（植物学专业论文）几种抗肿瘤生物碱的逆流色谱分离和活性筛选.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 摘要 生物碱是人类研究最多的一类天然有机化合物，多数具有显著的生理活性。 如何快速高效地分离和筛选出具有生物活性的生物碱类化合物是当前药物研究 的一大挑战本文利用逆流色谱研究了莲子心生物碱和细胞松弛素类生物碱的分 离条件，建立了几种有效分离这两类生物碱的新方法，对于深入开发这些生物碱 药物具有重要意义 论文首先建立了一种应用线性溶剂梯度作为分离条件的逆流色谱法分离莲 子心 ( n e l u m b on u c i f e r a ) 中的莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱，利用正己烷乙酸 乙酯甲醇5 m m o l 氨水( p h 7 5 ) ( 4 ：6 ：3 ：7 ，v ) 和( 5 ：5 ：5 ：6 ，v ) 梯 度洗脱，克服了传统逆流色谱大多使用有毒溶剂( 氯仿 、分离时闯过长等缺 点在此基础上发展了一种连续洗脱推出逆流色谱法，采用正己烷乙酸乙酯 甲醇8 r e t o o l 氨水( 5 ：5 ：5 ：6 ，v v ) 体系三次连续洗脱，高效制备莲心碱、 异莲心碱和甲基莲心碱，节约时间和溶剂1 0 和3 5 论文还应用五种人肿瘤细胞模型，考察以上三种生物碱的体外肿瘤细胞增 殖抑制作用，结果显示异莲心碱对肿瘤细胞的抑制作用最好，i c 5 0 均小于 4 0 p g m l 。甲基莲心碱对b e a p 3 7 、s p c - a 、h e l a 、s g c 7 9 0 1 的抑制作用较好， i c 5 0 小于4 0 p g m l 。莲心碱对人肿瘤细胞的抑制效果较弱，对b e a p 3 7 、s p c a 、 s g c 7 9 0 1 的半数增殖抑制浓度i c s o 为4 0 6 0 p g m 其次，本论文将活性筛选与逆流色谱分离结合在一起，建立了“逆流色谱 分离细胞活性检测”筛选细胞松弛素的研究体系，采用正己烷乙酸乙酯乙醇 水( 6 ：3 ：2 ：5 ，v v ) 体系将粗提取分段，经过体外抗肿瘤细胞活性检测，确 定竹生肉球菌( e n g l e r o m y c e sg e e t z i ip h e n n ) 氯仿提取物中的主要成分为松胞 菌素d 。在此基础上为了有效分离松胞菌素d 及其类似物，建立了一种梯度洗 脱逆流色谱法，采用正己烷乙酸乙酯乙醇水( 5 ：5 ：4 ：6 ，v ) 和( 5 ：5 ： 6 ：4 ，v 淋系成功地分离出四种细胞松弛素类化合物：松胞菌素d ，e n g l o m y c i n ， z y g o s p o r i nd ，1 9 ，2 0 - e p o x y c y t o c h a l a s i nd ，纯度分别为9 9 1 、9 0 5 、9 3 5 、 9 2 2 其中z y g o s p o r i n d 在竹生肉球菌中首次被分离 关键词：逆流色谱，莲心碱，异莲心碱，甲基莲心碱，细胞松弛素，活性筛选 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t a l k a l o i d sa r cv e r yi m p o r t a n tn a t u r a lo r g a n i cc o m p o u n d s m o s to ft h ea l k a l o i d sh a v e r e m a r k a b l eb i o l o g i c a la c t i v i t i e s b e c a u s eo fs p e c i a lc h e m i c a lc o n s t i t u t i o n sa n dp r o p e r t i e s , t h e r ea r em a n yp r o b l e m si nt h ep r o c e s so fe x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o n h o wt or a p i di s o l a t e a n ds c r e e nn a t u r a lb i o a c t i v e a l k a l o i d sh a sb e e ns t i l lag r e a t c h a l l e n g ef o rc u r r e n t p h a s r m a c e t u t i cr e s e a r c h c o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h yi sap o w e r f u lt o o lf o rr e s o l v i n g c o m p l e t e m i x t u r ei n t oi n d i v i d u a l c o m p o n e n t s i t s au n i q u e l i p u i d - l i q u i dp a r t i t i o n c h r o m a t o g r a p h ya n dt h u se 1 i m i n a t e ss o m ep r o b l e m sr e s u l t i n gf r o ms o l i d - s u p p o r tm a t r i x , s u c ha sa d s o r p t i o n , d e g r a d a t i o n , p o l l u t i o na n dc h e m i c a lr e a c t i o n d u et ot h e s ea d v a n t a g e s o v e ro t h e r c h r o m a t o g r a p h i e s ，c o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h yw i n st h e p o p u l a ra p p l i c a t i o n s f o ri s o l a t i o n 。o f v a r i o u sb i o a c t i v en a t u r a lp r o d u c t s o nt h i sp a p e r , w ed e v e l o p e ds e v e r a ln o v a l c o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h ym e t h o d sf o rr a p i di s o l a t i o nb i o a c t i v en a t u r a la l k a l o i d sf r o m n e l u m b of l u c i f e r aa n de n g l e r o m y c e sg e e t z i ip h e n n f i r s t l y , w ee s t a b l i s h e dag r a d i e n tc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h yt os e p a r a t el i e n s i n i n e , i s o l i e n s i n i n ea n dn e f l i e n s i n i n ef r o mn e l u m b ot l u c i f e r a t h es o l v e n ts y s t e m sc o m p o s e do f n - h e x a n e - e t h y la c e t a t e - m e t h a n o b 5 m m o ln i - 1 3 h 2 0 ( 4 ：6 ：3 ：7 ，v v ) a n d ( 5 ：5 ：4 ：6 ，v v ) w e r e o p t i m i z e dt os e p a r a t et h r e ea l k a l o i d sb yg r a d i e n te l u t i o na to n et i m e t h e nw ed e v e l o p e d e l u t i o n - e x t r u t i o nc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h yt o s e p a r a t et h r e ea l k a l o i d se f f i c i e n t l y s o l v e n ts y s t e mc o m p o s e do fn h e x a n e - e t h y la c e t a t e - m e t h a n o l 8 m m o ln i - - 1 3 h e o ( 5 ：5 ：5 ：6 ， v v ) w a so p t i m i z e dt os e p a r a t et h r e ea l k a l o i d sf o rc o n t i n u o u st h r e et i m e si nn i n eh o u r sw i t h t h ep u r i t yo v e r9 0 ，a n ds a v e dt i m ea n ds o l v e n t10 a n d35 i na d d i t i o n , w eu s e d 所ek i n d so fh u m a nt u m o rc e l ll i n e ss p c - a 1 ，b c a p 3 7 ，h e l a , s g c - 7 9 0 1a n dh e p g 2t oe v a l u a t et h ep r e l i m i n a r yb i o a c t i v i t i e so ft h et h r e ea l k a l o i d s t h e r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a ti s o l i e n s i n i n es h o w e dg r e a ti n h i b i t o r ye f f e c to nf i v ek i n d so fh u m a n t u m o rc e l l s ，i c 5 0w a sl e s st o4 0 p g m 1 n e f e r i n es h o w e dg r e a ti n h i b i t o r ye f f e c to nb c a p 3 7 ， s p c - a , h e l aa n ds g c 7 9 01t o o ，i c 5 0w a sl e s st o4 0 0 9 m 1 h o w e v e r , t h ei n h i b i t o r ye f f e c t o nh e p 0 2d e c r e a s e ds l i g h t l y , a c h i e v i n g6 9 t t g m 1 l i e n s i n i n ep e r f o r m e dt h ew e a ki n h i b i t o r y e f f e c t , i c s 0t ob c a p 3 7 ，s p c - aa n ds g c 一7 9 0 1w a s 4 0 - 6 0 p g m 1 s e c o n d l y , t h i sa r t i c l ee s t a b l i s h e d “c o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y b i o a c t i v ea s s a y i i i 浙江大学硕士学位论文 s y s t e mt oc o n f n mt h a tc y t o c h a l a s i ndw a st h em a i nc o m p o n e n ti ne n g l e r o m y c e sg e e t z i ip h e n n i na d d i t i o n , w e e x p l o r e d a g r a d i e n tc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y , s e v e r a l c y t o c h a l a s i n si n c l u d i n gc ) r t o c h a l a s i nd ，e n g l o m y c i n , z y g o s p o r i nd ，1 9 ，2 0 - e p o x y c y t o c h a l a s i n dw i t ht h ep u r i t yo f 9 9 1 、9 0 5 、9 3 5 a n d9 2 2 r e s p e c t i v e l y , w e r ei s l a t i o n e d t h e s o l v e n ts y s t e mc o m p o s e do f n - h e x a n e - e t h y la c e t a t e - e t h a n o l - w a t e r ( 5 ：5 ：4 ：6 ，v v ) a n d ( 5 ：5 ：6 ：4 ， v v ) w a se h o o s e d a n dz y g o s p o r i ndw a si s o l a t e df r o me n g l e r o m y c e sg e e t z i ip h e n n f o rt h e f i r s tt i m e k e yw o r d s ：c o u n t e r c u r r e n t c h r o m a t o g r a p h y , l i e n s i n i n e , i s o l i e n s i n i n e ，n e f e r i n e ， c y t o c h a l a s i n , a c t i v i t ys c r e e n i n g i v 浙江大学硕士学位论文术语表 i | p l c h s c c c t l c p t f e l h 廿凇 1 3 c - n m r m s h r m s e s i m s m p i r u v n d z m t t p b s d m s o i c s o k 术语表 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h i g hs p e e dc o t m t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y t h i nl a y e r c h r o m a t o g r a p h y p o l y t e t r a f l u o r o e t h y l e n e n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c eo fl h n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c eo f1 3 c m a s ss p e c t r u m h i 曲r e s o l u t i o nm a s ss p e c t r u m e l e t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t t t m m e l t i n gp o i n t i n f r a r e ds p e c t r u m u l t r a v i o l e tr a y s m a s st oc h a r g e m e t h y lt h i a z o l y lt e t r a z o l i u m p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e d i m e n t h y ls u l f o x i d e i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n5 0 p a r t i o nt o e f l i c e n t v 高效液相色谱 高速逆流色谱 薄层色谱 聚四氟乙烯 核磁共振氢谱 核磁共振碳谱 质谱 高分辨质谱 电喷雾离子化质谱 熔点 红外光谱 紫外光谱 质核比 四甲基偶氮唑盐 磷酸缓冲液 二甲基亚砜 半数抑制浓度 分配系数 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得澎婆盘堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：寓蓐 签字日期：如ob 年月如日 i _ i ，c ， 一 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解澎姿态鲎有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝婆盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：高庸、 签字日期：撕g 年6 , e lz o 日 导师铭。聚嘶 签字日期：缈七月加。 浙江大学硕士学位论文 致谢 致谢 本人在浙江大学生命科学学院攻读硕士学位的两年来，老师们的谆谆教诲， 同学们的热心关怀给我很大的帮助和鼓舞，在他们的指导和帮助下，我顺利完 成了硕士论文，这里向他们表示衷心的感谢。 首先，我要感谢导师吴平教授，我在植物生理与生化国家重点实验室期间， 锝到吴平老师的悉心指导和谆谆教诲，导师广博的学识、开阔的科研思路、严 谨求是的治学态度给我留下深刻的印象，是我终身学习的榜样 其次，我要感谢吴世华导师的辛勤培养和悉心指导在吴老师的悉心指导 下，我不仅掌握了专业知识和实验技术，也领悟到作为科研工作者一丝不苟的 科研态度以及许多做人的道理。在此，对导师的无私教诲和悉心培养致以最诚 挚的敬意和最衷心的感谢。 再次，我要感谢刘非燕老师、杨璐师姐、俞志明师兄、张秋卉师姐，吴定 芳、罗可望等对我的关心、帮助和鼓励，在我遇到困惑和难题的时候，从他们 那里得到了许多专业的指导、中肯的意见和热情的鼓舞，衷心地谢谢你们 最后，我想向一直关心我成长的家人和朋友道谢，他们永远是支持我前进 的最坚强有力的后盾我会努力在今后的工作和学习中做一个积极向上、认真 负责的人 高原 2 0 0 8 年6 月于浙江大学紫金港校区 浙江大学硕士学位论文l 逆流色谱在天然生物碱分离中的应用 1 逆流色谱在天然生物碱分离中的应用 逆流色谱( c o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ，c c c ) 是利用溶质在两种互不相 溶的溶剂系统中分配系数的不同，从而进行分离的色谱法。逆流色谱可以在短时 问内实现高效分离和制备，可以达到几千个理论塔板数【1 一 与传统的分离方法相比，由于逆流色谱不使用固相载体作固定相，因此有许 多突出的优点：( i ) 克服了固相载体带来的样品吸附、变性、污染和峰形拖尾等 缺点嘲；( 2 ) 样品回收率高；( 3 ) 溶剂消耗量少；( 4 ) 成本低，使用过程中除了 溶剂消耗，没有多余的支出尽管逆流色谱的理论塔板数没有高效液相色谱 ( h p l c ) 高，但是逆流色谱的选择性和固定相与流动相的比例要高于液相色谱 在液相色谱中，固定相键和相只占分离柱体积的2 0 ，而逆流色谱固定相体积可 高达分离柱体积的8 0 。逆流色谱另外一个优点是可以改变流动相方向( 正向或 者反向) 。流动相可以作为固定相，固定相也可以作为流动相【4 1 由于逆流色谱很好地解决了固定相吸附带来的诸多问题，而且不会造成目标 化合物的结构变化，因此在分离纯化天然产物方面有着独特的优势，尤其应用于 生物活性指导下的天然产物分段方面目前逆流色谱已广泛应用于生化、生物工 程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域f 5 】 1 1 逆流色谱仪 1 1 1 螺旋营式离心分高仪 许多逆流色谱仪的原型都是在i t 0y 实验室( b e t h e s d a ，m a r y l a n d ，u s a ) 研 制出来的，包括同步行星式和非同步行星式离心分离仪其中被广泛使用的是首 先由p c i n c ( p o t o m a c ，m a r y l a n d ，u s a ) 公司生产的高速逆流色谱( h s c c c ) 【6 1 其它螺旋管式离心分离设备的生产商还有p h a r m a - t c c h ( b a l t i m o r e ，m a r y l a n d ， u s a ) ，a e c s ( b r i d g e n d ，u k ) ，北京新技术应用协会( b e i j i n g ，c h i n a ) ，t a u t o b i o t e c h ( s h a n g h a i ，c h i n a ) 和d y n a m i ce x t r a c t i o n s ( b r u n e ie n t e r p r i s ec e n t r e ， u x b r i d g c ，u k ) 典型的螺旋管式离心分离仪由聚四氟乙烯( p t f e ) 或者t e f z c l 管缠绕而成 ( 1 6 m m 或2 6 m r ai d ) 当螺旋管旋转时，螺旋管就会围绕中心轴做行星武运动 ( 图1 1 ) 7 1 行星式运动产生一个同步离心力场，让分析物以每小时5 0 0 0 0 次的 分配速度在两相溶剂体系之间分配。这种逆流色谱不需要采用旋转密封式接头就 浙江大学硕士学位论文l 逆流色谱在天然生物碱分离中的应用 可以解决在高速旋转和分离过程中可能出现的漏液问题【8 l 。 多层螺旋管式离心分离仪由两个或者三个相同的多层螺旋管以旋转轴为中 心对称排列组成分离柱的长度、流速、螺旋管的旋转方向等因素都会影响分离 效果【9 】 浙江大学【1 0 1 研制出一种新型的垂直螺式旋管行星分离仪，由四个垂直圆柱状 分离柱围绕旋转轴对称排列，分离管的为p t f e ( 4 m mi d ) ，总容量1 6 0 0 m 1 多 层螺线管的内部p 为0 2 8 ，外部p 为0 4 8 j 最大转速8 0 0 r p m 目前这种新型逆流色 谱已经成功分离了几种化合物。 柏国搿- 捌 图1 1j 型同步行星式离心分离仪示意图 f i g u r e 1 1s c h e m a t i cd r a w i n go far o t a t i n gc o i li n s t r u m e n te q u i p p e dw i t hp l a n e t a r yg e a r 1 1 2 筒状和圆盘状离心分商仪 1 9 8 2 年，日本东京s a n k e l 程公司的m u r a y a m a 和同事设计了一种筒状分离仪 由细管道连接的筒状分离柱围绕一个转子排列分离柱内先充满固定相，当分离 柱转动时，流动相被泵入分离柱，形成液滴状喷雾穿过固定相 圆盘状分离仪由s e a b ( v i l l e j u i f , f r a n c e ) 生产，原理与筒状分离仪相同 k r m e i l 仪器公司( s t a v 7 e ，f r a n c e ) 和p a r t u s 技术公司( r e i m s ，f r a n c e ) 制造过 容量1 2 5 l 和2 5 l 的圆盘状分离仪。 1 1 3 分析型逆流色谱仪 通常将螺旋管内径 l m m ，柱体积 5 0 m l 的多层螺旋管式离心分析仪称为分 析型高速逆流色谱。h s c c c 的一般色谱原理都适用于分析型h s c c c 分析型逆 流色谱虽然不能取代分析型高效液相色谱仪( h p l c ) ，但是它也有很重要的用途， 2 浙江大学硕士学位论文 l 逆流色谱在天然生物碱分离中的应用 尤其是可作为一种优化制备h s c c c 分离条件的有效手段此外，分析型h s c c c 还可以从粗提物和微量样品中分离活性化合物【1 1 】，不会造成微量样品的损失，分 析型逆流色谱还可以与质谱联用 1 1 4p h 区带精制逆流色谱 p h 区带精制逆流色谱( p h z o n e - r e f i n i n gc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ) 是分 离制备离子化合物有效方法它利用取代色谱特点，由一系列高浓度的溶质区带 组成，样品在区带之间的界面富集，杂质则在区带的边缘这种技术需要在有机 相中加入有机酸或碱，水相中加入无机反离子有机相和水相都可以作为流动相 或固定相当流动相穿入固定相时，由于酸碱反应，最终达到平衡。有机酸在有 机相和固定相中的分配系数作为量度，样品的分配系数与其的差距决定各样品的 出峰时间当样品进入柱中时被分离物质便以一串矩形峰的形式被洗脱出来，并 且依据p 勋和疏水性所决定的p h 值的大小依次排开【1 2 ，1 3 1 同普通的高速逆流色谱相比，p h 区带精制逆流色谱具有分离容量大、分离 纯度和效率高等优点。特别适用于分离那些在较宽的p h1 1 0 内，可形成稳定的 可离子化的物质。p h 区带精制逆流色谱是分离制备生物碱的非常有效的方法。 1 2 溶剂体系的选择 1 2 1 溶剂体系的选择原则 溶剂体系的选择对于逆流色谱十分关键，成功的逆流色谱分离实验的基础是 正确的溶剂体系的选择。逆流色谱的一个优点是即使选择了不合适的溶剂体系， 样品仍然可以被回收 通常来说，两相溶剂体系应满足以下要求【1 4 ，1 5 1 ： ( 1 ) 为了保证固定相保留值合适( 不低于5 0 ) ，溶剂体系的分层时间小于3 0 s ； ( 2 ) 目标样品的分配系数k 应该0 5 k k 1 ) ；k 值过小会减少峰的分辨率，k 值过大会造成峰形交宽和 拖尾 ( 3 ) 上下两相的体积大致相等，以免浪费溶剂； ( 4 ) 尽量采用挥发性溶剂，以方便后续处理，易于物质纯化 1 2 2 参考已知的溶剂体系 寻找合适的溶剂体系的第一步是查阅已知的文献资料，目前已经有大量的分 浙江大学硕士学位论文l 逆流色谱在天然生物碱分离中的应用 离实例和溶剂体系选择实例o k a t l 4 】认为氯仿甲醇水体系和极性稍小的正己烷 乙酸乙酯甲醇水体系对于许多样品都适合，在正己烷乙酸乙酯甲醇水体系 中，如果样品的亲水性很强，可以向溶剂体系中加入正丁醇o k a 描述了1 6 种由 正己烷乙酸乙酯甲醇水构成的溶剂体系，这些溶剂体系系列覆盖了一个较宽、 连续的极性范围，每种溶剂体系的上下相比例约为1 ：l ，分层速度在合适的时间 内i t o 1 研认为可先从正己烷乙酸乙酯甲醇水( 3 ：5 ：3 ：5 ，v v ) 开始( 表1 1 ) ， 如果k 值大于2 ，选择疏水性更强的体系( 箭头上方) ，如果k 值小于0 5 ，选择亲 水性更强的体系( 箭头下方) 。然后根据样品在两相中的分配关系调整溶剂体系 的组成 m a t - g a f f 1 7 1 也提出了相似的溶剂体系选择方法，正己烷乙酸乙酯甲醇水 ( 1 ：1 ：1 ：1 ，v ) 到乙酸乙酯：水( 1 ：1 ，v v ) 适用于分离极性化合物，正 己烷乙酸乙酯甲醇水( 1 ：l ：l ：l ，v v ) 到正丁醇：甲醇( 1 ：1 ，v ) 适合 分离疏水性化合物( 图1 2 ) 表1 1 溶剂体系选择示意图 t a b l e1 1s e a r c hf o rt h es u i t a b l et w o - p h a s es o l v e n ts y s t e m n - h e x a n ee t o a cm e o hn b u o hw a t e r + 1 00505 l 9l 5 0 5 i 82505 73505 64 5 0 5 55505 s t a r ti 45 4 05 353o5 h e r e i 2520 5 15 105 05oo5 04015 03 025 雹 菩 召 盏 昌 苍 4 浙学颂学位论文逆流色谱在天然生物碱分离中的应用 cfhkm p r 田1 2m a l g r 世溶剂体系选择模型 f i g u r e l 2s o v l e n ts y s t e m sb a s e do n t h e m a r g r m f r m o d e l 1 2 3 三元相田 相图是描述两相溶剂体系非常直观有效的方法，相图可以描述流动相和固定 相的精确组成，根据相图可以单独配置溶剂体系的某一相目前，文献中已有大 量的三元溶剂体系的相图可供参考，如s o 把n s o n 和a r l i t l ”汇编的l i q u i d - l i q u i d e q u i l i b r i u m d a t ac o l l e c t i o n ，给出了上百种三元洛剂体系的摩尔分数依据及其正交 型相图图13 是氯仿甲醇水的三溶剂体系相图例。融合曲线将两相区域和互溶 区域分隔开。 圉13 氯仿- 甲醇一水! 元相田 f i g u r e i3p h a s ed i a g r a m f o r t h ec h l o r o f o r m m e t h a n o l - w a t e rs o l v e ms y s t e m 浙江大学硕士学位论文l 逆流色谱在天然生物碱分离中的应用 1 2 4 薄层色谱 薄层色谱( t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y , t l c ) 是实验室常用的检测样品纯度 和摸索分离条件的一种方法，它具有方便、快速等特点，并且可以使用各种显色 剂，这对于无紫外吸收的样品尤为重要t l c 在h s c c c 溶剂系统选择中可以快 速指导建立逆流色谱的分离方法【1 9 1 首先按选定的溶剂系统配置一定量的两相溶剂，各取等量的上相和下相溶剂 于小试管中，加入数毫克样品，剧烈震荡使样品完全溶解，用毛细管取近似等量 的上下相溶液点在t l c 硅胶板上，待溶剂挥发完后用溶剂系统中的有机层或其它 合适的溶剂系统展开，根据样品的性质，选择适当的显色剂显色。选择样品在两 相中分布基本相等且i 讧值在0 2 加5 之间的溶剂系统。 t l c 法检查溶剂系统准确度较低，但是方便、快速，尤其是对复杂天然产物 分离的溶剂系统选择非常适用一个良好的溶剂系统的确定，常常需要多次改变 中介溶剂的含量，也需要对溶剂系统进行多次检测，这使得t l c 快速方便的特点 更加突出 1 2 5 高效液相色谱 高效液相色谱( i - i i g h - p c r f o r m a n c cl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，i - i p l c ) 也可以用 来检测样品在两相溶剂体系中的分配关系。配好不同比例的溶剂体系，剧烈振荡 使各溶剂充分混合，静置片刻，待两相分层后取出2 m l 下相溶液，置于试管中， 加入适量的粗提物，剧烈振荡使之完全溶解，经i - i p l c 仪测定，设某组分的峰面 积为a 1 。取出i m l 上述溶液，置于另一试管中，并向该试管中加入i m l 上相溶液， 剧烈振荡使溶质在两相问分配，静置片刻达分配平衡后，取出适量下相溶液，再 经h p l c 仪测定，设该组分的峰面积为a 2 则该组分在这种溶剂体系中的分配系 数k ( a 1 叫墟) a 2 。按照这种方法粗提物中各组分的分配系数都可计算出来 4 1 1 2 6 分析型逆流色谱 最直接和精确的溶剂体系选择方法是在分析型逆流色谱上试验分析型逆流 色谱具有柱体积小( 1 0 - 4 0 m 1 ) ，分离速度快( 一般不超过l h ) ，进样量少( 一般 为几微克) ，溶剂消耗量少等特点利用这些特点对初步选择的溶剂体系进行快 速筛选和适当的调整可以达到事半功倍的效果，很多具体的实例证明，分析型 c c c 是一种非常有用的溶剂体系筛选方法 6 浙江大学硕士学位论文l 逆流色谱在天然生物碱分离中的应用 利用o k a 和m a r g r a f f 模式系统地寻找c c c 溶剂体系对于离子化合物( 例如 生物碱) 是不够的，生物碱的分离不仅需要溶剂比例的调整，还需要p h 值和离 子强度的的调整，在这种情况，分析型c c c 是最直观地和最理想的溶剂体系选择 方式例如在优化c o p t i sc h i n e n s i s 皿a n l m c l l l a c e ) 生物碱分离条件的时候【2 0 】，用 分析型c c c ( 3 0 m 1 ) 尝试了一系列氯仿甲醇h c l 体系，最长分离时间2 小时， 通过分离色谱图的比较和分析，选择氯仿甲醇0 2 m h c i ( 8 ：3 ：4 ，v v ) 体系， 然后应用与2 3 0 “的半制备逆流色谱分离得到四种生物碱 1 3 逆流色谱的洗脱模式 1 3 1 梯度洗脱模式 高速逆流色谱通常使用恒定比例的溶剂系统，但是对于组分极性交化大的样 品，用恒定比例的溶剂系统难以达到分离效果此时可以像瑚? l c 一样采用梯度 洗脱的方法进行分离。梯度洗脱是一种有效节省洗脱时间的分离方式，适用于分 离一系列极性差别较大的化合物。在这个复杂的体系变化中，流动相组成的任何 变化都有可能打破液液平衡系统，引起固定相的大量流失【2 1 1 。图1 4 是乙酸乙酯 正丁醇水三元相图梯度洗脱变化示意图圈 图1 5 是不同极性化合物的梯度洗脱示意图，先用简单的梯度洗脱系统如水 乙腈( 1 0 0 ：0 0 ：1 0 0 ) 用h p l c 对样品进行极性扫描分析，将分析结果与图1 5 比 较得出样品的极性范围，再选择适当的溶剂系统，如正己烷正丁醇甲醇水( 极 性化合物) 、正己烷乙酸乙酯甲醇水( 中极性化合物) 和正己烷乙腈( 非极性化合 物) 。然后逐渐改变系统中某一溶剂的比例，如将正己烷乙酸乙酯甲醇水体系中 甲醇的比例从0 1 逐渐提高到2 5 ，最终得出最佳梯度洗脱系统一般情况下，可 以用线性梯度( 1 i n e a rg r a d i e n t ) 实现c c c 的梯度洗脱模式，用两个泵来实现流动 相组成的线性梯度变化，线性梯度已经在很多方面取得了成功。 7 浙江大学硕士学位论文l 逆流色谱在天然生物碱分离中的应用 ol o绚弱7 d 9 01 0 0 w a t e r 图1 4 乙酸乙酯正丁醇水三元相图，i = 起始流动相，a = 中问流动相，f = 最终流动相 f i g u r e1at e r n a r yp h a s ed i a g r a mf o r t h es o l v e n ts y s t e me t h y la c e t a t e - l - b u t a n o l - w a t e r i = i n i t i a l m o b i l ep h a s e ，a = i n t e r m e d i a t em o b i l ep h a s e ，f = f i n a lm o b i l ep h a s e 图1 5 不同极性化合物的梯度洗脱逆流色谱 f i g u r e 1 5g r a d i e n te l u t i o nc c cf o rd i f f e r e n tp o l a rc o m p o u n d s 1 3 2 双向洗脱模式 由于h s c c c 允许粗样直接上样分离，有时候样品非常复杂，其组分所覆盖 的极性范围很宽，采用等比例或梯度洗脱都很难实现一次性的分离，这时可以利 用c c c 液态固定相的特点，进行双向洗脱( d u a l m o d ee l u t i o n ) ，如第一步采取 反向洗脱，第二步采取正想洗脱，反之亦然图1 6 为双向分离模式示意图圆 第一步采取反向洗脱，极性的水相作为流动相，非极性的有机相作为固定相 溶质在柱内移动的速度与它们的分配系数成反比，即分配系数大的溶质移动速度 较慢，它们洗脱需要较长的时间第二步将原来的固定相换作流动相，从相反的 方向泵入柱内，这时，溶质的分配系数变为1 k ，即在第一步中分配系数越大的 溶质，在第二步中保留体积越低，越早被洗脱出来 浙大学顶学位论文 逆流色谱在天然生物碱分高中的应用 i p h a s er e v e r s n i 圈】6 职向洗脱模式示意图 f i g u r e1 6s c h e m m i c ”p r e s e n t a t i o no f t h ed u a l - m o d e c c cs e p a r a t i o n 1 3 3 洗脱推m 模式 双向洗脱模式是一种不连续的洗脱模式，当固定相换作流动相，流动相换作 固定相时，c c c 必须重新实现新的平衡。洗脱推出模式( e l u f i o n e x t r u s i o n ) 则 是另一种实现样品中宽极性范围成分分离的方式，洗脱推出是连续的洗脱方式， 不需要停止下来州。 这种方法利用了c c c 液态固定相的特性，将保留在柱中对固定相有极强亲 和力，也就是分配系数高的成分，用固定相推出柱外洗脱推出模式也包括两个 步骤：0 ) 常规洗脱；( i i ) 利用固定相将保留在分离柱内的对固定相亲和力强的疏 水性溶质边洗脱边推出，图17 为洗脱推出模式的示意图吲 群匡垂鎏雾薹 一 蛳 蜥- - o y 一p o 。官薹巨亘薹l _ 。 。巨奎宦翻三盈一 田1 7 洗脱推出模式示意图 f i g u m1 7s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o n o f t h ee u f i o n - e x t r u s i o n c c c 浙江大学硕士学位论文l 逆流色谱在天然生物碱分离中的应用 1 4 逆流色谱在生物碱类化合物分离中的应用 生物碱一般是指存在于植物中的碱性含氮化合物，大多数具有含氮杂环，有 旋光性和明显的生理效应 2 6 1 生物碱绝大多数分布在植物界的双子叶植物中，如 豆科、毛莨科等 生物碱的发现起始于1 9 世纪初，是人类研究最早最多的一类天然有机化合 物。目前已发现生物碱约6 0 0 0 种 2 7 1 ，多数生物碱具有显著的生理活性，往往是许 多药用植物的有效成分自1 9 6 5 1 9 8 0 年美国国家癌症协会( n c i ) 策划并实施了 从3 5 0 0 0 多种植物筛选抗癌新药计划一来，取得了令人鼓舞的结果。喜树碱 ( c a m p t o t h e c i n ) 及其衍生物已经成为继紫杉醇之后的第二个从植物中提取衍生 的抗癌药物，成为一个世界性的热门话题石蒜碱( 1 y e o r i n e ) 、长春碱( v i n b l a s t i n e ) 、 长春新碱( v i n c r i s t i n e ) 、苦参碱( m a t r i n e ) ，三尖杉酯碱( h a r r i n g t o n i n e ) 和高三 尖杉酯碱( h o m o h a n 血g t o n i n e ) 等显著的抗癌效果也得到了进一步的研究。作用 于神经系统的生物碱类药物有第一代的阿托品( a t r o p i n e ) ( 阻断m 胆碱受体的抗 胆碱药) 和第二代的石杉碱甲( h u p e r z i n ea ) 和石杉碱乙( h u p e r z i n eb ) ( 乙酰 胆碱酯酶抑制药物) 莲心碱( 1 i e n s i n i n e ) 和甲基莲心碱季胺盐( n e f e r i n e ) 、木 兰花碱( m a g n o f l o r i n e ) 和环常绿黄杨碱d ( e y c l o v i r o b u x i n ed ) 可治疗心血管系 统的疾病。小檗碱( b e r b e r i n e ) 、巴马亭( p a l m a t i n e ) 等有明显的抗菌消炎作用。 生物碱具有多种生物活性，在医药和农药领域有广阔的应用前景。深入地研 究和开发生物碱提取与分离的方法，使用化学合成方法对其结构进行修饰，筛选 强活性的生物碱，以及用药方式的改进和创新等，是未来对高活性生物碱进行进 一步研究的热点内容 生物碱类化合物呈碱性，大多数易溶于氯仿、苯、甲醇、乙醇等有机溶剂， 难溶于水，遇酸成生物碱盐易溶于水、甲醇、乙醇，难溶于有机溶剂。生物碱的 化学性质决定了其在选择逆流色谱的溶剂体系时印遵循一般的原则，又具有一些 特点下面总结逆流色谱分离生物碱常用的溶剂体系 1 4 1 常规逆流色谱法分裔生物碱类化合物 1 4 1 1 氯仿甲醇乙醇水体系 逆流色谱分离