（发育生物学专业论文）sfrp2过表达对小鼠牙胚发育影响的初步研究.pdf

摘要捅姜w n t s 基因家族编码数量庞大且分支众多的信号分子，涉及许多器官的模式形成及细胞的增殖和分化，其信号传导是通过f r i z z l e d 受体家族实现。分泌性f r i z z l e d相关蛋白( t h es e c r e t e d f r i z z l e dr e l a t e d p r o t e i n ，s f r p ) 作为w n t 信号的可溶性调节因子，可能与细胞膜上的f r i z z l e d 受体竞争性结合w n t 信号分子。通过s f r p 在胞外屏蔽w n t 信号，可以避免经典的w n t 1 3 c a t e n i n 途径或替代性扁平细胞极性途径的激活。研究表明：在牙胚发育过程中，表达了一系列的g e n t s 及其拮抗物。并且本实验前期的研究结果表明：s f r p 2 在小鼠e 1 1 5 - e 1 35 的磨牙间充质中都有表达而在切牙中不表达( 见附录图1 ) 。另有报道：s f r p 2 在小鼠e 1 4 5 - e 1 65 d 的磨牙间充质中也有表达，由此推测s f r p 2 的表达可能与磨牙的形成及牙齿类型的决定有相关。但迄今，s f r p 2 在牙胚发育过程中有何作用? 还不清楚。因此，本研究以小鼠的牙齿发育为模型，通过在小鼠牙胚中过表达s f r p 家族成员之一s f r p 2 ，探讨s f r p 2 在牙齿发育中通过调控w n t 信号所起的作用。主要研究工作包括：利用慢性病毒载体三质粒系统p n l e g f p p n l - e g f p s f r p 2 、p v s v g 、p h e l p e r 共转染2 9 3 t 包装细胞，生产e g f p i r e s 2 s f r p 2 、e g f p 慢性病毒并进行病毒的收集、冻存；用e g f p i r e s 2 - s f r p 2慢性病毒感染e 1 3 5 小鼠磨牙间充质细胞，接着将感染病毒的间充质细胞重新聚合，并将重聚后的团块与e 1 3 5 牙上皮重组接着重组块移入小鼠肾囊膜培养。实验结果表明：在e 1 3 5 小鼠磨牙间充质中过表达s f r p 2 后牙齿大小、牙尖数日及形态结构都没有明显差异。关键词：牙齿发育，w n t 信号通路，s f r p ，s f r p 2 ，过表达，慢病毒载体福建师范大学硕士学位论文a b s t r a c tt h ev e r t e b r a t ew n tg e n ef a m i l yr e p r e s e n t sal a r g ea n dd i v e r s eg r o u po fs i g n a l i n gm o l e c u l e si n v o l v e di nt h ep a t t e r n i n g ，p r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no fav a r i e t yo fo r g a n sa n dc e l lt y p e s 1 1 l c ys i g n a lt h r o u g ht h ef r i z z l e df a m i l yo f r e c e p t o r s i th a sb e c o m ec l e a rt h a ts e c r e t e dw n ta n t a g o n i s t sp l a yi m p o r t a n tr o l e si nr e g u l a t i n gw n ts i g n a l i n g m e m b e r so ft h es e c r e t e df r i z z l e d - r e l a t e dp r o t e i n ( t h es e c r e t e df r i z z l e dr e l a t e dp r o t e i n ,s f 讷f a m i l ya p p e a rt of u n c t i o na ss o l u b l em o d u l a t o r so fw r i ts i g n a l i n g ，p r e s u m a b l yb yc o m p e t i n gw i t hm e m b r a n ef r i z z l e dr e c e p t o r sf o rt h eb i n d i n go fs e c r e t e dw n tl i g a n d s s f r p se q u e s t e rw n t si nt h ee x t r a c e l l u l a rs p a c e ，p r e v e n t i n ga c t i v a t i o no f b o t ht h ec a n o n i c a la n dt h ep l a n a rp o l a r i t yw n tp a t h w a y s i nt h i se s s a y , w eu s em o u s et o o t hd e v e l o p m e n ta sam o d e li nw h i c ho v e r e x p r e s s i o no f s f r p 2w a sp e r f o r m e dt os t u d yi t sf u n c t i o ni nr e g u l a t i n gw n tp a t h w a y f i r s t l y , l e n t i v i r u sv e c t o r s ( t h r e ep l a s m i d sp n l - e g f p p n l - e g f p - i r e s 2 - s f r p 2 、p v s v ( 三p h e l p e r ) w e r ee x p l o i t e dt ot r a n s f e c t2 9 3 tp a c k a g i n gc e l ll i n e st op r o d u c ee g f p - i r e s 2 - s f r p 2i j e n t i v i r u s s e c o n d l y ，m o u s em o l a rm e s e n c h y m a lc e l l si n f e c t e db ye g f p i r e s 2 - s f r p 2l e 以v i m sw e r er e c o m b i n e dw i md e n t a le p i t h e l i u mt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fo v e r e x p r e s s i o no fs f r p 2o i lt o o t hd e v e l o p m e n t t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a t ：a sar e s u l to fs f r p 2o v e r e x p r e s s i o n , r e c o m b i n e dt o o t hg e r m sm a d et e e t hw h i c hh a v en od i f f e r e n c ei ns i z eo rc u s p s k e y w o r d s ：t o o t hd e v e l o p m e n t , w n t ss i g n a l i n gp a t h w a y s ，s f r p ，s f r p 2 ，o v e r e x p r e s s i o n ,l e n t i v i r u se x p r e s s i o nv e c t o ri i中文文摘中文文摘器官发生是一个极复杂的过程，其间涉及到许多细胞与组织间有序的相互作用脊椎动物所有器官均由上皮( e p i t h e l i u m ) 和间充质( m e s e c h y m e ) 组成，上皮和间充质之间的相互作用对器官发生至关重要。牙齿发生过程中，在上皮间充质问传递诱导信号的生长因子主要有四大类：骨形成蛋白( b m p ) ，成纤维细胞生长因子( f g f ) ，刺猬蛋白家族( h h s ) 和w n t 信号系统它们可以调节未分化的上皮和间充质细胞聚集、分化，启动牙胚发育的级联反应。牙胚发育是在复杂网络有序调控下的连续过程，并且网络中任何一个节点的改变都会影响网络功能，改变牙胚的正常发育本研究着重研究w n t 信号的调控因子s f r p 2 对牙齿发育的影响。w n t s 基因家族编码数量庞大且分支众多的信号分子，涉及许多器官和细胞类型的模式形成，增殖和分化，其信号传导通过f r i z z l e d 受体家族实现w n t 信号的另一类型受体与低密度脂蛋白( u ) l ) 受体相关，被称为l r p 5 6 。w n t 信号分子同时与f r i z z l e d 受体和l r p 5 6 结合，形成配体- 受体复合物来激活经典的w n t j 3 - c a t e n i n途径或替代性扁平细胞极性途径。分泌性f r i z z l e d 相关蛋白( s f r p ) 作为w n t 信号的可溶性调节因子，与细胞膜上的f r i z z l e d 受体竞争性结合w n t 信号分子。w n t 信号的另一拮抗分子d i c k k o p f k k ) 则是l r p 5 6 的抑制性配体。一旦d k k 与l r p s 6结合，就会阻止w n t - f r i z z l e d 和l r p 5 6 间的相互作用。在牙齿发育早期，w n t 基因家族中的许多基因及其拮抗物和受体均在牙胚中表达，包括w n t 7 b ，肪，卜彳，w n t - 6 ，w n t - 5 a ，w r i t 受体f z - 6 ，d k k ，s f r p s 等通过分析l e h 基因敲除小鼠，第一次证实w n t 信号在牙齿发育中的作用。作为w n t 信号途径中的关键成份，l e f l 基因的突变会导致牙齿发育停止在蕾状期由纠拿启动子驱动d k k 在牙上皮内异位表达，可以使牙上皮增厚但却不能进入蕾状期。s f r p 2 作为w n t 信号的拮抗物s f r p s 基因家族成员之一，本实验前期的研究结果表明：s f r p 2在小鼠e 1 1 5 - e 1 3 5 的磨牙间充质中都有表达而在切牙中不表达( 见附录图1 ) 另有报道：s f r p 2 在小鼠e 1 4 5 - e 1 6 5 的磨牙阃充质中也有表达。但迄今，s f r p 2 在牙胚发育过程中对牙齿发育有何作用? s f r p 2 的表达与磨牙的形成及牙齿类型的决定是否有相关还不清楚因此，本研究以小鼠为模型着重研究s f r p 2 通过调控w n t 信号通路对牙齿发育的影响。一本研究通过慢病毒三质粒系统转染2 9 3 t 包装细胞，生产慢病毒感染小鼠牙间i l i福建师范大学硕士学位论文充质，使其过表达s f r p 2 ，探讨s f r p 2 在牙齿发育过程中通过调控w n t 信号所起的作用。本实验研究分为两个部分：( 一) 应用慢病毒三质粒系统转染2 9 3 t 包装细胞生产慢性病毒；( 二) 利用生产的慢病毒在e 1 3 5 小鼠牙胚中过表达s f r p 2 ，探讨其通过调控w n t 信号通路在牙齿发育中的作用。本实验的主要结果和结论如下：1 、应用慢病毒三质粒系统p n l - e g f p p n l - e g f p i r e s 2 - s f r p 2 、p v s v g ，p h e l p e r共转染2 9 3 t 包装细胞生产慢性病毒j e t p e i t m 试剂盒转染方法比磷酸钙转染方法的转染效率高。在所有转染前提条件一致的情况下( 包括细胞密度、状态、质粒的用量等各种外界条件) ，磷酸钙转染法与j e t p e i t m 试剂转染法相比：转染3 6h 后在倒置荧光显微镜下观察发现，j e t p e i t m 转染试剂法比磷酸钙法产生了更多的绿色荧光细胞，并且绿色荧光的强度也更大，这表明：j e t p e i t m 转染试剂法包装病毒的效率比磷酸钙包装病毒的效率高。慢病毒三质粒系统p n l - e g f p p n l - e g f p i r e s 2 一s f r p 2 、p v s v g ，p h e l p e r 转染2 9 3 t 细胞系后，收集e g f p i r e s 2 一s f r p 2 病毒上清再感染2 9 3 t 细胞，2 4h 后去病毒液换新鲜培养液继续培养，可见e g f p 的表达。把e g f p - i r e s 2 一s f r p 2 病毒感染后的磨牙间充质细胞重聚培养过夜后，消化组织块成单细胞悬液于倒置荧光显微镜下观察，发现：感染上e g f p i r e s 2 一s f r p 2 病毒的间充质细胞发出了绿色荧光，而未感染的间充质细胞或是死细胞不表达绿色荧光在明场显微镜下计算出问充质细胞总数，在荧光显微镜下计算出表达绿色荧光的间充质细胞数，从而计算出e g f p i r e s 2 一s f r p 2 病毒的感染效率：表达绿色荧光的间充质细胞数间充质细胞总数= 4 5 5 0 。说明已将慢性病毒载体导入包装细胞系，并成功产生了有感染能力的慢性病毒。2 、在小鼠e 1 3 5 磨牙间充质细胞中过表达s f r p 2 对牙齿发育的影响打散的磨牙间充质细胞经e g f p 一匝s 2 一s f r p 2 慢性病毒感染重聚，与牙上皮重组后，同样能形成完整的牙釉质、牙本质、牙髓的牙齿结构并且牙齿的大小及牙尖数目都没明显变化。综上可以得出：在牙齿发育过程中，s f r p 2 的过表达对牙齿大小、形态结构影响不大推测：s f r p 2 的过表达可能阻断了w r i t 基因家族中一个或多个成员的信号传导，但是这些成员在牙齿发育过程中可能不起关键作用，也可能w n t 基因家族中i v其它成员在牙齿发育中有相似的功能但不会被s f r p 2 抑制具体作用机制有待进一步研究。v第1 章绪论第1 章绪论1 1 研究背景牙齿发育是器官发育常用的研究模型之一目前已利用分子生物学技术分析了与牙齿发育密切相关的转录和生长因子及其相关基因( 如m s x l ，m s x 2 , d l x zp i t x l ，p i t x 2 , b m p s , f c f s , p a t c h e d , s h h , p a x 9 , b a x l w n t s 等) 在牙齿发育中的表达模式和作用机制。w n t 信号系统作为牙齿发育早期的四大类生长因子之一，在牙齿发育过程中有许多w n t s 及其受体或拮抗物的表达。s f r p 2 作为w n t 信号的可溶性调节因子在肿瘤发生、胚胎发育、干细胞等方面都有重要调节作用u “并且前期的研究结果表明：在小鼠牙齿发育早期e 1 1 5 一e 1 3 5 ，s f r p 2 在磨牙间充质中都有表达( 见附录1 ) 。同时也发现随着s f r p 2 表达水平的降低，磨牙间充质失去诱导牙齿发育的能力但目前，但究竟s f r p 2 通过调节w n t 信号通路在牙齿发育中起什么作用以及s f r p 2 是否对牙齿类型的决定有关还未见报道。因此，本研究将探讨s f r p 2 通过调节w n t 信号在对牙齿发育的影响。1 2 哺乳动物牙齿的发育过程牙齿作为研究哺乳动物器官发生的模式器官，牙齿发育的形态学和分子机制是所有器官中研究最为透彻的。以小自鼠的磨牙为例( 见图1 - 1 ) ，e g 5 时，胚胎中脑和后脑神经嵴迁移到原口，形成未来的牙间充质l o - e 1 0 5 时，牙齿发生部位和牙齿类型己被决定 1 1 - 1 3 1 。e 1 1 5 时，未来成牙部位的上皮开始增厚，这是牙齿发育过程中第一个可见的形态变化在这个时期，成牙部位的上皮细胞由立方状伸长为高柱状，发生极化并形成牙原基，此时称之为牙原基期( 1 a m i n a rs t a g e ) 。e 1 2 5 和e 1 3 5 期间，增厚的牙上皮因为持续的增殖，已向下突入由神经嵴衍生而来的间充质中，并分泌一系列生长因子诱导周围的间充质聚集在下陷的牙蕾上皮周围。此时牙胚发育进入蕾状期( b u ds t a g e ) ，牙蕾上皮细胞依旧呈现高柱状。e 1 4 5 和e 1 5 5 ，持续增殖的牙上皮开始在周边发生卷曲，而在中心则生成控制牙尖形成的临时性结构一釉结节，并表达一系列的生长因子，如s h h ，b m p 2 ，b m p 4 ，b m p 7 ，f g f 4和f g f 9 【1 4 j 由于釉结节内的细胞发生凋亡，而周边上皮依旧增殖，一导致整个牙上皮不均匀生长，使得牙上皮的整体形态由蕾状变为帽状，因而称此期为帽状期( c a p福建师范大学硕士学位论文s t a g e ) 。e 1 6 5 以后，牙胚进入钟状期( b e l ls t a g e ) ，此时的牙上皮开始分化为前成釉质细胞。而间充质细胞分化为前成牙本质细胞两类细胞均呈现出相同的变化一细胞由高柱状进一步加长，细胞核迁移到远离基底膜的一端开始分泌形成牙釉质和牙本质的基质。由神经嵴衍生而来的间充质不但形成分泌前牙本质的成牙本质细胞，还形成未来的牙槽骨【15 1 。i n h h 舶n期l i d 埘s n t - n q l ,弋眇b u d图1 1 牙齿发育过程i l l lf i g u r e1 - it o o t hd e v e l o p m e n te 1 1 5 时，牙原基期( 1 a m i n a rs t a g e ) 未来成牙部位的上皮开始增厚；e 1 2 5 和e 1 3 5r 蕾状期( b u ds t a g e ) ，增厚的牙上皮向下突入阃充质中；e 1 4 5 和e 1 5 5 ( c a ps t a g e ) ，持续增殖的牙上皮开始在周边发生卷曲，而在中心则生成控制牙尖形成的临时性结构釉结节( e f t r e a lk n o t ) ：e 1 6 5 ，钟状期( b e l ls t a g e ) 此时的牙上皮开始分化为前成釉质细胞而问充质细胞分化为前成牙本质细胞。1 3 牙齿发育过程中上皮与问充质之间的相互作用1 3 1 上皮与问充质器官发生是一个极复杂的过程，其间涉及到许多细胞与组织间有序的相互作用。脊椎动物所有器官均由上皮( e p i t h e l i u m ) 和间充质( m e s e c h y m e ) 组成，上皮和问第1 章绪论充质之间的相互作用对器官发生至关重要嘲在胚胎发育过程中，胚胎组织大概可分为上皮和间充质两种成份，上皮是由一层或几层相互紧密排列的细胞组成，这些细胞靠一层叫基底膜( b 船e m e mm e m b r a n e ) 的胞外基质相互连接，细胞群体存在极少细胞问质。上皮细胞均存在极性，极性是其的一个重要特征。所谓极性( p o l a r i s )是指上皮或上皮细胞的两个相对的面在结构和功能上具有某种明显的差异。与基底膜相连的一面称为基底面( b a s a ls u r f a c e ) 背对基底膜，即朝向身体表面或某一身体腔面的一面叫游离面( a p i c a ls u r f a c e ) 。许多上皮的游离面存在微小的手指样的突起，称之为微绒毛，微绒毛增加了上皮细胞的表面积上皮细胞来源于各个胚层。间充质则是由一群联结松散的细胞组成，细胞外充满了胞外物质，细胞形态也不太规则间充质细胞来源于中胚层和神经嵴细胞，来源于神经嵴细胞的间充质也叫外闯充质( e c t o m e s e c h y m e ) p t 。1 3 2 牙齿发育过程中上皮一间充质信号传导在牙胚形成过程中，间充质对上皮信号的反应在时间上具有特异性在牙胚形一成过程中，各种有关信号因子在这两种组织中传递，激发相关基因的表达，在时间和空间上调控牙齿形成。牙齿发生的定位作用是在e 1 0 5 d ，此时还未出现形态学上的变化，由于在胚胎下颌口腔面上皮中表达的b m p 4 ( b o n em o r p h o g e 鹏廿cp r o t e l a4 )和f o f g ( f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r8 ) 之间的拮抗作用，决定了间充质中p a x 9 的表达部位【l 町以及预定牙上皮中p i t x 2 的表达部位【1 9 - 2 0 ，也就决定了牙齿发生的部位。同，时牙齿发育的类型也是在该时期决定的b m p 4 诱导问充质中特定部位转录因子b a r x l 的表达，决定了在该部位将发生磨牙【2 l - 2 2 1 到了e 1 1 5 d ，牙齿的发育开始出现形态发生变化。首先，在磨牙发生部位的牙上皮出现局部增厚，立方状的上皮细胞沿其游离面一基底面轴伸长，形成由柱状细胞构成的牙上皮，并构成游离面一基底面极性，此时称之为牙板期。一系列编码生长因子的基因在增厚的牙上皮中表达，其中包括，叠髓玩椤，b m p 2 ，b m p 7 ，s h h ，阡_ f j ，w n h o b 等 z z - 2 s 这些上皮的信号分子将诱导其下方的牙间充质中一些基因的表达，包括m s x l ，m x x 2 ，l e f t ，d l x l ，d l x 2 ，p t c ，g l i l 和s y n d e c a n 1 1 2 9 - 3 ”到e 1 1 5 d 时，增厚的牙上皮不断分裂并向其下方的牙问充质组织入侵内陷，导致到了e 1 2 5 d 到e 1 3 5 时的上皮组织形成蕾状的结构，此时称之为牙蕾期在此期间，蕾状上皮的基底层细胞维持柱状形态，这一由柱状细胞构成的基底层上皮结构是牙齿发育中的标志性形态结构。b m p 4福建师范大学硕士学位论文的表达在此期由上皮转移到间充质中，而且被认为是一种间充质的反馈信号而作用于牙上皮】。随后将发生一系列的细胞分裂和形态变化，牙间充质细胞围绕牙蕾聚集，出现帽状和钟状结构，分别为帽状期和钟状期。在以后的发育中，牙上皮基底层细胞分化为成釉质细胞，而牙间充质细胞则分化为成牙本质细胞在e 1 4 5 的帽状期中，伴随着牙上皮的形态变化而形成的珐琅节( e n a m e lk n o t ) 嗍，是一种l 临时性的结构，与牙尖的形成有关。由于许多信号分子，如s 删，b m p 2 ，b m p 4 b m p 7 ，f g f 4 ，f g f 9 等都在珐琅节中表达p ”，因此珐琅节被认为是调控牙尖模式形成的信号中心。在随后的钟状期发育中，上皮起源的细胞将分化为成釉细胞，间充质起源的细胞将分化为成牙本质细胞。此外，问充质细胞还将分化形成牙槽骨，作为牙齿的基座 3 9 1 1 4w n t 信号通路哺乳动物的器官发育依赖于各胚层之问连续的相互诱导作用【6 】。这种诱导作用是通过可溶性的蛋白质生长因子在细胞和组织问的扩散实现的。器官发育中的组织者产生一种生长因子，并释放到细胞外，作用于邻近的细胞或另一组织。而受到生长因子作用的细胞或组织则产生一种转录因子，激活相应的基因表达，从而生成并释放另外一种新的生长因子，反作用于组织者使其产生新的诱导信号。这种有时间和空间次序的生长因子和转录因子的表达变化，构成了器官发育中的连续和相互的诱导作用 4 0 - 4 q 。牙齿发生过程中。在上皮问充质问传递诱导信号的生长因子主要有四大类：骨形成蛋白( b m p ) ，w m 信号系统，成纤维细胞生长因子( f g f ) 和刺狷蛋自家族( h h s ) 。w r i t 信号系统作为其中一类生长因子。在胚胎发育过程中对模式形成、分裂增殖、细胞的分化，细胞极化及器官的形成都有重要作用1 4 ”，研究其在牙齿发育中的作用，将有助于进一步完善牙齿发育的分子机制。1 4 1w n t 基因及其蛋白结构特征w n t 一词产生于2 0 年前，它是由非洲果蝇的分节的极性基因w i n g l c s s ( s g e m e n tp o l a r i t yg e n e ) 和小鼠的一个原癌基因i n t - i 两个词台成派生而来。w n t 基因最初是在小鼠乳腺癌中作为原癌基因被克隆出来的，因为发现病毒基因在其旁边插人可激活该基因，称为h i t 基因【州研究发现其与果蝇的w i n g i e s s 基因为同源基因，故合称为w r i t基因。目前从原虫到脊椎动物的不同物种中，发现了近百个同源基因，统称为w m基因家族h ”。它们编码一类结构相似的分泌型蛋白：一段疏水信号肽连接一个肽酶第1 章绪论识别位点，无跨膜区，其氨基酸序列从3 5 0 到3 8 0 ，编码一段含2 3 或2 4 个半胱氨酸的保守区，n 端4 个糖基化点【惦州1 4 2w m 的受体f r i z z l e d 蛋白f r i z z l e d 是研究果蝇极性基因时发现的一个基因家族【4 。1 ，目前有十多个成员，其蛋白的共同特征是从n 端开始，一段信号肽连接含l o 个高度保守半胱氨酸的残基区( c y s t e i n e r i c hd o m a i n , c r d ) ，4 0 - 1 0 0 个氨基酸组成的高变区用于形成弹性连接( f l e x i b l el i n k e r ) ，接着是7 个跨膜区域和一个胞浆内的尾部。大多数f r i z z l e d 蛋白分泌后，与胞膜的葡萄糖磷脂酰肌醇的锚状结构结合，露出c r d 区与w n t 结合；c 端的s t x v 序列是与下游d s h 蛋i e i p d z 区结合的位点 4 9 1 1 4 3w n t 信号通路的作用机制1 4 3 1w n t 信号通路w n t s 基因家族编码数量庞大且分支众多的信号分子，涉及许多器官和细胞类型的模式形成，增殖和分化，其信号传导通过f r i z z l e d 受体家族实现 s os 。w h t 信号的另一类型受体与低密度脂蛋白( l d l ) 受体相关1 s 2 - 5 4 1 ，被称为l r p 5 6 。w n t 蛋白通过与f r i z z l e d 受体家族的成员结合激活下游信号通路。现己知w r i t 信号通路在细胞内至少有三条分支【5 5 巧明( 见图1 2 ) ：( 1 ) b c a t e n i n f 言号通路，也称经典i 拘w n t 信号通路：( 2 ) p c po t a n a rc e l lp o l a r i t y ) 信号通路；( 3 ) w n 们a 2 + 信号通路；这三条信号通路中，研究历史最久，最受人瞩目的是w n t ，c a t e n i n 信号通路。目前认为w n t 必须同时与l r p 5 6 和f r i z z l e d 结合，形成有功能的配基一受体复合物来激活特定经典的w 州b - c a t e 血l i 蕴路。在经典的w n t 通路中( 见图1 - 2 ： 3 - c a t e n i np a t h w a y ) ，w r i t 蛋白结合到f r i z z l e d上，然后与辅助受体l r p 5 6 形成w m - - f r i z z l e d - - l r p 5 6 复合体，将信号传导到细胞质内继而激活胞质内d i s h e v e l l e d 家族蛋白( d s h ) 细胞质中的d i s h e v e u e d 一旦被激活就立即抑制了糖原合成酶激酶3 b ( o s k - 3 1 3 ) 的活性，g s k - 3 p 的活性被阻断后，i b - - c a t e n i n 从a p c 蛋白上分离出来并进入到细胞核中与t c f l e f ( t 细胞特异因子，淋巴样增强子结合因子1 ) 转录因子家族蛋白相结合，调节各种靶基因的转录无w n t 信号刺激时，轴蛋白a x i n 作为这一通路的负调控因子，其主要作用是与抑癌蛋白a p c 和g s k 3 d 形成复合物而促使p - - c a t e n i n 的丝氨酸苏氨酸磷酸化。磷酸化的1 3 - c a t e n i n 在胞质中通过泛素蛋白酶体的作用而快速降解【5 9 】福建师范大学硕士学位论文m e c h a n i s m so fw n ts i g n a lp r o c e s s i n g圄1 - 2w r i t 信号通路作用机制【删f i g u r ei - 2m e c h a n i s m so f w n ts i g n a lp r o c e s s i n ga p e ：抑癌蛋白；s f r p ：分泌性f r i z z l e d 相关蛋白；g s k - 3 ：糖原合成酶激酶3 8 ；l r p 5 ，6 ：低密度脂蛋白( l d l ) 受体相关：d s h ：d i s h e v e l l e d 家族蛋白t c f l e f ：t 细胞特异因子，淋巴样增强子结合因子lw r i t 信号通路在细胞内至少有三条：( 1 ) p - c a t e n i n 信号通路；( 2 ) p c p ( p l a n a r c e l lp o l a r i t y ) 信号通路：( 3 ) c a 2 + 信号通路。在经典的w n t 信号通路中，当有w n t 信号刺激时，w n t 蛋白结合到f r i z z l e d 上，然后与辅助受体l r p 5 6 形成w r i t - - f r i z z l e d - - l r p 5 6 复合体，将信号传导到细胞质内继而激活胞质内d i s h e v e l l e d 家族蛋白( d s h ) 进而抑制了g s k - 3 p 的活性c s k - 3 p 的活性被阻断后，f - c a t a n i n 积累进入细胞核中与t c f l e f 结合，调节各种靶基因的转录；当无w n t信号刺激时i - c a t e n i n 磷酸化而降解。1 4 3 2w r i t 信号的拮抗物w r i t 信号通路的拮抗物都是通过在胞外阻止w n t 配体与其受体f r i z z l e d 蛋白的结合来阻断w n t 信号通路根据作用机制的不同可以分为两类：第一类包括s f r p 家6第l 章绪论族蛋白( 分泌型的相关性卷区蛋白) ，w i f 1 ( w n t 抑制因子) 和c e r b e r u s ，它们通过与w n t 受体竞争性结合w n t 配体，阻断w n t 的经典通路和平面的细胞极性通路第二类d i c k k o p f 家族p 鼬p ，它是l r p 5 6 的抑制性配体 4 v 4 9 1 ，通过与w n t 受体复合物的亚基l r p 5 6 结合，阻止w n t - f r i z z l e d 和l r p 5 6 间的相互作用，阻断经典的w r i t 1 3 c a t e n i n 途径，保留平行极性的信号通路 6 1 】。另外，胞外不含c r d 区的分子也会和w n t 配基结合1 6 2 】s f r p s ( t h es e c r e t e df r i z z l e dr e l a t e d p r o t e i n s ) 含有与w n t 受体f r i z z l e d 蛋白相似的c r d 区，因此，可以与w n t 受体f r i z z l e d 蛋白竞争性结合w n t 。到目前为止，已经发现了5 种不同类型的s f r p s ：s f r p l 、s f r p 2 、s f r p 3 、, f r p 4 、s f r p 5 。功能上这些s f r p s似乎是作为子w n t 信号的可溶性调控因子( s o l u b l em o d u l a t o r ) 【6 3 1 并且这些蛋白有许多不同的名称( 见表l 1 ) 如：s f r p 2 ( s e c r e t e d f r i z z l e d - r e l a t e d p r o t e i n 2 ) 同名的蛋白有：s f r p - 2s e c r e t e da p o p t o s i s - r e l a t e dp r o t e i nl 、s a r p 1 、s d f 5p r o t e i n 。r a x f r p 2位于第三染色体，基因全长6 8 8 1 个碱基，有4 个外显子和3 个内含子，e d n a 长，。2 0 2 8 个碱基 1 4 1 s f r p 2 作为s f r p 家族之一也含有与w m 受体f r i z z l e d 蛋白相似的c r d 区，因此也可以和f r i z z l e d 蛋白竞争结合w n t 配体但是，近来的研究表明【6 3 】：部分删除s f r p 3 的c d r 区，也能与w n t 一1 结合，但是丧失了阻断w m 一1 信号通路的功能。推测，w n t 配体上可能有别的结合位点与s f r p 3 结合位点u r e n 等人的研究表明嗍：c d r 区并非是与w g 结合所必需的：他们把s f r p l 的c r d 区删除后仍。能与w g 结合。但还不清楚出现这种结果是s f r i 3 与s f r p l 的不同，还是w m l 与w g 的不同造成的。因此究竟c r d 区是不是s f r p 与w r i t 配体结合所必需的，还有待于迸一步的研究表i - 1 哺乳动物5 种s f r p s l 明t a b l e1 - 1f i v em a m m a l i a ns f l p桶建师范大学硕士学位论文1 4 3 3w m 信号的拮抗物对w m 信号通路的调控w m 配基( 1 l g a n d ) 通过与细胞膜上的f r i 2 z l e d 受体结合将信号传导到细胞内部，分泌性f r i z z l e d 相关蛋白( s f r p ) 与f r i z z l e d 蛋白相同的c d r 区所以可以和f r i z z l e d蛋白竞争结合w r i t 配基从而到达拮抗w n t 信号的作用阮t , 6 6 t l 。目前s f r p 与w r i t 配体结合抑制w m 信号的模型也得到了进一步的完善。u r e n a 晔】，等人的研究表明，在w r i t 集中浓度高的区域s p 币i 作为w n t 的激活剂，而在w n t 浓度低的区域作为w n t 的拮抗剂。并且s f r p l 也以另一种方式阻断w r i t 信号通路，即：s f r p l 与f r i z z l e d 蛋白形成没有功能的复合物再与w n t 结合从而阻断w r i t信号通路1 6 针。1 4 4w n t 信号与肿瘤发生、牙胚发育的关系w m 信号的研究热点在于w m 传导通路的调控及其传导通路上各种蛋白质的相互作用上，目前研究w n t - - f r i z z l e d 信号通路在肿瘤发生、胚胎发育、干细胞方面的报道较多。并且许多研究都证明基因的表达往往与它的功能是密切联系的。阡钿皿及其受体或拮抗物在在肿瘤细胞及发育的器官中的表达与它们在肿瘤发生，胚胎发育中的作用也不例外。1 4 4 1w r i t 信号在肿瘤发生及胚胎发育中的作用重建s v r p 的功能，会削弱w m 信号，并在许多类型的癌症中引发程序性死亡。我们知道w m 信号通过激活 3 - c a t e n i n f f c f 介导的转录来抑制程序性死亡。d a d f a r m a y s 等人口o 】的研究表明：在1 3 - c a t e n i n 缺陷型的间皮瘤细胞系中s f r p 4 表达的抑制与启动子的过甲基化有关。在e - c a t e n i n 缺陷型的闻皮瘤细胞系中恢复s f r p 4 的表达则会阻断w m 信号诱发程序性死亡，抑制了细胞生长。在表达s f r p 4 及b - c a t e n i n的间皮瘤细胞中用r n a i 的方法降低s f r # 的表达会激活w n t 信号，促进细胞生长，抑制化学药品诱发的程序性死亡。腊蕾和饶进军等人的研究发现：在p 5 3 1 碉性的h e p 3 b 肝癌细胞中外源性p 5 3 能诱导s f r p l 的表达，这为s f r p l 阻断w m 信号传导通路w n t 通路抑制剂作用机制方面提供了新的实验依据【7 l - 7 2 112 0 0 6 年k a t o h 等人的研究表明旧：h e d g e h o g 和w 眦胚胎发育及癌形成过程中是共同作用的。分化的肠上皮细胞中分泌了h e d g e h o g ，诱导了s f r p l 在间充质中的表达从而阻断了分化的上皮中经典的w n t 信号通路。从而限定w n t s 只在干细胞或祖细胞中表达。s f r p 2 的表达具有组织特异性，它特异性的在脂肪第1 章绪论组织、视网膜神经上皮中表达、心脏、脑、骨骼肌肉、胰腺、胸腺、前列腺、皋丸、卵巢、小肠、结肠中表达。并且在脂肪组织小肠、结肠中的表达很强烈。甲基化的s f r p 2 是结肠癌的标记基因。s f r p 2 对视网膜的发育和肌细胞生成有重要作用【5 $ - 6 2 1 4 4 2w n t 信号与牙齿发育的关系( 1 ) w n t 信号分子在牙胚发育中的表达s a r k a r1 7 4 等人用原位杂交方法检测了小鼠牙齿发育过程从上皮增厚到钟状早期( e l i 5 - e 1 5 5 ) 六种w r i t 基因w n t s - 3 , 5 a , 瓯7 6 和l o b 及w n t 受体m f z 6 ，以及w n t 受体的拮抗物s f r p 3 柏s f r p 2 的表达发现：首先这些基因的表达具有空间特异性：w r i t - 4 , w n t - 6 以及w n t 受体m f z 6 在面部、口周及牙上皮中表达。w n t - l o b 只特异性的在预定的牙上皮( p r e s u m p t i v ed e n t a le p i t h e l i u m ) 表达。w n t s - 3 和乃，只在口腔上皮中表达，而在预定的牙上皮中不表达并且所，口在牙蕾期的牙上皮中也没有表达，仅在控制牙形态发生的信号中心珐琅结中表达w n t s 6 ，j 和m f z 6也只在原发性釉结节和继发性釉结节中均有表达。在牙齿发育早期w n t - 5 a 与其拮抗物sf r p 3 和s f r p 2 以p d 梯度( g r a d e dp r o x i m o - d i s t a l , p - d ) 的方式在牙问充质中表达，并且s f r p 3 和s f r p 2 的表达并不重叠w n t - s a 和s f r p 3 在牙乳头间充质中强烈表达此外，w n t s 的表达还具有时间特异性。d a s s u l e 等 7 5 1 研究了w n t - 1 0 a ，所l f j ，s h h 和b m p 2 在牙胚上的表达，e 1 1 0d 时，助恨o b ，s h h 和b m p 2 在切牙区沿近远中向呈细条带分布，阡锄r j d 6 和b m p 2 的表达弱，s h h 强阳性表达；e 1 1 5d时，w n t - i o b ，s h h 和b m p 2 的表达进一步向远中延伸，w n t l o b 和b m p 2 的表达增强，w n t l o a 在相同区域开始表达；e 1 2 0d 时，四者在裂缝处( d i s t e m a ) ，即鼠切牙和磨牙问的无牙区的表达完全被下调，且共同表达于切牙中线处和磨牙始基上e 1 3 5d 时，w n t - l o a ，w n t - 1 0 b 在凹陷上皮尖部均有最强的表达：到了e 1 4 5 的帽状期，这2 个基因的表达仅局限在釉结节，釉结节是牙齿发育过程中图式形成的信号中心 7 4 1 。并且前期研究( 见附录1 ) 表明：在早期牙齿发育过程中，有多种s f r p s 的表达。s f r p 2只在磨牙间充质中表达，而在磨牙上皮及切牙中都不表达；s f r p 3 在磨牙和切牙的间充质中都表达，而在上皮中都不表达；s f r p 4 只在切牙间充质中表达，而在切牙上皮及磨牙中都不表达。由此推测：可能不同的s f r p s 通过调控w n t 信号在牙齿发育中所起的作用也不同，并且可能正是这种差异而导致不同类型的牙齿发生综上，在早期牙齿过程中表达了一系列的w n t s 及其受体和拮抗剂并且在时间和空间上调控着牙齿发育9福建师范大学硕士学位论文( 2 ) w r i t 信号分子与牙齿发育的关系w r i t 信号分予与牙齿发育的关系。通过分析工e 打基因敲除小鼠，第一次证实w m 信号在牙齿发育中的作用。作为w n t 信号途径中的关键成份，工e ，7 基因的突变会导致牙齿发育停止在蕾状期m w n t 3 也在釉结节内表选，但由k - 1 4 启动子驱动的w m 3 过量表达不会引起牙齿形态的明显变化【明。当小鼠缺乏某种w n t 。包括w n t l ，w n t 2 ，w r i t 3 ，w n t 3 a ，w n t 4 或w n t s a 时，胚胎会过旱死亡而无法分析牙齿表型 3 7 , 7 1 1 7 9 1 ，因而单独某个w n t 基因在牙齿发育中的功能尚不清楚。w n t 信号分子的拮抗物对牙齿发育的影响。由k - 1 4 启动予驱动d k k 在牙上皮内异位表达，可以使牙上皮增厚但却不能进入蕾状期嗍。f i e l d ”1 等人的研究表明tw n t 信号在牙齿形态建成中具有十分重要的作用。d i c k l p f ( d k , k ) 基因家族成员通过与w r i t 受体复合物结合来调节w r i t 信号通路。通过对牙齿发育各阶段d k k l ，- 2 ，和om r n a 的表达的检测，发现这三种基因在时空上表达有很大差异，在牙齿发育的起始阶段，d k k l 在预定切牙形成部位间充质后端表达，而在磨牙