（植物学专业论文）多基因型种群育种的遗传多样性基础研究.pdf

吴秋花：多基因型种群育种的遗传多样性基础研究 目录 y 1818 1 芝d 摘要5 a b s t r a c t 7 缩略词表9 第一部分文献综述10 1 水稻遗传多样性的研究1o 1 1 生物多样性和遗传多样性的概念1 0 1 2 遗传多样性的检测1 l 1 2 1形态标记1 l 1 2 2细胞标记ll 1 2 3生化标记12 1 2 4分子标记12 1 3 微卫星标记14 1 3 1水稻中的微卫星标汜1 4 1 3 2 水稻染色体己开发的s s r 标记15 1 3 3s s r 在遗传育种中的应用16 1 4遗传多样性的度量16 2 水稻遗传多样性育种18 2 1水稻遗传多样性育种的研究背景1 8 2 2遗传多样性育种思路19 2 3研究目的和研究意义2 2 2 3 1 遗传多样性育种的重要性2 2 2 3 2分子标记辅助育种与水稻品质改良2 3 第二部分用s s r 分子标记分析水稻遗传多样性育种2 4 一 谪f言241 2 4 月u 舌 2 材料和方法2 4 2 1 材料2 4 2 &j1 华南师范大学硕士研究生毕业论文 2 2 实验方法2 5 2 3 主要仪器设备2 6 3结果与分析2 7 3 1数据的筛选2 7 3 2 s s r 标记分析结果2 8 3 2 1等位基因结果分析2 8 3 2 2多态信息含量结果分析。3 6 4 讨论41 第三部分抽穗期和株高性状与s s r 分子标记的相关分析4 3 一 青f言431日u 舀 2 材料与方法4 3 2 1 实验材料。4 3 2 2实验方法。4 3 3结果与分析4 5 3 i亲本材料及遗传多样性育种后代抽穗期和成熟期株高性状分 ；f f i 4 5 3 2亲本和基础群体中不同抽穗期等位基因频率的分布4 7 3 2 1亲本及基础群体中抽穗期与亲本一致的等位基因频率的分 ；f i 亍4 7 3 2 2基础群体中不同抽穗期的株系等位基因频率的分布5 6 3 2 3基础群体中不同抽穗期等位基因频率发生偏移的等位基因聚 类分析6 5 3 2 44 0 个与抽穗期相关的等位基因与抽穗期q t l 的关系6 9 3 3亲本及基础群体中不同株高等位基因频率分布7 0 3 3 i亲本及基础群体中与亲本株高一致株系的等位基因频率分 布7 2 3 3 2 基础群体中不同株高等位基因频率的分布7 8 嘉， j 吴秋花：多基因型种群育种的遗传多样性基础研究 3 3 3基础群体超亲株高的株系的等位基因频率发生偏移的等位基 因聚类分析8 2 3 3 45 1 个与株高相关的等位基因与株高q t l 的关系8 5 4讨论8 7 第四部分直链淀粉含量与s s r 分子标记的相关分析8 9 1 前占8 9 2材料与方法8 9 2 1材料8 9 2 2 方法9 0 3结果与分析9 0 3 1亲本及遗传多样性育种后代直链淀粉含量分析9 0 3 2亲本及遗传多样性育种后代直链淀粉含量与s s r 标记的相关分 析9l 3 2 1亲本及基础群体中不同直链淀粉含量的株系的等位基因频率 的分布91 3 2 2用5 7 个等位基因对亲本及基础群体进行聚类分析9 9 4 讨论10 3 总结10 5 参考文献10 6 附录a试剂的配制112 附录b5 2 对引物相关信息11 4 附录c实验材料的抽穗期和株高性状分布1 18 附录d亲本及基础群体的直链淀粉含量1 2 2 附录es s r 电泳图版1 2 5 附录f攻读硕士期间发表的论文12 6 致谢1 2 7 4 华南师范大学硕：卜研究生毕业论文 摘要 本研究以水稻多基因型种群( 遗传多样性) 育种材料的11 个亲本、 遗传多样性育种后代基础群体样本( 是亲本组经过叠加式杂交创造的 重组基因型稳定后代的代表样本，a 1 a 2 1 4 ) 和在这个群体中选取出来 的集成稻( h b j t l 6 ，“多基因型种群品种”是基础群体中选出的符合 品种表现型一致性特性的3 0 个不同的基因型) 为研究对象，应用了 5 2 对s s r 分子标记对多基因型种群育种进行遗传多样性的研究，并结 合田问性状和品质性状，分别进行了抽穗期和s s r 分子标记、株高和 s s r 分子标记、直链淀粉含量和s s r 分子标记的相关性分析。研究结 果如下： 5 2 个s s r 位点中，每个位点可检测到2 - 6 个等位基因，亲本组、 基础群体样本和集成稻一共检测到18 4 个等位基因，其中亲本组的等 位基因数为16 5 ，基础群体的等位基因数为l7 9 ，集成稻的等位基因数 12 8 。结果表明，基础群体比亲本组具有更丰富的遗传变异，这与多亲 本杂交，充分重组产生尽可能丰富的变异类型的多基因型种群育种( 遗 传多样性育种) 体系的初衷相吻合，而集成稻的遗传变异则比亲本和基 础群体都要小，因为集成稻是基础群体的一部分，部分小于总体，是 合理的结果，但集成稻的基因型比单基因型品种增加了3 0 倍，其多样 性也随之增加。对三个群体的多态信息含量p i c ( p o l y m o r p h i e i n f o r m a t i o nc o n t e n t ) 值进行显著性检验，结果表明，亲本与基础群体 的p i c 值没有显著差别，因此我们可以说基础群体在分子水平上很好 的保持了亲本的遗传多样性。综合各种参数( 等位基因数、等位基因 频率、p i c 值) 表明，水稻遗传多样性育种不但可以创造出更多的遗 传变异、很好的保持亲本的遗传多样性，而且在集成稻( 多基因型种 群品种与单基因型品种比较) 以成倍的速度恢复农业生产系统多样性。 结合田间表型数据，以亲本的为参照，分别分析了s s r 标记与抽 穗期和株高的相关关系。研究结果发现，5 2 个位点的l8 3 个等位基因 中有4 0 个等位基因与抽穗期基因相关，有51 个等位基因与株高基因 相关，与ir 6 4 a z ud hq t l 图谱的抽穗期和株高q t l 对比发现，这些 等位基因在相关农艺性状的q t l 之内或者是与相关农艺性状的q t l 存 在连锁关系。 此外，还对直链淀粉含量和s s r 分子标记进行了相关分析，研究 结果发现，5 2 个位点的1 8 3 个等位基因中有5 7 个等位基因与淀粉合成 的基因相关，这些等位基因中包含了已经证实的与淀粉合成相关的 s s r 分子标记r m l 9 0 a 、r m l 9 0 b 、r m l 9 7 a 、r m l 9 7 b ，进一步证实 了这种分析方法的可行性和可靠性。 关键词：水稻遗传多样性育种 s s r抽穗期株高 直链淀粉含量相关分析 6 一 一 一 华南师范大学硕士研究生毕业论文 a b s t r a c t ： f i f t y - t w os s rp r i m e r si nr i c ew e r eu s e dt od e t e c tg e n e t i cd i v e r s i t y a m o n gp a r e n t a lp o p u l a t i o n ，t h e i rp r o g e n yo fas t e a d yr e c o m b i n e d g e n o t y p ef o u n d a t i o n a lp o p u l a t i o na 1 一a 214w h i c hc r e a t e db ys u p e r p o s e d h y b r i d ，a n dh b j t 16p o p u l a t i o nw i t hi d e n t i c a la g r i c u l t u r a lp h e n o t y p eb u t d i f f e r e n tg e n o t y p ec h o s e df r o ma1 - a 214p o p u l a t i o n m e a n w h i l e ，t ot a k e i n t oa c c o u n ta g r i c u l t u r a la n dq u a l i t yp r o p e r t i e s ，t h er e l a t i v i t i e sb e t w e e n h e a d i n gd a t ea n ds s rm a r k e r ，p l a n th e i g h ta n ds s rm a r k e r ，a m y l o s e c o n t e n ta n ds s rm a r k e rh a v eb e e na n a l y s e dr e s p e c t i v e l y t o t a l l y18 4a l l e l e sw a sd e t e c t e dw i t har a n g ef r o mt w ot os i xa l l e l e s a te a c hl o c i i np a r e n t a lp o p u l a t i o n ，al a 214p o p u l a t i o na n dh b j t16 p o p u l a t i o n t h ea l l e l en u m b e ro fp a r e n t a lp o p u l a t i o nw a s1 6 5 ，a 1 - a 2 1 4 p o p u l a t i o nw a s17 9a n dh b j t 16 p o p u l a t i o nw a s12 8 c o m p a r e dw i t h p a r e n t a lp o p u l a t i o n ，t h ev a r i a t i o no fa 1 一a 214p o p u l a t i o nw a sm o r e a b u n d a n tt h a nt h a to fh b j t16p o p u l a t i o n t h i sw a si na c c o r dw i t h m u l t i g e n o t y p e c o l o n y b r e e d i n g ( g e n e t i c - d i v e r s i t y b r e e d i n g ) p r o j e c tf o r h b j t l 6w a sp a r to fa 1 - a 2 1 4 t h o u g ht h ev a r i a t i o no fh b j t l 6i sl e s s t h a nt h a to fp a r e n t a lp o p u l a t i o na n da 1 一a 214p o p u l a t i o n ，t h eg e n e t i c d i v e r s i t y o fh b j t16h a v e i n c r e a s e d30t i m e sb yt h e c o m p a r i s o no f s i n g l e g e n o t y p eb r e e d a n a l y s i so fv a r i a n c e ( a n o v a )a m o n gp i cv a l u e s o fp a r e n a l p o p u l a t i o n ，a 1 一a 214p o p u l a t i o na n dh b j t16p o p u l a t i o n i n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sl i t t l ed i f f e r e n c eb e t w e e np i cv a l u e so fp a r e n a l p o p u l a t i o na n da 1 - a 2 1 4p o p u l a t i o n ，w h i c hs u g g e s t e d t h a ta 1 - a 2 1 4 p o p u l a t i o nh o l dp a r e n t s g e n e t i cd i v e r s i t y f i n a l l y ，w er e a c h e dt h e c o n c l u s i o nt h a tr i c e g e n e t i c - d i v e r s i t y - b r e e d i n gn oo n l yc r e a t e dal o to f v a r i a t i o na n dk e p tp a r e n t s g e n e t i cd i v e r s i yi na1 - a 214p o p u l a t i o n ，b u t a l s od o u b l er e n e w e dt h ed i v e r s i t yo fa g r i c u l t u r ep r o d u c t i o ns y s t e m c o m p a r e dw i t hs i n g l e g e n o t y p eb r e e d 7 i 吴秋花：多基冈型种群育种的遗传多样性基础研究 a c c o r d i n gt oa g r i c u l t u r a lp h e n o t y p e ，t h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nh e a d i n g d a t ea n ds s rm a r k e r ，p l a n th e i g h ta n ds s rm a r k e rw e r e a n a l y z e d r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew e r e4 0a l l e l e sw e r er e l a t e dt o h e a d i n gd a t eg e n e ，a n d51 a l l e l e sw e r er e l a t e dt op l a n th e i g h tg e n e c o m p a r e dw i t ht h em a po fi r 6 4 a z ud hq t l ，t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a t t h e s ea l l e l e ss h o u l d b ep a r to fq t ll o c io fc o r r e l a t i v ea g r i c u l t u r a l p r o p e r t i e s ，o rc o s e g r e g a t i o nw i t hq t ll o c i o fc o r r e l a t i v ea g r i c u l t u r a l p r o p e r t i e s i na d d i t i o n ，t h ec o r r e l a t i o nb e t w e e na m y l o s ec o n t e n ta n ds s rm a r k e r h a v eb e e na n a l y s e d ，a n dt h er e s u l ti n d ic a t e dt h a tt h e r ew e r e5 7a l l e l e s r e l a t e dt og e n e sf o rs t a r c hs y n t h a s e r m l 9 0 a 、r m l 9 0 b 、r m l 9 7 a 、 r ml9 7 b ，w h i c hw e r ec o n f i r m e dh a v er e l a t e dt og e n e sf o rs t a r c h s y n t h a s e w e r ec o n t a i n e di nt h e ms t r o n g l y s u g g e s t e d t h a tt h e f e a s i b i l i t ya n dd e p e n d a b il i t yo ft h er e l a t e da n a l y s i sm e t h o d k e yw o r d s ：r i c e g e n e t i c - d i v e r s i t y b r e e d i n g s s r h e a d i n gd a t e p l a n th eig h ta m y l o s ec o n t e n t c o r r e l a t i o na n a l y s i s 8 7 4 华南师范大学硕十研究生毕业论文 缩略词表a b b r e v i a t i o n s 9 吴秋花：多基因型种群育种的遗传多样性基础研究 第一部分文献综述 1水稻遗传多样性的研究 1 1生物多样性和遗传多样性的概念 生物多样性是地球上全部陆地、海洋和其他水域的动物、植物、 微生物、它们所拥有的基因，以及它们与生存环境形成的生态系统的 总称( 陈灵芝，19 9 3 ) 。生物多样性是一个描述自然界多样化的、内容 广泛的概念，其研究对象包括基因、细胞、种群、物种、群落，乃至 生态系统、景观等多个层次和水平。其中研究较多主要有基因( 遗传) 多样性、物种多样性、生态系统多样性和景观多样性( 马克平，l9 9 3 ； b a r b i e r ，b u r g e s se ta l ，1 9 9 4 ) 四个水平。 遗传多样性是种内不同群体之间或一个群体内不同个体遗传变异 的总和。广义地说，遗传多样性是生物物种的基因中蕴藏的遗传信息 的总和。任何一个物种都具有独特的基因库和遗传结构，同时在不同 的个体间往往也存在着丰富的遗传变异，一般说遗传多样性是指种内 的多样性，即种内的遗传变异( 马克平，19 9 3 ) 。遗传多样性是其他一 切多样性的基础和最重要的成分( b a r b i e re ta l ，19 9 4 ；s p i e s s 19 8 9 ； h a r t le ta l ，1 9 8 9 ：i n g r o u i l l e ，1 9 9 2 ) 。 一个物种或群体的进化潜力和抵御不良环境的能力既取决于种内 遗传变异的大小，也有赖于遗传变异的群体结构。一个物种或群体遗 传多样性越大或遗传变异越丰富，对环境变化的适应能力就越强，越 容易扩展其分布范围和丌拓新的环境。物种或群体中遗传变异的大小 与进化的快慢成正比。一个种群没有遗传多样性就不能进化，也无法 适应其生存环境的变化。由于人类活动的影响，环境正在全球尺度上 发生变化，很多物种将不得不适应这一变化或承受更大灭绝机会的考 验。遗传多样性对物种和群落多样性有决定性作用，因为，物种能使谱 系发展，而进化能力的维持却要靠遗传多样性的存在，物种多样性来自 l o 华南师范大学硕十研究生毕业论文 于进化时间内的遗传多样性( t e m p l e t o n ，19 9 6 ) 。 1 2 遗传多样性的检测 早期研究遗传多样性主要是在形态和染色体水平上，主要检测不 易受环境影响的质量性状。到6 0 年代中期应用凝胶电泳发现蛋白质和 酶具有更丰富的多态现象，从此栽培和野生植物遗传多样性的研究得 到空前的发展。同工酶，尤其是等位基因编码的等位酶一般表现为互 显性遗传，不仅可用于质量性状，而且也适于数量性状的研究。遗传 多样性在理论上应该是d n a 碱基序列的多样性。7 0 年代中发明用限 制性片段长度多态性( r f l p ) 分析d n a 序列的多样性( a v i s ee ta l ， 19 7 9 ) ，证明d n a 比蛋白质多样性水平更高。8 0 年代中发明聚合酶链 式反应( p c r ) ，能快速检测d n a 多样性。随后遗传多样性研究发展更 快，并由r f l p 和p c r 派生出许多新的检测方法。总的来说，遗传多 样性的检测可以从形态学水平、染色体水平和分子水平上来进行，遗 传标记主要分为形态标记、细胞标记、生化标记、分子标记四种类型。 1 2 1形态标记 形态学标记主要以直观的可以进行比较的描述为主，包括植物学 特征、器官构造、发育规律、地理分布和生态环境等。形态标记狭义 上指的是生物特定的肉眼可见的外部特征特性，如植株的株高、叶形、 果实的颜色等。由于这种标记简单、直观，长期以来作物种质鉴定及 育种材料的选择通常都是以形态学标记来进行的，但是在育种工作中 要获得具有特定形态特征的材料，所需时间长，而且多态性比较少， 遗传表达不太稳定，易受环境及显隐性基因的影响。 1 2 2细胞标记 细胞学标记建立在细胞变异的基础上，主要包括染色体变异和细胞 亚显微结构的变异，染色体变异是产生遗传变异的来源之一，主要体 现为染色体组型特征的变异，包括染色体数目变异及染色体结构变异， 染色体结构上的倒位、缺失、重复、异位是构成染色体多态现象的重 要因素，同时，染色体水平上的多态性还可体现在染色体的形态( 着丝 吴秋花：多基因型种群育种的遗传多样性基础研究 点位置) 、缢痕和随体等核型特征上。随着染色体研究技术的发展，细 胞标汜包括染色体组型分析，核型分析，带型分析及细胞原位杂交方 法。利用细胞标记，科学家就可以宏观鉴别物种的分类及核型的演化， 但是，这种标记的数目非常有限，限制了它在农业上的应用。 1 2 3生化标记 生化标记指某一生物个体不同于另一个体的生理生化反应指标和 参数或其他变化特征。6 0 年代初出现了同工酶标记，从蛋白质水平来 反映生物的遗传变异。 同工酶分析是现代植物分类、起源和作物遗传育种研究的有效手 段之一，它是指功能相同而结构不同的酶，可能由同一基因座编码， 也有可能由不同基因座编码，理想的同工酶标记应该是由同一基因座 位编码的不同结构的酶，常称之为等位酶标记。水稻同功酶的研究始 于6 0 年代，8 0 年代中期达到高峰，孙新立等( 19 9 6 ) 建立了一套适合 水稻的同功酶聚丙烯酰胺凝胶电泳分析方法，能够较好的鉴别水稻不 同类型材料。 同工酶标记的基本原理是根据电荷性质的差异，通过蛋白质电泳 或色谱技术和专门的染色反应显示出同工酶的不同形式，从而鉴别不 同的基因型。由于其经济方便，易于操作，受到广泛的应用，特别在 品种质量和纯度鉴定以及动植物群体遗传结构研究中的应用最广 ( b r o w n ，1 9 8 3 ) ，但是实验结果随生物的不同发育时期，不同器官以及 环境而变化，可以利用的遗传位点数量比较少，对电泳分析的样品要 求较高。并且蛋白质凝胶电泳所表现的是基因的产物而并不是基因本 身，因此必须正确判断哪些带型代表等位基因，哪些带型代表一个基 因位点，才能进行遗传学的统计分析( 邱芳等，1 9 9 8 ) 。 1 2 4分子标记 8 0 年代以来，随着分子生物学技术的发展，产生了一类重要的遗 传标记，即以直接检测d n a 分子碱基序列变异为基础的分子标记。分 子标记直接以d n a 的形式表现，不受季节、环境的限制，不存在表达 1 2 华南师范大学硕士研究生毕业论文 与否的问题；数量多，几乎遍及整个基因组：多态性高；并且大多数 分子标记表现为共显性，能够鉴别出纯合基凶型和杂合基因型，提供 完整的遗传信息。因此分子标记出现以后，研究人员更多地是通过分 子标记从d n a 水平上检测个体间遗传多态性和物种的相关性。 分子标记主要有以下几种：r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ) ，r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a s ) ， a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 、s t s ( s e q u e n c e t a g g e d s i t e ) 和s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 等。 由于分子标记有其独特的优点，可以不受时间、地理位置的影响， 比传统的方法更能反应品种间的多样性，它在作物遗传改良中是一种 非常有效的方法，有助于培育出具有高产潜力的新品种。分子标记辅 助育种是一项有发展潜力的育种辅助新技术，与我国丰富的传统育种 经验相结合，有助于突破常规育种的局限性，育成高产、优质、多抗 的新品种。此外分子标记在品种纯度检测、杂种优势预测、分析育种 材料系谱及亲缘关系和构建品种指纹图谱等方面也得到了广泛应用。 ( 1 ) r f l p ( 限制性片断长度多态性) ：是指用限制性内切酶酶切 不同个体基因组d n a 后，含同源序列的酶切片断在长度上的差异。差 异的显示和检测是用克隆的d n a 片断作为同源序列探针( 即r f l p 标 记) 进行分子杂交，再通过放射自显影( 或非同位素技术) 实现的。 ( 2 ) r a p d ( 随机扩增多态性d n a ) ：在p c r 技术的基础上，w i l l i a n s ( 19 9 0 ) 和w e l s h 、m ec l e l l a n d ( 19 9 0 ) 采用随机核苷酸序列为引物扩 增基因组d n a 的随机片断，获得了一种新的分子标记，即r a p d 。因 此r a p d 标记就是用随机序列组成的寡核苷酸为引物，通过专门的 p c r 反应扩增获得的长度不同的多态性d n a 片断。 ( 3 ) a f l p ( 扩增片断长度多态性) ：是l9 9 3 年，z a b e a um a r e 和 v o sp i c t 发明创建的一种d n a 分子标记技术。其原理是d n a 多聚酶 在催化d n a 复制时需要一小段核苷酸序列作为引物，由于不同物种或 不同品种中的基因组d n a 序列差异很大，在复制特定的d n a 序列时 吴秋花：多基因型种群育种的遗传多样性基础研究 所需引物的核苷酸序列也不相同，因而在不同品种间可扩增出特定的 d n a 谱带。 ( 4 ) s t s ( 序列标记位点) ：它是由一段长度为2 0 0 5 0 0 b p 的序列 所界定的位点，在基因组中只出现一次。基因组任何多态性的标记都 可以作为基因组的界标转变为s t s 标记，前提是测定长度适合的单拷 贝片断的两端序列，设计一对专一扩增的引物( 2 0 个核苷酸左右) ，用 p c r 方法显示s t s 的特异片断。 其中r f l p 需要探针，又要做放射性标记；r a p d 每个标记提供的 信息量少，受反应条件的影响较大，稳定性不高；a f l p 稳定性高，多 态性好，不过这种分子标记费用比较大，而且对于实验室设备和操作 人员的技术要求比较高，所以其应用也受到一些限制；s t s 的开发依 赖于测序，目前为止，所开发的数量非常有限；s s r 简单方便，以目 的基因组d n a 的序列信息为基础，己被广泛应用。 ( 5 )s s r 分子标记 微卫星( m i c r o s a t e l l i t e ) 又称简单序列重复( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ， s s r ) ，或称短串联重复( s h o r tt a n d e mr e p e a t ，s t r ) 。这是一类由几个核 苷酸( 一般2 4 个) 为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序 列。这些串联重复序列由于重复次数的不同而造成序列长度的多态性， 因此称之为简单序列长度多态性( s i m p l es e q u e n c el e n g t hp o l y m o r p h i s m ，s s l p ) 。s s r 是共显性的一类遗传标记，符合孟德尔式的分离和遗传， 每个s s r 序列在不同基因型间差异大，具有座位多态性，每个s s r 座 位两侧一般是相对保守的多拷贝序列，即s s r 两侧序列在同一物种内 高度保守，据此设计一对特异性引物来扩增s s r 序列，在经聚丙烯酰 胺凝胶电泳，染色，通过比较谱带的相对迁移距离来分辨不同个体的 s s r 。利用银染技术取代传统的放射性标记提供了一种快速、敏感、低 成本的显影手段，使微卫星的应用更加简单快捷。 1 3 微卫星标记 1 3 1水稻中的微卫星标记 1 4 华南师范大学硕士研究生毕业论文 水稻是单子叶植物，其微卫星的频率相对较低，p a n a u d ( 19 9 5 ) 对 水稻基因组中各类微卫星的频率进行了研究。研究结果表明，在水稻 基因组中最丰富的微卫星是( g a ) n 和( g t ) n 。在长4 5 0 m b 的水稻基因组 中，这两类微卫星的总和约为2 6 0 0 。以三个、四个核苷酸为重复单位 的微卫星虽然比以双核苷酸为重复单位的微卫星的频率低，但此类微 卫星的碱基组合类型较多，其总和高达2 7 0 0 ，比( g a ) n 和( g t ) n 的总 和还要多。研究还表明，微卫星在编码区与非编码区之间出现的频率 没有显著的差异，微卫星是随机分布于染色体上的。粗略估计，在水 稻基因组中大约有5 7 0 0 10 0 0 0 个微卫星( m c c o u c he ta l ，19 9 7 ) 。 栽培稻中微卫星标记等位基因的丰富性为多个实验证实( p a n a u de t a l ，1 9 9 6 ；w ue ta l ，19 9 3 ) 。这些独立的研究表明，在栽培稻中每个 微卫星座位的等位基因数为2 2 5 个( m c c o u c he ta l ，1 9 9 7 ) 。微卫星 的p i c ( p o l y m o r p h i ci n f o r m a t i o nc o n t e n t 多态信息含量) 值高达0 6 9 ， 通过计算微卫星标记的p i c 值既可以算出给定座位的多态性数量，又 可以检测到各个种质中各等位基因的频率( a n d e r s o ne ta l ，l9 9 3 ； b o t s t e i ne ta l ，l9 8 0 ) ，因此这是一类信息含量很高的特殊分子标记。 y a n g 等( 19 9 4 ) 也报道每个座位中s s r 等位基因数量与目标微卫星 d n a 内简单重复序列的数量的重要关联，因而在鉴别亲缘关系十分相 近的材料时是一种十分有用的工具。一些研究还表明微卫星标记在各 稻属近源野生种中可以得到可靠的扩增( p a n a u de ta l ，19 9 6 ) ，因而 可以用于种间杂交的分析。 1 3 2 水稻染色体已开发的s s r 标记 水稻基因组蕴藏着及其丰富的s s r ，s y n g e n t a 公司的测序结果 ( s t e p h e ne ta l ，2 0 0 2 ) 发现在粳稻基因组中存在约4 万个以2 个、3 个、 4 个核苷酸为基序的s s r ；我国华大公司的测序结果表明在籼稻9 31 1 基因组中则分布着约1 7 的s s r ( j u ny ue ta l ，2 0 0 2 ) 。目前，康奈尔 大学等根据m o n s a n t or ic eg e n o m e ( m r g ) 测序公布的6 6 5 5 个含s s r 的序列，已经设计了水稻的2 4 14 对二、三、四核苷酸的引物，此2 4 l2 吴秋仡：多基因型种群育种的遗传多样性基础研究 对引物代表了2 2 4 0 个独一无二的s s r 标记位点( s u s a ne ta l ，2 0 0 2 ) ， 与先前所报道( m e c o u c he ta l ，2 0 01 ) 的5 0 0 个s s r 标记结合起来， 此次的报道使水稻的s s r 标记增加到了2 7 4 0 个，大约每15 7 k b 一个 s s r 标记。熊立仲等( 19 9 8 ) 定位了2 8 个微卫星标记，a k a g i 等( 19 9 6 ) 在水稻基因库中的117 9 8 个序列中发现了3 6 9 个完整的微卫星标记， 其中分布于a s o m i n o r i ( 粳稻) 和i r 2 4 ( 籼稻) 上的2 8 ( 0 s r l 0 s r 2 8 ) 个多态性标记已正确地绘制于水稻基因和微卫星图谱上。因此，已经 成功绘制于水稻微卫星图谱上的标记将近有3 0 0 0 个，并且这些微卫星 标记随机分布于水稻染色体上，在水稻中开发出来的简单重复序列长 度多态性( s s l p ) 已足够应用于基因型的鉴定、基因、数量性状位点 ( q t l ) 分析、大片断文库插入的筛选和分子标记选择辅助育种。 1 3 3s s r 在遗传育种中的应用 长期以来，水稻育种专家对水稻品种的选育和利用都是通过对一定 的重要性状如产量、品质、抗性等进行选择来达到目的。目前微卫星 在水稻基因组中的覆盖水平足以进行品种鉴定、种质保存和利用、主 基因和q t l 的分析，以及系谱分析和标记辅助选择育种。微卫星标记 在水稻主基因和q t l 定位中的应用已有若干报道。利用s s r 与特定功 能基因的高度连锁性，进行分子标记辅助选择( d n am a r k e ra s s i s t e d s e l e c t i o n ，m a s ) ，可以提高育种的选择效率，加快育种速度。 1 4 遗传多样性的度量 遗传变异可以在各种水平上测量，高等生物基因组( g e n o m e ) 包含有 4 ，0 0 0 到5 0 ，0 0 0 个结构性基因位点。因此，为了测定一个物种或种群 样本的基因变异的确切数值，必须研究所有的位点，然而这是不可能 的，所以只能选择少量的基因去估测全部基因变异。由于基因多态程 度随基因位点而变化，所以我们必须随机选择一些基因位点，然后做 这些位点的等位基因频率和多样性分析。 某一种群的特定等位基因频率叫基因频率或等位基因频率。等位 基因频率是基因多样性研究的基本参数，种群基因变化由其频率变化 1 6 华南师范大学硕士研究生毕业论文 来描述。考虑一个基因位点有二个等位基因a 1 和a 2 ，双倍体种群等 位基因位点上有三种可能的基因型：如a 1a l ，a 1a 2 和a 2 a 2 。让n1l ， n 1 2 和n 2 2 分别代表a la l ，a 1 a 2 和a 2 a 2 的数量，且 n l l + n 1 2 + n 2 2 = n 。a 1a l ，a 1a 2 和a 2 a 2 的相对频率分别是x ll = n 11 n ，x 12 = n 12 n 和x 2 2 = n 2 2 n 。a 1 基因频率或等位基因率为：x i = ( 2 n 1l + n 1 2 ) ( 2 n ) = x 11 + x 12 2 ；显然a 2 的基因频率是x i i = 1 一x i 。 基因( 遗传) 多样性，基因多样性也叫异合子性，它的度量不依 赖于多型性的主观定义，而是根据基因频率。首先考察一随机交配的 种群，让x i 代表一个位点上第i 个等位基因种群频率，这个位点上的 异合子性( h ) 被定义为：h = l 一x i2 ( i = l m ) 。m 是等位基因数，平均 异合子性即基因( 遗传) 多样性( h ) 则是所有基因位点的平均值，也等于 一个随机抽取个体异合子等位基因的期望比例，它有明确的生物学意 义。我们可以认为从一个种群选出来的两个随机交配的基因概率是不 同的，这个概率等于随机交配二倍体种群的异合子性，且可定义为基 因频率或异合子性，n e i ( 19 8 7 ) 将此值称为基因( 遗传) 多样性，认为这 个简单的遗传变异的度量指标可用于单倍体、二倍体和多倍体等任何 有机体，不管是否随机交配或无性繁殖。 指数的统计方法如下： ( 1 ) 多态位点百分数p ：p = 多态位点数总位点数。 ( 2 ) 平均每个位点的等位基因数a ：a = a i n ( a i ，第i 个位点上的 等位基因数；n ，所测定位点的总数) ，即各位点等位基因之和除以所 测定位点的总数。 ( 3 ) 等位基因的频率( n e ie ta l ，2 0 0 2 ) ：x i = x i i + l 2 x i j ( j i ，即表 示除i 勺外，对x i j 在j 取不同值时的总和) ，x i 表示第i 个等位基因 的频率，x i i 表示基因型x i x i 的频率，x i j 表示基因型x i x j 的频率。 ( 4 ) 基因多样性( g e n ed i v e r s i t y ) 一个座位上的基因多样性统计方法 为( 庞广昌等，1 9 9 1 ；n e ie ta l ，1 9 7 3 ) ：h i = l - x i 2 或h = n ( n 1 ) ( 1 一 x i 2 1 。x i ，为某一座位第i 个等位基因片段在电泳或杂交分析中出现的 1 7 吴秋花：多基因型种群育种的遗传多样性基础研究 频率；n 为等位基因的数目。 ( 5 ) 平均基因多样性指数为( n e i ，l9 7 5 ) ：h = i l h i ，l ，为实