（特种经济动物饲养专业论文）家蚕SCPxSCP2基因的克隆和表达分析.pdf

家蚕s c p x s c p 2 基因的克隆和表达分析 特种经济动物饲养专业硕士研究生龚竞 指导教师朱勇教授 ( 摘要) 胆固醇是昆虫细胞膜成分，同时，更主要的作用是作为蜕皮激素的前体。由于昆虫体内 缺少2 种关键性的合成酶昆虫不能通过自身从头合成胆固醇。事实上，昆虫主要依赖食物 中的胆固醇来满足生长，发育和繁殖的需要。中肠是吸收转化胆固醇的主要部位，然后通过 血淋巴中的脂蛋白，运送到前胸腺转化利用；或是运送到脂肪体以自由的胆固醇和胆固醇酯 储存起来。因而，昆虫胆固醇代谢研究的重点集中在胆固醇代谢运输系统。 s c p 2 蛋白是动物中广泛存在的脂质转运蛋白。哺乳动物中s c p x p r o s c p 2 基因是一个融 合基因，其中s c p 2 蛋白的主要功能是参与胆固醇和脂肪酸的代谢，在细胞内运输胆固醇及脂 类。s c p 2 能将细胞中的类固醇物质运载到线粒体，形成类固醇激素，如昆虫的蜕皮激素；吸 收自由的胆周醇形成细胞膜等。 本研究首先对家蚕s c p x s c p 2 基因进行生物信息学分析，预测了这个基因核酸、m r n a 、 和蛋白质情况：利用r t p c r ，克隆了这个基因并调查该基因在不同组织、不同时期的表达情 况；最后，通过p e t 表达系统将家蚕s c p x 蛋白和s c p 2 蛋白进行体外表达，为以后的功能研 究奠定基础。 以棉铃虫s c p x 基因为参照，经过生物信息学分析，在家蚕基因组中找到了家蚕的 s c p x s c p 2 基因绸序列，氏为8 9 0 2b p 。基于基因结构预测，推测家蚕s c p x s c p 2 基因有2 个编码区1 个内含子。用d n a s t a r 软件将e s t 进行拼接，结果得到2 个c o n t i g s 。将家蚕的 b m s c p x b m s c p 2 基因在c d n a 水平进行克隆、测序和分析，得到了家蚕b m s c p x s c p 2 的编 码区完整的序列。通过分析发现，该基因存在两种拼接形式，即b m s c p x 和b m s c p 2 两种的 m r n a 形式。其中，b m s c p x 眭2 1 6 5n t ，b m s c p 2 长1 0 3 5n t 。经过实验验证，发现b m s c p x s c p 2 基因的确有选择性拼接形式的存在，其中b m s c p 2 这种形式缺少了编码硫解酶结构域的区段 的序列。 b m s c p x 蛋白由5 3 6 个氨基酸组成，b m s c p 2 蛋白由1 4 6 个氨基酸组成。在线工具预测， 发现b m s c p x 蛋白包含硫解酶。n ，硫解酶- c 和s c p 2 结构域。b m s c p 2 蛋自只含有s c p 2 结构 域。b m s c p x 和b m s c p 2 蛋白质的分子量、等电点分别是5 78 k d 、1 62 k d 和6 5 4 、9 2 2 。使 用b l a s t 软件分析发现b m s c p x 蛋白与棉铃虫s c p x 蛋白有8 8 同源性和9 4 相似性。与 果蝇s c p x 蛋白有6 4 同源性和7 9 相似性。按蚊s c p x 蛋白6 5 同源性和7 6 相似性。并且 无论是b m s c p x 蛋白，还是b m s c p 2 蛋白，在c 端部有s e r - l y s l e u 结构过氧化酶体的靶序 西南大学硕士毕业论文 列，是个高度保守的蛋白。 r t - p c r 分析发现，b m s c p x s c p 2 基因只在中肠和马氏管以选择性拼接的方式特异表达， 其中，中肠的表达量要高很多。中肠时期表达分析，发现最早在4 龄能检测到两种m r n a ， 整个5 龄表达量都很高，在5 龄3 天达到最高峰，而在预化蛹时期却只能检测到b m s c p 2 ，到 成虫期b m s c p x 和b m s c p 2 都检测不到。然而，b m s c p 2 的m r n a 几乎在所有组织都能检测 到。 另外，本研究通过p e t 原核表达系统对b m s c p x 和b m s c p 2 进行捉外表达。在i p t g 的 诱导下，在6 0k d 处和约2 0k d 处出现明显浓粗的新蛋白质带。p e t 2 8 ( a ) 表达载体中h i s 标签是2 ，3 9k d ，而表达产物b m s c p x 蛋白的分子量在5 7 8 5k d 左右，b m s c p 2 蛋白的分子量 在1 62 0k d 左右。所以，与h i s 的融合蛋白的分子量分别是：6 02 4 k d 和1 8 5 9 k d 。 s c p 2 蛋白是参与胆固醇在细胞内各个细胞器间循环运输的主要蛋白，对其基因结构及蛋 白功能的研究将有助于我们对昆虫的胆固醇代谢有更为清楚的认识。本研究采用生物信息学 分析、基因克隆，表达谱分析等研究方法对家蚕的s c p ) ( s c p 2 基因进行了研究，发现了两种 不同的基因表达形式，它们在不同时期不同组织间存在表达差异，暗示着它们在代谢过程中 将起到不同的作用。此外，本研究通过体外表达的s c p x 蛋白和s c p 2 蛋白也为s c p 2 抑制剂 ( s c p i s ) 的研究提供研究平台，它可以为鳞翅目农林害虫的防治提供研究基础，具有相当广 阔的开发应用前景。 关键词家蚕胆固醇s c p “s c p 2 选择性剪接基因表达 i i a b s t r a c t i ni n s e c t ，c h o l e s t e r o li sn o to n l yr e q u i r e df o rc e l l u l a rm e m b r a n e ，b u ta l s oi si n v o l v e di nt h e i m p o r t a n tp r o c e s so fe c d y s t e r o i db i o s y n t h e s i sh o w e v e r ，i n s e c t sc a r ln o tp r o d u c ec h o l e s t e r o lv i ad e n o v os y n t h e s i sb e c a u s et h e yl a c kt w ok e ye n z y m e si nt h e i rb o d i e s i nf a c t ，i n s e c t sm a i n l yd e p e n do n d i e t a r yc h o l e s t e r o lt of u l f i l lt h e i rg r o w t h ，d e v e l o p m e n ta n dr e p r o d u c t i o nf u n d a m e n t a ls t u d i e sh a v e d e t e r m i n e dt h a tm i d g u to fi n s e c ti st h em a j o rs i t eo fc h o l e s t e r o la b s o r p t i o na n dc o n v e r s i o na f t e r t r a n s p o r tb yv a s c u l a rl i p o p r o t e i ni nh e m o l y m p h ，c h o l e s t e r o li sc o n s u m e db yt h ep r o t h o r a c i cg l a n d s o nt h eo t h e rh a n d ，c h o l e s t e r o lc a nb ec a r r i e dt of a tb o d yv i al i p o p h o r i no ft h eh e m o t y m p h ，a n db e s t o r e di nf a tb o d ya sf r e ea n de s t e r i f i e df o r m st h e r e f o r e ，t h eh a l l m a r ko ff a tm e t a b o l i s mi ni n s e c t s c e n t e r so nt h el i p i dt r a n s p o r ts y s t e m s t e r o l c a r r i e rp r o t e i n 2 ( s c p 2 ) i sal i p i d b i n d i n gp r o t e i n ，w h i c he x i s ti ns p e c i e sb r o a d l yt h e s c p x p r o s c p - 2g e n ei saf u s i o ng e n ei nm a m m a la n dt h es c p 2p r o t e i ni sc o n s i d e r e di n v o l v e di n c h o l e s t e r o l ，f a t t ya c i dm e t a b o l i s ma n dt h e i ri n l r a c e l l u l a rt r a n s p o r t p r o t e i ns c p 2c o u l dn o to n l y a b s o r bf l e ec h o l e s t e r o lf o rt h ec o n s t r u c t i o no fc e l l u l a rm e m b r a n e s ，b u ta l s op r o v i d ec h o l e s t e r o la s a p r e c u r s o rt om i t o c h o n d r i af o rt h es t e r o i db i o s y n t h e s i s ，s u c ha si n s e c t sm o l t i n gh o r m o n e s i nt h i sw o r k ，w ep r e d i c a t e dt h ed n a ，m r n aa n dp r o t e i no fb m s c p x s c p 2g e n eb y b i o i n f o r m a t i c sm e t h o df i r s t l yt h e nu s i n gar t p c r b a s e dc l o n i n gs t r a t e g y ，w ei s o l a t e dt w ot y p e s m r n af r o mas i n g l eb m s c p x s c p 2g e n e ，a n da n a l y z e dt h ee x p r e s s i o np a r e r no fb m s c p xa n d b m s c p 2i nd i f f e r e n ts t a g e sa n dt i s s u e s f i n a l l y ，t h eb m s c p xa n db m s c p 2g e n ew e r ec l o n e di n t o t h ep e t 2 8 ( a ) h i st a gv e c t o rt oe x p r e s si ne s c h e r i c h i ac o l is t r a i nb l 2 1 i no r d e rt of i n dt h ec a n d i d a t eo fs c p x s c p 2g e n ei nb o m b y xm o r i ，t h es c p xa m i n oa c i d s e q u e n c eo ft h es t ) o d o p t e r al i t t o r a l i s w a su s e dt os e a r c hi nt h es i l k w o r md b e s ta n dg e n o m e s e q u e n c eo fs i l k w o r mb yt b l a s t np r o g r a m i tw a sf o u n dt h a tb m s c p x s c p 2g e n eh a d8 9 0 2b p i ng e n o m e ，a n dc o m p r i s e d2e x o n sa n d1i n t r o na f t e ra s s e m b l i n ga l lt h ee s t s ，t w o c o n t i g w e r e o b t a i n e da n a l y z e db m s c p xa n db m s c p 2g e n eb yc l o n e da n ds e q u e n c e d ，i tw a sf o u n dt h a tt h e r e s u l t sw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h ep r e d i c t e ds e q u e n c e sw ea s s e m b l e d 加s i l i c o ，w h i c hv e r i f i e do u r p r e d i c t i o nt h eb m s c p x s c p 2g e n ee n c o d e st h et w ot y p e so ft r a n s c r i p t sb ya l t e r n a t i v es p l i c i n g m e c h a n i s mt h e b m s c p xh a s2 1 6 5n ta n d b m s c p 2h a s1 0 3 5n t o r fo fb m s c p xl i e s i n1 9 7 1 8 0 4n t ，e n c o d i n g5 3 6a m i n oa c i d s f u n c t i o n a ld o m a i nf r o m p r e d i c t i o ns h o w e dt h a t i tc o n t a i n st h i o l a s e n ，t h i o l a s e - ca n das c p 2d o m a i n c o m p a r e dt o b m s c p x ，t h eb m s c p 2c o n t a i n sa no r fo f4 3 8f a tc o d i n gf o r1 4 6a m i n oa c i d s i to n l yc o n t a i n sa s c p 2d o m a i nm o l e c u l a rw e i g h ta n dp lo fb m s c p xa n db m s c p 2a r e5 78k d ，1 62k da n d6 5 4 ， 92 2 t h ea l i g n m e n to f a m i n oa c i ds e q u e n c e ss h o w e ds i m i l a r i t yo f t h es c p 2g e n ef a m i l ym e m b e r s i l l 西南大学堕士毕业论文 b m s c p xh a s8 8 i d e n t i t ya n d9 4 s i m i l a r i t yt bs p o d o p t e r at i t t o r a l i ss c p xg o n eb m s c p xh a s 6 4 i d e n t i t ya n d7 9 s i m i l a r i t yt od r o s o p h i l as c p xg e n e b m s c p xh a s6 5 i d e n t i t ya n d7 6 s i m i l a r i t yt oa e d e ss c p xg e n ea l s o ，b o t hb o n b y x 胛d hs c p xa n ds c p 2p r o t e i nc t e r m i n a l s c o n t a i ns e r - l y s l e u ，w h i c hi sap e r o x i s o m a l t a r g i o gs i g n a l ， a n a l y s i s b yr t - p c rs h o w e dt h a tt h eb m s p x s c p 2g e n eo c c u m dt n la l t e r n a t i v es l i c i n gt o p r o d u c es c p xm r n aa n ds c p 2m r n ao n l ymm i d g u ta n dm a l p i g h i a nt u b u l e sb u tt h eb m s c p x a n db m s c p 2e x p r e s sm u c hh i g h e ri nm i d g u tt h 驴i nm a l p i g h i a nt u b u l e st h eg e n ee x p r e s s i o n p r o f i l e sa n a l y s i so fm r n a i s o l a t e df r o mm i d g o t 耻d i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e sr e v e a l e dt h a tt h e t w ok i n d so fm r n ac o u l db ed e t e c t e da tt h ee a r l yo ft h e4 t hi n s t a rl a r v a ea n dw e r es t r o n g l y e x p r e s s e do r ld a y - 3o f 5 t hi n s t a rl a r v a eo n l ys c p 2r n r n ac o u l db ed e t e c t e df r o mp r e p u p a e ，a n di t s e x p r e s s i o nl e v e lb e c a m ev e r yl o wb e f o r ea d u l t1 4 0 , w g v e r , b m s c p 2c o u l db ed e t e c t e di na l m o s ta l lo f t h et i s s u e sa n ds t a g e s f u t h e r m o r e ，p r o t e i nb m s c p xa n db r e s c i a 2 e r eo v e r e x p r e s s e db yp e t 2 8 ( a ) v e c t o ri n b l 2 1 ( d e 3 1ec e l lw i t hi p t gi n d u c t i o n t w oo b v i o u s l yb a n d so ft h er e c o m b i n a n tp r o t e i n sw e r e f o u n dw i t ht h ea p p a r e n tm o l e c u l a rw e i g h to f6 0k da n d2 0k d s i n c et h em o l e c u l a rw e i g h to fh i s t a gi s2 3 9k d ，w h i l et h em o l e c u l a rw e i g h to f1 3 n a s c p xa n db r a s c p 2w e r e5 7 8 5k da n d1 62 0k d r e s p e c t i v e a sav i t a lc h o l e s t e r o lt r a n s p o r t e r ，s c p 2w 劬i r l v o l v e di nc h o l e s t e r o la n dl i p i di n t r a c e l l u l a r t r a f f i c k i n gr e s e a r c ho ns c p x s c p 2g e n ea n d t 3f i m o t i o n sw o u l dh e l pu su n d e r s t a n dt h ep r o c e s so f c h o l e s t e r o lm e t a b o l i s mm o r ec l e a r l y w es t u d i e db f n s c p x s c p 2v i ab i o i n f o r m a t i c sm e t h o d ， m o l e c u l a rc l o n i n g ，e x p r e s s i o np r o f i l ea n dp r o l a r y o t i ce x p r e s s i o n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h e i d e n t i c a lg e n es c p x s c p 2e n c o d e st h et 州qt y ! a e so f t r a n s c r i p t sb y a l t e r n a t i v es p l i c i n g m e c h a n i s mt h et i s s u e s p e c i f i ce x p r e s s i o np a t t c r r o fb r n s c p xa n db m s c p 2a r ed i f f e r e n tg r e a t l y ， w h i c hm i g h th a v ed i f f e r e n tr o l e si nc h o l e s t e r o lr t a b o l i s r nt h er e c o m b i n a n tp r o t e i n so fb m s c p x a n db m s c p 2a l s od oh e l pf o rs e a r c h i n gi n h i b i t o r so fb r n s c p 2 ，a n dp r o v i d ea v a i l a b l ef u n d a m e n t a l k n o w l e d g et ob e t t e rp r e v e n t i o na n dc u r eo fl e p i d b p t e t a li n s e c to ff a r m i n ga n df o r e s t r y ，w h i c hh a s b r i g h tf u t u r ei na p p l i c a t i o n k e y w o r d s ：b o m b y xm o r i ，c h o l e s t e r o l ，s c p x s c i 2 ，a l t e m a t i v es p l i c i n g ，g e n ee x p r e s s i o n 独创性声明 学位论文题目：苤查! 堡里! 签塑! 基囤鱼直隆塑麦垫佥插 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者 彰岔 签字日期：2 9 0 6 年5 月7 目 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：日不保密， 口保密期限至 年月止) 。 学位论文作者签名彰色 签字目期：7 e , - o ( , 年产月) 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位 通讯地址 导师签名：缘殄 g - # 日期：如6 年、月7 日 邮编 文献综述 1 文献综述 1 1 胆固醇的运输与固醇载体蛋白2 ( s t e r o lc a r r i e r p r o t e i n2 ，s c p 2 ) 11 】胆固醇的合成 胆固醇又称胆甾醇，分子式为c z ，h 4 s o ，在哺乳动物的脑、肝、肾和蛋黄中含量很高，是 最常见的一种动物固醇” 。胆同醇合成部位除成年动物脑组织及成熟红细胞外，几乎在全身各 组织内部可合成。但肝是主要合成场所，占合成总量的7 0 8 0 ，1 0 由小肠合成。其他组 织如肾上腺皮质、脾脏、卵巢、睾丸及胎盘乃至动脉管壁，也可合成胆固醇。胆固酵是生理 需要的，也是构戏细胞膜的重要组成成分。但是当胆固醇过高或过低都将影嘀正常生命过程b j 。 1 12 血液中的胆固醇的运输 胆固醇运输是一个十分复杂的过程，它既包括血管中的运输，也包括细胞内的运输。在 过去很多实验的基础上，已经比较清楚参与胆固醇血管运输的血浆脂蛋自主要有低密度脂蛋 白( l d p ) 与高密度脂蛋白( ) p ) ，以及乳糜微滴和极低密度脂蛋白。 乳糜微粒( c m ) 在小肠粘膜细胞内，由再酯化生成的甘油三脂、磷脂及吸收的胆固醇，与载脂蛋白共同 形成c m 。c m 经淋巴进入血液，运输到肝脏，进而被肝组织摄取利用。c m 的功能是运输外 源性脂类( 以甘油三酯为主) 。 极低密度脂蛋白( v l d l ) 由肝细胞合成的甘油三酯、载脂蛋白以及磷脂、胆固醇等在肝细胞内共同组成v l d l 。此 外，小肠粘膜细胞也能合成少量v l d l 。v l d l 被分泌入血后，其中的甘油三酯被水解，水解 产物被j i - t # b - t 织摄取利用，可见v l d l 是运输肝合成的内源性甘油三酯的主要形式。 低密度脂蛋白( l d l ) l d l 是在血浆中由v l d l 转变而来的，v l d l 中的甘油三酯进一步水解，最后颗粒中脂 类主要为胆固醇酯，载脂蛋白为a p o l ii i i 。它是转运内源性胆固醇的主要形式，运载胆固醇到 几乎所有组织。肝及肝外组织的细胞膜表面广泛存在l d l 受体，可特异识别并结合含a p o l i 1 i i 的脂蛋白。当血浆中l d l 与此受体结合后，受体将聚集成簇，内吞入胞内与溶酶体融合， 进一步被降解。其中，主要运输到肝脏( 7 5 ) 。肾上腺和脂肪性组织。 高密度脂蛋白( h d l ) h d l 是由肝和小肠粘膜细胞合成的，以肝为主。初合成后分泌入血的h d l 称为新生h d l ， 它可接受外周血中的胆固醇并将其酯化，逐步转变为成熟h d l 。成熟h d l 可被肝细胞摄取利 用。因此h d l 的作用就是从肝外组织将胆固醇转运到肝内进行代谢”j 。 1 】3 胆固醇的细胞内运输与固醇载体蛋白s c p 2 虽然胆固醇在血液中运输的研究已经取得了较大的进展，但是胆固醇的细胞内运输研究 远落后于胆圄醇细胞外运输和其他胆固醇代谢的研究，同时也成为胆固醇运输研究的前沿。 胆固醇的细胞内运输对于细胞内胆圃醇平衡起着重要作用。在血浆脂蛋白运输胆固醇研究取 得重大进展的基础上，最近儿年的研究重点集中在胆固醇富集区、细胞质膜显微结构域，以 及两者的相互作用和细胞内运输代谢的途径”。 研究者发现胆固醇可以通过自由扩散进入细胞，但是这个简单的过程并z ；能满足细胞埘 胆固醇的需要”j 。大部分外源胆固醇和胆固醇酯都是由低密度脂蛋白携带经过特异的质膜显微 结构c a t h r i n c o a t e dp i t 形成泡囊进入细胞”。随后泡囊中的l d l 胆固醇进入溶酶体，在溶酶 体内部被水解释放，并运送到质膜高尔基体、内质网和线粒体，以及其他细胞器。胆固醇在 细胞内的运输，可以分为蛋白质介导和泡囊转运 8 9 ，1 ”。例如： 胆圃醇从溶酶体转运到高尔基体，又从高尔基体到质膜，再到内质网；通过泡囊转运【“】。 胆同醇从溶酶体转运到高尔基体，再从高尔基体直接到内质网：通过泡囊转运1 1 3 , 1 4 , 5 。胆固醇 从浴酶体转运到内质网：通过s c p 2 蛋白介导【”1 。胆固醇从溶酶体到线粒体：通过s c p 2 蛋白 介导 ”1 。胆圊醇从溶酶体转运到质膜：通过s c p 2 蛋白介导$ “j 。胆固醇在内质网上的积累 通过s c p 2 介导【4 。 最后，胆固醇通过细胞质膜和细胞膜穴样内陷流出细胞”】。外源胆固醇既可以通过泡囊 转运出细胞，也可以通过s c p 2 蛋白介导出细胞 2 0 , 2 1 。而内源胆固醇只能通过s c p 2 介导出细 胞”1 。 从上面的分析可咀看出胆固醇细胞内运输的方式主要有两种，泡囊运输和s c p 2 蛋白运 输。其中，s c p 2 蛋白运输的速度比泡囊运输要快得多。因此，s c p 2 蛋白在胆国醇运输过程 当中起着极为重要的作用。 尽管胆固醇通过溶酶体进入细胞内部的机制仍不十分清楚 胆固醇细胞内代谢途径仍不 明晰；信息调控在胆固酵吸收、释放的运输中的作用研究尚浅，但是越来越多来自模式生物 细胞膜研究、转染细胞、遗传突变体和转基因小鼠等的证据表明，s c p 2 等在胆固醇的细胞内 运输的过程中扮演着了必不可少的角色。 1 2s c p 2 研究进展 i2 ls c p 2 的发现 早期的研究表明，在胆固醇从内质网到细胞膜的运输过程中存在一种独立于泡囊运输途 径，它速度快、需要消耗能量，而且需要载体蛋白的协助。人们一直试图分离得到一种这样 的蛋白，但是并没有成功。直到1 9 8 0 年，b j n o l a n d 等人从小鼠的肝脏中纯化到了一种蛋自 s c p 2 ，它能够激活腮圆醇水化酶的活性从而改变细胞膜内外胆固醇的浓度，而且在体外组织 培养系统中，该基因的表达能够影响胆固醇的运输【2 2 1 。因此它被认为是胆固醇代谢途径中重 要的载体蛋白之后不久，在其他哺乳动物、鸟类、线虫等物种也相继发现了s c p 2 蛋白1 2 3 2 4 1 。 1 22s c p 2 基因家族 在脊椎动物中，目前s c p 2 基因家族至少包括4 个成员，它们是s c p 2 ，s c p x ，d p b e 和 u n c 2 4 h s l p 1 。它们的共同点是在c 端都有s c p 2 结构域【2 6 1 。其中，5 8k d as c p x 和13k d a s c p 2 是s c p 2 基因家族最受关注的成员。在脊椎动物中这两个蛋白是由同一个基因一固醇载 体蛋白基因s t e r o ic a r r i e rp r o t e i nx s t e r o lc a r r i e rp r o t e i n 2 ( s c p x p r o - s c p 2 ) 编码的，因而又简称 s c p x 基因或s c p 2 基因2 6 , 2 7 , 2 s 。 2 文献练述 1 2 3s c p x p r o s c p 2 基因的结构和不同m r n a 的拼接形式 s c p x p r o s c p 2 基因是一个融合基因，有两个不同的启动子，分别编码1 5k d a 无活性的 固醇载体蛋白2 前体( p r e c u r s o ro f s t e r o lc a r r i e rp r o t e i n2 ，p r o - s c p 2 ) q 5 8k d a 固醇载体蛋白一x ( s t e r o lc a r r i e r p r o t e i nx ，s c p x ) 2 7 , 2 9 ，如图1 1 。单拷贝的s c p x s c p 2 基因已经在人类3 “， 大鼠刚，小鼠，鸡【2 3 】中发现。人类的s c p r d p r o s c p 2 基因约有8 0k b ，由】6 个外显子和15 个内含予组成 3 0 】。小鼠s c p x p r o s c p 2 基因的结构与人类的很相似，也是由1 6 个外显子和1 5 个内含子组成。不仅如此，人们还发现s c p x p r o 。s c p 2 基因在两个启动子下发生选择性多聚 酰苷酸化一选择性拼接的一种，即p o l y a 加尾的地方不同，共生成4 种m r n a ：28k b m r n a 和2 , 2k b m r n a 编码s c p x ，1 。5k b m r n a 和0 9k b m r n a 编码s c p 2 3 2 1 0 1 2 , 4s c p x p r o s c p 2 蛋白的翻译后修饰 1 3k d as c p 2 蛋白，又叫作非特异性转运蛋白，可以由1 5k d ap r o s c p 2 切去n 端约2 0 个氨基酸肽段获得，也可以通过5 8k d as c p x 经翻译后修饰得到【2 8 1 ，如图1 2 。s c p 2 的主要 功能是参与胆固醇和脂肪酸的代谢，在细胞内运输胆固醇及脂类o ”。研究表明，s c p 2 在胆固 醇的吸收、细胞内运输、酯化作用、氧化作用等方面具有重要的功能。此外，还是形成胆固 2 1 一z 5 k b i l a r n a 2 7 3 5k bm r n a s ，一l 0 8 一& 9 k b m r n a 1 4 1 8 k b m r n a i “ i sk b - p ”o - s c p - 2 4 6 k n n p h d t e i n p h o s p i - i 2 c d 日 p e pr 1 1 i i ) e t 3k d a s c p 一2 图11 固醇载体蛋白一x 圈醇截体蛋白一2 基因( 引i 刍a d a i h e r t oe g 2 0 0 1 ) 3 西南大学硕士毕业论文 醇、结合胆固醇到肺部表面活性剂、将新合成的胆固醇分泌到胆汁以及运输胆吲醇的脂蛋向 分泌的必要条件2 ”。s c p 2 表达水平的异常与许多疾病有关，这些疾病包括糖尿病、动脉硬化、 z e l l w e g e r 、垲曼氏病( 类脂组织细胞增多症) 等。 s 8k d as c p - x ( t i - i i o l a s e s c f 一 z 4 6k 1 ) ap r o t e i r r h i o l a s e ) 1 sk d ap r o - s o p - 2 卜一s t ，n m i n c h 叫 l - 犯。一 nc 1 一- z ，。一一 n c 图12 编码国醇载体蛋白一x 固醇载体蛋白一2 基因初级氪基酸序刊之间的关系( 引自a d a i b e r t om g ，2 0 0 1 ) 1 2 5s c p x p r o s c p 2 蛋白的一级结构 5 8k d a f f 0 s c p x 的n 端具有酮酯酰c o a 硫解酶( 3 k e t o a c y c o at h i o l a s e ) 活性，c 端具有s c p 一2 的功能结构域，是一个由硫解酶 q j s c p 2 组成的融合蛋白2 8 3 。酮酯酰c o a 硫解酶在生物体脂 质代谢的b 氧化过程中起着重要催化作用，即催化d 酮脂酰- c o a 被第二个c o a s h 分子硫解， 产生乙酰。c o a 和比原来脂酰c o a 少2 个碳原子的脂酰c o a ，如图13 所示。这两种蛋白在c 端 有相同的氨基酸序列。c 端最后三个氨基酸a l a - l y s l e u 是一个过氧化酶体靶序列信号。细胞器 定位显示，s c p x f f h 酮酯酰c o a 硫解酶几乎全部在过氧化物酶体内，而s c p 2 主要存在于过氧化 物酶体1 ”。s c p x 和s c p 2 的m p , n a 广泛存在于各种组织里，但是只在参与胆固醇和脂类代谢的 组织中高效表选 3 , 2 7 1 。 r铲、一+一罂r占co + 铡运a o 口 u 0 。f 划胼 魄南h f l i _ f j 辨髋蛳懈a 图13 酮酯酰c o a 硫解酶催化过程 4 文献综述 曼阜曼! 皇曼皇鼍曼曼鼍兰! 皇! 曼鼍鲁! 曼! ! 鼍! 尝皇鼍皇鼍! ! 鼍量曼鼍曼量皇! ! 鼍曼曼皇皇皇舅曼! 曼! 詈皇量暑皇舅舅篡 l2 6s c p x p r o - s c p 2 蛋白的二、三级结构 蛋白的二、三级结构决定着蛋白的生理生化性质。为了更深入了解s c p 2 蛋白的功能g a r c i a f l 等人利用核磁共振技术研究了s c p 2 蛋白的高级结构。结果表明，s c p 2 蛋白n 术端的3 2 个 氮基酸可以形成一个n 螺旋的结构域，它不仅可以与阴离子磷脂膜结合，而且形成的结构域 可以与脂肪酸结台盼3 ”。 12 7s c p 2 蛋白的进化 无脊椎动物体中，s c p 2 基因家族的一些成员已经被研究报道。在线虫( c a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s ) 体内硫解酶基因和s c p 2 基因不是融合在一起的，而是分别由两个不同的基因：p 4 4 和u n c 2 4 编码。p 4 4 ，是一个i i 型硫解酶，和脊椎动物s c p x 的n 端蛋白同源的。u n c 2 4 ，和 脊椎动物s c p x 的c 端蛋白同源2 5 。3 ”。根据数据库检索分析，融合的s c p x p r o s c p 2 基因始于果 蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) ，然而果蝇的s t e r o lc a r r i e rp r o t e i nx - r e l a t e dt h i o l a s e ( s c p x ) 基因胚 胎期在中肠里只含有一种1 4 k b 的转录产物1 。s c p x 蛋白是否通过蛋白水解产生硫解酶蛋白和 s c p 2 还不清楚。 1 3 昆虫胆固醇代澍 12 1 食物摄取胆固醇 昆虫和哺乳动物有许多相同或相似的代谢系统。在许多研究领域，昆虫往往作为一种简 单的动物模型使我们更容易理解一些生物学现象口7 】。昆虫和哺乳动物的胆固醇代谢基本模 式也是相似的，但是同时它们也存在明显的区别，那就是获得胆固醇的来源和转化胆固醇的 去向p ”。 哺乳动物既能从小分子的碳单位合成，如乙酸，合成胆固醇，也能通过食物获取身体所 需的胆同醇3 9 】。昆虫不能通过自身合成胆圆醇，原因是昆虫体内缺少2 种关键性的合成酶： 鲨烯合酶、羊毛甾醇合酶【4 0 , 4 ”。园而不能从头合成胆固醇，胆固醇主要来自植物甾醇。在哺乳 动物中，大部分胆固醇在肝脏转变为胆汁酸，小部分胆固醇经肠道内细菌作用转变为粪固醇 随粪便排出体外。在昆虫中许多研究表明，胆固醇除了是细胞膜的主要成分外，更主要的作 用是作为蜕皮激素的前体“, 4 3 , 4 4 1 。 12 , 2 昆虫体内胆固醇代谢重点 昆虫胆固醇代谢的重点集中在胆固醇运输系统h ”。昆虫通过进食，食物进入肠腔。中肠 细胞吸收植物甾醇，如6 谷甾醇、油菜甾醇和谷甾醇，发生脱烷反应，将植物甾醇转化为胆 中肠 植物甾醇e 凰1 4n ! t t 体nj i - e n n 运输 血淋巴 淼碧二 ，躲 西南大学硕士毕业论文 l 司醇1 4 “。尽管有报道某些杂食性、肉食性昆虫在前肠或嚎鬟中吸收胆固醇，但是中肠仍是吸 收转化胆【鲴醇的主要部位，并且转化p 谷甾醇成胆固醇仅在昆虫肠道内发生 “ 。然后通过运 脂蛋白( 1 i p o p h o r i n ) ，昆虫血淋巴中主要的脂蛋自，更多的时候指的是商密度脂蛋白h p l 4 ”。 运遴到体内不同组织，或是转化利用，主要是前胸腺；或是以自由的臌固醇和胆固醇酯储存 在脂肪体中，如图14 。 12 3 昆虫的胆固醇与蜕皮激素 胆固醇在昆虫体内的主要用途是在前胸腺或同类腺体台成蜕皮激素，又称蜕皮甾醇。此 外，昆虫的卵巢也能合成蜕皮甾醇。1 9 5 4 年k a r l s o n 首先报道了一种与昆虫蜕皮变态有关的激 素一蜕皮酮【4 。昆虫体内发育过程主要是甾醇类激素蜕皮酮及其活性代谢物2 0 ，羟基蜕皮酮和 半秸类保佑激素( m ) 协调控制的j 。幼虫体内j h 阻止昆虫组织对蜕皮甾醇产生变态反应， 只能引发幼虫蜕皮i 当末龄幼虫缺少m 时，蜕皮甾醇升高，才能诱导变态。除此之外，蜕皮 甾醇还有许多其他重要作用，尤其在繁殖方面一蜕皮甾酵能调控卵黄和精予发生。因此，蜕 皮甾醇对昆虫蜕皮、生长发育和繁殖起着重要