硕士学位论文-CD44v6、整合素αvβ3、EGFR及E-钙粘素在A549和SK-OV-3细胞系的表达差异与远处转移关系的研究.doc

CD44v6、整合素v3、EGFR及E-钙粘素在A549和SK-OV-3细胞系上表达的差异与远处转移关系的研究The Research of Relationship between Distant Metastasis and the Difference of Expression Levels of CD44v6, Integrinv3, EGFR and E-cadherin in A549 and SK-OV-3 Cell Lines 作 者：何松原 导 师：雷开键 教授 二一四年五月中图分类号学校代码UDC密 级授予单位川北医学院CD44v6、整合素v3、EGFR及E-钙粘素在A549和SK-OV-3细胞系的表达差异与远处转移关系的研究The Research of Relationship between Distant Metastasis and the Difference of Expression Levels of CD44v6, Integrinv3, EGFR and E-cadherin in A549 and SK-OV-3 Cell Lines作 者何松原导 师雷开键培养院系临床医学院授位类别科学学位授位级别硕士学科门类医学学科专业肿瘤学研究方向肿瘤化疗与生物治疗年 级2011级学 号201102076二一四年五月致 谢时光荏苒，我的三年研究生学习生涯即将结束。毕业之际，谨向我尊敬的导师雷开键教授、贾钰铭教授、谭榜宪教授以及所有关心、支持和帮助过我的老师、同学们致以最诚挚的谢意。衷心地感谢导师雷开键教授三年来在临床和科研上严格要求，孜孜不倦的教诲以及生活上无微不至的关怀。导师崇高的医德、渊博的知识、精湛的医术以及过硬的医患沟通技巧，使我终身获益。衷心地感谢贾钰铭教授、谭榜宪教授给予我同样的关心和帮助。衷心地感谢母校川北医学院给我这次研究生深造的机会。衷心地感谢宜宾市第二人民医院给我良好的学习环境和生活上的保障。衷心地感谢宜宾市第二人民医院生物实验室谢敏老师、彭芳芳老师在科研上的建议和帮助。衷心地感谢宜宾市第二人民医院检验科陈江主任、施绍瑞老师对我实验的指导和帮助。衷心地感谢肿瘤科叶序卷、张跃宜副主任医师，钟俐强、汪善兵、张霞、李娜、江茂琼医师及王静护士长对我的帮助和支持。衷心地感谢各位评委老师对我文章的细心审阅和指导。衷心地感谢家人的理解和支持。CD44v6、整合素v3、EGFR及E-钙粘素在A549和SK-OV-3细胞系的表达差异与远处转移关系的研究 摘 要目的：利用流式细胞仪检测肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中CD44v6、整合素v3、EGFR及E-钙粘素的表达水平差异，进一步探讨这些差异与肺癌和卵巢癌远处转移的关系。方法：培养肺癌A549细胞和卵巢癌SK-OV-3细胞生长至对数期，消化并收集细胞悬液，调整细胞浓度至流式细胞仪专用抗体所要求的浓度。利用流式细胞仪分组检测两种细胞系CD44v6、整合素v3、EGFR及E-钙粘素的表达水平，每组6个样本。数据采用SPSS19.0软件（中文版）进行统计学分析，计量资料组间差异采用两独立样本t检验，检验水准为P0.05。 结果：CD44v6在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达的阳性率分别为（93.482.97）%和（82.734.28）%；整合素v3在肺癌A549细胞株和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达的阳性率分别为（95.422.26）%和（83.601.26）%；EGFR在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达的阳性率分别为（94.303.43）%和（88.520.88）%。CD44v6、整合素v3、EGFR这三种表面分子在肺癌A549细胞系中的表达均高于卵巢癌SK-OV-3细胞系，有统计学意义（P0.01）。E-钙粘素在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达的阳性率分别为（94.521.59）%和（86.963.07）%，有统计学意义（P0.05）。 结论：促转移分子CD44v6、整合素v3、EGFR在肺癌A549细胞系的表达高于卵巢癌SK-OV-3细胞系，抑制转移分子E-钙粘素在肺癌A549细胞系的表达也高于卵巢癌SK-OV-3细胞系，综合考虑，这可能是肺癌比卵巢癌更容易发生远处转移特别是脑转移的部分分子机制。 关键词：A549；SK-OV-3；CD44v6；整合素v3；EGFR；E-钙粘素；远处转移The Research of Relationship between Distant Metastasis and the Difference of Expression Levels of CD44v6, Integrinv3, EGFR and E-cadherin in A549 and SK-OV-3 Cell LinesAbstractObjective: To investigate the expression levels of CD44v6, Integrin v3, EGFR and E-cadherin in A549 cell lines and SK-OV-3 cell lines using flowcytometry and to further analyze the relationship between the differences of these molecules and distant metastasis in lung cancer and ovarian cancer.Methods: A549 cell lines and SK-OV-3 cell Lines were cultured to exponential period. The two cell lines were collected and adjusted to the concentrations to suffice the requests of antibodies conducting flowcytometry. Expression levels of CD44v6, Integrinv3, EGFR and E-cadherin in A549 cell lines and SK-OV-3 cell lines were detected. The SPSS 19.0(Chinese version) was used for statistical analysis. The differences of these molecules were compared using independent samples t test. P value less than 0.05 was considered statically significant.Result: The positive rates of CD44v6 in A549 cell lines and SK-OV-3 cell lines were (93.48 2.97)% and (82.73 4.28)%，respectively. The positive rates of integrinv3 in A549 cell lines and SK-OV-3 cell lines were（95.422.26）% and （83.601.26）%，respectively. The positive rates of EGFR in A549 cell lines and SK-OV-3 cell lines were（94.303.43）% and （88.520.88）%，respectively. The positive rates of the aforementioned three markers were higher in A549 cell lines than those in SK-OV-3 cell lines（P0.01）. The positive rates of E-cadherin in A549 cell lines and SK-OV-3 cell lines were（94.521.59）% and （86.963.07）%，respectively，with statistical difference（P0.05）.Conclusions: The positive rates of CD44v6, integrinv3 and EGFR which all increase the risk of metastasis in A549 cell lines are higher than those in SK-OV-3 cell lines. The positive rate of E-cadherin which decreases the risk of metastasis in A549 cell lines is also higher than that in SK-OV-3 cell lines. Taken together, the results may suggest the part of reason why lung cancer has distant metastasis, especially brain metastasis more easily than ovarian cancer. Key words: A549, SK-OV-3, CD44v6, integrinv3, EGFR, E-cadherin, distant metastasis目 录前言1材料与方法2结果 10讨论 15结论 25附图 26参考文献33综述38参考文献44附录48个人简历49原创性声明及版权使用授权说明50 川北医学院硕士学位论文前言远处转移是恶性肿瘤重要的生物学特征之一，不同来源的恶性肿瘤远处转移发生率有明显的差异。其中脑转移严重影响患者的生活质量及预后。肺癌恶性程度高，容易发生远处转移，约40%患者在确诊时已经发生远处转移。其中肝转移、骨转移、脑转移及肾上腺转移发生率较高。李凤虎等1统计546例期NSCLC患者不同器官远处转移率高低顺序分别为骨53.8、脑30.6、肺25.1、肝14.5、肾上腺12.1、远处淋巴结6.8、皮下6.4、胰腺0.7、甲状腺0.5和脾0.5%。另有报道肺癌脑转移率高达80%2-3。卵巢癌位于盆腔中，通过种植途径发生腹盆腔转移较常见，而其他组织及器官的远处转移明显低于肺癌，有报道4卵巢癌发生实质器官的转移率小于5%，特别是脑转移极少见。有报道，卵巢上皮细胞癌（epithelial ovarian cancer, EOC）脑转移发生率平均为0.95-10。许多学者都注意到卵巢癌不容易脑转移的现象，其机制却鲜有研究。推测可能与以下因素有关：1、血脑屏障的阻挡作用；2、腹膜屏障的阻挡作用；3、肺癌细胞和卵巢癌细胞的侵袭能力存在差异； 4显微镜镜下观察可以看出卵巢癌SK-OV-3细胞比肺癌A549细胞体积大，卵巢癌细胞可能不容易透过血脑屏障。杜琴11分别将卵巢癌SK-OV-3细胞和肺癌A549细胞通过尾静脉、腹腔、颈总动脉及颅内四种途径注入裸鼠体内，观察脑、肺及腹腔转移情况。结果发现：把肺癌和卵巢癌细胞株直接注入裸鼠颅内，两种癌细胞的成瘤率均非常高，无统计差异。通过尾静脉、腹腔和颈总动脉途径，肺癌细胞可进入颅内生长成肿瘤，而卵巢癌细胞不能进入颅内。此外，卵巢癌细胞发生肺转移、腹腔转移率均低于肺癌细胞。由此可以推测：1、卵巢癌细胞的侵袭力可能低于肺癌细胞；2、血脑屏障和腹膜屏障可以阻挡卵巢癌细胞，但不能阻挡肺癌细胞，原因有待进一步探讨。肺癌细胞与卵巢癌细胞的远处转移特别是脑转移率的差异是由于两种癌细胞表面结构存在差异所致。随着肿瘤分子生物学的发展，肿瘤细胞表面的分子结构及功能越来越清楚。有些细胞分子促进肿瘤转移，例如CD44v6、EGFR、 整合素v3；有些细胞分子抑制肿瘤转移，例如nm-23、E-cadherin。比较肺癌细胞与卵巢癌细胞表面的转移相关分子的差异，可以进一步揭示卵巢癌不易发生远处转移特别是脑转移的分子机制。本研究利用流式细胞仪检测肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中促转移分子CD44v6、整合素v3、EGFR及抑制转移分子E-钙粘素的表达水平，并分析这两种癌细胞中上述转移相关分子的差异，探讨临床上肺癌与卵巢癌脑远处转移特别是脑转移率存在差别的原因，目前国内外未见相关文献报道。卵巢癌不易发生远处转移特别是脑转移机制的研究对肺癌远处转移的防治有重要的指导意义。1 材料与方法1.1 材料1.1.1癌细胞系（1）肺癌A549细胞系：第4代 购于中国科学院上海生命科学院（2）卵巢癌SK-OV-3细胞系：第5代 购于中国科学院上海生命科学院1.1.2癌细胞培养基（1）肺癌A549细胞系培养基：改良型RPMI-1640培养基 Thermo fisher 货号：SH30809.01B（2）卵巢癌SK-OV-3细胞系培养基：HyClone DMEM高糖培养基：Thermo fisher 货号：SH30249.011.1.3主要试剂（1）人抗CD44v6流式单克隆抗体：Monoclonal Anti-human CD44v6-Phycoerythrin R&D 货号：FAB3660P（2）人抗整合素v3流式单克隆抗体：Monoclonal Anti-human Integrinv3(CD51/CD61)- Phycoerythrin R&D 货号：FAB3050P（3）人抗EGFR流式单克隆抗体：PE Mouse Anti-human EGF Receptor BD货号：555997（4）人抗E-钙粘素流式单克隆抗体：PE Mouse Anti-E-cadherin BD货号：562526（5）FBS(胎牛血清) HyClone 100ml/支（6）胰酶粉 100g/瓶 上海（7）DMSO（二甲基亚砜）100ml/支 上海（8）EDTA（乙二胺四乙酸）50g/瓶 上海（9）等渗PBS缓冲液(1) 500ml/瓶 上海1.1.4主要仪器（1）水热型CO2 培养箱：Thermo scientific SERIES（2）生物安全柜：Thermo scientific 1300 SERIES A2（3）离心机：Thermo scientific Sorvall ST 16（4）细胞培养瓶：Corning T75（5）流式细胞仪： BD FACSCanto （6）电动移液器：Thermo Fisher S1 0.1ml-100ml（7）手动移液器：Thermo Fisher 1l-10l；10l-100l（8）涡旋混合器： 上海（9）流式检测管：BD 5ml/支（10）离心管Corning 20ml/支（11）显微镜：OLYMPUS（12）细胞计数板：求精 上海（13）Eppendorf管：2ml 上海（14）超低温冰箱 SANYO （15）医用冷藏柜 海尔（16）恒温水浴箱 上海1.2 实验方法1.2.1实验试剂的制备1.2.1.1胎牛血清的处理将-80冻存的胎牛血清取出，4条件下自然解冻过夜，然后在56水浴灭活2小时，取出摇匀，10ml/支分装，-20冻存。使用前37水浴融化。1.2.1.2含10%FBS的癌细胞培养基的配制将分装后的胎牛血清水浴融化；取改良型RPMI-1640培养基和DMEM高糖培养基各90ml，加入10ml的胎牛血清，混匀，即为癌细胞培养基。2-4条件下保存待用。1.2.1.3消化液的配制 （1）量取100ml PBS缓冲液；（2）称取胰酶0.25g和EDTA0.02g；（3）将上述称取的试剂加入100mlPBS缓冲液中，常温低速搅拌至完全溶解无颗粒；（4）0.22m无菌滤膜过滤除杂，20ml/支无菌分装，-20保存，一周内用完。1.2.1.4 癌细胞洗液的配制取出预先冻存的胎牛血清，水浴融化。取500ml等渗PBS缓冲液(1)，加入2.5ml的胎牛血清（0.5%），混匀，0.22m无菌滤膜过滤除杂，-20保存。1.2.2肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系的培养1.2.2.1细胞系复苏（1）从液氮罐中取出预先冻存的两种癌细胞系；（2）用止血钳夹住冻存管放在37水浴箱中快速解冻；（3）解冻至冻存管中冰晶完全融化时离心（3000转/分钟，5分钟 常温）；（4）快速移除冻存管中细胞冻存液；（5）将细胞的沉淀用对应的培养基充分重悬；（6）把细胞悬液转到T75斜颈细胞培养瓶中；（7）补足相应的培养基至8ml（铺满瓶底即可）；（8）显微镜下观察细胞形态是否正常，细胞状态是否良好；（9）将复苏的癌细胞进行培养（CO2浓度为5%，温度为37）；（10）6小时后显微镜下观察复苏是否成功。1.2.2.2癌细胞系的传代镜下观察细胞生长状况，若癌细胞铺满瓶底80%时即可传代。移除旧培养液，加入2ml上述配好并预热的消化液轻轻洗一遍，再加入2-3ml消化液，并使其分布均匀，显微镜下观察癌细胞间隙增大，开始退缩时终止消化，加入对应的癌细胞培养基4ml，轻柔吹打细胞脱落至单个细胞悬液状态，按1传3的比例传代至3个培养瓶中继续培养。1.2.3样本准备（按照试剂说明书操作） （1）用上述配好并预热的消化液分别消化肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系；（2）离心收集癌细胞（500g，5分钟，常温）；（3）用上述配好的等渗PBS缓冲液洗3次（500g，5分钟，常温）；（4）重悬癌细胞，收集并计数；（5）用细胞洗液调整细胞终浓度为4106/ml和1107/ml（Monoclonal Anti-human CD44v6-Phycoerythrin试剂、Monoclonal Anti-human Integrinv3(CD51/CD61)-Phycoerythrin试剂要求细胞浓度为4106/ml；PE Mouse Anti-human EGF Receptor试剂、PE Mouse Anti-E-cadherin试剂要求细胞浓度为1107/ml）。1.2.4利用流式细胞仪分组检测1.2.4.1流式细胞仪检测CD44v6在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系表达水平（按照购买试剂说明书的具体步骤操作）。（1）样本分组：A549实验组6管，分别标记为A1-1、A1-2、A1-3、A1-4、A1-5、A1-6；SK-OV-3实验组6管，分别标记为S1-1、S1-2、S1-3、S1-4、S1-5、S1-6；同时准备A549同型对照管和SK-OV-3同型对照管。（2）A549实验组6管及A549同型对照管加25l浓度为4106/ml的肺癌A549细胞悬液；SK-OV-3实验组6管及SK-OV-3同型对照管加25l浓度为4106/ml的卵巢癌SK-OV-3细胞悬液。（3）A549实验组6管及SK-OV-3实验组6管样本中分别加入10l Monoclonal Anti-human CD44v6-Phycoerythrin，A549同型对照管和SK-OV-3同型对照管中加入5l PE标记的Anti-human IgG。（4）2-8条件下避光反应35分钟。（5）用预先配好的等渗PBS缓冲液4ml洗涤癌细胞以去除未与癌细胞结合的CD44v6抗体，重复2次。（6）用预先配好的等渗PBS缓冲液300l重悬癌细胞。（7）将所有样本用流式细胞仪检测分析。每个样本计数10000个细胞，参照同型对照结果设立阳性标准，得出A549实验组6个样本和SK-OV-3实验组6个样本的CD44v6阳性表达百分率。1.2.4.2流式细胞仪检测整合素v3在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系表达水平（按照购买试剂说明书的具体步骤操作）。（1）样本分组：A549实验组6管，分别标记为A2-1、A2-2、A2-3、A2-4、A2-5、A2-6；SK-OV-3实验组6管，分别标记为S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5、S2-6；同时准备A549同型对照管和SK-OV-3同型对照管。（2）A549实验组6管及A549同型对照管加25l浓度为4106/ml的肺癌A549细胞悬液；SK-OV-3实验组6管及SK-OV-3同型对照管加25l浓度为4106/ml的卵巢癌SK-OV-3细胞悬液。（3）A549实验组6管及SK-OV-3实验组6管样本中分别加入10l Monoclonal Anti-human Integrinv3(CD51/CD61)-Phycoerythrin，A549同型对照管和SK-OV-3同型对照管中加入5l PE标记的Anti-human IgG。（4）2-8条件下避光反应35分钟。（5）用预先配好的等渗PBS缓冲液4ml洗涤癌细胞以去除未与癌细胞结合的整合素v3抗体，重复2次。（6）用预先配好的等渗PBS缓冲液300l重悬癌细胞。（7）将所有样本用流式细胞仪检测分析。每个样本计数10000个细胞，参照同型对照结果设立阳性标准，得出A549实验组6个样本和SK-OV-3实验组6个样本的整合素v3阳性表达百分率。1.2.4.3流式细胞仪检测EGFR在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系表达水平（按照购买试剂说明书的具体步骤操作）。（1）样本分组：A549实验组6管，分别标记为A3-1、A3-2、A3-3、A3-4、A3-5、A3-6；SK-OV-3实验组6管，分别标记为S3-1、S3-2、S3-3、S3-4、S3-5、S3-6；同时准备A549同型对照管和SK-OV-3同型对照管。（2）A549实验组6管及A549同型对照管加100l浓度为1107/ml的肺癌A549细胞悬液；SK-OV-3实验组6管及SK-OV-3同型对照管加100l浓度为1107/ml的卵巢癌SK-OV-3细胞悬液。（3）A549实验组6管及SK-OV-3实验组6管样本中分别加入20l PE Mouse Anti-human EGF Receptor，A549同型对照管和SK-OV-3同型对照管中加入5l PE标记的Anti-human IgG。（4）2-8条件下避光反应35分钟。（5）用预先配好的等渗PBS缓冲液4ml洗涤癌细胞以去除未与癌细胞结合的EGFR抗体，重复2次。（6）用预先配好的等渗PBS缓冲液300l重悬癌细胞。（7）将所有样本用流式细胞仪检测分析。每个样本计数10000个细胞，参照同型对照结果设立阳性标准，得出A549实验组6个样本和SK-OV-3实验组6个样本的EGFR阳性表达百分率。1.2.4.4流式细胞仪检测E-钙粘素在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系表达水平（按照购买试剂说明书的具体步骤操作）。（1）样本分组：A549实验组6管，分别标记为A4-1、A4-2、A4-3、A4-4、A4-5、A4-6；SK-OV-3实验组6管，分别标记为S4-1、S4-2、S4-3、S4-4、S4-5、S4-6；同时准备A549同型对照管和SK-OV-3同型对照管。（2）A549实验组6管及A549同型对照管加100l浓度为1107/ml的肺癌A549细胞系悬液；SK-OV-3实验组6管及SK-OV-3同型对照管加100l浓度为1107/ml的卵巢癌SK-OV-3细胞系悬液。（3）A549实验组6管及SK-OV-3实验组6管样本中分别加入5l PE Mouse Anti-E-cadherin，A549同型对照管和SK-OV-3同型对照管中加入5l PE标记的Anti-human IgG。（4）2-8条件下避光反应35分钟。（5）用预先配好的等渗PBS缓冲液4ml洗涤癌细胞以去除未与癌细胞结合的E-钙粘素抗体，重复2次。（6）用预先配好的等渗PBS缓冲液300l重悬癌细胞。（7）将所有样本用流式细胞仪检测分析。每个样本计数10000个细胞，参照同型对照结果设立阳性标准，得出A549实验组6个样本和SK-OV-3实验组6个样本的E-钙粘素阳性表达百分率。1.3 统计分析 数据采用SPSS19.0软件（中文版）进行统计学分析，计量资料组间差异采用两独立样本t检验，以P0.05为差异具有统计学意义。2 结果2.1 CD44v6在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达的阳性率检测结果及比较CD44v6在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达的阳性率分别为（93.482.97）%、（82.734.28）%，通过统计分析，肺癌A549细胞系表达CD44v6高于卵巢癌SK-OV-3细胞系，有统计学意义（P0.05）。（见表1、表5）2.2整合素v3在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达的阳性率检测结果及比较整合素v3在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达的阳性率分别为（95.422.26）%、（83.601.26）%，通过统计分析，肺癌A549细胞系表达v3高于卵巢癌SK-OV-3细胞系，有统计学意义（P0.05）。（见表2、表5）2.3 EGFR在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达的阳性率检测结果及比较EGFR在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达的阳性率分别为（94.303.43）%、（88.520.88）%，通过统计分析，肺癌A549细胞系表达EGFR高于卵巢癌SK-OV-3细胞系，有统计学意义（P0.05）。（见表3、表5）2.4 E-钙粘素在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达的阳性率检测结果及比较E-钙粘素在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达的阳性率分别为（94.521.59）%、（86.963.07）%，通过统计分析，肺癌A549细胞系表达E-钙粘素高于卵巢癌SK-OV-3细胞系，有统计学意义（P0.05）。（见表4、表5）表1 CD44v6在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系表达的阳性率编号A549SK-OV-31.97.3%74.8%2.90.1%83.4%3.93.5%84.1%4.90.3%84.3%5.696.3%93.4%87.6%82.2%表2 整合素v3在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系表达的阳性率编号A549SK-OV-31.98.7%83.7%2.92%85.8%3.95.5%83.6%4.96.8%82%5.6.95.1%94.4%82.9%83.6%表3 EGFR在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系表达的阳性率编号A549SK-OV-31.88.8%88.9%2.97.7%88.4%3.96.7%90%4.92.2%88%5.6.96.8%93.6%88.4%87.4%表4 E-cadherin在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系表达的阳性率编号A549SK-OV-31.95.2%83.6%2.96.9%91.7%3.92.9%88%4.93.4%85.6%5.94.2%85.9%53表5 肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系表达CD44v6、整合素v3、EGFR及E-钙粘素的阳性率比较(s)类别NCD44v6 (%)P值N整合素v3 (%)P值NEGFR (%)P值NE-钙粘素 (%)P值A549693.482.97695.422.26694.303.43594.521.59SK-OV-3682.734.280.000683.601.260.000688.520.880.008586.963.070.013.讨论3.1恶性肿瘤发生远处转移的机制是否发生远处转移是恶性肿瘤与良性肿瘤最主要的区别之一。流行病学调查显示，大量恶性肿瘤患者的死亡主要是由远处转移引起。特别是脑转移严重影响恶性肿瘤患者的生活质量和预后。不同来源的恶性肿瘤在侵润和转移方面存在巨大的差异，例如肺癌、肝癌等容易发生远处转移，甲状腺癌发生远处转移相对少见。同一来源的恶性肿瘤中不同病理类型也存在差异，例如小细胞肺癌发生脑转移远多于非小细胞肺癌。癌细胞的远处转移是一个复杂的生物学过程。癌细胞主要通过血液途径发生远处转移，涉及以下几个步骤：（1）肿瘤新生血管形成；（2）肿瘤从原发灶脱落，穿透基底膜，侵润周围正常组织；（3）癌细胞侵犯血管，进入血液循环；（4）癌细胞在血液循环中运行和存活；（5）癌细胞停滞在远处器官的毛细血管床，可能是因为癌细胞在毛细血管的狭窄处被阻挡，随后穿过血管内皮细胞形成转移灶，也可能是癌细胞表面蛋白与毛细血管内皮表面蛋白的特异性结合从而在远处组织形成转移灶。癌细胞也可以通过淋巴管发生远处转移，近年来研究发现，恶性癌组织和癌旁组织内存在新生的淋巴管，具体的转移机制目前还不清楚。此外，个别肿瘤还可以通过腹膜种植转移，例如晚期胃癌癌细胞从原发灶脱落，种植在卵巢组织上形成转移灶，也称为Krukenberg瘤。 目前关于癌细胞发生远处转移的分子机制的研究已经取得较大的进展。有些基因产物促进恶性肿瘤发生转移，而有些基因产物抑制肿瘤转移，分别称之为转移相关基因和转移抑制基因。许多癌基因，例如ras、fos、mos、src，或突变了的转移抑制基因如p53基因突变型，都可以编码促进转移的蛋白分子，促进肿瘤转移。转移抑制基因可以编码具有抑制癌细胞转移的蛋白分子，如nm23基因是其中具有明确抑制癌细胞远处转移作用的转移抑制基因。有文献报道，nm23-H1基因能抑制体外培养的肺癌细胞株A549细胞的增殖12。在I期非小细胞肺癌中，nm23-H1mRNA的表达在肺癌淋巴结微转移阳性组低于微转移阴性组13。有学者发现，在有血管和淋巴结转移的肺癌标本中nm23低表达14。均证实了nm23基因的抑制转移作用。文献报道还有其他一些细胞表面分子与癌细胞远处转移密切相关，例如E-cadherin抑制转移，CD44v6、EGFR和整合素v3促进转移。本研究从检测肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系的一些与肿瘤远处转移相关的分子入手，探讨肺癌与卵巢癌存在不同远处转移率特别是脑转移率的原因，目前国内外未见相关报道。3.2 CD44v6在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达水平差异及与远处转移的关系CD44是一种细胞表面黏附分子，它是由单个基因所编码的一类位于细胞膜上的跨膜糖蛋白，广泛存在于正常的上皮组织和非上皮组织中。人类的CD44基因定位在第11号染色体上,由20个外显子及插入其间的内含子组成。其中有10个外显子稳定表达，编码标准型CD44蛋白(即CD44s) , 主要在造血源性细胞和间质细胞中表达，主要介导细胞与细胞之间以及细胞与基质之间的黏附。其他的10个外显子以多种组合插到稳定表达的外显子中间，编码一组变异型CD44蛋白(即CD44v) , 主要于肿瘤细胞和上皮源性细胞中表达。目前已发现10多种CD44v，其中CD44v6与肿瘤远处转移的关系最为密切。Sari等15用免疫组化方法检测307例卵巢上皮细胞癌中CD44s的表达，结果显示高分化卵巢癌、卵巢粘液性腺癌和早期卵巢癌中CD44s高表达。在单变量分析中，CD44s高表达患者5年总生存率及5年无复发生存率更高，提示CD44s是卵巢癌预后良好的指标。而CD44v则促进恶性肿瘤转移，是预后不良的指标。Penno等16用CD44v高表达的癌细胞株接种到大鼠后，其肺部形成了多个肉眼可见的癌转移灶。而CD44v低表达的癌细胞株接种大鼠后，其肺部只出现了1-2个镜下可见的癌转移灶。这说明CD44v可以促进肿瘤发生远处转移。文献报道17-19多种肿瘤CD44v6表达升高，与肿瘤远处转移及预后有关。CD44v6在各种肿瘤中广泛表达，肺癌表达较高。Takanori等20用RT-PCR法检测61例非小细胞肺癌中CD44v6的表达率为59%(39/61),用免疫组化方法检测30例非小细胞肺癌CD44v6的表达率为76.7%(23/30)，正常肺组织中几乎不表达或弱表达。有淋巴结转移的非小细胞肺癌CD44v6的表达率为79.3%(23/29),无淋巴结转移的非小细胞肺癌CD44v6的表达率为40.76%(13/32)，两者有统计学差异。说明CD44v6促进非小细胞肺癌发生远处转移。CD44v6在卵巢癌中也有不同程度的表达。Shi等21用PCR法检测卵巢癌标本中CD44v6 mRNA的表达，复发的卵巢癌标本中CD44v6 mRNA的表达水平远远高于原发的卵巢癌。用蛋白质印迹法也得出同样的结果，但是CD44s在复发卵巢癌和原发卵巢癌中的表达没有差别。腹腔转移灶、盆腔转移灶及原发灶的CD44s在mRNA水平和蛋白质水平无明显差别，而腹腔转移灶表达的CD44v6及CD44v6 mRNA都高于盆腔转移灶和原发灶。说明CD44v6表达越高，癌细胞可能越容易转移，转移的距离越远。卵巢癌的腹盆腔转移与CD44v6密切相关。此外，该学者用免疫组化方法测得卵巢癌期、期、期（FIGO分期）CD44v6阳性表达率分别为42.12%、83.33%、85.00%。胡雪梅等22应用免疫组化SP法检测35例卵巢癌中CD44v6的阳性表达率为88.6%。CD44v6是广泛表达在各种恶性肿瘤中的促进转移分子。本实验中CD44v6在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达的阳性率分别为（93.482.97）%和（82.734.28）%，肺癌A549细胞系表达CD44v6高于卵巢癌SK-OV-3细胞系。肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系来源于人体肿瘤组织，我们假设目前经过传代的癌细胞系与人体相应癌细胞具有相似性，本实验说明CD44v6在促进肺癌细胞更容易发生远处转移中起了一定的作用。3.3 整合素v3在肺癌A549细胞株系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达水平差异及与远处转移的关系整合素家族是一类由一个亚单位和亚单位组成的异二聚体跨膜糖蛋白。整合素v3是整合素家族成员之一，它介导细胞与细胞、细胞与基质的黏附，与肿瘤血管生成和远处转移密切相关。正常细胞中整合素v3表达低或检测不到，但在一些肿瘤细胞表达上调，现已证实在黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和恶性胶质瘤中有不同程度表达。整合素v3促进肿瘤细胞远处转移与其增强肿瘤细胞与细胞外基质的粘附能力有关。另外，整合素v3还可以调节细胞信号传导途径，激活蛋白水解酶，导致细胞外基质和细胞基底膜降解，促进癌细胞发生侵润和远处转移。先前的研究发现23，整合素v3的表达还与恶性肿瘤的分化和恶性程度相关。低分化肿瘤中整合素v3高表达，而较高分化的肿瘤中整合素v3表达较低或接近正常。李娜等24采用RT-PCR、Western-blot和免疫荧光染色比较小细胞肺癌特异性骨转移细胞系SBC-5和非骨转移细胞系SBC-3 中整合素v3的表达差异。结果显示SBC-5细胞系中整合素v3 mRNA和蛋白含量明显高于SBC-3细胞系且细胞表面的整合素v3免疫荧光明显较SBC-3细胞系多，说明整合素v3可能促进癌细胞发生骨转移。Abegrin (etaracizumab)是整合素v3的人源化单克隆抗体。有学者发现25，它可以在较低水平抑制SKOV3, HeyA8和 A2780三种卵巢癌细胞的增殖和侵袭能力。该学者用Abegrin (etaracizumab)治疗SKOV3和HeyA8两种卵巢癌细胞成瘤的裸鼠，可以使肿瘤缩小36%-49%，减小PCNA（增殖细胞核抗原）。可以间接说明整合素v3与恶性肿瘤的侵袭、转移相关。Jin等26用免疫组化方法检测208例非小细胞肺癌组织中整合素v3的阳性表达率为76%（158/208），而208例癌旁正常组织中的整合素v3的阳性表达率为24%（50/208）。有淋巴结转移的非小细胞肺癌组织中整合素v3的表达高于无淋巴结转移的非小细胞肺癌组织。有远处转移的非小细胞肺癌组织中整合素v3的阳性表达率高达90%，而无远处转移的非小细胞肺癌相对较低。胡春燕等27应用免疫组化检测52例非小细胞肺癌整合素v3的阳性率为80.8%。采用PCR检测整合素v3 mRNA在非小细胞肺癌组织中的阳性率为92.0%。姜学勤等28用免疫组化方法检测50例卵巢上皮细胞癌中整合素v3的阳性率为64%（32/50）,20例卵巢良性肿瘤组织整合素v3的阳性率为5%（1/20），而癌旁正常组织无整合素v3表达。本实验中整合素v3在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达的阳性率分别为（95.422.26）%和（83.601.26）%，肺癌A549细胞系表达整合素v3高于卵巢癌SK-OV-3细胞系，有统计学意义，与上述文献报道相符，说明整合素v3在促进肺癌细胞更容易发生远处转移中起了一定的作用。3.4 EGFR在肺癌A549细胞系和卵巢癌SK-OV-3细胞系中表达水平差异及与远处转移的关系EGFR是一种表达于细胞膜上的跨膜糖蛋白,基因定位于第7号染色体上，包含26个外显子,它的结构由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成。各种生长信号分子与EGFR结合,首先激活酪氨酸蛋白激酶(TPK), 细胞内的信号传递系统被激活,生长信号再传递到细胞核内,核内的核糖核苷酸增加,刺激细胞生长和增殖。如果EGFR过度表达，分裂增殖信号将持续传递到细胞内,细胞分化的正常调控状态被打乱,细胞发生恶性转化，继而出现远处转移。已有研究表明，许多人体肿瘤细胞表达的EGFR发生异常，包括EGFR过表达和EGFR结构性突变。EGFR在几乎所有表皮细胞、基质细胞和部分神经胶质细胞、平滑肌细胞中表达。正常情况下，每个细胞表达EGFR量较恒定，而许多上皮来源的肿瘤，如乳腺癌、头颈部肿瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌和脑胶质瘤中都存在EGFR高表达29。EGFR突变通常表现为缺失性突变，Weiss等30研究发现3例肺鳞癌发生胃肠道转移患者的肿瘤细胞中EGFR外显子19缺失。Shin等31研究发现EGFR外显子19缺失最常见，占57.2%，除此之外还存在21号外显子L858R基因突变和18号外显子G719X基因突变。EGFR过表达促进肿瘤发生远处转移，Lu等32发现在有淋巴结转移的结直肠癌中EGFR的表达显著上调，高于无淋巴结转移的结直肠癌，并且与肿瘤分期和5年生存率相关。在既往的体外实验中，研究者发现通过激活食管癌细胞的EGFR表达，可以减少细胞间的黏附，促进远处转移33。阻断肺癌细胞株EGFR的激活可以上调E-钙黏素的表达，减少癌细胞远处转移34. EGFR促进远处转移的分子机制可能此有关。有文献报道35-36,采用PCR及免疫组化方法检测132例恶性卵巢肿瘤中EGFR阳性表达率为62.9%-78.7%之间。另有相关研究37-38，采用免疫组化SP法检测156例肺癌组织中EGFR阳性表达率为44.8%-68.8%。比较以上数据，似乎未发现EGFR在肺癌和卵巢癌中的表达明显不同。而本实验利用流式细胞仪测得EGFR在肺