（林木遗传育种专业论文）星星草耐盐分子机理研究及相关基因的克隆.pdf

摘要 星星草是一种有较强耐盐碱能力的盐生植物，是进行植物耐盐碱机理研究的理想材 料。为研究n a h c 0 3 胁迫下星星草的耐盐机理，以4 5 0m m o l l n a h c 0 3 胁迫处理的星星 草叶片为材料构建了c d n a 文库，同时，用表达序列标签( e s t ) 分析和c d n a 表达谱芯 片分析相结合的方法研究了n a h c 0 3 和干旱胁迫下星星草基因的表达。 所构建c d n a 初始文库的滴度为1 0 x 1 0 6p f u m l ，文库的重组率为9 5 ，p c r 检测 显示，捅入片段的平均长度为o 8k b 。从文库中随机挑选31 6 8 个克隆进行测序，共获 得29 7 2 条高质量的序列；通过序列的聚类分析共将11 0 2 条序列拼接为4 9 6 个c o n t i g ， 其余18 7 0 条序列为单一序列，共获得23 6 6 条无重复的独立序列，它们的g e n b a n k 登 录号为c n 4 8 5 3 5 5 c n 4 8 7 7 2 0 。 从23 6 6 条序列中挑选6 6 0 个e d n a 经p c r 扩增后作靶基因点样在玻片上制成 c d n a 芯片。将对照、n a h c 0 3 和干旱处理的星星草总r n a ，经荧光染料c y 5 一d c t p 和 c y 3 一d c t p 标记后制成c d n a 探针，与c d n a 芯片进行杂交。 23 6 6 个序列的b l a s t x 分析结果显示，共有12 7 4 条序列与已知基因序列高度同 源，6 l8 条为与已知基因同源性较低，其余4 7 4 条序列与已知基因无任何同源性。将1 2 7 4 条与已知基因同源的序列按功能分为1 2 类，其中代谢、转录调节、功能未知及细胞 防御相关四类基因的表达丰度最高，分别占已分类e s t 总数的1 8 8 4 、1 2 4 8 、 1 1 2 2 和9 6 6 。对高丰度表达基因和1 6 2 条可能与耐盐相关基因的分析表明，光合作 用、转录调节、转运蛋白和细胞防御4 类基因的表达丰度较高，说明光合作用、水分和 离子的转运、耐盐基因的表达调控、活性氧等毒性物质的去除等过程在星星草抗盐胁迫 时起到了重要作用。e d n a 芯片研究n a h c 0 3 胁迫下星星草基因表达结果显示，共有2 5 个基因存盐胁迫处理前后差异表达，其中1 7 个基因在盐胁迫下表达下调，8 个基因在盐 胁迫下表达上调，这些基因的功能主要涉及了信号传导与转录调控、细胞防御、细胞代 谢3 个方面，这些差异表达的基因可能在星星草抗盐过程中具有重要作用。e d n a 芯片 研究干旱胁迫下星星草基因表达，共发现下调表达的基因2 4 个，上调表达基因l8 个。 差异表达基因的功能主要涉及了信号传导、转录调控、逆境响应等方面。通过以上研 究，初步建立了n a h c 0 3 、干旱胁迫前后星星草基因的表达谱。 植物的抗盐过程是一个复杂的多基因协同作用的体系。以上研究说明，通过e s t 技术和c d n a 芯片分析等基因组学研究手段的应用，可有效获取盐胁迫下星星草众多基 因的表达特征信息，从而为系统阐明星星草抗盐碱分子机理奠定坚实的基础。 关键词星星草；盐胁迫；c d n a 文库：表达序列标签；c d n a 芯片 童! ! 竺些奎兰至圭兰堡兰圣：= ：! ：= ：= ： a b s t r a c t p u c c i n e l l i at e n u i f l o r a ，ah a l o p h y t ew i t hh i g hc a p a c i t yo fs a l tr e s i s t a n c e ，i sa ne x c e l l e n t t a r g e tf o rp l a n ts a l tt o l e r a n c er e s e a r c h ae d n al i b r a r yw a sc o n s t r u c t e df r o mt h ei e a ro f 户 t e n u ( f l o r at r e a t e dw i t hn a h c 0 3 ( 4 5 0m m o l l ，4 8h ) a f t e re d n as e q u e n c e sw e r eo b t a i n e d t h r o u g hr a n d o m l ys e l e c t e ds e q u e n c i n gp r o c e s s ，e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ( e s t s ) a n n o t a t i o na n d e d n am i c r o a r r a ya n a l y s i sw e r ec a r r i e do u tt oi n v e s t i g a t et h eg e n ee x p r e s s i o np a t t e r n so fp t e n u i f l o r au n d e rn a h c 0 3a n dd r o u g h ts t r e s s e s p r i m a r yt i t e ro f t h el i b r a r yw a s1 0 x 1 0 6p f u l m l ，a n dt h er a t eo fr e c o m b i n a t i o nw a s9 5 ， w i t ha na v e r a g ei n s e r t ss i z eo fo 。8k b ，w h i c hw e r ed e t e r m i n e db yb o t hp c ra n ds e q u e n c i n g a n a l y s i s 。at o t a lo f 29 7 2h i g hq u a l i t ys e q u e n c e sw e r eg e n e r a t e df r o m316 8s e q u e n c e dc l o n e s w h i c hw e r es e l e c t e dr a n d o m l yf r o mt h el i b r a r y c l u s t e r i n ga n a l y s i sc a u s e d4 9 6c o n t i g s ( f r o m1 10 2s e q u e n c e s ) a n d18 7 0s i n g l e t o n s ，r e p r e s e n t i n g23 6 6n o n - r e d u n d a n tu n i q u et r a n s c r i p t s t h e g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r so f t h e s et r a n s c r i p t sa r ec n 4 8 5 3 5 5 - c n 4 8 7 7 2 0 at o t a lo f6 6 0c d n a sw h o s es i z e sl o w e rt o2 5 0b pw e r es e l e c t e df r o mt h ee s tc o l l e c t i o n t ob es p o to ng l a s ss l i d ea st a r g e tg e n e sa n dm a k ee d n ac h i p ，w h i l ee d n ap r o b e sw e r e s y n t h e s i z e da n df l u o r e s c e n td y e ( c y 5 一d c t pa n dc y 3 一d c t p ) l a b e l e df r o mt o t a lr n ai s o l a t e d f r o mc o n t r o la n dn a h c 0 3 一t r e a t e dp l a n t sr e s p e c t i v e l yv i ar t - p c r t h ee d n am i c r o a r r a yw a s m a d et h r o u g hh y b r i d i z i n gw i t ht a r g e tg e n e sa n dp r o b e so nt h es l i d e b l a s t xs e a r c hr e s u l t sf o r23 6 6e s t ss h o w e dt h a t12 7 4s e q u e n c e sh a d h i g h h o m o l o g o u st o k n o w n s e q u e n c e s ，w h i l e6 18e s t ss h o w e dl o wh o m o l o g o u st ok n o w n s e q u e n c e sa n dr e m a i n i n g4 7 4s e q u e n c e sh a dn oh o m o l o g o u st oi d e n t i f i e dg e n e s 12f u n c t i o n a l c a t e g o r i z a t i o n sw e r ec r e a t e df r o m1 2 7 4t r a n s c r i p t st h a tw e r ei d e n t i f i e db a s e do nt h e i rp r o t e i n f u n c t i o n s 4 g r o u p s t r a n s c r i p t s w e r es i g n i f i c a n t l ye x p r e s s e d ：m e t a b o l i s m ，t r a n s c r i p t i o n ， u n c l a s s i f i e da n dc e l lr e s c u e d e f e n s e ，w h i c hr e p r e s e n t e d1 8 8 4 ，1 2 4 8 ，1 1 2 2 0 ；a n d9 6 6 o fa l lc l a s s i f i e dg e n e s ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t so fe l u c i d a t i o ni nm o s ta b u n d m a t l ye x p r e s s e d a n ds a l t s t r e s s r e l a t e dg e n e si n d i c a t e dt h a tp h o t o s y n t h e s i s ，t r a n s c r i p t i o n ，t r a n s p o r t e r sa n dc e l l r e s c u e d e f e n s ec o m p o n e n t sc o m p r i s e dm o r eg e n e st h a no t h e r s ，i m p l y i n gt h a tp h o t o s y n t h e s i s ， w a t e r i o n st r a n s p o r t i n g ，t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i n ga n dt o x i cs u b s t a n c es c a v e n g i n go c c u p i e dv i t a l p o s i t i o n sd u r i n gs a l tr e s i s t a n c ei n 尸t e n u ! t l o r a t h er e s u l t so fe d n am i c r o a r r a yh y b r i d i z a t i o n s h o w e dt h a tt o t a l2 5g e n e sr e p r e s e n t e dd i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o np a t t e r n s ，i n c l u d i n g 17d o w n r e g u l a t e d ( s a l tr e p r e s s e d ) g e n e sa n d8u p - r e g u l a t e d ( s a l ti n d u c e d ) g e n e s t h e s eg e n e sf u n c t i o n s i n v o l v e di nv a r i o u sa s p e c t ss u c ha ss i g n a lt r a n s d u c t i o n ，t r a n s c r i p tr e g u l a t i o n ，c e l ld e f e n s e ，a n d m e t a b o l i s m ，s u g g e s t i n gi m p o r t a n tr o l e si ns a l tr e s i s t a n c eo fpt e n u i f l o r a t h em i c r o a n a y e x p e r i m e n t sa l s of o u n d2 4g e n e sw e r ed o w n - r e g u l a t e da n d18g e n e sw e r eu p r e g u l a t e db y d r o u g h ts t r e s s t h e s eg e n e sw e r eb e l i e v e dt h a ta s s o c i a t e di ns i g n a lt r a n s d u c t i o n ，t r a n s c r i p t r e g u l a t i o na n ds t r e s sr e s p o n s e s a sar e s u l t ，t h ep r e l i m i n a r yg e n ee x p r e s s i o np r o f i l e sb yw h i c h i i 户l e n u i f l o r ar e s p o n s e st on a h c 0 3a n dd r o u g h ts t r e s s e sw e r ee s t a b l i s h e d p l a n ts a l tt o l e r a n c ei sac o m p l e xs y s t e ma s s o c i a t e dw i t h m u l t i g e n e t i cc o o r d i n a t e d o p e r a t i n g f r o mt h er e s u l t sd e s c r i b e da b o v e ，w ec a l ls a f e l yc o n c l u d et h a tt h ec h a r a c t e r i s t i c so f m u l t i p l eg e n e se x p r e s s i o nu n d e rs a l ts t r e s sc o u l db em o n i t o r e da n dr e v e a l e db yu s i n gt h e g e n o m i c sa p p r o a c h e si n t e g r a t e de s t sm e t h o da n dc d n am i c r o a r r a ya n a l y s i s ，t h e r e b ym a k ea f o u n d a t i o nf o rt h o r o u g h l ys t u d y i n gt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f s a l tr e s i s t a n c eo f pl e n u i f l o r a k e y w o r d s p u e e i n e l l i at e n u i f l o r a ；s a l ts t r e s s ；c d n al i b r a r y ；e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ( e s t s ) ；c d n ac h i p 1 1 1 1 1 引言 1 绪论 目前，世界上有1 0 0 多个国家存在着不同类型的盐碱地l o 亿h m 2 ，约占全球可耕地面 积的1 0 ，我国就有2 1 6 x 1 0 7 h m 2 ，其中耕地约6 1 6 1 0 6 h m 2 。随着工业污染加剧、灌溉农 业的发展和化肥使用不当等原因，次生盐碱化土壤面积有不断加剧的趋势，给农业生产 造成重大损失。因此，综合治理盐渍土、提高植物的耐盐性已成为未来农业发展及环 境治理所亟待解决的重要课题，而研究植物耐盐的机理、了解植物对盐胁迫发生响应的 分子基础是解决这一课题所必需的。 迄今为止，植物耐盐机理的生物化学和分子生物学研究己取得了许多成果，科学工 作者从生理、生化及分子生物学等不同角度研究耐盐机理，以期筛选和培育出耐盐性突 出的植物新品种。但植物在盐渍条件下的生存是一个在个体、细胞、生化和分子水平上 高度复杂的遗传和环境相互协调的过程。所以，尽管目前对植物耐盐机理的研究，尤其 在生化和分子生物学水平的研究已取得相当进展，许多新的分子生物学技术，如分子克 隆技术、标记技术、转基因技术等广泛应用于植物育种工作，但植物耐盐机理的许多方 面仍不清楚，也尚未得到理想的耐盐品种1 2 】，因此，植物耐盐机理的研究还有待进一步 深入。 1 - 2 植物的耐盐机理 1 21 盐害对植物的影晌 限制植物生长最重要的因素是环境胁迫，其中以盐渍化和干旱最为严重。盐害对植 物生理方面的影响主要有两个方面：其一是由于不合理的n a + k + l b 例和n a + 、c 1 一浓度 过高导致的离子胁追，其二是土壤中高浓度的可溶性物质引起的渗透胁迫。 离子毒害主要是由于植物摄取了过量的n a + 、k 十、c 1 一等离子，使植物细胞内离子浓 度增高，而细胞内许多酶却只能在很狭窄的离子浓度范围才具有活性。在无机盐中对植 物危害最大的是钠盐，农作物通常对n a c i 非常敏感，即使是5 0m m o ln a c l 的低热度 对于耐盐性较强的水稻也是致死的【3 。 盐胁迫还影响到质膜的组分、透性、运输、离子流等发生一系列变化，导致细胞膜 的正常功能受损，进而使细胞的代谢及生理功能受到不同程度的破坏。土壤中可溶性物 质浓度的升高会导致植物细胞失水，产生渗透胁迫。渗透胁迫使细胞中离子和可溶性物 质失去平衡，因而引起植物营养缺乏，生长异常。盐碱地上的植物由于n a + 、c i 一、 m g “、s 0 4 。的浓度过高，使营养元素k + 、h p 0 4 2 。( h 2 p 0 4 _ ) 、n 0 3 - 吸收减少而出现缺乏 症。在玉米叶片中，n a + 或c r 的含量过高，导致磷酸化反应受阻，植物细胞的供能不 足，能荷降低而直接影响生长 4 l 。 东北林业大学硕士学位论文 1 2 2 植物的抗盐性 植物的抗盐性包括两个方面：避盐性和耐盐性。植物避盐机理相对简单，主要是通 过一些形态或解剖上的特征来实现避盐。植物的避盐方式主要有泌盐、稀盐和拒盐三种 f “。植物的耐盐方式主要有离子区隔化作用、渗透调节、维持膜系统的完整性和代谢变 化等。前面谈到将盐胁迫效应归结为两个方面，即特异离子效应和渗透效应。虽然此处 将耐盐机理表述为以下几点，但都可以从缓解植物的特异离子效应和渗透效应两方面加 以解释。 12 2 1 离子的摄入与区隔化 比较生理学研究发现，从盐生植物中分离出来的酶，在对盐的敏感程度上，与非盐 生植物中的酶并无区别。这一事实表明，盐生植物的抗盐能力并非由于酶的强大耐盐 性，而是依靠细胞在高盐条件下仍能维持完善的内部区隔，使酶不受高浓度盐离子的影 响。此外，取自盐生植物海蓬子( s a l i e o r n i ae u r o p a e a ) 的愈伤组织，与取自非盐生植物的 愈伤组织在抗盐能力上并无区别。这种现象表明植物的抗盐能力是完整植株的一种特 性，丽不是由个别部分单独的生理活动所决定的。 对大多数木本植物来说，特异离子毒性是造成盐害的重要因素。一些耐盐植物已逐 步形成了特定而复杂的机制以适应盐胁迫，其中一个机制就是离子平衡。离子平衡也被 称为离子摄入和区域化，是细胞或组织保持内部稳足状态的一种方式，这种方式使植物 在外界环境刺激下维持体内的离子平衡。h - ka t p a s e 是脂膜和液泡膜上的一种h + 泵，可 维持脂膜的n a + 、c l _ 浓度【6j 。研究证明盐可以诱导滨藜以t r i p l e xc e n t r a l a s i a t i c a ) 根和叶子 脂膜上的h + 。a t p a s e 的表达。采用r n a 原位杂交技术进一步对表达h + - a t p a s e 的细胞 进行定位，确定盐诱导下该基因在根尖细胞和叶鞘细胞表达。当外界环境n a 十浓度提高 ( 相对于细胞质) 时，植物通过n a + h + 逆向运转蛋白将n a + 转运到液泡中，实现区域化， 降低细胞质中的n a + 浓度。 木本植物存在区隔化的直接证据在红树( r h i z o p h o r a 肌口琊出) 中得到证实1 训，但有许 多间接证据，如成熟胡杨( p o p u l u se u p h r a t i c a ) 组织中较高的盐分含量，意味着胡杨具有 高效的区隔化作用。 12 2 2 渗透调节 植物为了消除盐胁迫所造成的伤害，通常在细胞内主动积累一些小分子有机化合物 和蛋白类保护剂来维持渗透平衡和体内水分，一般称之为渗透调节齐l j ( o s m o p r o t e c t a n t ) 。 小分子有机化合物有如下几类： ( 1 ) 多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、右旋肌醇甲醚 等；( 2 ) 糖类，如蔗糖、海藻糖等；( 3 ) 氨基酸及其衍生物，如脯氨酸、甘氨酸甜菜碱 ( 简称甜菜碱) 等。其中右旋肌醇甲醚、海藻糖、甜菜碱是次生代谢产物。这些化台物之 所以成为有效的渗透调节剂是因为它们易溶于水，且相对无毒，即使在细胞内的浓度很 高，也不干扰细胞的代谢过程或引起蛋白质的结构与功能的改变，也不影响其它许多生 物高分子物质的活性。渗透调节剂的积累在一定范围内可以维持盐胁迫下细胞的正常膨 压和细胞的正常代谢功能。目前对于脯氨酸和甘氨酸甜菜碱的研究比较深入。 ( 1 ) 脯氨酸( p r o l i n e ) 脯氨酸是渗透胁迫下易于积累的一种氨基酸，是盐生植物调节渗透压的一种溶质。 1 绪论 除调渗功能而外，它还具有稳定细胞蛋白质结构，防止酶变性失活和保持氮含量的作 用。研究表明烟草细胞在n a c i 胁迫下，脯氨酸占游离氨基酸总量的8 0 n 上【8 】。高粱 在严重缺水条件下，叶组织中脯氨酸的含量增加了1 0 8 倍，占游离总氨基酸的6 0 以上 1 9 。 对于脯氨酸的积累究竟是盐胁迫引起植物损伤的征兆，还是耐盐的原因，目的尚刁i 清楚。有人认为脯氨酸的积累是耐盐的原因，而不是盐胁迫下的偶然结果，v a n 等【lo 】建 立的土豆细胞系在无盐胁迫情况下也能积累大量脯氨酸，其中有的细胞系确实具有较强 的耐盐能力，表明大量脯氨酸的积累也许具有抗盐害的功能。另外有人则认为脯氨酸的 积累是盐胁迫的偶然性结果。以大豆为例，在同样的盐胁迫条件下，脯氨酸的积累所显 示的是一种栽培特性，其含量与抗渗透胁迫能力没有相关性1 1 ”。同样，在盐胁迫条件下 培育的高粱细胞中发现耐盐性与脯氨酸的积累也没有相关性【i ”。由此可见，脯氨酸的积 累与耐盐性状的关系还有待进一步研究。 ( 2 ) 甘氨酸甜菜碱( g l y c i n eb e t a i n e ) 与脯氨酸不同，甜菜碱作为次生代谢产物在微生物和植物中的渗透调节作用是没有 争议的。甘氨酸甜菜碱是无毒的细胞质调渗物质( o s m o l y t e ) ，因为高盐浓度对于酶的活 性有抑制作用，而甘氨酸甜菜碱却能使代谢中许多重要的酶类在渗透胁迫下保持活性， 从而对生物体提供耐盐保护。已知盐胁迫可以增加甜菜碱在植物中的积累，例如菠菜在 正常情况下积累甜菜碱为2 0p m o l g d w ，而在盐胁迫条件下可增加到3 7 1p , m o l g d w ， 类似的情况在其它植物中也有发现【l ”。甜菜碱的生物合成在植物的叶绿体中进行，首先 由胆碱脱氢形成甜菜碱醛中间产物，然后进一步脱氢生成甜菜碱。这两步酶促催化反应 的酶分别是胆碱单氧化酶( c m o ) 和甜菜碱醛脱氢酶饵a d h ) 。 为了查明甜菜碱的积累与渗透胁迫的关系，对c m o 和b a d h 这两个酶，尤其是对 b a d h 己进行了广泛的研究，在渗透胁迫下，b a d h 增加，酶活力也成倍增加。b a d h 是个6 0 k d 多肽二聚体，主要活性位于叶绿体基质中，b a d h 基因已经被克隆并得 到了表达。c m o 的最适p h 值为8 0 ，反应需要m g ”离子激活，分子量约9 8 k d 1 4 】。甜 菜碱作为参与调渗的小分子，它的积累与盐胁迫和缺水的严重程度成比例，在生物合成 水平上受到调控。例如菠菜经2 0 0m m o l ln a c l 处理后，c m o 的活性将增加3 倍，当 n a c i 的浓度从零逐渐增加到5 0 0m m o l l 时，b a d h 的活性从2 倍增加到4 倍，与之相 应的b a d h 的m r n a 也逐渐增加3 - - 4 斜”l 。所有的结果显示甜菜碱的积累与盐胁迫密 切相关，盐浓度的变化可能对甜菜碱生物合成过程中相关基因的表达进行调控，进而调 控甜菜碱的积累。 甘氨酸甜菜碱是一种很好的调渗保护剂，但是许多农作物，如水稻、土豆、番茄并 不能积累，如果利用基因工程手段，把甜菜碱合成途径的相关基因，转入普通作物使其 积累甜菜碱，将可达到增强作物耐盐性的目的。 东北林业大学硕士学位论文 1 3 盐胁迫调控的信号传导与基因表达 13 1s o s 信号途径 最近，z h u i 】等人的一系列关于s o s 突变体的工作，揭示出一条盐胁迫反应中全新 的信号通路。通过快中子轰击和t - d n a 插入突变等方法，从拟南芥中筛选出一系列超 盐敏感突变体( s a l to v e r l ys e n s i t i v e ，s o s ) ”“”】，遗传分析表明这些突变体属于5 个等位基 因群，s o s i - s o s 5 。 l i u 等认为。9 0 眄是拟南芥耐盐基因的一个必需基因。s o s l 突变体使拟南芥对高浓 度n a + 或低浓度k + 的环境相当敏感，它编码一个假定的n a + h + 逆向运输蛋白，其n 端 高度疏水，并带有1 2 个转膜区域。s o s 2 是拟南芥中重要的耐盐基因【2 。1 ，它编码一个 s e r t h r 蛋白激酶，s o s 2 突变体完全降低了植物在高浓度和低浓度环境下的忍耐性。 s o s 3 编码一个含有3 个e f 臂结构的c a 2 + 结合蛋白，其n 端有一个豆蔻酰化 ( m y r i s t o y l a t i o n ) 位点，此位点是该蛋白功能所必需的。表型叠加分析( p h e n o t y p i c a d d i t i v i t ya n a l y s i s ) 证明s o s l 、s o s 2 和s o s 3 在一条共同的s o s 信号传导途径中起作 用。该传导途径的主要作用机理是：c a 2 + 依赖性的s o s 3 是s o s 途径中最上游成员，植 物对盐胁迫的响应涉及一个短的调控级信号系统，细胞内部或外部感知高n a + 胁迫后， 未知原因导致了细胞质中c a 2 + 的富积，s o s 3 结合这些游离的c a 2 + 并激活s o s 2 蛋白激 酶，活化的s o s 3 s o s 2 激酶复合体使得s o s l 或其它的转运蛋白进行表达。s o s l 基因 的表达和转运蛋白的调控维持着诸如n a + 和k + 的动态平衡，从而使得植物可以忍受n a + 胁 迫。 13 2 脱落酸 脱落酸( a b s c i s i ca c i d ，a b a ) 是种植物激素，能促进叶子脱落和芽的休眠。对脱落 酸的不断研究发现其调节多种生理发育过程，其中之一就是营养体对渗透胁迫的反应。 和干旱条件一样，盐渍条件也能使叶中脱落酸的含量显著增高，细胞分裂素的含量显著 降低。这种变化能诱导气孔关闭从而抑制蒸腾作用、减少盐分吸收，还能限制根中盐 离子向木质部的转移，因而有助于抵抗盐害。许多研究发现，a b a 含量的升高是渗透 胁迫诱导的共同现象。同时，a b a 处理也能诱导植物对渗透胁迫的抗性。因此，多数 学者认为a b a 在渗透胁迫中充当传递信号的角色。 1 3 3 耐盐基因的转录调控元件 基因的转录调控元件主要有顺式作用元件( c 括a c t i n ge l e m e n t s ) 和反式作用 n 子- ( t r a n s a c t i n gf a c t o r s ) 。 1 3 3 1 顺式作用元件 研究得比较清楚的顺式作用元件包括a b a 应- - 2 u l q = ( a b a r e s p o n s i v ee l e m e n t ， a b r e ) 、脱水应答元件( d e h y d r a t i o nr e s p o n s i v ee l e m e n t ，d r e ) 、乙烯应答元件f e t h y l e n e 1 绪论 r e s p o n s i v ee l e m e n t e r e ) 等。 a b a 的保守顺式作用元件( c i sa c t i n ge l e m e n t ) c c a c g t g g ( a b r e ) 已经在多个a b a 诱导表达的基因中得到鉴定。人们还发现有一些渗透胁追诱导产生的信号传导途径和基 因表达调控是独立于a b a 的，其中一类重要的顺式作用元件是分析拟南芥r d 2 9 a 基因 的启动子发现的1 2 t , 2 2 1 。s h i n o z a k i 等为了了解植物逆境应答基因，通过差异显示方法从拟 南芥中克隆了一批受脱水诱导的基因r a ( r e s p o n s i v et od e h y d r a t i o n ) ，其中一个受脱水，同 时也受高盐、低温诱导的r d 2 9 a 基因的启动子中有一个与逆境胁迫应答有关的顺式元件 f d e h y d r a t i o nr e s p o n s i v ee l e m e n t ，d e a l ? ) ，并发现该元件有一个核心序列c c g a c ，陔核心 序列普遍存在于对干旱、高盐或低温胁迫应答基因的启动子中，对这些应答基因在逆境 下诱导表达起调控作用，但是其作用过程是独立于a b a 信号途径的【2 ”。进一步的研究 还发现，依赖和不依赖于a b a 的信号传导途径在激发胁迫调控基因表达时是以交错融 汇的方式发挥作用的【2 ”。研究用外源脱落酸处理后诱导的基因启动子，发现有些启动予 中含有一个回纹序列c a c g t g ，其核心序列为a c g t ，又称g b o x 。在许多胁迫诱导植 物基因中也发现存在g b o x 元件，说明此元件涉及胁迫诱导基因的表达。近年来在逆境 因子f 寒冷、干旱、盐碱) 诱导信号传导研究方面的另一重要进展是发现了环状腺苷二磷 酸核糖( c y c l i c a d pr i b o s e ，c a d p r ) 信号分子，它主要通过钙离子发挥作用，并先于a b a 诱导一些基因的表达【2 单6 1 。乙烯反应元件也是很重要的一类顺式作用元件。在伤害、高 盐或干旱等胁迫下，乙烯反应元件中的g c c 盒能与e r f s 结合调节基因的表达【27 ，“j ，这 些顺式作用元件的发现对研究植物胁迫应答基因的调控具有非常重要的意义。 13 3 2 转录因子 转录因子也称为反式作用因子，是指能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相 互作用，并对转录有激活或抑制作用的d n a 结合蛋白 2 8 1 。典型的转录因子一般具有4 个功能区：d n a 结合区、转录调控区、核定位信号区和寡聚化位点。通常根据保守性 较强的d n a 结合区的不同可将调控干旱、高盐、低温等相关的转录因子分为： ( 1 ) b z i p 类转录因子，它们是普遍存在于动植物及微生物中的一类转录因子，如能与 a b r e 结合的t r a b l 2 9 1 ，a b f s ( a b r e - b i n d i n gf a c t o r s ) 3 0 】以及玉米的v p l 3 1 】转录因子。 ( 2 ) a p 2 e r e b p 类转录因子，它们广泛存在于拟南芥( a p 2 ) 、番茄、烟草( e t h y l e n e r e s p o n s ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ，e r e b p s ) 、水稻、玉米等植物中，与植物的干旱、高盐 或低温信号有关。拟南芥的d r e b 转录因子属于a p 2 类转录因子，其d n a 结合域由 5 8 个氨基酸组成，非常保守 3 2 , 2 8 】。拟南芥中的c b f ( c r e p e a t d r e l t r e b i n d i n gp r o t e i n ) 基因家族c b f 2 、c b f 3 、c b f l 也编码含a p 2d n a 结合域的蛋白质，但它不受a b a 和 脱水调节f 3 3 。 ( 3 ) h o m e n d o m a i n l e u c i n ez i p p e r ( h d z i p ) 转录因子，至今只在植物中被发现。拟南芥 h d z i p 家族蛋白分为四类h d z i p i 、i i 、i i i 和 2 8 1 。e v a 从拟南芥中鉴定了一个h d z i p 基因a t h b 6 。a t h b 6 在茁期组成型表达，但也可被水胁迫、渗透胁迫或外源脱落酸 处理后，在短时间内显著上调。 ( 4 ) 含锌指结构域的转录因子，如苜蓿的爿珈2 ，转录因子是一个z i n c f i n g e r 家族的新 成员，这类蛋白可与盐诱导基因胁朋p 2 的启动子片段结合。愀y 蛋白是最近才鉴 定的只存在于植物中的一类新的转录因子，它们具有保守的6 0 个氨基酸的w r k y 机构 域。同时该结构域中还含有一类新的类似锌指模体，因而也可能是一类新的锌指蛋白。 ( 5 ) m y b 转录因子也是一类非常重要的转录因子，它是一类在植物中有特殊作用的 d n a 结合蛋白，可通过保守的5 2 个氨基酸的d n a 结合域( m y b ) 来与d n a 结合。植物 m y b 蛋白的功能包括二级代谢的调节细胞多肽，控制分生组织形成和细胞周期的调控 1 3 4 。 1 4 基因组学方法在植物耐盐机理研究中的应用 盐生植物( h a l o p h y t e ) 耐盐机理是一个复杂的多因子协作的问题，因此，采用基因组 学方法如e s t 和e d n a 芯片技术开展研究是揭示这种机理的重要途径p “。与r t p c r 干i i d d r t ，p c r 等研究方法相比，通过从e d n a 文库中随机挑克隆进行测序所获得的e s t 建 立e s t 数据库，然后寻找耐盐相关基因是可行和有效的。e d n a 芯片是基于r e v e r s e n o r t h e r n 、用于检测基因表达的技术，它还可以检测植物特殊胁迫的耐性，如盐、干旱 和极端温度的基因表达的不同或相似之处。此外，芯片还为检测胁迫耐性基因的转录物 提供快速全面的技术，这种转录物的表达模式在逆境条件下不同于从野生型突变所产生 的生化终点或信号途径功能异常的突变株。自然界中存在一些盐生植物，它们可以在高 盐环境下正常生长，许多学者相信盐生植物中蕴含有可用于基因工程改良农作物的耐盐 基因。植物的功能基因组学为寻找耐盐基因、阐明植物耐盐机理提供了技术基础，为植 物在耐盐性方面的改良创造了有利条件。 1 4 1 表达序列标签( e s t ) 技术 真核生物庞大的基因组中仅有约2 一3 的序列编码基因。如人的基因组由3 1 7 亿 b p 组成，约有2 的序列编码3 3 万个基因；水稻基因组为4 2 亿b p ，编码约5 万个基 因l j “。直接从如此众多的碱基序列中克隆基因，相当费时费力。如果按照传统的方法逐 个基因进行研究，要确定几万个基因的表达方式及相互间的关系，几乎是不可能完成 的。从基因的转录本m r n a 着手，对基因分离纯化，并进行功能和表达模式分析及定 位，则相对经济快捷。e s t 技术就是基于这种认识而发展起来的【2 】。通过从e d n a 文库 中随机挑取克隆进行测序，所获得e d n a37 或5 端的部分序列称为表达序列标签 ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，e s t ) ，e s t 的长度一般为3 0 0 - 5 0 0 b p 左右【3 7 , 3 8 】。 1 4 2 e s t 分析的思路与应用 e s t 分析的一般思路为：将基因编码区序y o ( c o d i n gs e q u e n c e ，c d s ) 与e s t 数据进 行比较，根据结果寻找感兴趣的e s t s ( 标准：长度l o o b p ，相似性介于5 0 8 5 之 问) ，再将所选e s t s 与g e n e m b l e 数据库进行比较、找出未克隆的e s t s ，与d b e s t 、 d s s t s 、d b h t g s 、m g d 及u n i g e n e 数据库比较搜寻重叠群c o n t i g s ，进而设计引物进行 p c r 扩增，或筛选c d n a 文库或索取c d n a 克隆号进行电子拼接，获取全长基因的 c d n a ，最终将该e d n a 用于基因定位、结构、功能检测分析等研究 3 9 1 。 e s t 的应用范围主要包括以下几个方面：( 1 ) 不同剪接型的识别；( 2 ) 构建重叠群 1 绪论 c o n t i g s ，加速全长基因的克隆；( 3 ) 基因结构分析( 内含予夕i 显子识别) ；( 4 ) 基因定位分 析；( 5 ) 基因表达分析1 4 。 基因表达的差异分析，可以通过计算某一基因片段在e s t 文库中出现的频率束确 定。然而，e s t 标签常常是由均一化的( n o r m a l i z e d ) e d n a 文库而来的【4 1 i 。而来自均一化 的c d n a 文库的e s t 序列，仅能用来比较c d n a 文库间基因表达有无的差异。比较基 因表达量的差异，必须用未均一化的( u n n o r m a l i z e d ) c d n a 文库。尽管e s t 分析存在一 定的局限性，但随着拟南芥和水稻全基因组测序的完成以及小麦、大豆、高粱等重要农 作物e s t 计划的实施，g e r d 3 a n k 中e s t 序列的数量迅速增加，用e s t 序列分析来研究 基因表达越来越显示出强大的生命力。目前，通过对公共数据库中人类e s t 的分析， 鉴定c d n a 文库间基因差异表达的网络资源已经发展起来了【4 2 】。 e s t 技术最早由s i k e l a 和m a t s u b a r a 提出，并被v e n t e r 大规模应用。e s t 已被广泛 应用于基因克隆、遗传图谱制作、功能分析等方面，直接推动了人类基因组计划的提前 完成；e s t 技术也是c d n a 芯片技术的基础，将e s t 计划所获得的序列点制成芯片， 成为研究基因表达及基因功能的强大平台。在后基因组时代e s t 技术和基因芯片技术 作为最重要的平台将显示出更加重要的作用。随着后基因组时代的到来，生物信息学将 在基因功能研究中发挥愈来愈重要的作用。而e s t 分析是生物信息学分析的核心之 一，它为新基因的克隆和功能分析提供了快速、有效的切入点。通过e s t 综合分析， 克隆、鉴定和定位新基因，对于获取和克隆侯选基因有重要参考价值。 1 4 3 植物的表达序列标签 早期，植物e s t 计划主要集中在拟南芥和水稻上，其它植物的e s t 相对较少，到 1 9 9 8 年1 2 月底，在美国国家生物技术信息中心( n c b i ) 数据库中公布的各种植物e s t 的 数目总和仅有几万条。截止2 0 0 5 年4 月1 5 日，这个数字变为2 66 3 06 4 9 条，6 年半内 增加了一千多倍。e s t 序列的来源覆盖了几乎所有重要的粮食作物、经济作物和多种树 木，包括水稻、小麦、大麦、大豆、玉米、马铃薯、棉花、甜菜、番茄、葡萄、高粱