（微生物学专业论文）产nisin菌株的微波选育及发酵条件优化.pdf

摘要 摘要 本研究以乳酸乳球菌乳酸亚种产n i s i r i 菌株( 编号：1 2 0 3 0 ) 为出发株，采用微波 诱变该菌株，琼脂扩散法筛选突变株，得到一株突变株w y 4 ，产n i s i n 的效价值为 5 1 1 5 6 i u m l ，比出发株提高4 2 1 3 ，遗传稳定实验证明其遗传性状稳定。 对w y 。4 菌株的发酵培养基主要成分如碳源、氮源、磷酸盐、v c 等进行了优化研 究，得出了优化后的培养基配方为：蔗糖1 ，玉米蛋白粉l ，牛肉膏1 ，酵母膏 07 5 ，乙酸钠0 。5 ，柠檬酸三铵o 2 ，t w e e n 8 00 1 ，n a h 2 p 0 40 2 ，m g s 0 4 7 h 2 0 o 0 2 ，m n s 0 4 h 2 00 0 0 5 ，c a c 0 32 p h 6 8 。 其中碳源，氮源的种类和配比对w y 4 菌株的发酵产量有很大影响，而实验用的几 种磷酸盐和在发酵培养基中添加v e 没有影响。 培养基优化后w y 4 菌株的效价达6 3 1 3 5 i u m l ，比对照提高了2 3 4 2 。 通过对接种量、发酵温度、发酵液的p h 的控制、向发酵液中补加碳源和氮源的方 法，优化w y 4 菌株的发酵条件。最佳接种量为5 ，最佳发酵温度在3 0 ，控制发酵 液p h 在不低于6 的同时补加碳源对菌株的发酵有明显的促进作用，而补加酶解玉米蛋 白粉对n i s i n 的产量没有的影响。 在优化培养基的基础上采用优化的发酵条件，突变株w y 4 的效价达1 0 1 7 6 i u m l ， 相对于没有优化发酵条件之前的6 3 1 3 5 i u m l 提高6 1 1 8 。 关键词： n i s i n微波诱变防腐剂发酵效价测定 a b s t r a c t a b s r a c t m u t a n tw y 一4w a so b t a i n e dt h r o u g ha g a rd i f f u s i o na s s a yf r o mt h ep r i m i t i v es t r a i n l a c t o c o c c u sl a c t i s1 2 0 3 0b ym i c r o w a v em u t a t i o n ，i t sn i s i na c t i v i t yw a s511 5 6 刑m l ，a n d t h ei n c r e a s i n gr a t ew a s4 2 13 i t sp r o p e r t yo f p r o d u c i n gn i s i nr e m a i n e ds t a b l ea f t e rs e v e r a l t i m e so fs u b c u l t u r e t h eo p t i m a li n g r e d i e n t so ft h ec u l t u r em e d i u mw e r ei n v e s t i g a t e d ，a n dt h e yw e r ea s f o l l o w s ：s a c c h a r o s eo f1 ，c o r ng l u t e nm e a lo f1 ，b e e fe x t r a c t o f1 ，y e a s te x t r a c to f 0 5 ，c s h 6 0 3 c i n ao f0 5 ，a m m o n i u mc i t r a t et r i b a s i co f0 2 ，t w e e n 8 0o fo 1 ，n a h 2 p 0 4 o fo 2 ，m g s 0 4 7 h 2 0o fo 0 2 ，m n s 0 4 h 2 0o f0 0 0 5 ，c a c 0 3o f2 ，a n dt h em e d i u mp h o f 6 8 t h ev a r i e t i e sa n dr a t i oo fc a r b o ns o u r c ea n dn i t r o g e ns o u r c eh a dg r e a ti n f l u e n c eo nn i s i n a c t i v i t y , h o w e v e gp h o s p h a t ea n dv i t a m i nch a dn os i g n i f i c a n ti n f l u e n c e u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h en i s i na c t i v i t yo fw y - 4w a s6 31 3 5 i u m l ，2 3 4 2 h i g h e rt h a n t h a to fo r i g i n a lc u l t u r em e d i u m t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea l s od i s c u s s e d ，a n dt h e yw e r ea sf o l l o w s ： i n o c u l u m 5 ，t e m p e r a t u r e30 。c ，p hk e p ta t6 ，f e r m e n t a t i o np e r i o d10 h t h e r ew e r eo b v i o u si m p r o v e m e n to fn i s i nw h e nt h ep ho fc u l t u r em e d i u mw a sk e p ta t6 a n dc a r b o ns o u r c ew a sa d d e dc o n t i n u o u s l yd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o n b u tn oo b v i o u si n f l u e n c e w a sd e t e c t e dw h e nn i t r o g e ns o u r c ew a sa d d e dd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o n t h em a x i m u mn i s i na c t i v i t yc o u l db eo b t m n e dw h e nw y - 4w a sc u l t u r e da tt h eo p t i m i z e d c o n d i t i o n s 谢t hn i s i na c t i v i t yo f1017 6 i u f m l ，61 18 h i g h e rt h a nt h a to fu n o p t i m i z a b l e c o n d i t i o n s k e yw o r d ：n i s i n ；m i c r o w a v em u t a t i o n ；p r e s e r v a t i v e ；f e r m e n t a t i o n ；d e t e r m i n a t i o no fa c t i v i t y n 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了致谢。 作者签名：迎鳖 日期：_ 2 竺4 年月丝日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密o 。 ( 请在以上相应方格内打“) 作者签名： 望燮 一日期：j 竺4 年上月翌一日 导师签名：邀：垒! 毽：日期：三盟年上月鲨日 第1 章绪论 1 1 研究背景 第1 章绪论 在食品生产中食品的防腐保鲜是一个重要的环节，商家通过各种方法延长食品的保 质期和货架期，如将食品消毒灭菌、低温保藏、添加防腐剂等。添加防腐剂是最常用的 方法之一，但是大多数防腐剂为化学防腐剂。目前最常用的化学防腐剂是苯甲酸钠，山 梨酸钾，由于它们的抑菌范围广而被广泛使用，但是这些化学防腐剂对芽胞菌的抑制效 果不明显【1 1 ，并且化学防腐剂的安全性越来越受到人们的置疑，化学防腐剂中的亚硝酸 盐可以使人血液中的血红蛋白氧化成正铁血红蛋白，从而导致血红蛋白失去载氧的功 能，而且亚硝酸和胺类化合物反应的产物n 亚硝基化合物可以致癌。 乳酸链球菌素，也称乳酸链球菌肽，英文缩写n i s i n ，是乳酸乳球菌乳酸亚种 ( l a c t o c o c c u sl a c t i ss s p 1 a c t i s ) 的部分菌株产生的一种短肽，可有效地杀死芽孢和革兰 氏阳性菌的营养细胞。n i s i n 是多肽类物质，食用后在肠道内被蛋白酶消化灭活，不但不 会改变肠道菌群的结构，被降解形成的氨基酸还可以作为营养吸收。抗菌素交叉性研究 表明，n i s i n 与其它抗菌素如青霉素、链霉素、红霉素等都无交叉抗性。由于其对人体安 全无毒副作用，是一种安全绿色环保的防腐剂，已成功运用于食品生产加工中【2 4 0 】。迄 今为止，n i s i n 已在世界约6 0 多个国家和地区被广泛应用【1 1 1 。 目前国内只有浙江天台制药厂生产商业用n i s i n ，其产量远远满足不了我国食品行业 的需求，而进口n i s i n 产品价格昂贵。利用各种方法筛选优化高产n i s i n 的菌株，提高n i s i n 产生菌的单位产量，可降低n i s i n 的生产成本，扩大n i s i n 的使用范围，使之逐渐代替 化学防腐剂，满足人们对绿色安全食品的需求和有效保障人民的身体健康。 1 2 国内外研究动态 1 2 1n i s i n 的发现与研究进展 1 9 2 8 年，r o g e r s 和w h i t t i e r 就发现乳酸乳球菌的代谢产物能够抑制部分革兰氏阳性 河北大学理学硕士学位论文 菌的生长【1 2 、1 3 】；1 9 4 4 年，m a t t i c k 和h i r s c h 发现血清学n 群中的一些乳酸乳球菌能产生 蛋白类抑菌物质，命名为n i n h i b i t o r ys u b s t a n c e ，即n 群抑菌物质，简称n i s i n 或乳链菌 肽【1 4 1 ；1 9 5 1 年，h i r s c h 等人应用n i s i n 改善了奶酪的品质【2 1 。1 9 5 2 年，c l i n t o c k 等人把产 n i s i n 的乳酸乳球菌菌株直接加到酸奶中来控制由产气梭状芽孢杆菌引起的膨胀腐败【3 】。 1 9 5 3 年，n i s i n 的第一种商业化产品n i s a p a l i n 在英国面世。 对n i s i n 的毒性、致癌性、存活性、再生性、血液化学、肾功能、应激反应以及动 物器官病毒学等生物学研究证明，n i s i n 是安全的。 1 9 7 1 年g r o s s ，e a n dm o r e l ，j l 发现了n i s i n 分子的完整结构【15 1 。在其后的几年中 n i s i n 被越来越多的国家作为一种安全的生物防腐剂使用。我国从1 9 8 9 年开始也对n i s i n 做了全面的研究，1 9 9 7 年中科院微生物所对产n i s i n 菌株的分离筛选做了详细的阐述【l 6 、 1 7 】 o 还连栋等还对n i s i n 的合成过程及控制做了详细的阐述1 9 1 ，李孱等对产n i s i n 菌 株的发酵条件的优化也进行了一定的研列2 0 2 1 2 2 1 。 1 2 2n i s i n 的结构 在自然界中存在2 种乳链菌肽天然变异体：n i s i n a 和n i s i n z 。二者的性质基本相同， 仅在结构上有一个氨基酸差异，n i s i n a 第2 7 位氨基酸残基是组氨酸，n i s i n z 则是天冬 酰胺。中科院微生物研究所通过对2 种乳酸菌肽天然变异体n i s i n a 和n i s i n z 对李斯特 氏菌抑菌活性的研究发现，n i s i n z 的抑菌活性强于n i s i n a 3 抹2 5 1 。 1 2 2 1n i s i n 的活性单位n i s i n 的活性单位定义为l m l 肉汁中抑制一个s t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e 细胞所需的n i s i n 的量，它被称之为一个r e a d i n g 单位，后来称为国际单位 ( i u ) ，称之为一个r e a d i n g 单位主要是因为n i s i n 的早期研究主要是在英国r e a d i n g 的 乳品工艺研究所进行【2 6 】。 t a m e r 建议使用r e a d i n g u n i t ( r u ) 表示每微克纯乳酸链球菌素制备物中存在活性的 量，因为乳酸链球菌的最初研究工作是在英国的r e a d i n g 大学进行的。1 9 6 9 年f a o w h o 微生物标准委员会制定了乳酸链球菌的标准国际单位i u ，1 r u = 4 0 i u t 2 7 1 。 1 2 2 2n i s i n 的分子结构其分子式为：c 1 4 3 h 2 2 s y 4 2 0 3 7 s 7 【3 】，其分子结构中有五个稀有 氨基酸氨基丁酸( a b a ) ，脱氢丙氨酸( d h a ) ，p - 甲基脱氢丙氨酸( d h b ) ，羊毛硫氨 2 第1 章绪论 酸( a l a - s - a l a ) ，p - 甲基羊毛硫氨酸( a b a s a l a ) ，它们通过硫醚键形成五个内环。 见图1 1 【2 6 1 。 h t 1 2 2 3n i s i n 生物合成的模型 图1 1n i s i n a 的结构 f i g 1 - 1t h es t r u c t u r eo f n i s i na p r c p c p t i d c 图1 - 2n i s i n 的生物合成模型 f i g 1 - 2t h em o d e lo fn i s i ns y n t h e s i s 3 z ， c o o h 河北大学理学硕士学位论文 参与n i s i n 生物合成的物质除结构基因【2 9 】外还有：1 一个或多个参与免疫的蛋白； 2 a b c 转移体( a t pb i n d i n gc a s s e t t e ) ；3 切割前导肽的丝氨酸蛋白酶；4 一个或两个催化 氨基酸脱水形成羊毛硫氨酸( l a n ) 的蛋白酶：5 双组分调节蛋白，目的是转运一个胞外 信号来诱导细菌素的表达2 8 1 。 n i s i n 的生物合成，首先由胞外的信号激活位于膜上的组氨酸激酶( 由n i s k 编码) ， n i s k 基因自身磷酸化作用之后，转移磷酸基到相关的调节因子( n i s r ) ，n i s r 将前肽分子调 节到位于膜上的修饰复合蛋白质( n i s b 和n i s c ) 进行修饰，修饰肽与转运蛋白( n i s t ) 相结 合，将修饰肽通过膜的转运，附在膜外表面的n i s p 将前导序列切除诱导有活性的n i s i n 分 子。 叶嗣颖等也通过实验证明了n i s p 基因在n i s i n 生物合成终末成熟过程中起控制作用 【3 0 1 。 1 2 3n i s i n 的性质 n i s i n 在酸性底物中较易溶解，p h 上升溶解性下降，当p h 为2 时溶解约为5 6 m g m l ，p h 5 时为3 m gm l ，p h 7 仅为lm gm l ，因为在食品保藏中n i s i n 的应用水平很 少( o 0 2 5m gm l 以) ，故溶解性不是其食品中应用的问题【2 6 1 。研究表明，n i s i n 在p h 2 甚至更低的稀盐酸环境中，经1 1 5 加热3 0 m i n 也不会失去活性【3 1 】。 n i s i n 分子在性质上呈酸性，随着p h 增加，热处理稳定性下降，p h 2 时的n i s i n 溶 液在1 1 5 、1 2 1 的灭菌时呈稳定性，p h 5 时损失活性的4 5 ，p h 7 时活性损失大于9 0 ， 食品生产中的灭菌对n i s i n 的活性基本无影响，大蛋白分子的存在有助于改善食品中 n i s i n 对热的稳定性，i o ( w w ) 还原乳中，n i s i n 能耐受1 0 8 ，2 m i n 的热处理p 2 1 。 1 2 4n i s i n 的抗茵性及其作用机理 n i s i n 专抑制革兰氏阳性菌，特别是细菌芽孢。 n i s i n 的抗菌作用呈浓度依赖型，即和n i s i n 自身浓度、敏感菌细胞或芽胞浓度相关。 n i s i n 具有抑菌( b a c t e r i o s t a t i c ) 或杀菌( b a c t e r d a l ) 作用，这要依赖于目标微生物的生理状态 和情况。处于能量状态的营养繁殖细胞较处于静止状态的营养繁殖细胞更易被杀死，杀 菌作用最常发生在目标微生物的最适p h 、温度和水活度( a w ) 的情况下，n i s i n 的抗菌作 4 第1 苹绪论 lime 一i ii - - 夸曼兰皇曼! ! ! 皇皇寡! 鼍皇曼鼍苎! 皇曼量皇皇皇 用在多重保护系统中能获得最好的效果，这种多层保护系统称之为障碍技术( h u r d l e t e c h n o l o l g y ) ，这种技术应用于菌的非最适p h 、温度和水活度( a w ) 的情况下【2 州。 n i s i n 对敏感革兰氏阳性营养繁殖细胞的作用缘于破坏细胞质膜，提出所谓的“孔 道理论 【3 3 、3 4 1 ，认为n i s i n 是一个疏水的带正电荷的阳离子分子，在一定膜电位存在下， 可吸附于敏感菌的细胞膜上，通过c 末端作用侵入细胞膜内形成通透性孔道，细胞膜失 去极化并导致a t p 泄露，使细胞内小分子和离子流失，细胞外水分子流入，造成细胞膜 内外能差消失，细胞自溶而死亡1 3 5 1 。 研究表明n i s i n 孔道的形成不需要蛋白质受体，n i s i n 孔道形成是因n i s i n 和细胞膜 上的细菌萜醇一焦磷酸- n 一乙酰胞壁酸一五肽- n - 乙酞葡萄糖胺 ( u n d e c a p r e n y l p y r o p h o s p h o r y l m u r n a c ( p e n t a p e p t i d e ) 一g l c n a c ) 简称为l i p i d l i 的分子对 接( d o c k i n g ) 作用而触发的【3 6 、3 7 3 8 1 ，l i p i di i 是n i s i n 作用的唯一目标，l i p i d i i 与n i s i n 问特效、高亲和力的相互作用导致孔道形成，膜对n i s i n 的敏感性依赖于l i p i d l i 浓度， 随着l i p i d l i 的浓度升高，膜对n i s i n 的敏感性增强。n i s i n c 末端和柔性绞链区是基本的 孔道构成成分，而n 末端区则是l i p i d i i 的识别区，n i s i n 和l i p i d l i 形成复合物而抑制 细胞壁生物合成( 肽聚糖合成) ，n i s i n 显示为二元杀菌机制。 也有研究认为n i s i n 的作用方式是多样化的，在l i p i d i i 存在时，孔道形成是稳定的， 且很低浓度的五环肽就导致细胞死亡，而当没有l i p i d l i 时n i s i n 仍能形成通道，但稳定 性稍弱且需要更高n i s i n 的浓度【3 9 1 。 芽孢相对于对产生芽孢的营养繁殖细胞来说对n i s i n 更敏感。这种抑制芽孢作用是 在芽孢上进行的，此作用在芽胞变模糊后，膨胀和生长前开始。 o u m e r 等认为n i s i n 对革兰氏阳性菌的致死作用还与其能诱导相关菌株产生氨肽酶 有关，产生氨肽酶活性高的菌株更容易被n i s i n 所裂解m 】。 n i s i n 在一定条件下也可以抑制革兰氏阴性菌，用e d t a 和其他螯合剂处理革兰氏 阴性菌也可使得它们对正常情况下对抗性的试剂变得敏感。其中e d t a 和其他鳌合剂的 确切作用是去除革兰氏阴性菌细胞壁上的m f + 和c a 2 + 离子，使得革兰氏阴性菌释放磷 脂和脂蛋白，这两种物质的丧失，增加了细胞壁的通透性，并使n i s i n 的c 末端作用于 细胞质膜【4 l 】，从而形成孔道使细胞膜失去极化造成细胞膜内外能差消失，细胞自溶而死 1 l 。 5 河北大学理学硕士学位论文 1 2 5n i s i n 的自身免疫性 产n i s i n 菌株自身对n i s i n 的免疫能力是由n i s i ( 含有2 4 5 个氨基酸) 起主导作用的， 这个免疫基因编码的膜蛋白能够与膜质蛋白形成a b c 转运体( a t pb i n d i n gc a s s e t t e ) ，而 这个转运体可以减弱n i s i n 与产n i s i n 菌株在细胞外表面的结合能力，它能抑制孔洞形 成而达到自身免疫。 除了n i s i 基因外，1 9 9 5 年s i e g e r s 等人进一步发现，n i s i n 基因簇下游的3 个基因 n i s e 、n i s f 和n i s g 也参与n i s i n 生产菌株的免疫性4 2 】。 1 2 6 影晌n i s i n 活性的因素 影响n i s i n 活性的因素【4 3 】来自很多方面，比如：n i s i n 自身性质的影响，目标控制菌 的性质状态，防腐剂或其他物质的影响，n i s i n 作用的p h 值和温度的影响等。 1 2 6 1n i s i n 的性质n i s i n 的分子结构决定着n i s i n 的抑菌活性功能，溶解度、稳定性、 扩散性，而这些性质均与n i s i n 抑菌活性密切关联。 目前有报道利用定点突变技术开发各种高活性或适当性质的n i s i n 变异体，如k 1 2 l n i s i n a 增加了n i s i n 引起的膜的传导性；n 2 7 k 、h 31 kn i s i n z 增加了n i s i n z 在自然条件 下的稳定性和溶解性，改善了n i s i n 的抑菌效；0 t 4 4 1 。 1 2 6 2 目标控制菌性质由于革兰氏阴性菌的外膜中的孔蛋白( p o r i n ) 仅允许分子量小于 6 0 0 的分子自由扩散，故n i s i n 分子不能进入到达目标细胞质膜，从而对革兰氏阴性菌 没有抑制作用。 可以利用各种膜干扰剂如鳌合剂( e d t a 、柠檬酸盐、六偏磷酸钠( h m p ) 、磷酸钠等) 来改变革兰氏阴性菌外膜通透性，使之变得对n i s i n 敏感，或者各种物理的因素如加热、 冷冻、高压( h p ) 和超高静f 玉, ( u n p ) 和脉冲电场( p e f ) h p ，u h p 和p e f 通过使细胞膜结构 和功能的完整性不稳定化而导致细胞破坏，促进了细胞对n i s i n 的渗透性【4 5 1 ，提高革兰 氏阴性菌对n i s i n 的感受性。 1 2 6 3 温度、p h 值的影响温度对n i s i n z 效力的影响因目标菌而异，如对单增李斯特 菌、蜡状芽抱杆菌温度升高到3 0 c 时，n i s i n 的最低抑菌浓度值( s i c ) 也明显升高，而对 无害李斯特菌i n n o c u a ) 、植物乳杆菌的最低抑菌浓度值则降低【3 4 1 。 6 第1 章绪论 p h 值也影响n i s i n 的活性，n i s i n 在p h 2 1 0 之间具有活性，在低p h 时具有高活性， 但酸水解会形成无活性的n i s i n 降解产物。n i s i n 一般适用于p h 值在3 5 8 0 之间。 1 2 6 4 防腐添加剂的影响n i s i n 与一些天然成分和其它防腐剂组合使用时可以增效。 低浓度的香芹酚和麝香草酚能提高n i s i n 对单增李斯特氏菌( l m o n o c y t o g e n e s ) 和蜡 状芽抱杆菌( 曰c e r e u s ) 的抑菌作用效果；棕榈酸硬脂酸，蔗糖，醋可增加n i s i n 活性使之 完全抑制蜡状芽抱杆菌和植物乳杆菌( l a c t o b a c i l u sp l a n t a r u m ) ；柠檬酸盐、六偏磷酸钠 ( h m p ) 增加n i s i n 抑制b c e r e u s 抱子萌发的效力【4 3 】；n i s i n 与e d t a 共用提高了对革兰 氏阳性菌菌的抑制效力效果；乳铁蛋t 刍( l a c t o f e r r i n ) 与n i s i n 结合显著提高n i s i n 对单增 李斯特氏菌抑菌作用效果【4 6 1 。 在低盐环境下乳酸能增加n i s i n 的效力；此外，n i s i n 与溶菌酶、纳他霉素( n a t a m y c i n ) 、 山梨酸、亚硝酸盐等其它天然或化学防腐剂配合使用，可以获得协同效应而改善其抗菌 谱、增强抗菌效果【4 7 1 。 由于n i s i n 呈疏水性，食品中的脂肪类物质会干扰其在食品中的均匀分布，使其无 法发挥抑菌作用；许多食品添加剂对n i s i n 也有抵消作用，n i s i n 在硫代硫酸钠和t i 0 2 ： 的存在情况下将被分解【2 6 1 。 1 2 7n i s i n 的遗传学研究 n i s i n 的遗传位点，近十几年来，通过消除质粒并结合转移实验也证实编码n i s i n 的 基因位于质粒d n a 上，而且发现产生n i s i n 的基因( n i p + ) 、蔗糖发酵基因( s u c + ) 和n i s i n 抗性基因( 1 1 i s + ) 是紧密连锁的。 另一方面，对n i s i n 基因的定位研究，特别是通过染色体的缺失与杂交实验发现， 编码n i s i n 的结构基因与染色体上一个可结合的转座子有关【4 8 】。 后来h o r n 等人证实n i s i n 的结构基因位于一个7 0 k b 大小的转座子( 被称作t n 5 3 0 1 ) 中【4 9 】。n i s i n 基因转座子是不稳定的，从而推测编码n i s i n 的基因可能位于一个可转座于 质粒和染色体上的转座子中，这意味着在不同菌株中，编码n i s i n 基因的遗传位置也不 一定相同【5 0 1 。 由于位于质粒和染色体上基因的表达效率存在差异，所以对n i s i n 遗传学进行深入 研究，能够使研究人员在分子生物学水平上来选育n i s i n 生产菌株，从而使人们有可能定 7 河北大学理学硕士学位论文 向改变n i s i n 的溶解度、稳定性和抑菌谱等特性，拓宽n i s i n 的应用前景。 c h a n i c kc h e i g h 等研究了乳酸菌a 1 6 4 及引入涉及到a 1 6 4 种有关合成n i s i n 的基因 n i s z ，n i s r k 或n i s f e g 多拷贝基因。研究表明，菌体细胞对n i s r k 的表达，使得n i s i n 的产量达到2 5 ，0 0 0a u m l 。n o t h e m 杂交表明n i s r k 的过表达可以增进n i s z 的翻译， a 1 6 4 菌株表达多拷贝基因也可以增加n i s i n 的产量，但是相对于多拷贝基因n i s r k 产 n i s i n 的速度要慢【5 。 1 2 8 效价测定的研究 1 2 - 8 1 管碟法测n i s i n 的效价管碟法和琼脂扩散法测n i s i n 生物效价原理基本相同，都 是利用n i s i n 的抑菌性质在指示平板的抑菌效果来测定效价。 随着n i s i n 在指示平板上的扩散，抑制敏感菌株的生长，而对其他范围内的菌株无 抑制作用，在指示平板上形成透明的抑菌圈，测量抑菌圈的直径换算出n i s i n 的效价值 1 5 2 o p o n g t h a r a n g k u lt 、d e m i r c ia 等报道了指示平板4 。c 条件下放置2 4 h 做预扩散，然 后加样3 0 。c 培养2 4 h 的方法检测效价，可以提高抑菌圈的精确度5 ”。 1 2 8 2 利用计算机编程测定n i s i n 效价近年来，有一些报道利用计算机编程来测定 n i s i n 的效价。 河北工业大学就运用利用二剂量法检测乳链菌肽效价，检测过程中只需研究样品溶 液和标准品溶液对检测造成的影响，排除了其它影响因素；确定了效价计算的c + + 运算 程序，避免了通过标准曲线法计算效价产生的误差，减少了人为的误差，大幅度提高了 测定乳链菌肽效价的准确性【5 4 1 。 1 9 9 6 年刘稳等报道了一种乳链菌肽生物测定方法，以浅黄微球菌为敏感指示菌，该 法的适用范围为5 1 0 0 i u m l ，并建立起一套微机运算程序，简化了数据处理工作，尤 其适于大批量实验数据运算。由于效价测量时采用同一型号培养皿，维持相同的培养基 厚度和使用相同浓度的指示菌悬液，结果的运算方法是固定的，所以可编成一个简单的 f o r t r a n 程序，利用微机处理【5 5 1 。 1 2 8 3 免疫法测定n i s i n 效价n a n d a k u m a r 通过组合流动注射系统( f i a ) 和e l i s a 进行 组合来测定n i s i n 。 8 第1 章绪论 曼|i 穹詈皇曼皇皇鼍! 皇苎鼍曼曼曼鲁皇! 暑! 鼍苎! 詈曼暑皇曼皇曼曼! 曼! ! ! 皇詈鼍曼皇舞皇暑皇篁量鼍曼曼曼! 曼皇蔓皇! ! ! ! ! 詈苎曼孽! ! 该系统被称作单克隆抗体的连续竞争流动注射免疫分析系统( c o m p e t i t i v e2f l o w2 i n j e c t i o ni m m u n o a s s a ys y s t e m ) ，可以用于直接测定悬浮液中的n i s i n 而不会有显著干扰， 从而实现了在线检测发酵过程中的n i s i n 或者食品体系中的n i s i n 5 6 1 。d a o u d i 通过免疫 印迹( w e s t e r ni m m u n o b l o t t i n g ) 发现一种特殊的n i s i n z 单克隆抗体对无生物学活性的 n i s i n z 的降解物具有高的反应性，能够快速而灵敏地检测培养基、牛奶和上清液中的 n i s i n 5 7 1 。 1 2 9n i s i n 的应用研究 n i s i n 由于能抑制大部分革兰氏阳性菌的生长，并可以和某些络合剂( 如e d t a 或柠 檬酸) 一起作用使部分革兰氏阴性菌变得敏感。所以，与其它乳酸菌产生的细菌素相比 n i s i n 具有较宽的抑菌谱。 除此之外，n i s i n 易于被人体消化道内蛋白酶降解，并且n i s i n 有良好的热稳定性以 及耐酸和耐低温贮藏等特性，因此应用n i s i n 可降低食品的杀菌温度、减少热处理时间 和保持食品原有的营养与风味等特点，这些特点使它成为一种比较好的天然食品保护 剂。 目前，n i s i n 已广泛应用于乳品、罐装食品、肉制品及酒精饮料产品的保存中。 1 2 9 1 对酸奶品质的影响一直以来，提高酸奶食用的安全性，延长酸奶保质期的都是 一个难解决的问题。 酸奶因其营养丰富极易感染有害微生物，天然酸奶没有经过高温杀菌，乳制品属于 热敏性的物料，虽经巴氏灭菌但仍可能残有部分细菌和耐热芽孢，所以保质期一般在1 4 d 左右。 结合n i s i n 的使用，可以弥补低温杀菌的不足，提高乳制品质量【6 】。n i s i n 已经在鲜 乳和各种乳制品( 如干酪，酸奶) 中已得到广泛地应用，取得了满意的效果。酸奶一般选 用嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌，由于嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌生长的互补作用， 使得保加利亚乳杆菌对n i s i n 的敏感性降低了。 有资料证明，酸奶中使用耐酸羧甲基纤维素( c m c ) 、复合稳定剂a 或b 作稳定剂， 再添加5 0 0 i u m l n i s i n ，就能有效地延长酸奶保质期4 - 8 d ，且不影响酸奶的感官和品 质【4 】。 9 河北大学理学硕十学位论文 另外，n i s i n 能有效抑制酸奶的后发酵作用，保持酸奶固有的风味和延长酸奶的贮 藏期【5 j 。 1 2 9 2 在肉制品中的应用传统的火腿和香肠生产中，普遍使用亚硝酸钠、硝酸钠等发 色剂来产生典型的腌制红色和腌制风味，并抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长，但这些添加 剂同时对人体具有潜在的致癌危斟5 8 1 。 n i s i n 能有效控制肉制品中微生物的生长，尤其是抑制产生毒素的肉毒梭状芽孢杆 菌的活性，并且n i s i n 本身呈酸性，能降低周围介质的p h 值，因而能降低残留的亚硝 酸盐含量，减少亚硝胺的形成。因此添加n i s i n 的肉制品能减少发色剂的用量，提高食 用安全性。目前已有多人将n i s i n 成功运用于肉制品加工实验中，并取得良好的效果【5 9 、 6 0 】 o 孔宝华等添加4 0 0 i u g n i s i n 的处理组的细菌总数远远低于对照组，n i s i n 可在一定 程度上可延长红肠的保存期【6 l 】。 张洪震等验证了n i s i n 在猪肉冷却肉保鲜中具有一定的抑菌作用，该作用随n i s i n 浓度的增加而增强，当n i s i n 的浓度为2 0 0 p p m 时，可使猪肉保质期延长l 倍，n i s i n 分 别与乳酸钠，山梨酸钾配合使用抑菌效果增强【6 2 】。 罗水忠等在对虾肉的保鲜实验中发现，虾肉糜用乳酸链球菌素等保鲜剂处理后，在 2 5 c 下贮存，保质期由2 天延长至5 6 天，而虾肉糜的感官并没有受到影响【6 3 】。 1 2 9 3 在罐头食品中的应用常规的罐头杀菌消毒处理难以将耐热芽孢菌，如嗜热脂肪 芽孢杆菌和热解糖梭菌的耐热芽孢彻底杀死。一旦条件适宜，这些芽孢便会导致罐头食 品腐败。而添加n i s i n 可有效地减少这方面的损失。 王莉平等阐述了各种罐头食品在添加n i s i n 后大大降低了罐头食品的杀菌强度，在 节约能源的同时，更重要的是提高了产品的品质，保证了产品的安全性【6 4 1 。 1 2 9 4 在酒精饮料中的应用由于n i s i n 只对革兰氏阳性菌有明显的抑制作用，而酵母 几乎不受其影响，因此n i s i n 可与酵母一起在生产啤酒、果酒、烈性乙醇等酒精饮料时 加入，用来抑制革兰氏阳性菌。 啤酒生产中易受乳杆菌和啤酒片球菌的污染，发生混浊、变酸、发粘等现象。o g d e n 等( 1 9 8 5 年) 证明了加入1 0 i u m l n i s i n 的啤酒可以存放4 2 天，保存期延长了一倍【6 引。英 国和德国的研究人员发现，1 0 0 i u m l 的n i s i n 对乳酸杆菌、片球菌及其它一些乳酸菌等 主要腐败性细菌均有抑制作用。 1 0 第1 章绪论 由此可见，n i s i n 在酒精饮料工业方面具有广阔的应用前景【6 j 。 1 2 9 5 保鲜膜由胶原蛋白与壳聚糖、n i s i n 做成的复合保鲜膜处理对低温肉制品在不 同贮藏温度下均具有显著抑菌效果和抑制挥发性盐基氮( t v b - n ) 值增长的作用【7 】， 从而延长其保质期。 1 2 9 6 酱油生产中的应用传统的酿造酱油由于受到工艺条件及本身性质的影响，需要 加入防霉剂，如苯甲酸钠、山梨酸钾等，由于它们属于化学添加剂的范畴，因此寻求天 然、高效的防霉剂成为传统酿造酱油生产中急需解决的问题，在酱油生产中n i s i n 和其 他防腐剂的混合使用可以降低防腐剂的最低用量【8 1 。 1 2 9 7 检测中的应用用乳链菌肽替代胆盐进行大肠菌群的检测，用量少，成本低，并 且效果较好，具有一定的经济价值 9 1 。 1 2 9 8 医疗方面的应用前景将n i s i n 和柠檬酸联合协同作用对幽门螺旋杆菌( h p ) 有 很好的抑制作用 6 6 1 。 柯连安等研究表明柠檬酸与菌细胞膜脂多糖镁离子结合而改变了革兰阴性菌细胞 膜的渗透屏障作用，为n i s i n 的作用提供了生物学基础，使得n i s i n 对h p 有显著的杀伤 作用。 另外还连栋还发现n i s i n 可阻止或抑制口腔菌利用糖的发酵，可以添加到以糖、淀 粉为主要成分的食物、糖果和饮料中，以阻止或降低口腔菌的糖发酵作用。可有效阻止 牙斑的形成和牙龈炎的发生【6 7 1 。 1 3 本课题的研究目的及研究内容 综上所述，随着国内外对n i s i n 的研究不断深入，以及人们对食品加工使用的安 全卫生的要求越来越高，n i s i n 作为目前世界上唯一被用于食品防腐的方面的天然绿色 安全的防腐剂有着巨大的发展前景。 目前国内只有浙江天台制药厂生产商业用n i s i n ，其产量远远满足不了我国食品行 业的需求，而进口n i s i n 产品价格昂贵。利用各种方法筛选高产n i s i n 的菌株、提高n i s i n 产生菌的效价等研究具有重要的现实意义。 微生物的诱变方式有很多，采用较多的是化学诱变和紫外线诱变，但这些方法对操 作人员都有很大的危险性，操作不慎会对人体造成伤害。微波是高频交变的电磁波，具 1 1 河北大学理学硕士学位论文 有传导作用和极强的穿透力，能够造成极性分子的迅速震动，这种震动能引起菌体d n a 分子间强烈的摩擦，使d n a 分子氢键和碱基堆积化学力受损，使得d n a 结构发生变 化，从而发生遗传变异【1 1 1 。微波诱变已在植物，禽畜，微生物育种等多方面得到应用【6 8 】。 利用微波诱变菌株提高菌体代谢产物的量已被证明是很好的诱变方法【6 9 7 0 7 1 1 。 n i s i n 的生产过程中在营养缺乏的情况下，采用补料分批培养的办法，在原始低浓 度的基质基础上添加营养物质可有效提高n i s i n 产量【7 2 朋】。 本研究的目的就是通过微波诱变处理产n i s i n 菌株，筛选n i s i n 高产菌株，进一步 优化培养基和发酵条件，提高其发酵产量。 本研究主要内容： 利用微波诱变产n i s i n 菌株，筛选n i s i n 产量有一定幅度提高的突变株。 通过对发酵培养基主要成分的优化，进一步提高突变株n i s i n 产量。 通过对接种量、发酵温度、发酵过程中控制p h 值、流加碳氮源等研究，进一步提高突 变株的n i s i n 产量。 1 2 2 1 材料 第2 章乳酸乳球菌的微波诱变育种 2 1 1 标准菌株：产n i s i n 菌种：乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i ss s p 1 a c t i s ) 编号1 2 0 3 0 ， 由中科院微生物研究所提供。 藤黄微球菌( m i c r o c c u sl u t e u s ) ，编号：1 2 2 9 9 ，由中科院微生物研 究所提供。 2 1 2 培养基 蛋白胨、酵母膏、葡萄糖培养基( p g y 培养基) 【7 4 、7 5 】：用于培养指示菌株( 1 2 2 9 9 ) 。 蛋白胨1 ，酵母膏0 5 ，葡萄糖1 ，琼脂1 8 ，p h 6 8 - 7 0 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 斜面培养基：用于传代n i s i n 生产菌( 1 2 0 3 0 ) 。酪蛋白胨1 ，牛肉膏1 ，酵母膏 o 5 ，蔗糖o 5 ，乙酸钠o 5 ，柠檬酸三铵o 2 ，t w e e n s 00 1 ， k 2 h p 0 4o 2 ，m g s 0 4 7 1 - 1 2 00 0 2 ，m n s 0 4 h 2 00 0 0 5 ，c a c 0 32 ， 琼脂1 8 ，p h 6 8 ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 。 种子培养基：用于扩大培养n i s i n 产生菌( 1 2 0 3 0 ) 。配比同斜面培养基，不添加琼 脂。 发酵培养基：用于发酵n i s i n 产生菌( 1 2 0 3 0 ) 。配比同种子培养基。 检测培养基：用于检测n i s i n 的效价。胰蛋白栋0 8 ，酵母膏0 5 ，葡萄糖o 5 ， n a c l0 5 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 00 2 ，t w e e n 8 01 ，琼脂1 8 ，p h 6 8 ， 1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 固体培养基：用于筛选菌株用。配比同斜面培养基。 其他试剂：n i s i n 标准品，浙江天台制药厂( 效价l x l 0 6 i u m l ) ，革兰氏染色液等。