t a t h i o n e r e p r o d u c t i v e t o x i c o l o g y ，2 0 0 6 ，2 1 ：3 1 3 3 2 1 1 1 李啸峰，迟宝荣，马琳，大肠癌多药耐药研究进展，吉林大学学报( 医学版) 2 0 0 3 ，2 9 ( 5 ) ：7 0 0 7 0 2 1 2 胡廷章，植物的谷胱甘肽转移酶家族重庆三峡学院学报，2 0 0 4 ， 2 0 ( 5 ) ：1 2 卜1 2 4 1 3 e d w a r d sr d i x o nd p i nh e r b i c i d e s a n dt h e i rm e c h a n i s m so fa c t i o n e d i t e db yc o b ba h ，k i r k w o o dr c s h e f f i e l d ：8 h e f f i e l da c a d e m i cp r e s s ，2 0 0 0 ， 3 3 7 1 9 ! 里! ! 堂垫查查兰堡主兰笪堡兰 笪些苎壁堑堡堕堕坌查丝些：茎堂堂堂坚墨! ! 塑塑星翌! ! 堡堡墅堕婴壅 1 1 4 d i x o nd p ，l a p t h o r na ，e d w a r d sr g e n o m eb i o l o g y2 0 0 2 ， 3 ( 3 ) ：3 0 0 4 卜3 0 0 4 1 0 1 5 m o o n sa f e b sl e t t 2 0 0 3 ，5 5 3 ：4 2 7 4 3 2 1 6 e d w a r d sr ，d i x o nd p ，w a l b o tv t r e n d sp l a n ts c i2 0 0 0 ，5 ：1 9 3 1 9 8 1 1 7 m u e l l e rl a ，g o o d m a nc d ，s i l a d yr ae ta 1 p l a n tp h y s i o l2 0 0 0 ， 1 2 3 ：1 5 5 1 一1 5 7 0 1 8 r o x a sv p ，s m i t hr k ，a l l e ne re ta 1 n a tb i o t e c h n o l1 9 9 7 1 5 ：9 8 8 9 9 1 1 9 c u m m i n si ，c o l ed j ，e d w a r d sr p l a n tj1 9 9 9 1 8 ：2 8 5 2 9 2 2 0 k a m p r a n i ss c ，d a m i a n o v ar ，a t a l l a hme ta 1 jb i o lt h e m2 0 0 0 2 7 5 ：2 9 2 0 7 2 9 2 1 6 2 1 l o y a l ll ，u c h i d ak ，b r a u nse ta 1 p l a n tc e l l2 0 0 0 2 ：1 9 3 9 1 9 5 0 2 2 戚元成，张 慧，赵彦修植物谷胱甘肽转移酶和盐胁迫，山东师范大学学 报( 自然科学版) 2 0 0 2 ，1 7 ( 2 ) ：7 1 7 5 2 3 j a k o b y w b e ta 1 b i o c h e m p h a r m a c 0 1 1 9 8 4 3 3 ：2 5 3 9 2 5 4 0 2 4 k a m a r r s t h ef u n c t i o n sa n dr e g u l a t i o no fg l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e i np l a n t s ，a n n u r e v p l a n t p h y s i 0 1 p l a n tm 0 1 b i o l 。4 7 ，1 2 7 ( 1 9 9 6 ) ， 2 5 k h a t z i o s ，f u n c t i o n sa n d r e g u l a t i o n o f p l a n tg l u t a t h i o n e s - t r a n s f e r a s e i n“p e s t i c i d e b i o t r a n s f o r m a t i o ni np l a n t s a n d m i c r o o r g a n i s m s ：s i m i l a r i t i e sa n d d i v e r g e n c e s ”a c ss y m p o s i u ms e r i e s 7 7 7 ，p p 2 1 8 2 3 1 ，a m c b e m s o c ，w a s h i n g t o n ，d c ，2 0 0 1 2 6 v d a n i e l ，g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e ：g e n es t r u c t u r ea n dr e g u l a t i o no f e x p r e s s i o n ，c r cc r i t r e v b i o c h e m m 0 1 b i 0 1 1 9 9 3 ，2 8 ，1 7 3 2 7 d j c o l e ，i c u m m i n s ，p j 1 - l a t t o n ，d d i x o n ，a n dr e d w a r d s ，6 1 u t a t h i o n e s - t r a n s f e r a s ei nc r o p sa n dm a j o rw e e d s i n “r e g u l a t i o no fe n z y m a t i cs y s t e m s d e t o x i f y i n g x e n o b i o t i c si np l a n t s ”n a t oa s is e r i e s ，p p 1 3 91 5 4 k l u w e r a c a d e mic ，d o r d r e c h t ，19 9 7 2 8 f