（药理学专业论文）维康醇对肝癌的抑制作用及其机理研究.pdf

螋硼 y 1 8 9 3 i c ：j i 芝：j i i l 目录 一、摘要 中文论著摘要l 英文论著摘要4 二、英文缩略语7 三、论文 前言8 材料与方法9 结果1 l 讨论1 7 结论1 8 四、本研究创新性的自我评价1 9 五、参考文献2 0 六、附录 综述2 3 在学期间科研成绩2 9 致谢3 0 个人简介3 1 中文论著摘要 维康醇对肝癌的抑制作用及其机理研究 刖声 肝细胞性肝癌( h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a , h c c ) 是严重威胁人类健康的主要肿 瘤之一。每年约有6 0 1 0 0 万新发病例，死亡人数高达6 0 万人次。目前h c c 的主要 治疗手段仍然是手术治疗，但治疗率低、复发性高、预后差。h c c 疗效不尽如人 意的最主要原因是诊断较晚。7 0 8 0 的h c c 病人发现时已到晚期，不能进行有效 的根治性治疗。研究和应用有效的、可耐受的治疗肝癌的新药仍然是未来长期的 持续性工作。 凋亡是参与维持机体生理平衡的重要机制，与机体生长发育和肿瘤等多种疾 病的发生发展过程都有着紧密的联系。常用的化疗药物可以引起肿瘤细胞的凋亡， 从而抑制肿瘤的生长。近年来，自噬作为另外一种细胞程序性死亡方式逐渐引起 了人们的高度关注。自噬与凋亡一样有着复杂的分子机制和调控机制，两者之间 存在着密切的联系。 从天然动植物中寻找低毒、高效的抗癌活性成分是近年来研究的热点之一。 紫杉烷类的代表药物紫杉醇( p a c l i t a x e l ，p t x ) 是从紫杉树树皮中提取的一种天然植 物类抗肿瘤药物。通过研究和临床证实紫杉醇是乳腺癌和卵巢癌及非小细胞肺癌 ( n s c l c ) 的一线和二线治疗药物。维泰醇( a l t e r n 0 1 ) 是利用红豆杉树皮中分离、 选育到的l 株高产紫杉醇菌种发酵生产的新型单体化合物。体外抗肿瘤活性研究表 明，维泰醇对2 0 多种肿瘤细胞株的增殖具有抑制作用，杀伤率可达5 0 - - 9 9 不等； 其抗瘤谱广，抑瘤效果显著。近年来紫杉烷类化合物化学研究焦点已转向发现新的 天然产物并对已发现的化合物进行结构上的改造，以提高生物活性，增强疗效， 降低毒副作用。维康醇是在紫杉醇发酵过程中获得的另一个化合物，其结构和维 泰醇非常相似，它的抗肿瘤活性以及其可能的作用机制值得我们进行详细研究。 本研究拟以肝癌细胞h c p g 2 为模型，应用m t t 法、流式细胞术、荧光染色、 以及w e s t e r nb l o t 等方法，探讨维康醇对肝癌的作用及其可能的作用机理。 材料和方法 以不同浓度维康醇作用于h e p g 2 细胞一定时间后，利用m t t 法检测其对细胞 增殖的抑制率，流式细胞仪p i 单染检测细胞周期分布的情况，流式细胞仪a n n e x i n v p i 双标记法检测细胞凋亡率，m d 0 荧光染色检测细胞自噬，以及w e s t e r nb l o t 技术 检测e i 、p 3 8 、i n km a p k s 和自噬相关蛋白m a p l c 3 的表达。 实验结果 l 、维康醇对h e p g 2 细胞增殖的影响 h e p g - 2 细胞经维康醇处理后，m ，丌法显示维康醇对h c p g 2 细胞具有明显的 生长抑制作用并呈时间剂量依赖性。经检验，与对照组相比有明显差异，p 0 0 5 或p 0 0 1 。当维康醇浓度达到1 0l l m 时，细胞抑制率显著升高。 2 、流式细胞法分析细胞周期和凋亡 流式细胞仪检测结果显示3l l m 、1 0g m 、3 0t t m 维康醇作用于h c p g - 2 细胞 4 8h 后，处于s 期和g 2 m 期的细胞比例升高，同时伴随g 1 g o 期细胞比例下 降，与对照组相比，差异有统计学意义( p o 0 5 或 o 0 1 ) 。a n n e x i n - v p i 染色检 测显示，31 t m 、1 0i x m 、3 0l l m 维康醇作用于h e p g - 2 细胞4 8h 后的细胞凋亡率 分别为7 5 2 、7 0 7 和2 3 6 6 ( 溶剂对照组为7 2 1 ) 。 3 、m d c 荧光染色检测细胞自噬 荧光显微镜下观察到，不同浓度维康醇作用于h e p g 2 细胞4 8h 后，细胞出 现的自噬泡逐渐增加，药物浓度达到3 州时自噬泡的数量最多，继续加大浓度， 自噬泡的数量减少。3 - m a ( 2m m ) 预处理1h 后再加入1 州的维康醇作用4 8h ， 可见空泡量明显减少。 4 、蛋白质印迹检测相关蛋白水平的表达 w e s t e r nb l o t 检测结果显示，1 0l l m 维康醇可以显著上调l c 3 i i 的表达水平， 随着药物浓度的升高，p - p 3 8 和p - e r k 蛋白水平的表达逐渐增高，但p - j n k 没有 显著变化。 2 结论 1 、维康醇抑制肝癌细胞h e p g 2 的增殖，并具有浓度和时间依赖性。 2 、维康醇在低剂量时，诱导h e p g - 2 细胞的自噬作用；在高剂量时诱导h e p g 2 细胞的凋亡，维康醇抑制h e p g 2 细胞的增殖是通过引起细胞周期阻滞和诱导细 胞凋亡和自噬的途径来实现的。 3 、维康醇对h e p g - 2 细胞的作用可能与e r k 和p 3 8 信号通路的激活有关。 关键词 维康醇；肝癌；自噬；凋亡；l c 3 ；m a p k s 3 英文论著摘要 i n h i b i t o r ye f f e c to fw k c i nh e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m ac e l l s i n t r o d u c t i o n h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ( h c c ) i sal e a d i n g c a u s eo fc a n c e r - r e l a t e dd e a t h w o r l d w i d e t h ee s t i m a t e di n c i d e n c eo fn e wc a s e si sa b o u t6 0 00 0 0 - 10 0 00 0 0p e ry e a r c a u s i n g6 0 00 0 0d e a t h sg l o b l l yp e ry e a r t h ec o m p l e xc o n d i t i o no ft h i sd e v a s t a t i n g c a l l c e ri sa s s o c i a t e dw i t hap o o rp r o g n o s i s s u r g i c a lr e s e c t i o np r o v i d e st h eb e s tc h a n c e f o rc u r eo rl o n g t e r ms u r v i v a l ，b u tf e wp a t i e n t sp r e s e n tw i n lr e s e e t a b l ed i s e a s ed u et o t h eu s u a l l yl a t eo n s e to fs y m p t o m s t h e r e f o r e ，t h ed e v e l o p m e n to fn e wd r u g sf o rt h e t r e a t m e n to fa d v a n c e dh c ci sn e c e s s a r y b o t ha p o p t o s i sa n da u t o p h a g yp l a yv i t a lr o l e si nt h em a i n t e n a n c eo fp h y s i o l o g i c a l b a l a n c ea n dt h es t a b i l i t yw i t h i nt h ee n v i r o n m e n t t h e ya r ei n t i m a t e l yc o n n e c t e d 、) l ，i m g r o w t hd e v e l o p m e n ta n dav a r i e t yo fd i s e a s ep r o c e s s e ss u c ha st u m o r f o rt h et u m o r t r e a t m e n t ，t r a d i t i o n a lc a n c e rt h e r a p ye v o k e sc e l ld e a t hb yi n d u c i n ga p o p t o s i s m o r e r e c e n t l y , o t h e rm e c h a n i s m so fc e l ld e a t hh a v ee m e r g e da sp o t e n t i a ln o v e lm e c h a n i s m s f o rc a n c e rt h e r a p i e st oi n d u c ec e l ld e a t h a sa n o t h e rp r o g r a m m e dc e l ld e a t ha u t o p h a g y a l s oh a sc o m p l e xm o l e c u l a ra n dr e g u l a t o r ym e c h a n i s m ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e m i sc l o s e l y m o r er e c e n t l y , d r u g sd e r i v i n gf r o mp l a n t sa r ep a i dm o r ea t t e n t i o nt oa n t i c a n c e r t h e r a p y p a c l i t a x e l ，ar e p r e s e n t a t i v ed r u go ft a x a n e s ，i sa k i n do fa n t i c a n c e rd r u g sw i t h p o w e r f u la c t i v i t ye x t r a c t e df r o mt h eb a r k o fy e w a l t e r n o la n dw k c a r en o v d c o m p o u n dp u r i f i e df r o mt h ef e r m e n t i n g p r o d u c t sb ym i c r o o r g a n i s m sn a m e d a s a l t e r n a r i aa l t e m a t av a t m o n o s p o r u sf r o mt h eb a r ko fy e w r e c e n ts t u d ys h o w e dt h a t a l t e m o lc o u l di n h i b i tt h ep r o l i f e r a t i o no fs e v e r a lm a l i g n a n tt u m o rc e l l s a sw c kh a s s i m i l a rc h e m i c a ls t r u c t u r ew i t ha l t e n 0 1 w ew o n d e rw h e t h e rw c kc o u l di n h i b i tc a n c e r 4 c e l lg r o w t h i nt h ep r e s e n ts t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt h ea n t i - t t l l l l o re f f e c ta n dt h ep o s s i b l e m e c h a n i s mo fw k ci nh e p g 2c e l l si n c l u d i n gt h ee f f e c t s0 nc e l lg r o w t h , c e l lc y c l e d i s t r i b u t i o n ，a p o p t o s i s ，a u t o p h a g ya n dt h ee x p r e s s i o no f r e l e v a n tp r o t e i n s m a t e r i a l sa n dm e t h o d s h e p g - 2c e l l sw e r et r e a t e dw i mw k c t h ec e l lp r o l i f e r a t i o n , c e l la u t o p h a g y , c e l l c y c l ed i s t r i b u t i o n , a n dc e l l a p o p t o s i s w e r ee v a l u a t e d u s i n g3 - ( 4 ， 5 - d i m e t h y l t h i a z o l 2y d2 ，5 - d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e ( m t t ) a s s a y , f l u o r e s c e n t m i c r o s c o p ya n df l o wc y t o m e t r y t h ee x p r e s s i o no fe r k 、p 3 8 、j n km a p k sa n d m a p l c 3w e r ee v m u a t e db yw e s t e r nb l o ta n a l y s i s t h er e s u l t sw e r ea n a l y z e db yt h e s p s s16 0s o m v a r e r e s u l t s 1 、w k ci n h i b i t e dh c p g 一2c e l lg r o w t hi nad o s ea n dt i m ed e p e n d e n tm a n n e r 畎o 0 5 ，o r0 0 1v s c o n t r 0 1 ) 2 、f l o wc ”o m c t r ya n a l y s i ss h o w e dt h a tw k ct r e a t m e n tr e s u l t e di i lt h e a c c u m u l a t i o no fc e l l sa tt h esp h a s ea n dg 2 mp h a s ei nh c p g - 2c e l l sd o s e - - d e p e n d e n t l y , w k ci n d u c e d h c p g 一2c e l la p o p t o s i sa th i g hd o s e s 3 、f l u o r e s c e n tm i c r o s c o p ys h o w e dt h a tal a r g eq u a n t i t yo fa u t o p h a g i cv e s i c l e s w e r eo b s e r v e dw i t hw c k t r e a t m e n t 3 - m a ，as p e c i f i ca u t o p h a g yi n h i b i t o r , r e v e r s e dt h e a u t o p h a g i ce f f e c to nh c p g - 2c e l l s 4 、p r o t e i ne x p r e s s i o n so fp e r k 、p - p 3 8a n dl c 3 - i ii nh c p g - 2c e l l sw e r e i n c r e a s e dw i t ht h ew c kt r e a t m e n t ，b u tn oo b v i o u sm o d i f i c a t i o ni np - j n k c o n c l u s i o n 1 、w k cc a ni n h i b i th c p g 一2c e l lg r o w t hi nv i t r o 2 、w k cs u p p r e s s e st h ec e l lg r o w t ho fh c p g 一2c e l l st h r o u g ht h ei n d u c t i o no fa u t o p h a g y a tl o wd o s e sa n dt h ei n d u c t i o no fa p o p t o s i sa n dc e l lc y c l ea r r e s ta th i g hd o s e s 3 、t h ea c t i v a t i o no fe r ka n dp 3 8m a p kw a si n v o l v e di nt h ei n h i b i t o r ye f f e c to f w k c i i lh c p g 2c e l l s 5 k e y w o r d s w k c ；h c p a t o m a ；a u t o p h a g y ；a p o p t o s i s ；m a p k s ；l c 3 6 英文缩略语 7 论文 维康醇对肝癌的抑制作用及其机理研究 刖置 肝细胞性肝癌( h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a , h c c ) 是严重威胁人类健康的主要肿 瘤之一。每年约有6 0 1 0 0 万新发病例，死亡人数高达6 0 万人次。目前h c c 的治疗 仍然是手术治疗为主，配合以放疗、化疗、生物治疗等多种治疗手段。但治疗率 低、复发性高、预后差。h c c 疗效不尽如人意的最主要原因是诊断较晚【l l 。7 0 8 0 的h c c 病人发现时已到晚期，不能进行有效的根治性治疗。因此肝癌的治疗仍 然主要依赖于全身化疗和相关的治疗如介入栓塞化疗等。到目前为止，肝癌的化 疗还不尽如人意，不懈地寻找有效的、可耐受的治疗肝癌的新药仍然是今后努力 研究的方向【2 i 。 对于肿瘤的化疗，研究较多的是药物诱导的肿瘤细胞凋亡。近来，自噬被人 们称为i i 型程序性细胞死亡。与凋亡一样，自噬有着复杂的分子机制和调控机制， 两者之间存在着紧密的联系。自噬是细胞在能量缺乏等代谢压力下的一种生理过 程，细胞内的细胞器、蛋白和胞质通过自噬作用被包裹、消化，降解成核苷、氨 基酸和脂肪酸被循环利用，从而维持细胞正常的代谢活动 a - a l 。这种形式的细胞死 亡主要表现为细胞浆中出现大量包裹着细胞器的空泡结构和溶酶体对空泡内成分 的降解【加l 。在哺乳动物自噬泡形成的过程中，l i g h tc h a i n 3 ( l c 3 ) 的修饰过程起 到了至关重要的作用【1 1 i ，m a pl c 3 与酵母中a p g s a u t 7 c v t 5 为同源基因，是自 噬发生的重要基因。人类的l c 3 分为两型：l c 3 1 和l c 3 i i ，在自噬发生时均经 转录后修饰。l c 3 羟基端首先被剪切，随后在细胞质中合成l c 3 1 。在自噬发生 时l c 3 1 在泛素样系统包括a p 9 7 和a p 9 3 的调解下转化成l c 3 一i i ，参与自噬小 泡的形成【1 2 1 。因此，l c 3 i i l c 3 1 比值与自噬的发生水平成正比【1 3 l 。丝裂原活化 蛋白激酶( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s ，m a p k s ) 是细胞内的一类丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶，包含3 个主要家族：e r k s ，j n k s 和p 3 8 m a p k s 。经研究 证实，m a p k s 信号转导通路存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导 8 至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应( 如细胞增殖、分化、转化及凋亡 等) 的过程中具有至关重要的作用。不同的细胞外刺激可激活不同的m a p k s 信号通路，通过其相互调控而介导不同的细胞生物学反应。 从天然动植物中寻找低毒、高效的抗肿瘤活性成分是近年来研究的热点之一。 紫杉烷类的代表药物紫杉醇( p a c l i t a x e l ，p t x ) 是从紫杉树树皮中提取的一种天然植 物类抗肿瘤药物。通过研究和临床证实紫杉醇是乳腺癌和卵巢癌及非小细胞肺癌 ( n s c l c ) 的一线和二线治疗药物，并可用于治疗头颈癌、食管癌、精原细胞瘤 和复发非霍其金淋巴瘤等1 1 4 - 1 8 l 。维泰醇( a l t e r n 0 1 ) 是利用红豆杉树皮中分离、选育 到的l 株高产紫杉醇菌种发酵生产的新型单体化合物。体外抗肿瘤活性研究表明， 维泰醇对2 0 多种肿瘤细胞株的增殖具有抑制作用，杀伤率可达5 0 9 9 不等， 其抗瘤谱广，抑瘤效果显著。近年来紫杉烷类化合物化学研究焦点已转向发现新的 天然产物并对已发现的化合物进行结构改造，以提高生物活性，增强疗效，降低 毒副作用。维康醇是在紫杉醇发酵过程中获得的另一个化合物，其结构和维泰醇 非常相似，它的抗肿瘤活性以及其可能的作用机制值得我们进行详细研究。本研 究应用m t t 法、流式细胞术、m d c 荧光染色以及w e s t e r nb l o t 等方法，研究维 康醇抑制肝癌细胞增殖的作用，并探讨其可能的作用机理。 一、材料 材料和方法 l 、试剂 r p m i 1 6 4 0 培养液( g i b c o 公司，美国) ，胎牛血清( 天津灏洋生物公司，中 国) ，m t t ( m e t h y l t h i a z o l y lt e t r a z o l i u m ，f l u k a 公司，美国) ，碘化丙锭( p i ，b i o s h a r p 公司，美国) ，a n n e x i nv - f i t c 试剂盒( 深圳晶美生物工程有限公司，中国) ，e c l ( a m e r s h a mb i o s c i e n c e s 公司，英国) ，p - e r k , e r k ，p - p 3 8 ，p 3 8 ，p - j n k ，j n k ，1 3 - a c t i n 抗体( s a n t ac r u zb i o t e c h ，美国) ，3 - m e t h y l a d e n i n e ( 3 - m a ) ，m o n o d a n s y l c a d e r v a r i n e ( m d c ，m e r c k 公司，德国) ，十二烷基硫酸钠( s d s ) 、二甲基亚砜( d m s o ) ， h o e c h s t3 3 2 5 8 荧光染料和兔抗人l c 3 抗体均为美国s i 肿a 公司产品。 9 2 、仪器 c 0 2 恒温培养箱( t h e r m oe l e c t r o nc o r p o r a t i o n ，美国) ，s w c j 1 b 型净化工 作台( 苏州净化设备厂) ，光学显微镜和荧光显微镜( o l y m p u s 公，日本) ，酶 标仪( t e c a n 公司，瑞士) ，f a c s c a l i b u r 型流式细胞仪( b e c t o nd i c k i n s o n 公司，美 国) 。 3 、细胞和药物 人肝癌细胞系h e p g 2 由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物 学研究所提供。维康醇由汕头市双骏生物工程有限公司提供。 二、方法 l 、细胞培养 人肝癌细胞系h e p g 一2 置于含1 0 胎牛血清、1 0 0u n i l 青霉素、1 0 0i t g m l 链 霉素的r p m i - 1 6 4 0 培养液中，于3 7 ( 2 、饱和湿度、5 c 0 2 的培养箱中培养。三 天传代一次，实验时用对数生长期细胞，每一种实验均重复三次。 2 、用四氮唑蓝比色法( m t t 法) 检测细胞增殖 h e p g - 2 细胞制成细胞悬液按1 0 0p l 孔加至9 6 孔板内，使每孔内细胞数为 5 0 0 0 。2 4 小时后加入含1 0 f b s 的r p m l l 6 4 0 培养液稀释的药物，包括不同药物 试验组及溶剂阴性对照组。检测药物作用2 4 、4 8 、7 2 小时后细胞增殖的抑制率， 每次实验每个浓度药物设三个重复孔，实验重复3 次。 3 、流式细胞术检测细胞周期变化 h c p g 一2 细胞以l x l 0 6 孑l 接种至6 孔板内，贴壁过夜后分别加入不同浓度的维 康醇。药物作用4 8h 后，0 2 5 胰酶消化收集细胞，7 0 乙醇4 0 c 固定细胞过夜。 用1 0 0m g m lp i ( 含5 0l , t g m lr n a 酶) 溶液避光染色细胞后用流式细胞仪进行细 胞周期检测。 4 、a n n e x i n v p i 双标记法检测细胞凋亡 h c p g 2 细胞以l x l 0 6 孑l 接种于六孔培养板中过夜，用不同浓度药物及溶剂处 理，4 8 小时后收集细胞，预冷p b s 离心洗涤2 3 次。将细胞重悬于2 5 01 t l 结合缓 1 0 冲液中，加入1 0p 1a n n n e x i n v - f i t c 和5 “1p i ，轻轻混匀，室温避光反应3 0 分钟 后用流式细胞仪检测。 5 、m d c 荧光染色检测自噬 h e p g 2 细胞接种至六孔板内，5 x 1 0 3 孔，贴壁过夜后分别加入不同浓度的维 康醇。药物作用4 8h 后除去含血清的培养液。用o 0 5m mm d c 于3 7 温育6 0m i n , 4 多聚甲醛固定1 5 m i n , p b s 洗后用封闭液封片，然后使用荧光显微镜( o l y m p u s ) 加3 5 6n l n 发射滤片和5 4 5n l n 激发滤片进行观察和照相。 6 、蛋白免疫印记实验( w e s t e r nb l o t ) 将h e p g 2 细胞( 1 x 1 0 6 个孔) 接种于6 孔培养板中过夜，加入不同浓度的药 物处理2 4h 。吸除培养液，p b s 洗涤后，每孔加入细胞裂解液5 0m ，获得总蛋白。 以牛血清白蛋白( b s a ) 做标准品，测蛋白浓度。取8 0 嵋总蛋白经1 0 聚丙烯 酰胺凝胶电泳分离后，转至硝酸纤维素膜上，5 脱脂牛奶( 含0 1 t w e e n2 0 ) 封闭1 小时，加一抗4 孵育过夜( p a c t i n 做为上样量对照) ，洗膜，加辣根过氧 化物酶标记的二抗室温孵育2 小时，洗膜，e c l 显色，扫描分析。 三、统计分析方法 实验数据均使用s p s s1 6 0 数据统计软件进行单因素方差分析、l s d t 检验， 以双侧p 0 0 5 为有统计学意义。 乡士甲 当日7 r l 、m t t 法检测维康醇对h e p g 2 细胞增殖的抑制作用 活细胞可将外源性m t t 代谢成难溶性兰紫色结晶，并沉积于细胞内，其数量 与增殖程度成正比。1 0 s d s ( 含1 0m mh c l ) 溶液溶解细胞中的紫色结晶，用酶 联免疫检测仪在5 7 0a m 波长处检测其吸光度值( o d 值) ，可以间接反映活细胞数 量。m t t 实验结果显示，不同浓度或不同作用时间的维康醇均对h e p g 2 细胞的增 殖具有抑制作用，随着药物浓度的升高及作用时间的延长，抑制率也相应增加( 图 1 ) 。说明维康醇抑s s j h e p g 2 细胞增殖的作用具有明显的时间和剂量依赖性。经检 验，差异具有统计学意义( 氏o 0 5 或木幸p 0 0 1 ) 。 图1 ，不同时间和浓度的维康醇对h e p g - 2 细胞的抑制率( ) ( 孑虹，n = 3 ) 2 、维康醇对h e p g 2 细胞周期分布的影响 流式细胞仪检测结果显示3l a m 、1 0l x m 、3 0 州维康醇作用于h e p g 2 细胞 4 8h 后，处于s 期和g 2 m 期的细胞比例升高，3 0 州维康醇处理组的s 期和 g 2 m 期的细胞为2 4 9 1 、1 6 3 5 ( 对照组的s 期和g 2 m 期的细胞为1 7 7 9 、 1 1 2 3 ) ，同时伴随g l g o 期细胞由对照组的7 0 9 8 降至3 0 肛m 维康醇处理组 的5 8 7 4 ，差异有统计学意义( p o 0 5 或 o 0 1 ) 。( 图2 ) 。 1 2 管狳r - 量d i p 函 酉蠹孑 一返 a 罾辫 - 蠹墓 r lo 玉8 、 乞力 c b d 图2 ，不同浓度维康醇对h e p g - 2 细胞周期分布的影响a ：对照组b ：维康醇 3l t mc ：维康醇1 0 州d ：维康醇3 0 州 3 、a n n e x i nv p i 双标记流式细胞仪分析维康醇对h e p g 一2 细胞凋亡 的诱导作用 a n n e x i n - v p i 染色检测显示维康醇可以引起h e p g - 2 细胞凋亡，3 小、1 0 州、 3 0 州维康醇作用于h e p g - 2 细胞4 8h 后的细胞凋亡率分别为7 5 2 、7 0 7 和 2 3 6 6 ( 溶剂对照组为7 2 1 9 6 ) ( 图3 ) 。 1 3 a c b 图3 ，不同浓度维康醇( t t m ) 对h e p g 2 细胞凋亡的影响a ：对照组，b ：维 康醇3l , t m ，c ：维康醇1 0i t m ，d ：维康醇3 0i t m 4 、荧光显微镜下观察m d c 染色细胞形态及自噬囊泡 维康醇作用于肝癌h e p g 2 细胞4 8h 后，可见随着药物浓度的增加，m d c 阳 性细胞逐渐增多。在荧光显微镜下，可见核周区域阳性显色，呈点状结构。对照 组细胞形态正常，含m d c 阳性结构的细胞较少。( 图4 ) 当使用特异性抑制剂 3 - m a 预处理后，细胞自噬水平接近对照组。( 图5 ) 1 4 a d bc e 图4 荧光显微镜观察维康醇诱导h e p g - 2 细胞自噬( m o n o d a n s y l c a d e r v a r i n e 染色，1 0 0 ) 1 1 - 对照组，b ：维康醇l 州，c ：维康醇3 州，d ：维康醇1 0 州e ： 维康醇3 0 州 abc 图5 荧光显微镜观察3 - m a 抑制维康醇诱导h e p g - 2 细胞自噬 ( m o n o d a n s y l c a d e r v a r i n e 染色，x 1 0 0 ) a ：对照组，b ：维康醇l 州，c ：维康醇1 0 - m + 3 一m a 20 m 1 5 5 、维康醇对h e p g 一2 细胞相关蛋白表达的影响 w e s t e r nb l o t 免疫印迹结果显示，维康醇作用于肝癌h e p g - 2 细胞2 4h 后，随 着浓度的升高，h e p g 2 细胞中l c 3 一i i 的表达逐渐增强( 图6 ) 。p - p 3 8 和p - e r k 蛋白水平的表达逐渐升高，但p - j n k 没有显著变化( 图7 ) 。 l c 3 - i - - - _ - - l c 3 i i c0 1o 3131 0 图6 ，维康醇对h e p g - 2 细胞m a p l c 3 蛋白表达的影响 p - e r k ，- 慵 e r k - _ - - u - _ p - p 3 8 p 3 8 p - j n k 蔓 ，_ - - - - - ，- - _ _ 盯哌 k。一 co 1o 3131 0 图7 ，维康醇对h e p g - 2 细胞e r k 、p 3 8 、j n km a p k s 蛋白表达的影响 1 6 讨论 肝细胞性肝癌的发病率占所有肿瘤疾病的5 ，全世界每年约有6 0 0 ，0 0 0 人次 死于肝癌。肝细胞性肝癌的发病原因目前尚不十分清楚，有较多因素参与其中。 目前h c c 总的治疗状况仍然是以手术治疗为主，但治疗率低、复发性高、预后差。 h c c 疗效不尽如人意的最主要原因是诊断较晚。7 0 - 8 0 的h c c 病人发现时已到 晚期，不能进行有效的根治性治疗。研究和应用有效的、可耐受的治疗肝癌的新药 仍然是未来长期的持续性工作。 紫杉烷类的代表药物紫杉醇( p a c l i t a x e l ，p t x ) 是从紫杉树树皮中提取的一种天 然植物类抗肿瘤药物。通过研究和临床证实紫杉醇是乳腺癌和卵巢癌及非小细胞 肺癌( n s c l c ) 的一线和二线治疗药物，并可用于治疗头颈癌、食管癌、精原细 胞瘤和复发非霍其金淋巴瘤等【体n i 。维泰醇( a l t e r n 0 1 ) 是利用红豆杉树皮中分离、 选育到的l 株高产紫杉醇菌种发酵生产的新型单体化合物。体外抗癌活性研究表 明，维泰醇对2 0 多种癌细胞株的增殖具有抑制作用，杀伤率可达5 0 - - 9 9 不等， 其抗瘤谱广，抑瘤效果显著。近年来紫杉烷类化合物化学研究焦点已转向发现新的 天然产物并对已发现的化合物进行结构改造，以提高生物活性，增强疗效，降低 毒副作用。维康醇是在紫杉醇发酵过程中获得的另一个化合物，其结构和维泰醇 非常相似。本研究显示维康醇对h e p g 2 细胞的增殖具有抑制作用。流式细胞术 结果显示h e p g 2 细胞经维康醇处理后，药物浓度到达3 0i x m 时凋亡率才有明显 上升，并诱导s 期细胞周期阻滞。表明药物在低浓度时早期凋亡和周期阻滞不是 维康醇抑制h e p g 2 细胞增殖的作用机制，提示维康醇可能通过其它机制抑制 h e p g 2 细胞的增殖。 程序性细胞死亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序性的 死亡，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用。多数学者把细胞死亡形 式分为凋亡性程序性细胞死t 二( a p o p t o s i s ) 、自噬性程序性细胞死亡( a u t o p h a g y ) 和 细胞坏死( n e c r o s i s ) 三种类型【1 9 i 。近年来，自噬性程序性细胞死亡逐渐引起了越来 越多研究者的注意。人们将a u t o p h a g y 称为i i 型程序性细胞死亡，这种形式的细 胞死亡表现为细胞浆中出现大量包裹着细胞器的空泡结构和溶酶体对空泡内成分 的降解 2 0 - 2 5 i 。某些抗肿瘤药物可诱导肿瘤细胞发生自噬，如脑胶质瘤的化疗药物 1 7 替莫唑胺能够诱导胶质瘤细胞发生自型2 引。本研究结果表明：维康醇低浓度时能 够引起h e p g 2 细胞自噬。经不同浓度维康醇处理4 8h 的h e p g 2 细胞荧光显微 镜下可见，m d c 标记的阳性细胞数量明显增加，而未处理的h e p g 2 细胞只有很 少部分呈m d c 阳性。3 m a 是一种常用的自噬抑制剂，使用3 - m a 预处理h e p g 2 细胞后发现，3 - m a 减弱了维康醇对h e p g 2 细胞的自噬诱导作用。在哺乳动物自 噬泡形成的过程中，l i g h tc h a i n 3 ( l c 3 ) 的修饰过程起n - f 至关重要的作用【1 1 l ， l c 3 i i l c 3 1 比值与自噬的发生水平成正蚪1 3 l 。w e s t e r nb l o t 免疫印迹结果显示， 1 0 州维康醇给药2 4h 后，l c 3 i i l c 3 i 比值明显升高。自噬不仅具有维持细胞 自我稳态的作用，过度上调也可以引起细胞死亡【2 7 。2 引。由于自噬的特点，药物诱 导肿瘤细胞产生自噬会出现两种不同的结果：一种是保护细胞防止周围环境带来 的损害；另一种是启动细胞主动性的i i 型细胞死亡程序即i 。维康醇作用于h e p g 2 细胞2 4h 后，磷酸化e r k 和p 3 8 水平随着药物浓度的升高而升高，但磷酸化i n k 无明显变化，说明维康醇对h e p g 2 细胞的生长抑制作用可能是通过激活了p 3 8 和 e r k 通路引起的，但不激活j n k s a p k 信号通路。综上所述，维康醇能够显著抑 制h e p g 2 细胞的增殖，在低剂量时，诱导h e p g 一2 细胞的自噬作用；在高剂量时， 维康醇抑制h e p g 2 细胞的增殖是通过引起细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡的途径 来实现的。 结论 1 、维康醇抑制肝癌细胞h e p g 2 的增殖，并具有浓度和时间依赖性。 2 、维康醇在低剂量时，诱导h e p g - 2 细胞的自噬作用；在高剂量时，维康醇抑制 h e p g 2 细胞的增殖是通过引起细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡的途径来实现的。 3 、维康醇对h e p g 一2 细胞的作用可能与e r k 和p 3 8 信号通路的激活有关。 1 8 本研究创新性的自我评价 1 、首次研究了维康醇对肝癌细胞h e p g 一2 增殖的抑制作用。 2 、首次证实了维康醇对肝癌细胞h e p g 一2 增殖的抑制作用是通过诱导细胞自 噬、凋亡和周期阻滞的途径实现的。 1 9 参考文献 l 高君，孙文兵。肝癌的早期诊断与鉴别诊断。中国临床医生2 0 0 9 ；3 7 ：5 - 7 2 王宝太，张宗芳。肝癌的药物治疗及进展。临床和实验医学杂志2 0 0 9 ；8 ：1 3 5 1 3 6 3z h o uf ，y a n gyx i n gd b c l - 2a n db c l - x lp l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h ec r o s s t a l kb e t w e e n a u t o p h a g ya n da p o p t o s i s f e b sj 2 0 1l ：2 7 8 ：4 0 3 - 4 1 3 4l i nj j ，l i nm ，y u e ta 1 t a r g e t i n ga p o p t o t i ca n da u t o p h a g i cp a t h w a y sf o rc a n c e r t h e r a p e u t i c s c a n c e rl e t t e r s ，2 011 ；3 0 0 ：10 5 - 11 4 5 k o g e ld ，f u l d as ，m i t t e l b r o n nm t h e r a p e u t i ce x p l o i t a t i o no fa p o p t o s i sa n da u t o p h a g yf o r g l i o b l a s t o m a a n t i c a n c e ra g e n t sm e dc h c m 2 010 ；10 ：4 3 8 - 4 4 9 6l c v i n eb ，m i z u s h i m an ，w g i nh w a u t o p h a g yi ni m m u n i t ya n di n f l a m m a t i o n n a t u r e 2 01l ； 4 6 9 ：3 2 3 3 3 5 7 f l e m i n ga ，n o d at y o s h i m 耐t ，e ta 1 c h e m i c a lm o d u l a t o r so fa u t o p h a g ya sb i o l o g i c a lp r o b e s a n dp o t e n t i a lt h e r a p e u t i c s n a tc h e mb i 0 1 2 0 1 1 ；7 ：9 - 1 7 8 w o n ge ，c u e r v oa m