（分析化学专业论文）盾叶薯蓣中薯蓣皂甙元提取新工艺的研究.pdf

中南大学硕士学位论文 摘要 摘要 薯蓣皂甙元是合成多种甾体类药物的重要原料，其主要来源是从 薯蓣属植物中提取获得。盾叶薯蓣是薯蓣皂甙元提取的重要原料，目 前己实现工业化生产，而生产过程中大量使用酸水，造成了严重的环 境污染。本文采用新的工艺进行薯蓣皂甙元的提取，为实现盾叶薯蓣 综合利用提供理论依据。 本论文的研究工作由以下几个部分组成： ( 1 ) 建立了一种准确、快速分析测定薯蓣皂甙元含量的反相高 效液相色谱方法，对提取物中薯蓣皂甙元与其它杂质的色谱分离条件 进行优化，确定流动相为甲醇一水( 9 5 ：5 ，v v ) ，流速1 0m l m i m u v 检测波长2 0 8n m ；柱温2 5 。结果表明薯蓣皂甙元在0 1 0 2 0 0 g l 范围内峰面积与其质量浓度具有很好的线性关系( r = o 9 9 9 8 ) ，样 品平均加标回收率为9 9 7 6 ，精密度r s d 为1 7 6 。该方法具有较 高的精密度和准确性，且分析周期短，适用于薯蓣皂甙元含量的精确 分析。同时，采用显色法，建立了分光光度法测定薯蓣皂甙元含量， 并与色谱法进行比较； ( 2 ) 研究了从盾叶薯蓣中预分离薯蓣总皂甙和淀粉、纤维素， 再进行水解，提取薯蓣皂甙元的新工艺。通过正交实验对薯蓣皂甙元 的提取工艺进行优选，选用l 2 5 ( 5 6 ) 正交表进行实验，以薯蓣皂甙元收 率为评价参数，考察了6 个因素对薯蓣皂甙元提取量的影响。得到最 佳的工艺条件为：甲醇回流提取4h ，回流速度为1 0 分钟次，用2 5 m o l l 的硫酸水解6h ，1 2 0 号溶剂汽油回流提取2h ，回流速度为1 5 分钟次。占盾叶薯蓣9 5 以上的淀粉与纤维素实现了与薯蓣总皂甙 的分离，大大减少了水解阶段的酸水用量。 ( 3 ) 研究了盾叶薯蓣提取薯蓣皂甙元后废渣发酵制取酒精的最 佳实验指标，以酒精产量为评价参数，采用5 因素4 水平的正交实验， 用可见分光光度法对1 6 种制取方法所得到的酒精进行比较分析。结 果表明，酒精与重铬酸钾溶液经加热显色后，在5 8 5 衄波长有最大 吸收波长，酒精体积分数在0 0 2 8 0 2 4 范围内线性关系良好 ( 闻9 9 9 8 ) ；发酵时间对于酒精产量影响最大，在实验室条件下，采 用5 0 9 原料使用7 u g 原料淀粉酶，1 1 0 u g 原料纤维素酶，1 1 0 u g 原料糖化酶，o 0 4g g 原料酵母，发酵4 天，可使酒精产量达到最大。 关键词盾叶薯蓣，薯蓣皂甙元，提取，测定 中南大学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t d i o s g e n i ni sas t e r o i d a lc o m p o u n dv e r yu s e f u li np h a r m a c e u t i c a l i n d u s t r y a s an a t u r a ls o u r c eo fs t e r o i d a lh o r m o n e s d i o s c o r e a z i n g i b e r e n s i sc h w r i g h ti sa ni m p o r t a n tr a wm a t e r i a lf o re x t r a c t i n g d i o s g e n i n , w h o s ei n d u s t r i a le m r a c t i o nh a sb e e nc a r r i e do u t h o w e v e r , m a s sp o l l u t i o ni sg e n e r a t e di nt h ep r o c e s sb e c a u s eo fa c i dh y d r o l y s i s a n o v e lt e c h n o l o g yf o rd i o s g e n i ne x t r a c t i o nw a ss t u d i e di nt h i sp a p e r t h ew o r ki nt h i sp a p e ri sd e s c r i b e da sf o l l o w s ： ( 1 ) a na c c u r a t ea n dr a p i dr e v e r s e d - p h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h yw a se s t a b l i s h e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd i o s g e n i n t h e c h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n sw e r es t u d i e df o rt h es e p a r a t i o nd i o s g e n i n f r o mo t h e rc o m p o n e n t c h r o m a t o g r a p l l i cs e p a r a t i o nw a sc a r r i e do u to n v p o d s ( 1 5 0 4 6n l n l ，5p m ) c o l u m nu s i n gm e o h ：h 2 0 ( 9 5 ：5 ，r oa st h e m o b i l ep h a s ea taf l o wr a t eo f1 0m l m i n n 忙u vd e t e c t i o nw a s p e r f o r m e da t2 0 8n l n r e s u l t ss h o w e dt h a tt h el i n e a rr a n g eo fc a l i b r a t i o n c u r v ew a s0 1 2 0 班( 间9 9 9 8 ) ，t h ea v e r a g er e c o v e r yw a s9 9 7 6 w i t hr s do f1 7 6 ( n = 3 ) i tc o u l db ec o n c l u d e dt h a tt h em e t h o dw a s a c c u r a t e ，r e p r o d u c i b l ea n dp r e c i s i o nc o u l db ea p p l i e dr a p i d l yd e t e r m i n e t h ed i o s g e n i n a tt h es a l n et i m e ，s p e c t r o p h o t o m e t r i ca n a l y s i so f d i o s g e n i n w a ss t u d i e df o rc o m p a r i s o nw i t hc h r o m a t o g r 印h y ( 2 ) an o v e lt e c h n o l o g yf o re x t r a c t i n gd i o s g e n i nf r o md i o s c o r e a z i n g i b e r s i sc h w r i g h tw a ss t u d i e d s e v e r a li m p o r t a n tf a c t o r sw e r e a n a l y z e di nt h eo r t h o g o n a ls t u d yo fs i xf a c t o r sa n df i v el e v e l s ，a n dt h e c o n t e n to fd i o s g e n i nw a sv a l u e da sa ne v a l u a t i o ni n d e xu s i n g s p e c t r o p h o t o m e t r y n l er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no fs u l f u r i c a c i dh a da no b v i o u se f f e c to nt h ec o n t e n to fd i o s g e n i ne x t r a c t e d a n d e x p e r i m e n t ss h o wt h eo p t i m a lt e c h n o l o g yf o rd i o s g e n i ne x t r a c t i o ni s u n d e rt h ec o n d i t i o n ss h o w na sf o l l o w i n g s ：2 0gs a m p l ei sr e f l u x e df o rgh w i t hm e t h a n o l ，a n d1 0m i n u t e sf o re a c hr e f l u xo p e r a t i o n ；t h e n1 0 0m l2 5 m o l lh 2 s 0 4i sa d d e df o r6h o u r so fh y d r o l y s i s ；a tl a s ti sr e f l u x e df o r2h w i t hg a s o l i n e ，a n d1 5m i n u t e sf o re a c hr e f l u xo p e r a t i o n , w h i c hc a nb e u s e d 船ar a p i da n dc l e a ne x t r a c t i o nt e c h n o l o g y p r e e x t r a c t i o no fs t a r c h a n dc e l l u l o s e a sm a i nc o m p o u n do f d i o s c o r e az i n g i b e r s i sc hw r i g h t , 中南大学硕士学位论文a b s t r a c t w o u l dr e d u c ea c i dc o n s u m p t i o no b v i o u s l yc o m p a r i n gt ot r a d i t i o n a l t e c h n o l o g y ( 3 ) t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n si na l c o h o lp r o d u c t i o nb y r e s i d u ef r o md i o s g e n i np r o c e s s i n gw e r ee s t a b l i s h e d s e v e r a li m p o r t a n t f a c t o r sw e r ea n a l y z e di nt h eo r t h o g o n a ls t u d vo ff i v ef a c t o r sa n df o u r l e v e l s t h ec o n t e n to fa l c o h o lw a sv a l u e da sf l l le v a l u a t i o ni n d e xu s i n g s p e c t r o p h o t o m e t r y t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h el i n e a rr a n g eo fc a l i b r a t i o n c u r v ew a s0 0 2 8 o 2 4 ( r = 0 9 9 9 8 ) a f t e rc o l o rr e a c t i o n ，a n do p t i m a l f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e da sf o l l o w s ：t h eu s el e v e lo fq a m y l a s ea s7u g ，c e l l u l a s e110u g ，g l u c o a m y l a s e110u g ，y e a s to 0 4 g g ，a n d4d a y sf e r m e n t a t i o nt i m e k e yw o r d sd i o s c o r e a z i n g i b e r s i sc h w r i g h t ，d i o s g e n i n ， e x t r a c t i o n ，d e t e r m i n a t i o n i i i 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说 明。 作者签名： 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位 论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论 文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 作者签名：导师签名e t 期： 年一月一日 中南大学硕士学位论文第一章绪论 1 1 盾叶薯蓣概述 1 1 1 薯蓣资源概况 第一章绪论 盾叶薯蓣( d i o s c o r e az i n g i b e r e n s i sc h w r i g h t ) 为薯蓣科薯蓣属多年生藤本植 物，俗称黄姜，其根茎中含有薯蓣皂甙( d i o s c i n ) ，为甾体皂甙，水解产物为薯 蓣皂甙元( d i o s g e n i n ) 。薯蓣科有9 属，除薯蓣属外，其余属多为单种或少种属， 广布于全球的热带和亚热带地区，尤以美洲热带地区种类最多，间断分布于世界 各洲。薯蓣属种类最为丰富，约6 0 0 至8 0 0 种【”，广布于热带地区，亦有少数分 布于亚热带和温带地区。其中含有薯蓣皂甙的植物有1 3 6 种，其中4 1 种薯蓣皂 甙元含量在l 以上【2 】我国有薯蓣属l 属8 0 余种，其中含薯蓣皂甙元有1 7 种。 1 1 2 盾叶薯蓣的主要成分 盾叶薯蓣的根茎中含有薯蓣皂甙及4 5 至5 0 0 6 的淀粉，4 0 至5 0 * , 4 的纤维素。 刘承来等【3 】从盾叶薯蓣干燥根茎的乙醇提取物到4 个甾体化合物：表一菝葜皂甙 元( e p i - s m i l a g e n i n ) ；延令草次甙( t r i l l i n ) ，结构为3 - 0 ( b d - 葡萄吡喃糖) 薯 蓣皂甙( 3 - m ( i b - d - g l u c o p y r a n o s y l ) - d i o s g e n i n ) ；薯蓣皂甙元- 双葡萄糖甙 ( d i o s g e n i n - d i g l u c o s i d e ) ，结构为3 - 0 d d 葡萄吡喃糖( 1 舛) - p - d 葡萄吡喃糖】 薯蓣皂甙元( 3 - o - p - d o g l u c o p y r a n o s y l ( 1 4 ) 一 3 - d - g l u c o p y r a n o s y l - d i o s g e n i n ) 纤细皂甙( g r a c i l l i n ) ，结构为3 o b d - 葡萄吡喃糖( 1 鹕) - a - l - g 李吡喃糖 ( 1 川) 】- p d - 葡萄吡喃糖 - 薯蓣皂甙( 3 - 0 p d g l u c o p y r a n o s y l ( 1 寸3 ) - c t - l - r h a m n o p y n o s y l ( 1 寸2 ) 】 3 - d - g l u c o p y r a n o s y l - d i o s g e n i n ) 。1 9 8 5 年刘承来 等【4 1 又从盾叶薯蓣新鲜根茎的甲醇提取物分离到薯蓣皂甙元棕榈酸酯 ( d i o s g c n i n p a l m i t a t e ) 、d 谷甾醇( 3 - s i t o s - t e r 0 1 ) 、纤细皂甙( g r a c i l l i n ) 、原纤细 皂甙( p r o t o g r a c i l l i n ) 和原盾叶皂甙( p r o t o z i n g i b e r e n s i s s a p o n i n ) 。其中原盾叶皂 甙是一新甾体皂甙，结构式为3 - 0 a - l - g 李毗喃糖( 1 寸3 ) 【p d 葡萄吡喃糖 ( 1 观) 】p n 葡萄吡喃糖 2 6 0 p d 葡萄吡喃糖卜薯蓣皂甙元 ( 3 - 0 一 a l - r h 锄o p y n o s y l ( 1 斗3 ) - 【p - d - g l u c o p y r a n o s y l ( 1 2 ) 】 d d g l u c o p y r a n o s y l - 2 6 - o - 3 d - g l u c o p y r a n o s y l - d i o s g e n i n ) 。1 9 8 3 年唐世蓉等p j 从盾叶薯蓣根中分离出两个水不溶性三糖皂甙( a 和b ) 和两个水溶性四糖皂甙 ( c 和d ) ，并将皂甙a 命名为盾叶皂甙a ( z i n g i b e r e n i n a ) ，其结构式为薯蓣皂 甙元3 o 1 3 - d 葡萄吡喃糖( 1 斗2 ) 】o - a - l - g 李吡喃糖( 1 3 ) 】- o - p d - 葡萄 中南大学硕士学位论文第一章绪论 吡哺糖甙。b 为纤细皂甙( g r a c i u i n ) 的立体异构物，c 为原盾叶皂甙a ( p r o t o z i n g i b e r e n i n a ) ，d 为原盾升皂甙b ( p r o t o z i n g i b e r e n i nb ) 。唐世蓉等 6 1 用 盾叶薯蓣地上部分首先经8 0 乙醇冷浸三次进行提取，再用大孔树脂层析柱去除 叶绿素杂质，然后干法上柱进行多次硅胶柱层析，分离得到盾叶皂甙a 3 ( 约莫皂 甙元3 o a - l - 李吡喃糖基( 1 2 ) 】 p d 葡萄吡喃糖基( 1 寸4 ) 】一p d 一葡萄 吡喃糖甙) 和叉蕊皂甙1 v ( 约莫皂甙元3 o 【a l - 鼠李吡喃糖基( 1 斗2 ) 】【p d - 葡萄吡喃糖基( 1 3 ) 】1 3 - d - 葡萄吡喃糖甙) ，最后进行反相柱层析得到盾叶皂 甙a l ( 约莫皂甙元3 o 一【a l 鼠李吡喃糖基( 1 专2 ) 】p d 葡萄吡喃糖甙) 和盾 叶皂甙a 2 ( 2 4 a - 羟基约莫皂甙元- 3 - 0 【l 鼠李吡喃糖基( 1 一 2 ) 】- p d 葡萄吡 喃糖甙) 。 1 1 3 盾叶薯蓣资源在我国的分布 盾叶薯蓣在我国广泛分布于陕西南部、甘肃东南部、四川东部和南部、湖北、 湖南、贵州以及云南，袁晓颖等【7 】将盾叶薯蓣在我国的分布范围划分为两个区： 第1 分布区是以武当山区为中心的秦巴武当区，其范围约在东经1 0 5 。1 1 5 0 ， 北纬3 0 0 5 0 3 2 0 ，此处植被正是我国亚热带常绿林一落叶阔叶混交林地带，是 我国北方暖温带落叶林与南方亚热带常绿阔叶林的过渡类型。第1 1 分布区为西 南中南区，从云南西北部的国界线向东延伸至湖南部分地区，范围约在东经 9 9 0 1 1 5 0 ，北纬2 5 。3 & 0 5 0 ，该范围植被类型多为亚热带山地酸性黄壤常绿阔 叶林一落叶阔叶树混交林及亚热带常绿阔叶林。 2 0 0 5 年吴泽宇等哺1 对湖南的薯蓣属植物资源进行了调查研究，调查结果表明 湖南的薯蓣属资源主要分布在衡阳、怀化、长沙、郴州、岳阳等地，可以采到的 标本有薯蓣、黄独、绵萆薜、盾叶薯蓣、细柄薯蓣、福州薯蓣、柴黄姜、日本薯 蓣、薯莨等9 种。并从资源蕴藏量、利用现状等方面综合评价湖南省薯蓣属资源 的应用，结果表明盾叶薯蓣应用最好。 1 i 4 盾叶薯蓣的栽培技术 齐迎春等【川通过对盾叶薯蓣栽培技术的研究，显示盾叶薯蓣的栽培地一般要 求土壤疏松，海拔7 0 0 8 0 0n l 的山坡为好，也可以与农作物间作。盾叶薯蓣主 要有两种繁殖方法，根茎繁殖：盾叶薯蓣根茎上的芽眼在一般栽培条件下，不 做任何处理，可以任意分开，晾干切口后栽种下去，均能形成不定芽。种子繁 殖：每年1 0 1 1 月份采种，挑选褐色、种粒饱满、健康无病虫害的种子，用常 规层积或保湿方法处理3 4 月后，即第二年春季即可播种。半个月就可以出苗， 出苗率可达9 5 以上。盾叶薯蓣适于种子繁殖，操作简单，出苗率高，能提高单 2 中南大学硕士学位论文第一章绪论 产，降低成本。王日照等“o j 采用i e 交实验，对盾叶薯蓣氮、磷、钾和种植密度 等四个因素进行田间试验，结果表明种植密度对盾叶薯蓣产量有极显著的影响， 其它三个因素没有显著影响。盾叶薯蓣产量以6 7 7m 2 种植密度1 1 0 0 0 株左右为 最高。 1 1 5 盾叶薯蓣的综合利用 在盾叶薯蓣中提取薯蓣皂甙元过程中综合利用盾叶薯蓣，对于薯蓣皂甙元生 产的可持续发展具有重要的意义。黄利群等【l l 】经过分离、纯化及诱变、筛选等工 作，获得了一株新菌株h a 6 0 8 ，并将该菌株用于盾叶薯蓣的发酵。利用新工艺， 在获得薯蓣皂甙元的同时，还获得了柠檬酸。黄进等【1 2 1 研究了一种从盾叶薯蓣 中同时提取薯蓣皂甙元和葡萄糖的生产工艺，首次提出了以中和作为主要脱盐方 法从盾叶薯蓣水解滤液中提取高纯度葡萄糖的工艺。c a i x i a n gz h a n g 掣b 铡用盾 叶薯蓣提取薯蓣皂甙元后的残渣制备了活性碳，并对活性碳的多孔性及苯酚、亚 甲基兰吸附值进行了表征，表明制备的活性碳具有良好的物理和化学性质。同时 还利用制备的活性碳进行了降低薯蓣皂甙元提取过程中废水化学需氧量( c o d ) 和生物化学甲烷势( b m p ) 的可行性试验，实现了以废治废。 1 2 暮蓣皂甙元概述 1 , 2 1 蓦蓣皂甙元简介 薯蓣皂甙元由于它对乳腺的雌激素作用1 1 4 1 ，而用于甾体激素和甾体避孕药的 合成，其分子式为c 2 7 h 4 2 0 3 ，分子量4 1 4 6 2 ，其结构式如图1 1 所示。1 9 4 0 年 代发现可的松对类风湿性关节炎具有良好的消炎作用，而当时生产可的松的原料 昂贵，因此寻求廉价的原料来源成为了研究热点。r u s s e l lm a 咄盯发现墨西哥薯 蓣属植物中含有薯蓣皂甙元，薯蓣皂甙元在结构上与人体内存在的一些甾体激素 极为相似，使得从植物中提取获得的薯蓣皂甙元成为了生产甾体激素和避孕药的 廉价原料。 图1 - 1 薯蓣皂甙元结构式 中南大学硕士学位论文 第一章绪论 1 2 2 薯蓣皂甙元的主要性质 薯蓣皂甙元的化学名为a 5 2 0 1 3 f ，2 2 0 【f ，2 5 0 l f 螺旋甾烯3 d 醇，简称5 异螺 旋甾烯一3 p 一醇，是异螺甾烷的衍生物，在植物中以薯蓣皂甙的形式存在，即在 c 一3 位和c 2 6 位通过皂甙键与糖链相连进而与植物细胞壁紧密连接，薯蓣皂甙 元是特定的2 7 c 甾体皂甙元，其结构特征是在甾核上有单个双键5 和具有3 6 羟 基，与c 一2 5 相连的c 2 7 甲基为a 定向，即c 2 5 为r 构型。薯蓣皂甙元为白色 结晶状粉末，熔点为2 0 4 2 0 7 ，常温常压下不溶于水，易溶于石油醚、乙醇、 甲醇、乙酸等有机溶剂中1 1 5 j 。 1 2 3 薯蓣皂甙元的分布及含量 薯蓣皂甙元在盾叶薯蓣中的分布随盾叶薯蓣部位、采摘季节以及雌雄株等差 异而显示不同。郭永兵【1 6 j 研究结果表明盾叶薯蓣嫩茎顶端的薯蓣皂甙元含量最 高，抽茎段区次之，接着是嫩茎区段，其后为老茎区段和底层区段，须根及地上 茎基部段的薯蓣皂甙元含量很低，说明在同一根茎中，代谢旺盛部位的薯蓣皂甙 元含量比代谢微弱的部位要高。曹玉芳等 1 7 1 利用高效液相色谱法对盾叶薯蓣营 养器官特别是根茎中薯蓣皂甙元含量的动态变化、品种之间的差异以及雌雄之间 的差异进行了研究。结果表明，实生苗根状茎中薯蓣皂甙元的含量，2 年生高于 1 年生；根茎营养繁殖的2 年生根状茎中皂甙元的含量高于1 年生的含量；花叶 品种的含量高于绿叶品种的含量；雄株的含量比雌株的含量高。在地上的缠绕茎 和叶中没有检测到薯蓣皂甙元。由根茎繁殖的1 年生根状茎前期皂甙元含量增加 缓慢，后期增加较快；2 年生根状茎盛花期含量最高，开花后期含量最低，随后 含量逐渐增加。 1 2 4 薯蓣皂甙元的应用 薯蓣皂甙元可用于消炎、抗肿瘤、抗病毒、诱导癌细胞死亡和免疫作用，还有 研究数据【l8 】表明薯蓣皂甙元还具有降血糖的作用。薯蓣皂甙元更多地被应用于 化学合成前体。 薯蓣皂甙元a b 环处的5 一烯一3 一醇结构很容易转变成甾体药物所需的4 一烯一3 一 酮结构，故常作甾体抗炎药【i9 】( 如地塞米松等) 、性激素( 如黄体酮、睾酮等) 和女用避孕药( 如炔诺酮、炔雌醇等) 的半合成原料。薯蓣皂甙元经裂解、氧化、 消除等三步反应可制得孕甾一5 ，1 6 一双烯一3 一醇一2 0 一酮，简称孕甾双烯醇酮，是合 成皮质激素与甾体抗炎药、孕甾类避孕药的重要中间体。孕甾双烯醇酮转变成酮 肟后，经贝克曼重排成烯胺乙酰化合物，再加酸水解可得去氢表雄酮醋酸酯，它 4 中南大学硕士学位论文 第一章绪论 是合成雄甾类药物与1 9 - 去甲基甾体药物( 如炔诺酮等) 的中间体刚。 诱导癌细胞死亡是阻止或停止癌症扩散的最有效途径之一，通过细胞分化治 疗和诱导细胞凋亡可以实现这一目标，大量文献表明薯蓣皂甙元具有诱导肿瘤细 胞凋亡和抑制细胞分裂的功能。s a n d r am o a l i c 、c c o r b i 白 e 和p a t r i c kt r o l l i l a s 等【2 “乜2 3 人，进行了一系列薯蓣皂甙元对人骨肉瘤细胞的增殖、细胞周期以及 诱导细胞凋亡的研究，结果发现，薯蓣皂甙元能抑制人骨肉瘤细胞的生长，使细 胞分裂周期停止在g 1 期，诱导细胞凋亡。通过与海柯皂甙元、替告皂甙元同时 作用于人骨肉瘤细胞进行对比，结果表明薯蓣皂甙元诱导细胞死亡的效率最高。 d a v i d y l e g e r 等 2 4 2 5 研究了薯蓣皂甙元对红白血病h e l 细胞的作用，结果表 明，薯蓣皂甙元通过p 5 3 调节下游靶基因p 2 l 使红白血病h e l 细胞分裂周期停 止在g 2 m 期，并诱导细胞凋亡。r u ih u o 等【2 6 】研究了薯蓣皂甙元诱导h e l a 细 胞凋亡的作用机理，经薯蓣皂甙元处理的h e l a 细胞出现了细胞凋亡的典型特征： 形态变化和d n a 断裂，薯蓣皂甙元通过降低线粒体跨膜电位和减少b c l - 2 的表 达引起了h e l a 细胞凋亡，从而得出结论：薯蓣皂甙元是通过c a s p a s e 途径诱导 h e l a 细胞凋亡。 薯蓣皂甙元还可以作为原料，合成其它具有抗肿瘤等生物活性的成分。有文 献报道 2 7 1 以薯蓣皂甙元为原料合成了具有抗肿瘤活性的o s w - 1 ；y i c h u nz h a n g 等i 勰】以薯蓣皂甙元为原料合成了一种具有抗肿瘤活性的原薯蓣皂甙；h o n g - j i q u a n 等 2 9 1 人用薯蓣皂甙元合成了具有抗肿瘤活性的维生素d 衍生物、螺旋甾醇 类和呋甾醇类物质三种成分；m i c k a 荟ld e n a n c 等1 3 0 以薯蓣皂甙元为原料合成了 一种新的氧代固醇，氧代固醇具有抑制肿瘤细胞分裂和诱导肿瘤细胞凋亡等功 能；田伟生等【3 l 】以薯蓣皂甙元为原料，利用完整骨架和全部官能团转化薯蓣皂 甙元成偏诺皂甙元，偏诺皂甙元及其糖甙化合物被广泛应用于治疗各种出血性疾 病。 1 3 薯蓣皂甙元分析方法的研究进展 1 3 1 重量分析法 重量法是指将薯蓣皂甙元粗提物烘至恒重后称重，结晶重与样品绝对干重之 比为薯蓣皂甙元含量。石艳霞蚴报道，将浓缩至一定体积的皂甙元石油醚提取 液室温放置即析出薯蓣皂甙元的白色晶体，用垂溶漏斗过滤，结晶用溶剂洗后在 1 0 5 干燥、冷却、称重、计算含量。重量法误差较大，仅可用于薯蓣皂甙元的 初步定量。 5 中南大学硕士学位论文第一章绪论 1 3 2 分光光度法 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或 发光强度，对物质进行定性和定量分析的方法。薯蓣皂甙元的结构中没有共轭双 键，其溶液在紫外区吸收弱，因此采用紫外一可见分光光度法需要对薯蓣皂甙元 进行显色。陈战国等【”】以香荚兰醛一高氯酸为显色剂，冰醋酸为溶剂，用紫外一 可见分光光度法在5 3 0r l m 波长处测定薯蓣皂甙元的含量，其结果表明薯蓣皂甙 元在1 0 0 2 0 0 0m g 甩范围内线性关系良好。马敬中等m 】根据甾体化合物的共 同结构环戊烷多氢菲可以发生l i e b e r m a n n - b a r c h a r d ( 乙酸酐与浓硫酸体积比1 9 ： 1 ) 反应，他们以l i e b e r m a n n - b a r c h a r d 试剂为显色剂，氯仿为溶剂，对干黄姜提 取的甾体皂甙元在4 6 0n l n 波长处进行测定，其结果表明在7 7 6 x l o 7 9 3 1 x l o 5 e d m l 范围内呈线性关系。黄进等【1 2 1 采用浓硫酸一甲醇( 体积比4 ：1 ) 为显色剂， 用紫外一可见分光光度计在4 1 2 衄波长处对薯蓣皂甙元进行测定。采用紫外一可 见分光光度法对薯蓣皂甙元进行测定时，需要选择专属性较好的显色反应才能提 高定量的准确度。 1 , 3 3 极谱法 以电解过程中的电压一电流曲线为基础建立起来的电化学分析方法称为伏安 法，其中以滴汞电极为工作电极的伏安法称为极谱法【3 5 1 。许多有机化合物可在 滴汞电极上还原产生有机极谱波。极谱分析法对一般有机化合物，高分子化合物， 药物和农药等分析是非常有用的【3 6 1 。徐斌等1 3 7 采用线性扫描极谱技术，研究了 薯蓣皂甙元的极谱催化波及应用，研究结果表明，在p h = 5 3 1 - 0 5 的b r 缓冲溶 液、o 1m o l lk c i 和8 x l o 弓m o l lh 2 0 2 的底液中，薯蓣皂甙元产生极谱催化波， 其一阶导数波的峰电位在一1 0 5 ( 似s c e ) 处，峰电流与薯蓣皂甙元浓度在 1 o 1 0 4 8 o x l 0 4m o l l 范围内具有良好的线性关系，检出限为1 0 l o sm o l l 。 1 , 3 4e l i s a 定量分析法 酶联免疫吸附测定( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y , 简称e l i s a ) 或称 酶标记免疫测定，是指固相载体吸附技术和免疫酶测定技术相结合的一类方法。 它先将抗原或抗体吸附( 或称包被) 在固相支持物表面，再通过免疫反应形成酶 标记的抗原抗体复合物，然后加入该酶的适当底物使之生成有色产物，测定其吸 光率以计算出抗原或抗体的数量【3 8 】。 杨红艳等【3 9 i 为检测薯蓣细胞中薯蓣皂甙元的含量，提出了薯蓣皂甙元的 e l i s a 定量分析的可行性。由于薯蓣皂甙元分子量低，本身不具有抗原性，建立 6 中南大学硕士学位论文第一章绪论 薯蓣皂甙元的e l i s a 定量分析方法必须先对结构进行衍生，使其具有活性基团 与大分子相偶联。试验利用薯蓣皂甙元3 位上的o h ，在d m a p 的催化下，薯 蓣皂甙元与丁二酸酐反应，生成薯蓣皂甙元丁二酸单酯，用m s 、瓜、1 hn m r 、 1 3 cn m r 等方法对产物结构进行了表征。用混合酸酐法制备薯蓣皂甙元与牛血 清白蛋白的结合物( d g - h s - b s a ) ，碳二亚胺法制备薯蓣皂甙元与卵清蛋白的结 合物( d g - h s 0 、r a ) ，经t n b s 测定，每个分子结合物连接的薯蓣皂甙元分子数 分别为2 8 0 和8 8 。偶联的产物分别用作制备制备抗体的免疫原和e l i s a 测定时 的包被原。 1 3 5 薄层扫描法 薄层扫描法是指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外 或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱 及积分数据用于鉴别、检查或含量测定。魏永春等【柏】以石油醚一氯仿一甲醇( 1 0 ： 1 0 ：o 5 ) 为展开剂，用2 0 咖l 磷铝酸无水乙醇溶液喷雾显色，在6 5 0n m 波长 处进行检测，结果表明薯蓣皂甙元在0 3 1 s 雌的范围内与峰面积线性关系良 好。 1 3 6 气相色谱分析法 气相色谱法系采用气体为流动相( 载气) 流经装有填充剂的色谱柱进行分离 检测的色谱方法。陶莉1 4 l 】等采用柱温2 7 0 ，汽化温度3 3 0 ，氮气流速5 0 m e m i n 的色谱条件，结果表明薯蓣皂甙元及其主要杂质能有效分离，测定样品无需 衍生化都述虎等【4 2 l 建立了毛细管气相色谱法测定穿龙薯蓣总皂甙中薯蓣皂甙 元的含量，色谱条件为柱温2 7 0 ，柱头压1 2 3 7 k p a ，汽化温度3 3 0 ，检测 温度3 1 0 ，载气流速2 0 m e r a i n ，分流比4 0 ：l ，结果表明薯蓣皂甙元在3 5 2 1 7 5 8n g 范围内峰面积与其浓度线性关系良好， 1 3 7 高效液相色谱分析法 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱 进行分离检测的色谱方法。由于高效液相色谱法适用于高沸点、大分子、强极性 和热稳定性差化合物的分离分析，因此广泛应用于甾类化合物的分离分析。由于 甾体皂甙元在紫外区吸收弱，一般采用在近紫外区透明度较好、背景吸收相对较 低的反相高效液相色谱法对薯蓣皂甙元进行测定。达世禄等1 4 3 1 人采用 z o r b e x - 0 d s ( 1 5 0 x 4 6m m ) 色谱柱，用甲醇作流动相，0 5m e m i n 的流速，采 7 中南大学硕士学位论文第一章绪论 用紫外检测器在2 1 0n m 波长处进行检测。都述虎等 4 4 1 人采用反相高效液相色谱 法对穿龙薯蓣中的薯蓣皂甙元进行了检测，采用肛b o n d a p a kc 1 8 色谱柱，甲醇为 流动相，流速1 0m l m i n ，用二极阵列检测器在2 0 8 啪波长处进行检测，结果 表明薯蓣皂甙元在1 9 0 9 5 1i t g 范围内峰面积与其浓度线性关系良好。刘宏伟 等【4 5 】采用蒸发散射光检测器( e l s d ) ，测定了荜薜总皂甙水解后的薯蓣皂甙元 含量，采用色谱条件：m i g h t y s i lr p 1 8g p ( 4 6m m x l 5 0m m ) 色谱柱；甲醇为 流动相；1 0m l m i n 流速，结果表明薯蓣皂甙元在4 2 4l a g 范围内线性关系良 好。蒸发散射光检测器的响应值只与样品的质量有关，而与有无紫外吸收无关， 适用于无紫外吸收或紫外吸收很弱的样品。 1 4 薯蓣皂甙元提取方法的研究进展 1 4 1 自然发酵酸水解法 此法采用发酵一酸水解一提取工艺提取薯蓣皂甙元，首先将盾叶薯蓣粉碎，在 一定温度下进行发酵，加酸水解，接着将水解产物进行过滤，水洗或加碱至中性， 烘干后用非极性溶剂进行回流提取，王元兰等 4 6 1 采用发酵水解法对盾叶薯蓣中 薯蓣皂甙元进行提取，并考察了发酵时间、水解时间、抽提物的p h 值和回流速 度对薯蓣皂甙元收率的影响。结果表明发酵4 8 小时，水解4 小时，抽提物d h 值为近中性和回流速度为2 5r a i n 次条件下，可获得最佳的薯蓣皂甙元收率。 1 4 2 二次酸水解法 对直接酸水解后的盾叶薯蓣残渣进行二次酸水解，可使薯蓣皂甙元的收率有 所提高。于武江等 4 7 1 通过正交实验研究了二次酸水解法提取薯蓣皂甙元的工艺 条件，结果表明二次酸水解法比直接酸水解法的薯蓣皂甙元收率提高了9 5 5 ， 并通过熔点、元素分析法、红外、核磁共振等一系列的表征手段表明，二次酸水 解法从盾叶薯蓣中提取出的产品为纯度较高的薯蓣皂甙元，符合工业生产的要 求，也证明了二次水解法的可行性。 1 4 3 酶解酸水解法 对盾叶薯蓣发酵时加入纤维素酶或淀粉酶，可使原料中的淀粉或纤维素类物 质得到分解，有利于薯蓣皂甙向薯蓣皂甙元转化并有利于薯蓣皂甙元从植物组织 细胞中释放出来 4 8 1 。酶都是结构特异的蛋白质，决定了与化学催化剂相比，具 有独特的性质，高度专一性：酶在其空间结构中由几个氨基酸残基构成极小空 间或者区域成为酶的“活性中心”，它包括结合部位和催化部位。前者处于与底 8 中南大学硕士学位论文第一章绪论 物结合位置，决定酶的高度专一性，后者决定酶的催化类型、性质，两者缺一不 可，互相配合，使酶具有高度催化效率。温和的催化反应条件：生物催化反应 一般在2 0 4 0 、p h 4 9 的条件便可顺利进行，因此，相对来说，能耗低，设 备要求低，并且无需特殊的专用设备，条件比较温和。并且生物催化反应一般在 水溶液中进行，所需试剂简单。反应底物来源广泛：生物催化剂催化的反应物 可以是化学品，也可以是农、林、畜、渔业的产品或者副产品，甚至是他们的废 水或是废物嗍。张彩霞等i f , o 认为植物药的细胞壁是由纤维素构成，而植物的有 效成分被包裹在细胞壁内，纤维素是f h d - d - 葡萄糖以1 ，4 b 葡萄糖甙键连结，纤 维素酶可以破坏1 3 d 葡萄糖键，使细胞壁破坏，并增加有效成分溶出率，从而提 高提取率。他们在对穿龙薯蓣提取薯蓣皂甙元中采用了纤维素酶对样品进行了酶 解处理，用硫酸调p h 值至5 0 ，加入纤维素酶充分搅拌，置于4 0 恒温水浴9 0 r a i n ，结果表明提高了薯蓣皂甙元的收率。佟玲等睁l j 通过正交实验研究了盾叶薯 蓣提取薯蓣皂甙元的酶解工艺，其结果表明，1 5 0g 盾叶薯蓣在3 5 0m l 水、3 0m l 淀粉酶、4 0 下酶解1 2h 的条件下，薯蓣皂甙元的收率最高。张裕卿掣5 2 】利用 阶梯生物催化协同提取盾叶薯蓣中的薯蓣皂甙元，采用纤维素酶和果胶酶复合制 剂、淀粉酶及糖化酶的协同作用，对盾叶薯蓣进行阶梯生物催化，并通过正交实 验确定了阶梯生物催化协同提取技术的最佳条件。从薯蓣皂甙元在植物中的存在 形式解释了阶梯生物催化协同提取技术的机理，张裕卿等认为，在植物中，薯蓣 皂甙元和糖链连接形成薯蓣皂甙，大量的淀粉颗粒与皂甙共混存于细胞的主要部 分，外部被纤维组织组成的细胞壁包裹着，同时还有果胶等杂质存在。纤维素酶 和果胶酶复合酶制剂可以促进d d - 葡萄糖甙键的水解而破坏植物细胞壁，并可以 使果胶等充分的分解掉，有利于有效成分的析出；淀粉酶可部分分解淀粉使粘稠 的原料液黏度降低，进一步使皂甙裸露出来；糖化酶可以使薯蓣皂甙连接的糖链 部分断裂。通过生物酶的阶梯处理，可以使薯蓣药材中包裹着薯蓣皂甙的杂质分 解掉，生成次级皂甙，空问位阻减少，从而在水解时能够最大限度地将薯蓣皂甙 转化成薯蓣皂甙元，使薯蓣皂甙元的提取收率提高。 1 4 4 分离法 分离法加工薯蓣植物的工艺技术是将薯蓣根茎带水磨碎，在水中筛分，将各 有用成分分开后，分别采用适宜的方法加工利用。周振起等【5 3 】在实验中加自来 水浸泡穿龙薯蓣1 2h ，滤去多余的水，研磨，加1 0 倍的水搅匀，先过4 0 日筛， 再过1 0 0 目筛，重复研磨过筛几次，直至渣中无明显颗粒为止，合并滤液，加 0 1 的明矾，沉淀1 2h ，倾去上层清夜，加水至原体积，搅匀、沉淀，重复洗 二次，调p h 为6 5 ，加液化酶2 0 0 单位幢绝干淀粉，搅拌升温至9 0 ，保温0 5 9 中南大学硕士学位论文 第一章绪论 h ，使淀粉液化，降温至6 0 ，调p h 为4 4 ，加糖化酶2 0 0 单位儋绝干淀粉， 保温8h ，分出糖液，糖渣用盐酸水解，1 2 0 # 汽油提取得薯蓣皂甙元。其提高薯 蓣皂甙元收率的原因解释为：据资料报道，薯蓣植物中所含原始甙的c 3 位上的 寡糖多为支链寡糖，由于c 3 位上结合的支链糖产生位阻，水解不完全。薯蓣皂 甙和淀粉存在于薯蓣植物细胞中，被严密的植物组织包围和有大量淀粉的存在， 干扰了薯蓣原始甙的酸水解。应用分离法制取薯蓣皂甙元，将植物体带水磨碎， 把纤维束搓开，分出淀粉和皂甙，使包围皂甙的严密组织解体了，皂甙或被水解 形成的次级甙游离出来，催化剂才能容易地接触到皂甙分子，进行全面地催化水 解作用。应用酶制剂将淀粉转化为糖，排除了对皂甙酸性水解的干扰，同时在酶 的作