（生态学专业论文）桐花树幼苗植物络合素和植物多酚对重金属的响应.pdf

摘要 本文采用盆栽砂培试验，研究了红树植物桐花树( a e g i c e r a sc o r n i c u l a t u m ) 幼苗植物络合素和植物多酚对重金属c d 、c u 和z n 暴露浓度和暴露时间的响应。 分别设置c d 、c u 和z n 的暴露浓度系列为0 、5 、1 0 、2 0 、3 0m gl ，以不加重 金属为对照，培养期1 5 0 天。对c d 、c u 年1 z n 暴露下，桐花树幼苗非蛋白巯基 ( n p t ) 、谷胱甘肽( g s h ) 、植物络合素( p c s ) 、总多酚( t p ) 、总缩合单宁 ( t c t ) 、可溶缩合单宁( e c t ) 、蛋白质结合缩合单宁( p c t ) 和纤维素结合缩 合单宁( f b t ) 的响应，以及植物络合素在非蛋白巯基中的分布比例和各缩合单 宁组分在总缩合单宁中的分布比例特征等进行了系统的研究，进一步探讨桐花树 幼苗植物络合素和植物多酚在其重金属耐性机制中发挥的作用。结果表明： 1 c d 、c u 和z n 分别暴露下，桐花树幼苗根系和叶片的非蛋白巯基( n p t ) 含量与空白对照相比有显著增高，这表明在重金属扰乱了桐花树幼苗体内的巯基 代谢。相对于c u 和z n 而言，c d 对n p t 的影响最大，表明c d 对桐花树幼苗的毒性 最大。相对于根系而言，重金属对桐花树幼苗叶片中n p t 的诱导效果较弱。对于 c u 和z n 而言，在相同的处理浓度下，不同处理时间对桐花树幼苗根系和叶片的 n p t 含量影响的差异均不明显；只有在高浓度( 3 0m gl 1 ) c d 处理组的试验后 期观察至u n p t 含量有明显下降的趋势。n p t 作为抗氧化剂，重金属暴露下其含量 的增加对于缓解重金属对植物造成的氧化伤害具有重要意义。 2 作为植物络合素合成的底物，桐花树幼苗谷胱甘肽( g s h ) 对重金属暴 露体现出积极响应。c d 、c u 和z n 处理下，桐花树幼苗根系g s h 含量均明显 增高，但是在本试验设置的处理浓度范同内，重金属对g s h 含量的剂量效应不 是很明显。除了高浓度c d 处理组的试验后期观察到根系g s h 含量的明显下降 之外，其他处理均没有观察到明显的时间效应。c d 和c u 暴露显著增加桐花树 幼苗叶片g s h 的含量，但是z n 的影响效果不明显。重金属暴露促使桐花树幼 苗加强g s h 的生物合成，为p c s 生成提供前体物质，对桐花树幼苗抵御重金属 毒害具有重要意义。 3 桐花树幼苗根系和叶片植物络合素( p c s ) 含量在重金属暴露下显著增 高。在本试验设置的浓度范围内( 0 - 3 0m gl 1 ) ，不同浓度c d 、c u 和z n 处理对 桐花树幼苗根系p c s 含量有浓度效应，但是对叶片p c s 含量影响的差异较不明 显。在c d 处理组，桐花树幼苗根系和叶片p c s 含量均随着处理时间的延长而有 明显下降的趋势；在c u 并i z n 处理组没有观察到明显的时间效应。重金属胁迫下， 桐花树幼苗根系p c s 含量明显高于叶片p c s 的含量，表明根系是p c s 合成的主要 部位。重金属胁迫下桐花树幼苗体内p c s 含量的增加，对于植物清除体内游离的 重金属离子，缓解重金属离子毒害起到关键作用。 4 重金属暴露显著改变p c s 在n p t 中的分布比例。c d 、c u 和z n 处理下， 随着暴露时间的延长，桐花树幼苗根系和叶片中的p c s n p t 均有波动上升的趋 势，表明重金属诱导桐花树幼苗体内n p t 向p c s 转化，并且随着暴露时间的延 长，这一转化反应更明显。 5 与对照相比，重金属暴露刺激桐花树幼苗叶片总多酚( t p ) 的合成，表 明重金属暴露影响桐花树幼苗植物多酚代谢。但是在0 3 0m gl 。的浓度范围 内，重金属对t p 的剂量效应并不明显。本试验中，相同处理浓度下，c d 、c u 和 z n 对t p 的影响效果在统计水平上的差异不显著。桐花树幼苗体内多酚物质的大 量合成和累积可能对植物清除体内过多的氧自由基方面发挥重要作用。 6 在0 3 0m gl 。的范围内，桐花树叶片可溶缩合单宁( e c t ) 的含量随 着暴露的重金属浓度的增大而呈单峰曲线趋势。 7 c d 、c u 和z n 对桐花树幼苗叶片蛋白质缩合单宁( p c t ) 的影响相似：较 高的重金属暴露浓度( 1 0m gl 1 ) 促进p c t 含量的显著提高。 8 与e c t 和p c t 相比，纤维素缩合单宁( f c t ) 对重金属的响应规律比 较特殊：桐花树幼苗叶片f c t 含量在重金属暴露下呈现下降趋势。相同处理浓 度下，f c t 对不同重金属的响应没有统计学上的差异。 9 总缩合单宁( t c t ) 表现出和t p 一样的特征，即重金属暴露促使t c t 含量显著增加。 10 e c t 、p c t 和f c t 各组分在t c t 中的比例分布受重金属的影响发生显 著改变。e c t 厂r c t 随着重金属暴露浓度的增高而增大；而f c t t c t 却随着重 金属暴露浓度的升高而下降。这一结果表明重金属暴露显著影响桐花树幼苗叶片 的多酚代谢，这可能对桐花树吸附体内过多的游离金属离子，清除自由基，增强 重金属耐性方面发挥积极作用。 i i 关键词：植物络合素：植物多酚：桐花树：重金属 i i i a b s t r a c t i nag r e e n h o u s es a n d yc u l t u r es y s t e mw ei n v e s t i g a t e dt h er e s p o n s eo f p h t o c h e l a t i n sa n dp h e n o l i c sm e t a b o l i s m st oh e a v ym e t a l s ( c d ，c u ，a n dz n ) o f m a n g r o v e ( a e g i c e r a sc o m i c u l a t u m ) s e e d l i n g s c d ，c uo rz nw e r ea d d e d a s c h l o r i d e st ot h en u t r i e n ts o l u t i o na tl e v e l so f0 ，5 ，10 ，2 0 ，3 0m gl - 。r e s p e c t i v e l y s y s t e m a t i cs t u d i e so na e g i c e r a sc o r n i c u l a t u ms e e d l i n g sw e r ec a r r i e do nn o n p r o t e i nt h i o l s ( n p t ) ，g l u t a t h i o n e ( g s h ) 。p h y t o c h e l a t i n s ( p c s ) ，t o t a lp h e n o l i c s ( t p ) ，t o t a lc o n d e n s e dt a n n i n ( c t ) ，e x t r a c t a b l ec o n d e n s e dt a n n i n ( e c t ) ， p r o t e i n b o u n dc o n d e n s e dt a n n i n ( p c t ) a n df i b r e b o u n dc o n d e s e dt a n n i n ( f c t ) t h em a i np u r p o s ew a st of u r t h e rr e v e a lt h ef u n c t i o n so fp h t o c h e l a t i n s a n dp h e n o l i c si nh e a v ym e t a l st o l e r a n c ei na e g i c e r a sc o r n i c u l a t u ms e e d l i n g s t h er e s u l t sa r ea sf o i l o w s ： 1 h e a v ym e t a l s ( c d ，c ua n dz n ) e x p o s u r ei n c r e a s e dn o np r o t e i nt h i o l s ( n p t ) c o n c e n t r a t i o ni nt h el e a v e sa n dr o o t so fa e g i c e r a sc o r n i c u l a t u ms e e d l i n g s ， i n d i c a t i n gd i s t u r b a n c e si n - s hm e t a b o l i s m i tw a sf o u n dt h a tc dw a st h em o s t e f f e c t i v ea c t i v a t o ro fn p t , w h e r e a so t h e rh e a v ym e t a l s ( c ua n dz n ) a c t i v a t ei t t oam u c hl e s s e re x t e n tt h a nc d w ea l s of o u n dt h a tt h ec o n t e n t so fn p ti n r o o t sw e r em u c hh i g h e rt h a nt h a ti nl e a v e s a st oc ua n dz n ，i nt h es a m e e x p o s u r ec o n c e n t r a t i o n 。t h ec o n t e n to fn p t w a sn o ta f f e c t e db yt h ee x t e n d i n g o ft i m e ；a st oc d ，d i s t i n c td r o pi nt h ec o n t e n to fn p tw a sf o u n da t3 0m gl - 1 t r e a t m e n ta f t e r15 0d a y so fe x p o s u r e t h ev a r i e t yo fn p ti na e g i c e r a s c o r n i c u l a t u ms e e d l in g sm i g h ta c ta sa n t i o x i d a n ta n dp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei n t o l e r a n c eo fh e a v ym e t a l s 。 2 i nr e s p o n s et oh e a v ym e t a l se x p o s u r e ，a e g i c e r a sc o r n i c u l a t u ms e e d l i n g s s h o w e ds i g n i f i c a n ti n d u c t i o no fr o o t sg l u t a t h i o n e ( g s h ) h o w e v e r , i nt h e p r e s e n ts t u d y ，t h el e v e lo fg s hd i dn o ts t a t i s t i c a l l yc h a n g ew i t ht h ev a r i e t yo f h e a v ym e t a l st r e a t m e n tl e v e l s ；e x c e p t i n ga tt h e3 0m gl c dt r e a t m e n t ，t h e c o n t e n to fg s hw a sn o ta f f e c t e db yt h ee x t e n d i n go ft i m e t h ee x p o s u r eo fc d a n dc us i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dt h ec o n t e n to fg s hi nl e a v e so fa e g i c e r a s c o r n i c u l a t u ms e e d l i n g s ，w h i l en o s t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n c ew a sf o u n da tz n t r e a t m e n t s s i n c ep c ss y n t h e s i si sr e g u l a t e db yt h ei n t r a c e l l u l a rl e v e lo fg s h ， t h ei n c r e a s eo fg s hm i g h tc o n t r i b u t et o w a r d si n c r e a s e di np c si na e g i c e r a s c o r n i c u l a t u ms e e d l i n g s 3 p h y t o c h e l a t i n s ( p c s ) w e r ea l s oi n d u c e ds i g n i f i c a n t l yu n d e rh e a v ym e t a l s e x p o s u r ei nc o m p a r i s o nt oc o n t r 0 1 s t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n c e si nt h ec o n t e n to f p c sw e r ef o u n d u n d e rd i f f e r e n tl e v e lo fh e a v ym e t a l st r e a t m e n t s ( 0 - 3 0m gl 1 ) i nr o o t so fa e g i c e r a sc o r n i c u l a t u ms e e d l i n g s ，w h i l en o ti nl e a v e s a l t h o u g hc d i n c r e a s e db o t ht h ep c sc o n t e n t si nr o o t sa n dl e a v e so fa e g i c e r a sc o m i c u l a t u m s e e d l i n g s ，w ed i df i n dt h a tt h el e v e l so fp c sd e c l i n e dd r a s t i c a l l yf o l l o w i n gt h e e x p o s u r et i m ea th i g hl e v e lt r e a t m e n t s ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tl o n g t i m ea n dh i g h l e v e le x p o s u r eo fc dm i g h td i s t u r bt h eb i o s y n t h e t i cr e g u l a t i o no fp h y t o c h e l a t i n s m a r k e d l y t h ei n c r e a s eo fp c sm i g h ta c ta ss o r b e n to fd i s s o c i a t i v eh e a v y m e t a l si o n ，a n df u r t h e ra f f e c t e dt o l e r a n tm e t a b o l i s mi na e g i c e r a sc o r n i c u l a t u m s e e d l i n g s 4 i tw a ss h o w e dt h a th e a v ym e t a l se x p o s u r ec h a n g e dt h ed i s t r i b u t i o n so f p h y t o c h e l a t i n s ( p c s ) i nn o np r o t e i nt h i o l ( n p t ) u n d e rc d ，c ua n dz n e x p o s u r e ，t h ep c s n p tr a t i ow e r ef o u n dt oi n c r e a s ef o l l o w i n gt h ee x p o s u r e t i m e ，w h i c hs u g g e s t e dt h a th e a v ym e t a l si n d u c e dt h eb i o s y n t h e s i so fp c sf r o m n p t , a n de x p o s u r et i m eh a ds o m ee f f e c t so nt h i sb i o s y n t h e t i cr e g u l a t i o n 5 f o l i a rt o t a l p h e n o l i c s ( t p ) o fa e g i c e r a sc o r n i c u l a t u ms e e d l i n g sw a s d i s t i n c t l yi n d u c e db yh e a v ym e t a l si nc o m p a r ew i t hc o n t r o l ，w h i c hi m p l i e d d i s t u r b a n c eo fp h e n o l i cm e t a b o l i s m t h ea c c u m u l a t i o n so ft pm i g h ta c ta s a n t i o x i d a n ta n dp l a yap a r ti n i n t e g r a t e dm e c h a n i s m so fh e a v ym e t a l s v d e t o x i f i c a t i o n a tt h er a n g eo f0 3 0m gl 。t h e r ew a sn os t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n c e i nt h ee f f e c t so fd i f f e r e n tt r e a t m e n to fh e a v ym e t a l st ot h ec o n t e n t so ft p a tt h e s a m et i m e ，u n d e rt h es a m et r e a t m e n tl e v e l ，n os t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n c ew a s f o u n db e t w e e nc d ，c ua n dz n 6 a tt h er a n g eo f0 3 0m gl 一。t h ef o l i a re x t r a c t a b l ec o n d e n s e dt a n n i n so f a e g i c e r a sc o r n i c u l a t u ms e e d l i n g si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yu pt o l o wl e v e l so f h e a v ym e t a l se x p o s u r ew h i l ea ta b o u t2 0m gl ，t h e i rl e v e l d e c l i n e d d r a s t i c a l l y 7 c d ，c ua n dz nh a dt h es a m ee f f e c t so nt h ef o l i a rp r o t e i n b o u n dc o n d e n s e d t a n n i n s ( p c t ) ：h i g h e rt r e a t m e n tl e v e l s ( 10m gl - 1 ) o fh e a v ym e t a l se n h a n c e d t h ec o n t e n t so ff o l i a rp c to fa e g i c e r a sc o r n i c u l a t u ms e e d l i n g s 8 i nc o m p a r ew i t he x t r a c t a b l ec o n d e n s e dt a n n i n s ( e c t ) a n dp r o t e i n - b o u n d t a n n i n s ( p c t ) ，f i b r e b o u n dc o n d e n s e dt a n n i n s ( f c t ) r e s p o n d e dd i f f e r e n t l yt o h e a v ym e t a l s t h e i rc o n t e n t sd e c l i n e dd r a s t i c a l l yf o l l o w i n gt h ei n c r e a s eo f h e a v ym e t a l st r e a t m e n t s 9 a st h es u mo fe x t r a c t a b l ec o n d e n s e dt a n n i n s ( e c t ) ，p r o t e i n b o u n dt a n n i n s ( p c t ) a n df i b r e - b o u n dc o n d e n s e dt a n n i n s ( f c t ) ，t h ef o l i a rt o t a lc o n d e n s e d t a n n i n s ( t c t ) a c t e di nt h es a m ew a ya st o t a lp h e n o l i c s ( t p ) i nr e s p o n s et o h e a v ym e t a l se x p o s u r e h e a v ym e t a l si n d u c e dt h ec o n c e n t r a t i o n so ff o l i a rt c t i na e g i c e r a sc o r n i c u l a t u ms e e d l i n g s 10 i tw a ss h o w e dt h a th e a v ym e t a l se x p o s u r es i g n i f i c a n t l yc h a n g e dt h e d i s t r i b u t i o n so fe c t , p c ta n df c ti nt c t - u n d e rc d ，c ua n dz ne x p o s u r e ，t h e e c t t c tr a t i ow e r ef o u n dt oi n c r e a s ef o l l o w i n gt h ee x p o s u r et i m e ，w h i l e f c t 厂r c tr a t i od e c l i n e ds i g n i f i c a n t l y , w h i c hs u g g e s t e dt h a th e a v ym e t a l s d i s t u r b e dt h ef o l i a rp h e n o l i cm e t a b o l i s mo fa e g i c e r a sc o r n i c u l a t u ms e e d l i n g s v i a sap a r to ft h ea n t i o x i d a n ts y s t e m ，t h ev a r i e t yo fp h e n o l i c sa n dc o n d e n s e d t a n n i n sm i g h tp l a ya ni m p o r t a n tp a r ti n h e a v ym e t a lt o l e r a n c ei na e g i c e r a s c o r n i c u l a t u ms e e d l i n g s k e y w o r d s ：p h y t o c h e l a t i n s ：p h e n o l i c s ；a e g i c e r a sc o r n i c u l a t u m ；h e a v ym e t a l s v i i 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。 本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明 确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。 声明人( 签名) 军丸永 2 口刃年月f 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保留 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学位论文用 于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的 内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的 学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 保密( ) ，在年解密后适用本授权书。 ， 2 不保密( ) ( 请在以上相应括号内打“4 ”) 作者签名：章友) 耙日期： 勿习年6 月箩日 新签名淞眺7 年 桐花树幼苗植物络合素和植物多酚对重金属的响应 1 前言 1 1 植物的重金属耐性机制 重金属被人为规定为密度大于5 9 c m 3 的金属元素，如c d 、c u 、z n 、p b 、 n i 、c r 、c o 、m o 和h g 等。这些金属大部分分布在地壳中。工业革命以后，随着 人类活动对重金属需求量的增加，大量的重金属元素被释放到生物圈中【1 】。而这 些从地壳中释放到生物圈的重金属，除了一小部分悬浮在空气中以外，大部分都 降落到了水体和土壤环境中。多数植物由于生长在土壤环境中而直接成为与重金 属接触最多也是最亲密的生物。水生植物，尤其是藻类，从某些角度上可以说就 是生长在金属离子溶液里。 和其他生物一样，植物在面对重金属的时候面临着两难的境地。一方面，植 物体内需要一定浓度的金属离子( 例如c u 2 + 和z n 2 + ) 来维持氧化还原电位的稳定、 电子的正常转运、以及各种转录因子和生化酶类功能的正常发挥等。然而另一方 面，植物体内过多的有效态重金属离予会对植物的正常生长和生理代谢产生巨大 的毒害作用，主要表现为氧化胁迫、细胞膜损伤、光合作用和呼吸作用受阻、生 物大分子降解等。例如，细胞内的某些重金属离子( 女h c d 2 + 、p b 2 + 和h 9 2 + ) 不仅 能与众多酶类的活性中心或蛋白质中的巯基结合，还能取代金属蛋白中的必需元 素( n 如c a 2 + 和m 9 2 + ) ，导致生物大分子构象改变、酶活性丧失及必需元素缺乏， 干扰细胞的正常代谢过程【2 1 。另外，重金属能干扰物质在细胞中的运输过程【3 1 ， 并能通过氧化还原反应产生自由基而导致细胞氧化损例4 一j 。 为了适应这样的生存环境，植物一。方面发展出了特殊的吸收机制以保证体内 维持正常代谢所需的重金属离子的水平；另一方面，对于那些植物本身不需要的， 或者可以对植物体造成毒害的重金属，植物体也进化出了相应的耐受机制。这些 重金属耐受机制包括：重金属的吸收和转运作用、区域化作用和重金属的络合作 用、以及通过各利一抗氧化防卫系统清除由重金属胁迫引起的自由基等。 1 1 1 重金属的吸收和转运 土壤中的重金属离子进入植物体内的第一步是根系吸收。金属离子进入根部 的维管束，首先要穿过内皮层以及内层的凯氏带。由于发育完伞的凯氏带是很难 穿越的，因此重金属离子的转运主要经过凯氏带发育未完全的根系幼嫩部分【6 】。 但是现在还不清楚重金属离子转运到维管束的过程。 无论是普通植物或是超累积植物，大部分金属离子都是通过专一或通用的离 桐花树幼苗植物络合素和植物多酚对重金属的响应 子载体( 转运蛋白) 进入根细胞的。转运蛋白对重金属的选择性吸收成为植物适 应重金属胁迫的重要机制之一。近年来，利用分子生物学手段研究植物细胞膜吸 收金属离子已取得了显著的进展，相关金属离子转运器陆续被鉴定分离。铁离子 控制转运器( i r o nr e g u l a t e dt r a n s p o r t e r ，i r t ) 基因i r t l 较早在拟南芥中被克 隆出来，它能修复酿酒酵母f e t 3 1 f e t 4 突变体的缺陷症状。i r t l 表达的酵母菌表 现出很强的f e 2 + 吸收能力，而对f e 3 + 则几乎完全不亲合。除此之外，i r t l 对c d 2 + 、 c 0 2 + 、m n 2 + 和z n 2 + 等的转运能力也较弱同。通过对酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 的吸收缺陷突变型的修复的研究，一系列编码合成金属离子转运器 的c d n a 相继被克隆。比如拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) c o p t l 基因能修复 酿酒酵母的高亲合性c u 吸收缺陷的突变型c t r l - 3 的缺陷症状，被认为可能是c u 转运圳剐。 由于木质部细胞壁具有较强的离子交换能力，可能会导致转运过程中重金属 离子在木质部的滞留，因此在木质部的转运过程中，络合状态的重金属离子应该 比游离的重金属离子更容易运输。w h i t e 等( 19 8 1 ) 【9 j 从理论上测算得出，木质 部组织液中的大部分f e 2 + 、z n 2 + 应该与柠檬酸形成络合物，而c u 2 + 则应该被氨基 酸( a s p 、h i s 等) 结合。植物体内的其他络合物质在重金属离子的转运过程中 也发挥积极的作用。例如植物中广泛存在的烟酰胺能与c u 2 + 、n i 2 + 、c 0 2 + 、z n 2 + 、 f e 2 + 、m n 2 + 等多种重金属离子形成络合物。分析缺失烟酰胺的烟草突变体 ( c h l o r o m e r v a ) 表明烟酰胺在烟草生长期幼苗的z n 2 + 、f e 2 + 、m n 2 + 经由韧皮部 的转运，以及c u 2 + 经由木质部的转运过程中均起重要作用【1 0 1 。 植物通过限制对重金属的吸收和转运，有效地降低体内重金属浓度l 仉12 1 。 例如，蝇子草( s i l e n ev u l g a r i s ) 耐重金属细胞系中，c u 的累积量明显低于重金 属敏感细胞系【1 3 l ：麦瓶草( s c u c u b a l u s ) 耐受c d 细胞系中的c d 含量也明显低 于敏感细胞系中的c d 含量【1 4 】。m e h a r g 等( 1 9 9 4 ) 【1 5 1 报道，绒毛草( h o l c u s l a n a t u s ) 耐a s 品种体内a s 的累积速率远低于敏感品种。之后m e h a r g 等证明耐a s 的绒毛草品种基凶组中有抑制砷酸盐磷酸盐( a r s e n a t e p h o s p h a t e ) 吸收系统的 基因，该基因的表达能有效地降低细胞对a s 3 + 的吸收速率和细胞a s 3 + 的累积速 率，从而减轻a s 对植物的毒性。对c d 具有较强耐性的小麦和玉米品种体内c d 的 积累量较少，而对应的耐性较差品种体内c d 的累积量较多【1 6 】。其他研究发现： 在蝇子草( s i l e n ev u l g r a r i s ) 的耐c d 细胞系中，c d 累积量明显低于敏感细胞系 2 桐花树幼苗植物络合素和植物多酚对重金属的响应 s c u c u b a l u s ，可能的机制是耐性细胞系通过降低c d 向细胞质的运输速率而解毒 【1 7 1 。植物这种限制吸收重金属的机制还需进一步研究。 1 1 2 重金属的区域化作用 植物对进入细胞内的重金属可通过转运和区域化作用，将重金属储存在植物 体的特定部位，以避免细胞中具有重要生物学功能的生物大分子受到重金属的伤 害。研究表明，芥菜( b r a s s i c aj u n c e a ) 的重金属解毒机制之一就是把c d 贮存 在叶片的表皮毛中，其叶片表皮毛中的c d 含量比叶片组织高4 3 倍【1 8 】。o r t i z 等 ( 1 9 9 5 ) f 19 j 的研究表明，在裂殖酵母中，p c c d 复合体是被运输到液泡中储存 的。燕麦( a v e n as a f i v a ) 中也观察到了类似的现象【1 8 1 。 1 1 3 重金属的络合作用 重金属离子通过根系运转器以及其它途径进入植物细胞后，通过络合作用固 定金属离子以降低其生物毒性是植物对细胞内重金属解毒的主要方式。植物中已 经发现的络合物质主要有金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n s ，m t s ) 、植物络合素” ( p h y t o c h e l a t i n s ，p c s ) 、有机酸( o r g a n i ca c i d s ) 以及氨基酸( a m i n oa c i d s ) 等。 m t s 是一种低分子量、富含半胱氨酸残基的金属结合蛋白，通常由6 1 个氨 基酸残基组成，分子量为6 0 0 0 7 0 0 0d a ，半胱氨酸残基约占3 0 左右。m t s 最先是在马肾中发现的一种与c d 解毒相关的金属结合蛋白。19 8 7 年，l a n e 等【2 0 】 从小麦胚胎中发现e c 蛋白，并证明其氨基酸序列与动物体中发现的m t s 一致，从 而证明了植物体中含有m t s ，并将e c 归为第二类m t s 。后来，又陆续从其他植物 如拟南芥、玉米、西红柿和棉花中发现有编码m t s 的基因存在。m t s 蛋白富含c y s 的结构特点决定了它的金属离子络合功能。研究表明，m t s 对多种重金属，如c u 、 z n 、p b 、a g 、h g 、c d 的阳离子都有络合作用【2 1 1 。 植物络合素( p c s ) 是由于重金属离子诱导而在植物体内合成的一类能够络 合重金属离子的小分子多肽，其在植物的重金属耐性机制中的作用将在下面的 1 2 小节详细介绍。 重金属暴露下，植物根系能够分泌出氨基酸和有机酸等低分子有机物。一方 面，这些物质可以与根际中某些游离的重金属离子络合形成稳定的金属络合物复 合体，从而降低土壤中重金属的移动性，同时根系分泌的有机酸和氨基酸类物质 可以吸附、包埋重金属污染物使其在根外沉淀下来，减少重金属对植物的毒害； 桐花树幼苗植物络合素和植物多酚对重金属的响应 另一方面，根系分泌物中大量的有机酸和酚类化合物与某些重金属如f e 3 + 、m n 2 + 、 z n 2 + 形成络合物，增加了这些重金属作为养分离子的有效性，有利于植物吸收利 用，增强植物抵御重金属胁迫等不利环境的能力1 2 2 1 。目前根系分泌的有机酸对重 金属的络合作用已成为重金属耐性研究中的热点。 1 2 植物络合素在重金属耐性中的作用 植物络合素( p h y t o c h e l a t i n s ，p c s ) 的发现是深入了解植物重金属耐性机 理的重要一步。p c s 是一种可以有效地结合重金属离子的富含半胱氨酸的多肽物 质，首先在酵母中发现f 2 3 ，之后在高等植物中发吼【2 4 1 ，随后在藻类中也检测到 了p c s 的存在【2 5 】。 植物络合素具有共同的结构特征( y - g l u c y s ) 门- g l y ，其中n = 2 1 1 ( 图 1 2 1 ) 。按照几数值的不同，植物络合素有许多类型，例女i p c 2 、p c 3 $ 1 p c 4 等 ( 表1 2 1 ) 。植物受到重金属胁迫后，一定量的重金属离子被吸收进入细胞质中， 诱导植物络合素合成酶由非活性状态转变为活性状态，以谷胱甘肽( g s h ) 为 底物，合成植物络合素。已知有多种金属，如n i 、c u 、z n 、a g 、s n 、t e 、v 、 a u 、h g 、p b 、b i 的硝酸盐或硫酸盐或a s 、s e 的阴离子均可诱导p c 的产生【2 7 j 。 图1 2 1 植物络合素的结构式 f i g u r e1 - 2 1s t r u c t u r eo fp c s 4 桐花树幼苗植物络合素和植物多酚对重金属的响应 表1 2 1 已从植物中分离出来的p c s 及其种类( 蔡保松等，2 0 0 3 ) 2 6 】 t a b l e1 2 - 1t y p e so fp c si s o l a t e df r o md i f f e r e n tp l a n ts p e c i e s 1 2 1p c s 的生物合成 与其他一些重金属络合蛋白( 例如金属硫蛋白) 的生物合成不同，p c s 不是 由基因直接编码产生的，而是以g s h 为底物的生物合成的产物( 图1 2 2 ) 。生 物体一开始以g l u 和c y s 为底物，在y 谷氨酰半胱氨酸合成酶( y g l u t a m y l c y s t e i n es y n t h e t a s e ，y e c s ) 的催化作用下，以a t p 为能源，合成y g l u c y s 。 之后，以y g l u c y s 和g l y 为底物，在谷胱甘肽合成酶( g l u t a t n i o ns y n t h e t a s e ， g s ) 的催化作用下，在y g l u c y s 的c 端催化y g l u c y s 与g l y 的链接，合成 桐花树幼苗植物络合素和植物多酚对重金属的响应 g s h 。最后，在植物络合素合成酶的催化作用下，一个g s h 分子的n 端与另一个 g s h 分子的c 端以a - 酰胺键的形式相连接，合成一个p c 2 分子。类似的反应可以 继续下去，相应生成p c 3 、p c 4 和p c 5 ，甚至是更长链的p c n 分子，这已被大量生 理、生化和基因实验所证明。g r i l l 等( 1 9 8 9 ) 【2 9 】的实验证明：在重金属的作用下 p c 合成酶催化如下反应：y - g l u - c y s g l y + ( y - g l u - c y s ) n g l y = ( y g l u c y s ) n + 1 g l y + g l y ，p c 一重金属螯合物的形成促进酶促合成反应，而酶促反 应受到反应产物、g s h 、p c 以及p c 一金属螯合物的调节。r i i e g s e g g e r 和b r u n o l d ( 1 9 9 2 ) 3 0 】的实验表明：金属离子诱导激活y 谷氨酰( 基) 半胱氨酸转二肽酶 ( 简称p c 合成酶) ，同时细胞质中g s h 减少，重金属一p c 螯合物合成并积累。 j _ o o o o o o o o o o o o o o o o o 、 【c y s t e i n e c y s ) j 1 - _ _ _ _ - _ _ - - _ _ - - - - _ - _ - - _ _ _ _ ， j 谭c s y n t h e 娩 【y - g l u t a m y l c y s t e i n e ( y e c ) ) 、 g s h s y n t h e t a s e p ce y n t h a s e s y n t h a s e 图1 - 2 2p c s 的合成途径( h i r a t a ，2 0 0 1 ) 【2 8 l f i g u r e1 - 2 2b i o s y n t h e t i cp a t h w a yo fp h y t o c h e l a t i n e s 1 _ 2 2p c s 基因及其分子生物学基础 虽然早在19 8 9 年，g r i l l 掣2 9 1 就已经得到部分纯化的p c s ，但直到19 9 9 年 p c s 基因才分别从拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 、裂殖酵母 6 桐花树幼苗植物络合素和植物多酚对重金属的响应 ( s c h i z o s a c c h