（水产养殖专业论文）微拟球藻（nannochloropsis+oculata）cdna文库构建、est分析及Δ6去饱和酶基因克隆初探.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 洼! 翅遗直基丝盘塞挂别重题丝! 奎拦互窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 竺兰血塑兰竺竺! ! 竺! 一 学位论文j 短权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印，缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名- 彳磊五二 签字嗍叩年“午日 导师签字： 签字日期冲年i , e j 4 日 徽拟球蔫( 栅b 帅曲o c u 越a ) c d n a 文库构建、e s t 分析及a 6 去饱和酶基因克隆初探 微拟球藻( a 刀刀d c 办肠，a p s 西d c 甜励纠c d n a 文库 构建、e s t 分析及6 去饱和酶基因克隆初探 摘要 微拟球藻，单细胞藻类，由于其富含各种蛋白、多不饱和脂肪酸及色素，因 而被认为是高附加值生物，且培养条件简单，易规模化培养，毫无疑问有着巨大 的商业开发潜力。然而，目前对微拟球藻的研究主要集中在堵养、毒理及生理生 化，极少涉及到分子水平。因此，我们构建了微拟球藻的e d n a 文库，进行了如 下几个方面的工作： 1 ) 培养 微拟球藻生长的培养基：忱；温度：2 味1 ；光照周期：d l 为1 2 ：1 2 ；光 照强度：7 0 仙m o ls - i 一。 2 ) e d n a 文库构建 微拟球藻于指数生长中期收集并用t f i z o l 试剂抽提r n a 。纯化后并合成 e d n a , 与载体连接后转入大肠杆菌。经测定，文库库容为2 5 1 0 5 克隆，重组率 为9 5 ，p c r 检测的e d n a 3 库插入片断主要分布在5 0 0 1 0 0 0b p 之间。 3 ) e s t 分析 随机测序了5 8 1 2 个克隆，得到5 3 1 5 个e s t s ，其长度在1 0 0 7 1 6b p ，平均大小 为4 2 0b p 。序列经过拼接和聚簇后，共得至u 6 6 8 个c o n f i g s 、1 2 9 2 个s i n g l e t o n s 。非 冗余序列翻译成氨基酸序列后提交g e n b a n k ，通过在数据库中进行相似性检索， 推断的氨基序列与已知的氨基酸序列进行比对。结果有6 3 7 条序列与数据库提交 的蛋白序列相似度显著，其余的相似度极小。在可被注释的4 9 0 条非冗余序列中， 发现了9 条与脂质合成合代谢有关的n r s s 以及亲环素、静双加氧酶类似序列各一 条，此外核糖体和光反应等蛋白占绝大部分。 4 ) a 6 去饱和酶基因克隆 采用简f f f p c r 策略没有克隆到a 6 去饱和酶基因，说明微拟球藻的去饱和酶基 因很可能与目前已知的去饱和酶基因有所不同。 总之，本论文所做工作为深入了解微拟球藻生理生化过程奠定了很好的分子 微拟球藻( m 埘h b 帅妇a c u l a t a ) e d n a 文库构建、e s t 分析及a 6 去饱和酶基因克隆初探 基础。 关键词：微拟球藻；e d n a 文库；表达序列标签：分析；6 去饱和酶；克隆 2 徽拟球藻( n m d o r o p s i so c u l a t a ) c d n a 文库掏建、e s t 分析及6 去饱和酶基因克隆初探 e d n a l i b r a r yc o n s t r u c t i o n 、e s ta n a l y s i so f n a n n o c h l o r o p s i s o c u l a t aa n d p r i m a r i l ys t u d y o i lt h ec l o n i n go f a 6d e s a t u r a s eg e n e a b s t r c t n a n n o c h l o r o p s i so c u l a t a ( e n s t i g m a t o p h y e e a e ) ，am e e u k a r y o f i cu n i c e l l u l a r a l g a , w h i c hi sc o n s i d e r e dt ob eo f h i g hn u t r i t i o n a lv a l u eo w i n gt oi t sl a r g ea m o u n t so f p r o t e i n s ，p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ( e s p e c i a l l ye p a ) a n dd i v e r s ev a l u a b l e p i g m e n t s i nr e s p e c t t h a ti tg r o w sw e l lu n d e rc o n d i t i o n so f m a a sc u l t u r e ，n o c u l a t ah a s c o n s i d e r a b l ep o t e n t i a lf o rc o m m e r c i a le x p l o i t a t i o n h o w e v e r , p r e v i o u ss t u d i e so f t h i s m i e r o a l g af o c u s e do ni t st a x o n o m y ，c u l t u r ea n db i o c h e m i s t r ya n dl i t t l eh a sb e e n k n o w n 砒t h em o l e c u l a rl e v e lu n t i ln o w t h e r e f o r e 。ac d n a l i b r a r yw a sc o n s t r u c t e d a s f o l l o w s ： 1 ) a l g a lc u l t u r e n a n n o c h l o r o p s i so e u l a t a w a sg r o w ni n2 5 0m lf l a s k sc o n t a i n i n g 1 5 0m l s t e f i l i z e ds e a w a t e re n r i c h e dw i t h1 7 2m e d i u m t h ec u l t i v a t i o nw a sc o n d u c t e da t2 0 士1 a n d7 0 p m o lp h o t o ns - 1 m - 2w h i t ef l u o r e s c e n tl i g h to n1 2 w 1 2 hl i g h t d a r kr h y t h m 2 ) c o n s t r u e i o no f e d n al i b r a r y c e n sw e r ec o l l e c t e da tt h em i d d l eg r o w t hp h a s e t o t a lr n aw a se x t r a c t e db yt h e g u a n i d i n et h i o e y a n a t e - p h e n o l c h l o r o f o r me x t r a c t i o nm e t h o d t o t a lr n aw e r er u no n a g a r o s eg e lt oi n v e s t i g a t et h eq u a l i t y e d n as y n t h e s i sw a sp e r f o r m e da n de d n aw a s i n s e r t e di n t oe e o ris i t e so fp b l u e s c f i p t ae d n al i b r a r yc o n s i s t i n go f2 5x1 0 s c l o n e sw a sc o n s t r u c t e da n do v e r9 5 o ft h ec l o n e sw e r er e c o m b i n a n t sd e t e r m i n e d t h r o u g hx - g a l i p t gs c r e e n i n g t h ei n s e r ts i z ew a sd e t e r m i n e db yp c r , ar o u g h e s t i m a c ew 3 sm a d ef o rr a n d o m l yc h o s e nc l o n e s , w h i c hr a n g e df r o m5 0 0t o1 0 0 0b p 3 ) e s ta n a l y s i s at o t a lo f 5 8 1 2c l o n e sw e r et h e ns e q u e n c e d , ac o l l e c t i o no f 5 3 1 5e s tr e a d sw a s o b t a i n e d s e q u e n c el e n g t h sv a r i e df r o m1 0 0t o7 1 6b p ，嘶也a na v e r a g eo f 4 2 0 b p t h e t r i m m e dr e a d sw e r ec l u s t e r e da n da s s e m b l e d , y i e l d i n g6 6 8c o n t i g s e a c hs e q u e n c e f r o mt h en o n - r e d u n d a n tc o l l e c t i o nw a st r a n s l a t e di n t oa l l l i n oa c i ds e q u e n c e sa n d s u b j e c t e dt os i m i l a r i t ys e a r c ha g a i n s t1 1 1 d a t a b a s eb ym e a r so f t h eb l a s t xa l g o r i t h m s i m i l a r i t yb e t w e e nad e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c ea n dak n o w ns e q u e n c ew a s j u d g e d 3 微拟球藻( ，口月h o c 枷r 甲，妇倒抽哪c d n a 文库构建、e s t 分析及a 6 去堕和疃苎堕重堕塑堡 t ob es i g n i f i c a n tw h e nt h eev a l u ew a sl e s st h a nl e 一0 4 a sar e s u l t , o n l y6 3 7 s e q u e n c e s s h o w e ds i g n i f i c a n ts i m i l a r i t yt op r o t e i n sr e g i s t e r e di nn l d a t a b a s e ，a n dt h er e m a i n d e r s h o w e do n l yw e a ks i m i l a r i t yo rn os i m i l a r i t y ，a m o n gt h es e q u e n c e st h a tc o u l db e a n n o t a t e d ，t h e r ea r e9n r s sr e f e r e dt ol i p i dm e t a b o l i s m ，i n t e r e s t i n g l y ，c o n t i 9 6 3 8 s h o w sh i g l l l ys e q u e n c es i m i l a r i t yt oc y c l o p h i l i n , a n dz g w 0 5 2 9i sh i g l l l ys i m i l a r ( 8 7 a m i n oa c i di d e n t i t y ) t os e q u e n c eo fa - - d i o x y g e n a s e i na d d i t i o n , s u c ha s r i b o s o m a lp r o t e i n sa n dl i g h th a r v e s t i n gc o m p l e xc o m p o n e n t sa r ec o m p a r a t i v e l y a b u n d a n t 4 ) c l o n i n go f a 6 d e s a t u r a s eg e n e d e g e n e r a t ep c r u s e dt of i n da 6d e s a t u r a s et u r n e dt oaf a l u r e t h i sw o r ks e tt h em o l e c u l a rb a s i sf o rf l l r t h e rs t u d i e so nn a n n o e h l o r o p s i so c u l a t at o b e t t e ru n d e r s t a n di t sb i o c h e m i c a l ，p h y s i o l o g i c a la n dc e l l u l a rp r o c e s s e s k e yw o r d s ：n a n n o c h l o r o p s i so c u l a t a ；e d n al i b r a r y ；e s t ：a n a l y s i s ；a 6d c s a t u r a s e g e n e ；c l o n i n g a b b r e v i a t i o n s ：e s t , e x p r e s s e ds e q u e n c et a g 4 徽拟球 l l i ( n a n n o e h l o r o p a a f f 口嘲c e 咐 文库构建、e s t 分析及a 6 去饱和酶基因克隆初探 第一章前言 1 e d n a 文库分类及研究进展 微藻基因组十分庞大，其复杂度是蛋白质的上百倍，而且含有大量的重复序 列。因此无论是采用电泳分离技术还是杂交的方法，都很难直接分离到目的基因 片段，这是从染色体出发直接克隆目的基因的一个主要困难所在，这个问题可以 通过对m r n a 产生的e d n a 进行克隆而得到部分解决，因为尽管微藻一般具有 上万种不同的基因，但在一定发育阶段的细胞中，只有约1 5 的基因得以表达， 产生出约1 3 0 0 0 种不同的m r n a 分子。可见从m r n a 出发的e d n a 克隆，其复 杂程度要比从基因组直接克隆小得多，克隆的基本过程是通过一系列的酶催化作 用，使总m r n a 转变成双链e d n a 群体，并插入到适当的载体分子上，然后转 化大肠杆菌菌株或包装成噬菌体颗粒。如此便构成了包含所有表达基因编码序列 的c d n a 文库。此技术己成为当今研究真核生物分子生物学的基本手段。 随着分子生物学的迅速发展，e d n a 文库构建已成为这一领域中日益重要的 技术。该技术主要应用于以下三个方面，第一：筛选目的基因，通过e d n a 文 库的筛选，可能获得结构基因的c d n a ；第二：构建表达型e d n a 文库，通过筛 选特异性表达蛋白质分离基因；第三：用于分离在特定发育阶段或特定组织中表 达的基因。 e d n a 文库构建的一般流程是：提取目的组织中的r n a 进而分离m r n a ： 以随机引物或o l i g e ( d t ) 为引物，用逆转录酶将m r n a 转变为e d n a - m r n a 杂合 体；利用r n a s e h 可特异消除d n a - m r n a 杂合体中的r n a 特性，将杂合体中 的m r n a 消化为小分子片段，再以此小分子r n a 片段为引物，借助d n a 聚合 酶合成c d n a 第二链；利用分子筛过柱去除合成产生的c d n a 短片段；利用连 接酶将c d n a 中存在的缺刻消除，同时将c d n a 与适当的载体连接，转化细菌 或噬茵体，最后进行滴度测定。 自七十年代中叶首例c d n a 克隆问世以来【“，己用构建和筛选c d n a 文库的 方法克隆了很多基因。最初的c d n a 克隆技术主要适合于获得高丰度的m r n a 的拷贝，即通过使用相应的核酸或抗体探针来筛选富含该m r n a 的组织的c d n a 徽拟球, 藻( n a n n o c h l o r o p s i ao c u l a t a ) c d n a 文库构建、e s t 分析及6 去饱和酶基因克隆初探 文库，从而达到克隆目的e d n a 的目的。但对于那些低丰度m r n a 拷贝，通常 需要筛选大量克隆子，才可能获得相应的c d n a 。有时传统的e d n a 文库构建方 法甚至很难得到理想的结果。近年来己发展了一些构建文库的新方法和新技术， 主要有：减数e d n a 文库、标准化e d n a 文库以及染色体及其区域特异性e d n a 文库构建法等。 1 ) 减数c d n a 文库( s u b s t r a t e de d n al i b r a r y ) 减数e d n a 文库常用于克隆两种组织或同一组织在不同生理或病理状态下 差异表达的基因。由于减数文库富集了仅在一种组织中或一种状态下表达的 e d n a 克隆，使筛选克隆的总数减少数十倍。最初构建e d n a 文库是通过生物素 卵黄清蛋白体系去除两种组织或状态下共有的m r n a ，以此来富集表达有差异 的e d n a ，但普遍的问题是回收的e d n a 量少，易丢失些m r n a ，以及m r n a 易降解导致合成的e d n a 过短。近年来，科学家在建库方法学上进行了不少改 进，主要有：磁珠减数技术、乳胶和p c r 结合技术1 2 - 3 、代表性差异筛选法【4 1 和 酶降解法【5 】等。 2 ) 标准化文库( n o r m a l i z e de d n al i b r a r y ) 即构建一个等量含有目的组织或细胞特异表达基因的e d n a 文库，因此又 称等量化e d n a 文库( e q u a l i z e de d n al i b r a r y ) 。该文库的优点是：增加克隆极低 丰度的m r n a 的可能性，特别是经过减数和选择杂交仍难以克隆的转录样本； 等量化的e d n a 可作为探针来发现基因组顺序中的转录区，尤其是普通e d n a 探针所不能发现的稀有转录区。将原始丰度m r n a 拷贝数相对应的探针与标准 化的e d n a 文库进行杂交，可估出大多数基因的表达水平，并可发现一些组织 表达特异性的基因。该文库的构建方法分为两类： a ) 用基因组d n a 选择杂交，得到的e d n a 丰度与对应基因组d n a 丰度 一致； b ) 根据e d n a 退火的动力学特性，使未复性部分的单链c d n a 逐渐趋于等 量化。此方法又可细分为： 短片段、双链e d n a 复性法；嗍 克隆e d n a 自身杂交的方法；1 7 1 半固相m r n a 和e d n a 杂交方法； 环状单链杂交的方法嘲。 6 徽拟球藻( r 口咿魄h h 护出o c u a t a ) c d n a 文库柯建，f s t 分析及a 6 去饱和酶基因克隆初探 用短片段、双链c d n a 复性的方法构建的c d n a 文库主要包含短片断c d n a 等量化文库，这在估计基因的表达水平和发现组织特异性基因方面优于长片断的 等量化c d n a 文库，同时也避免了同源基因之间的减数杂交；用克隆化c d n a 自身杂交方法产生的c d n a 文库增加了覆盖m r n a ，其优点是结合杂交选择的 方法可迅速发现基因组中编码c d n a 的区域；用半固相m r n a 和c d n a 杂交的 方法构建的c d n a 文库常含有全长的e d n a 分子，因此可用于筛选表达文库的 方法来分离c d n a 的克隆；用环状单链进行杂交的方法构建c d n a 文库，在文 库的构建过程中省去了亚克隆的步骤，同时也保证了文库中的c d n a 长度。由 于复性发生在3 端的2 0 0 b p ，避免了基因家族之间的交叉杂交，保证了c d n a 的代表性。 3 ) 染色体或区域特异性c d n a 文库 该技术可以在微藻生理代谢过程中研究相关基因的定位。随着微藻生物活性 物质代谢途径机理的深入研究，利用c d n a 文库技术来克隆未知的相关基因将 可能引起研究者的广泛注意，尤其是在微藻中筛选全长c d n a 片断有着p c r 技 术不可比拟的优点。当然，c d n a 文库技术也存在一些缺点，主要是建库耗时长， 价格昂贵；对于低丰度的m r n a 在文库中出现的几率不高，筛库工作复杂，易 受假阳性的干扰等。 近年来，针对上述缺点，对构建c d n a 文库的技术进行了不少改进。c d n a 文库的构建过程可大体分为总r n a 的提取、m r n a 的纯化、c d n a 的合成以及 将c d n a 克隆入载体等几个主要步骤，其中c d n a 的合成是其中最复杂也是文 库构建成败的关键步骤。现在直接使用些生物试剂公司的c d n a 合成试剂盒， 能够在一天内就完成文库构建，且具有重复性好，成功率高，快速简捷等特点【9 】。 针对低丰度m r n a 在文库中出现的机率不高的缺点，可用p c r 和c d n a 文库技 术相结合构建出p c r - c d n a 文库加以解决，即利用p c r 技术对捕捉到的微弱信 号进行放大，使低丰度的m r n a 再反转录成c d n a 过程中获得较多的拷贝数，从 而尽可能获得较完整的c d n a 文库。目前筛选c d n a 文库是分子生物学研究中 获得目的基因的重要方法，通常使用放射性同位素标记的核酸探针进行【l o 】。但 使用这种方法筛选文库耗时耗材，假阳性过高，有时甚至得不到理想的结果。为 了克服这些缺点，许多新方法已被应用于未知基因的分离，其中p c r 介导的 c d n a 文库的矩阵排列筛选方法在功能表达筛选中已获得较好的应用【l l 】。 徽拟球藻( r d h 删f o ，删打o e u 脚d n a 文库构建、e s t 分析殛a 6 去饱和酶基因克隆初探 2 微藻e s t 研究进展 在过去的十年，生物的基因组研究业已成为研究热点，大量生物学信息的获 得更有助于我们认识物种之间的关系。但这项工作在不同的物种中开展的进度是 不一样的，目前此项工作主要集中在细菌、植物、哺乳动物，相反，在微藻中有 关基因组信息知之甚少。目前，公共数据库中只有四种微藻的全基因序列：原始 红藻( c y a n i d i o s h y z o nm e r o l a e ) 1 2 1 、莱茵衣藻( c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t t o ( h t t p ：g e n o m e j g i - p s o r g e h l r e 2 e h l r e 2 h o m e h t m l ) 、伪矮海链藻( t h a l a s s i o s i r a p s e u d o n a n a ) t 1 3 1 、原始绿f f ( o s t r e o c o c c u st a u r 0 【1 堋，其他的如红藻( g a l d i e r i a s u l p h u r a r i a ) 1 1 6 1 、三角褐指藻( p h a e o d a c t y l u mt r i e o r n u t u m ) i 明、一种多细胞藻类 ( v o h , o xc a r t e n ) 0 9 1 、球石藻沏t f 妇理缸j j 蝴已经在国际上开展了相关工作并取 得了很大的进展。 但是，基因组测序非常昂贵，能进行这项工作的资源毕竟有限 2 0 l ，更快捷、 有效的方法是对e d n a 测序进行e s t 分析1 2 h 。耳前，已经有3 6 0 0 百万e s t s 在 公共数据库上公布，除了上述进行全基因测序的藻类，条斑紫菜( p o r p h y r a y e z o e n s i su e a a ) 【1 嘲、红藻( g a l d i e r i as u l p h u r a r h 7 ) 嘲、塔玛亚历山大藻 ( a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ) 2 4 1 、强壮前沟藻( a m p h i d i n i u me a r t e r a eh u l b u r t ) 【2 5 】等也 进行了e s t s 相关研究工作。 3 亲环素和a - 双加氧酶研究进展 3 1 亲环素研究进展 亲环素( c y e l o p h i l i n s , c y p s ) 是一个多功能蛋白家族，广泛分布于细菌、真 菌、植物和哺乳动物中，在进化的过程中比较保守。亲环素最初是作为环孢菌素 a ( c y e l o s p o r i n a , c s a ) 的蛋白受体被发现的，环孢菌素a 是一种免疫抑制剂， 临床上用于治疗器官移植产生的排斥反应及自身免疫系统疾病，所以亲环素被认 为参与了免疫抑制过程；后来大量的研究表明，亲环素还具有其它许多重要的生 物学功能，如辅助蛋白折叠、介导细胞问信号转导和细胞凋亡、参与h i v 病毒蛋 白组装等；最近，亲环素的三维结构也得到解析，为我们更好地了解亲环素生物 学功能的分子机制提供了依据。 8 徽拟球藻( h n d c f 卵甲l 缸o e u l a t a ) e d n a 文库构建、e s t 分析及a 6 去饱和酶基因克隆韧探 亲环素的分布 1 9 8 4 年，i - i a n d s e h u m a e h e r 等首次从牛胸腺细胞中提取得到亲环素a ( c y c l o p h i l i n a , c y p a ) ，此后，又从动、植物的各种组织和器官中陆续分离获得多 种亲环素。目前，已发现并克隆了亲环素的多种异构体，构成了亲环素蛋白家族 1 2 7 - 3 s 1 。这些已发现的亲环素按其来源可分为六大类：眼虫类、线虫类、扁形类、 真菌类、植物类和哺乳动物类，其中研究最为详细的是人体和拟南芥中的亲环素 鲫。亲环素在各种生物体中广泛分布，但是不同物种中分布的位置并非完全相 同，在植物中多位于细胞质、内质网、叶绿体、线粒体和细胞核 3 0 1 ；而在动物 中则主要位于细胞质、内质网、线粒体和细胞膜中。 亲环素的蛋白结构 目前，研究最多的是植物和人体中的亲环素。图1 显示了几种常见植物的亲 环素和人体内亲环素c y p a 的蛋白序列比较结果。已知c y p a 的i l e 5 7 、p h e 6 0 、 t h r 7 3 、a l a l 0 1 、a s n l 0 2 、p h e l l 3 、t r p l 2 1 、l e u l 2 2 和i - i i s l 2 6 这9 个氨基酸残基是 与c s a 结合的部位，并且也是肽酰脯氨酸顺反异构酶( p p i a s e ) 的活性中心，如 果这些氨基酸残基发生突变，就会影响亲环素与c s a 的结合以及亲环素的p p i a s e 酶活。从图1 中可以看出，植物和人体中的亲环素存在较高的同源性，在多个位 点出现连续几个氨基酸完全一致的情况，推测在植物中这些保守的氨基酸残基同 样参与了亲环素对底物的识别和对肽酰脯氨酸顺反异构的催化。 9 微拟球藻( n a n n o c h l o r o p s i to c u l a t a ) c d n a 文库构建、e s t 分析疑a 6 去饱和酶基因克隆初探 表1 不同物种代表生物的亲环素序列 分类( c l a s s )物种( s p e c i e s l g e n b a n l ( 序列号 ( g e n b a n k n o ) 眼虫类 杜氏利什曼原虫( l e 打h m a n i am a j o r ) c a a 7 3 9 0 4 ( e u g l e n o z o a ) x p8 1 6 5 0 5 克氏锥虫( t r y p a n o s o r n ac r u z is t r a i nc l b r e n e r ) 线虫类 旋盘尾丝虫( o n c h o c e r c av o l m d u s ) a a d d 9 5 6 4 ( n e m a t o d e ) 捻转血矛线虫( h a e m o n e h u * c o n t w 船) a a w 8 2 6 5 8 秀丽隐杆线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) a 甜( 6 8 2 8 3 扁形类 曼氏血吸虫( s e h i s t o s o m am c m s o n 0 a a 0 4 6 9 8 5 ( p l a t y h e l m i n t h e s ) a a x 2 7 9 1 0 日本血吸虫( s e h i s t o s o m a j a p o n i c u m ) 真菌类 霉菌( t o ! y p o c l a d i u mi n f l a t e ) c a a 3 3 5 8 6 ( f u n g i ) 烟曲霉( a s p e r g i l l u s f u m i g a t u s ) c a l 7 8 4 4 8 啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) p 2 5 7 1 9 ) p5 7 1 8 6 5 新型隐球菌( c r y p t o c o c c u sn e o f o r m a n s ) 植物类玉米( z e am a y s ) c 从4 8 6 3 8 ( p l a n t ) 水稻( o r y z a s a 幽a ) b a b 6 2 3 2 9 菜豆( p h a s e o l u sv u t g a n 0 c a a 5 2 4 1 4 a a a 2 0 0 4 8 拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) a a c 0 5 6 3 9 莱茵农藻( c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i 0 a a c 6 4 9 3 3 日本凋毛藻( g r i f f i t h s i a j a p o n i c a ) 哺乳动物类 人( h o m o s a p i e r ) a a c 6 0 7 9 3 ( m a m m 目d ) 小家鼠( m u sm u s e u u s ) n p9 9 7 5 3 8 l o 徽拟球藻( m 怕嗍 打o c u l a t a ) c d n a 文库构建、e s t 分析厦a 6 去饱和酶基因克廖初探 1 0 r-j。l 。i 。l。- f 。 rp -。-i。一。 z 1 一 a s 一 p v 一一一 九t1m a s s ：s s m o m vh t s r s i p u o i g 聃叫r 淘嗍n r t t o s v c f ga r s s g i a l s sr l r y a s p l 3 k q t 2 一一一 t 3叫asshlllwsu 。哪 l t s z 1 i o s p 、r t 1 九t 2 k t 3 i ls 厶乩 as 。 r v 九t 1 _ l2 t 3 h ，s z 乩 a s p v 凡t 1 屯t 2 尢t 3 壬ls z 也 n s v _ t 1 - t 2 九t 3 也s 6 0 图1 几种常见亲环素的蛋白序列比较 f i g 1a l i 鲷m e n to f c y c l o p h i l i np r o t e i ns e q u e n c e so f s e v e r a lo l 倒s m s 核磁共振( n 1 恹) 分析显示亲环素主要由3 组螺旋和8 组反平行的b 一折 叠组成【3 1 1 。x 射线晶体衍射分析表明，亲环素整个分子呈球形，半径约为1 t r i m 。 c y p a 的结构研究得最为清楚，与c s a 结合的9 个氨基酸残基从片层结构的表面 向外突出，形成约1 0 i 5 n m 左右的深沟，使c s a 约4 3 的表面积嵌入其中， 一氍一黧。瑚壤 蕤震锄鏖添氍。脚隧 型三一冀一震荽窿型暑嫩瓣一箧粼一篓兰三一震娴一隧菇鬻 微拟球藻( n a n n o c h l o r o p s i so e u l a t a ) c d n a 文库构建，e s t 分析及6 去饱和酶基因克隆初探 而c y p a 的构象几乎不变【3 3 】。 图2 亲环素a 的环孢菌素结合位点及其相关的氮基酸残基 r i g 2 t h eb i n d i n gs i t eo f c y c l o s p 0 1 i nat oe y c l o p h i l i naa n dt h er e l a t i v ea m i n oa c i dr e s i d u e s 此外，在拟南芥中还发现了具有多功熊域的亲环素蛋自，如拟南芥中的 a t c y p 5 7 、a t c y p 5 9 、a t c y p 6 3 等，其基因相对于单一功能域的亲环素多了 t r p ( t e t r a t r i e o p e p t i d er e p e a t ) 、s k - r e ( s e r l y s - a r g g l u - r i e hr e g i o n ) 、u ( u - b o x d o m a i n ) 、w d 4 0 ( w d 4 0r e p e a t ) 和r r m ( v n ar e c o g n i t i o nm o t i f ) 等编码序列，研究 推测它们可能参与了r n a 的转录后加工鲫。 亲环素的生物学功能 亲环素具有多种生物学功能，其中两种研究的最为透彻。一是亲环素具有肽 酰脯氨酸顺反异构酶( p p i a s e ) 活性，能够催化蛋白质特别是富含脯氨酸的蛋白 质折叠，同时起着分子伴侣的作用 3 5 1 ；二是与c s a 结合形成c y p c s a 复合体，在 人体中通过钙调磷酸酶抑制免疫反应。在植物( 蚕豆) 作为一种蛋白抑制剂 阻碍钙离子和钾离子进出保卫细胞的通道。此外，亲环素还参与细胞凋亡【3 7 】、 细胞问信号转导1 3 s l 、h i v 病毒蛋白组装等多种生物学过程，还有资料显示亲环素 ( c y p a ) 是一种氧化应激诱导分泌的生长因子1 3 9 j 。 亲环素与蛋白折叠 1 2 徽拟璩自飘m d c 如r 印曲o c u a t a ) c d n a 文库构建、e s t 分析及a 6 去饱和酶基因克隆初探 在蛋白质的合成过程中，新形成的肽键均为反式构型，这样形成的结构比较 稳定，但是有一个重要例外，就是 e x p r o ( x 是指除p r o 夕b 其它任一氨基酸残基) 序列中的肽键，它可以是反式的，也可以是顺式的1 4 0 i 。在含脯氨酸残基的蛋白 分子中，由于空间结构的制约，蛋白质在折叠时，某些x 帕键( 约占1 0 - 2 0 ) 必须异构化为顺式构型，才能使蛋白质形成天然空间构象。由于x - p r o 键的异构 反应较蛋白折叠反应慢得多，x - p r o 键的异构就成了整个折叠反应过程中的一个 限速步骤。x - p r o 由反式向顺式异构化常发生在翻译过程中或者翻译后，可自发 完成也可由酶催化完成，亲环素就是一种具有催化脯氨酸异构化的酶【4 1 1 。由于 亲环素在多种生物及生物体的不同部分均有分布，其序列具有高度保守性，因此 推测亲环素的顺反异构酶活性可能对生物体的存活至关重要。 亲环素与免疫抑制 环孢素a ( c s a ) 是从真菌代谢产物中分离得到的1 1 个氨基酸的环状多肽，是 一种高效免疫抑制剂，可逆并特异的作用于淋巴细胞，抑制t 细胞介导的免疫反 应。l i u 等证明了c y p c s a 复合物的靶蛋白是依赖于c a 2 + 的钙调素s 砒蛋白磷酸 酶( c a l c i n e u r i n , c a n ，又称神经钙蛋白) 嘲。c 削广泛分布于哺乳动物的神经组织 和t 、b 淋巴细胞中，是一个二聚体蛋白，由c 削a ( 5 9 k m ) 和c a n b ( 1 9k u ) 两个亚基 组成，作用于磷酸化的s e t 嘲基，活性受c a 2 + 及钙调素( c a l m o d u l i n ，c a m ) 调 节。c y p - c s a 复合物与c a n 结合可抑制其活性，使t 细胞核因子0 虾a t e ) 不能被 去磷酸化，阻断了n f - a t c 从胞浆到细胞核的转移，导致细胞信号传导中断，t 细 胞活化所必需的一些细胞因子表达受阻，从而抑制了t 细胞增殖【4 3 】。 如前所述，x 射线衍射和核磁共振分析表明c y 队的p p i a s i ：活性中心也是免疫 抑制剂c s a 的结合位点，但是该部位不能同时与酶的作用底物和c s a 结合，因此， 如果亲环素发挥p p i a s e 功能就不能抑制免疫反应，反之亦然。曾有研究者认为 c y p a 之所以能起到免疫抑制作用关键是c s a 与c y p a 的结合抑制j c y p a 的p p i a s e 活性。但是进一步的研究显示事实并非如此。一是产生免疫抑制所需的c s a 的量 明显少于抑制p p i a s e 活性所需的量；二是人工合成的c s a 类似物能有效地抑制 p p i a s e 活性但却不能抑制免疫反应；此外，已知的免疫抑制剂蛋白受体都具有 p p i a s e 活性，但是c s a 仅抑铝l j c y p 的p p i a s e 活性，对其它种类的p p i a s e 活性毫无影 响t 蜘。因此，关于p p i a s e 活性与免疫抑制的关系还有待于进一步研究。 亲环素与细胞凋亡 微拟球藻( n a n n o c h l o r o p s i sd c u l a t a ) c d n a 文库构建、e s t 分析及6 去饱和酶基因克隆初探 细胞凋- l 三( a p o p t o s i s ) 是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的程序 性死亡，涉及一系列基因的激活、表达以及调控。染色质d n a 在核内切酶催化 下降解是细胞凋亡的典型特征。近年来有研究表明亲环素具有核酸酶活性，在t 细胞自然凋亡过程中起作用。c s a x 进a t 细胞后与c y p 结合，激活c y p 的核酸酶活 性从而降解d n a l 4 5 】。已知n u c l 8 是参与细胞凋亡的主要内切酶之一，w e s t e m 实 验证明亲环素与n u c l 8 抗体间有交叉反应，说明二者具有相似的氨基酸序列。 亲环素可以降解单双链d n a 、超螺旋d n a 和r n a ，这种核酸酶活性与p p i a s c 的 活性无关，可被c a m 矿激活嗍。 亲环素与珈【、，病毒蛋白组装 。 g a g 多聚蛋白对h i v 生命周期的多个阶段都很重要。c y p a 通过与g a g 多聚蛋 白相互作用，特异性地掺x h i v - 1 颗粒，影响g a g 多聚蛋白的形成，进而影响h i v 病毒蛋白颗粒的组装。c y p a 对hi v 1 的感染性影响是作为分子伴侣而不是作为 顺反异构酶而起作用。但基于g a g 片段的c 末端与底物相似。也不能完全排除顺反 异构酶活性的参与。c y p a 也可能通过调节h 1 脱衣壳来影响病毒的复制m 。 人体l 内c y p a 与病毒的自然结合是h i v - i 进行有效复制的关键。c y p a 结合于病毒 衣壳蛋白p 2 4 的g l y - p r o 位点，催化p r o 肽键顺反异构化。c s a 与c y p a 的结合能阻 断p 2 4 与c y p a 结合，影响有功能的蛋白外壳形成，进而使病毒不能形成完整的