（动物遗传育种与繁殖专业论文）猪解耦联蛋白基因（UCP2和UCP3）遗传变异研究.pdf

中国农业大学硕士学位论文 摘要 摘要 u c p s 基因具有调节a t p 产生、维持体温、控制体内超氧自由基( 活性氧) 的生成、调控脂 肪代谢和维持氧化磷酸化平衡等多方面功能。目前，u c p 基因家族在者禽上研究得较少。本研究 通过对u c p 2 和u c 丹基因的克隆、测序，得到了u c p 2 和u c p 3 基因的全序列，通过对这两个 基内分别进行基因组扫描，初步获得了基因的多态信息。通过p c r 、p c r s s c p 、p c r r f l p 和 测序等方法，对多态性位点在1 5 个猪品种中进行了群体验证并进行基因分型。u c p 2 基因共验证 了1 2 个突变位点，其中包括3 个缺失突变和9 个单碱基突变，在扫描的外显子中未发现突变； u c p 3 基因共验证了2 4 个突变位点，其中包括4 个缺失突变和2 0 个单碱基突变，在扫描的外显 子中发现2 个s n p s ：t 1 0 5 6 g ( 错义突变) 和c 1 4 5 3 t ( 同义突变) 。应用转录网子分析软件 n 毽e a r c hv e t1 3 分别对u c p 2 和e e p 3 基因的非翻译区进行潜在调控元什和蛋白结台位点的 预测，结果表明，u c p 2 基因仅有一处突变g 一4 2 a 改变了转录因f 结合位点；u c p 3 基因a 5 2 1 g 、 1 8 3 0 n ! 缺失、3 2 1 9 n t 缺失、c 3 3 9 9 a 和c 3 4 0 1 a 几个位点的碱基突变使转录因子的结合情况发生 了改变。u c p 2 和u c p 3 连锁基因共存在7 个缺失位点，对这7 个缺失位点进行联合分析表明： u c p 基因缺失突变可能对猪的生产性能日增重有一定影响。对u c p 3 基因的4 个引起转录结合位 点改变的多态性位点1 8 3 0 n t 处1 6 b p 缺失、3 2 1 9 n t 处6 b p 缺失、c 3 3 9 9 a 和c 3 4 0 1 a 进行单倍型分 析，b b a a 组合的单倍型h 1 的转录因二j 二可能对猪的生产性能日增重有一定的促进作用。总之， u c p 2 和u c p 3 基冈存在极其丰富的变异，其中碱基错义突变和缺失突变的检测及引起转录因子 结台位点改变的碱基突变的发现可作为重要的分子遗传标记，为进一步研究u c p 基因转录、调 控提供了理论依据。 关键词：猪，解耦联蛋白2 ，解耦联蛋白3 ，单核苷酸多态，缺失 1 1 1 中国农业大学顿士学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t u n c o u p l i n gp r o t e i n s ( v c p s ) a r em i t o c h o n d r i a lm e m b r a n et r a n s p o r t e r s , a c t i n ga sa l lu n c o u p l e ri n o x i d a t i v ep h o s p h o r y l a t i o n u c p sh a v ean u m b e ro fp r o p o s e dr o l e si nt h er e g u l a t i o no fa t ps y n t h e s i s a n df a t t ya c i dm e t a b o l i s m i nt h i se x p e r i m e n t ，t h ep o r c i n eu n c o u p l i n gp r o t e i n2 ( u c p 2 ) a n d3 ( v c p 3 ) g e n e sw e r ec l o n e db yp c rt h e ns e q u e n c e d t w od n as e q u e n c e sw a sa c q u i r e dr e s p e c t i v e l y w e d e t e c t e dt h ep o l y m o r p h i s m so ft h et w og e n e sb yp c r - s s c p ，p c r - r f l pa n ds oo n ，a n dt h e nc o n f i r m e d b yd n as e q u e n c i n g 1 3p o l y m o l p h i s m sw e r ed i s c o v e r e di nu c p 2g e n e ，i n c l u d i n gt e ns n p sa n d3 d e l e t i o n s 2 4p o l y m o r p h i s m sw e r ed i s c o v e r e di nu c p 3g e n e ，i n c l u d i n g2 0s n p sa n d4d e l e t i o n s ，i n w h i c ht 1 0 5 6 gw a sm i s s e n s em u t a t i o na n dc 1 4 5 3 tw a ss i l e n tm u t a t i o n w ep r e d i c tt h ep o t e n t i a lp r o t e i n f a c t o rb i n d i n gs i t e sb yt r a n s c r i p t i o nf a c t o ra n a l y s i st o o lt f s e a r c hv e r l 3o nl i n e t h er e s u l tc l e w e d t h a tg - 4 2 ai nu c p 2a n da 5 2 1 g1 6 b pd e l e t i o na t1 8 3 0 n t ，6 b pd e l e t i o na t3 2 1 9 n t ，c 3 3 9 9 a ，c 3 4 0 1 ai n u c p 3m a yh a v es o m ee f f e c to nt h er e g u l a t i o no fu c p 2a n du c p 3 g e n et r a n s c r i p t i o na n dr e g u l a t i o n b e c a u s et h o s em u t a t i o nc a u s ec h a n g e si nt h en u m b e r sa n dk i n d so ft r a n s c r i p t i o nf a c t o rb i n d i n gt ot h e i n t r o n s 7d e l e t e dm u t a t i o n sw e r ec o v e r e di n l i n k a g eg e n e so fu c p 2a n du c p 3 t h eg e n o t y p e c o m p o u n d i n go f7d e l e t e ds i t e sh a ds i g n i f i c a n te f f e c to np e r f o r m a n c et r a i t so ft h ep i gs u c ha sw e i g h t t h e r ea r e1 6 b pd e l e t i o na t1 8 3 0 n t ，6 b pd e l e t i o na t3 2 1 9 n t ，c 3 3 9 9 aa n dc 3 4 0 1 af o u ri m p o r t a n ts i t e s w h i c hg i v er i s et oc h a n g e so ft r a n s c r i p t i o nf a c t o rb i n d i n gs i t e s h a p l o t y p ea n a l y s i so ft h o s es i t e s i n d i c a t e st h a th a p l o t y p e1i sf a v o r a b l ea n dt r a n s c r i p t i o nf a c t o ro ft h o s es i t e sm a yp r o m o t eg r o w t ho f p i g s i naw o r d ，a l lt h o s er e s u l ti n d i c a t e dt h a tu c p 2a n du c p 3g e n e sh a v ep l e n t yo fp o l y m o r p h i s m si n t h i sp o p u l a t i o na n dd e l e t e dm u t a t i o n sw e r er e m a r k a b l ya s s o c i a t i e dw i t hb o d yw e i g l l lo ft h ep i g t h i s s t u d ys u g g e s t st h a tt h e s em a r k sc a nb eu s e f u lf o rn e x tr e s e a r c ho fg e n et r a n s c r i p t i o na n dr e g u l a t i o n k e yw o r d s ：p i g ，u c p 2 ，u c p 3 ，s n p ，d e l e t i o n i v 国家自然科学基金( 项目编号：3 0 4 7 1 2 3 5 ) 和 霍英东教育基金( 项目编号：9 1 0 2 8 ) 资助 t h i sw o r kw a sf u n d e db yn a t i o n a ln a t u r a ls c i e n c e f o u n d a t i o no fc h i n a ( n o 3 0 4 7 1 2 3 5 ) a n df o k y i n g t u n ge d u c a t i o nf o u n d a t i o n ( n o 9 1 0 2 8 ) 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：杏聿乏爷 时间： 知。厂年占月中f 1 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农n p 大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 杏享乞铲 时间： 知d 厂年占月牛日 导师签名：造善i 傻 时问：纵年月，4 日 中国农业大学硕上学位论文 解耦联蛋白基因结构与功能的研究进展 第一章解耦联蛋白基因结构与功能的研究进展 解耦联蛋白( u n c o u p j i n gp r o t e i n ，u c p ) 是近年来发现的线粒体阴离子转运家族( m i t o c h o n d l i a l a n i o n c a r r i e r f a m i l y , m a c f ) 成员，是当前发现的晟直接影响能量代谢的功能基因，u c p 最主要 的生理功能是氧化磷酸化的解耦联作用，即决定能量流向是氧化磷酸化反应生成a t p 还是产热散 失。机体摄入的能量除了一部分以脂肪的形式储存外，大部分经能量释放、转移、利用等过程后 以热能的形式散发或转变为a t p 用于体内各种化学反应的化学功、用于离子转运的转运功及骨骼 肌对外界所做的机械功等形式。 到目前为止，u c p 基因家族中共发现了6 个成员，包括u c p l 、u c p 2 、u c p 3 、u c p 4 、 u c p 5 ( 或称脚犯p j ) 和u c 尸6 ，它们分布在动物、植物、鱼类、真菌和原生动物中【1 j 。 1 1 u c p 基因家族的概述 1 1 1 此尸，基因 1 9 8 5 年，d a v i dn i c h o l l s 等首次发现了人的u c p i 基因，并定位于4 号染色体长臂( 4 q 3 1 ) j ， 基因全长1 3 k b ，包括9 k b 的转录区，由6 个外显子组成，编码3 0 7 个氨基酸。猪的u 二p j 基网 1 二1 9 9 9 年由l a r s e n 等9 j 克隆了部分d n a 片段，并定位在8 q 2 1 ，由于只克隆了部分片段，所以 该基因的大小、结构和表达调控方式均不清楚。u c p l 主要在棕色脂肪组织( b a t ) 中表达，b a t 是哺乳动物体内非寒战性产热的主要来源，其产热机制是通过u c p l 的作用使氧化磷酸化和a t p 的合成解耦联，从而增加能量消耗和产热，由丁b a t 在成人体内很少，所以，u c p l 在人体能龟 平衡中的作_ l ；f j 不大1 4 j 。猪也是到目前为i l 所发现的体内缺少b a t 的物种之一，因此，猪可以利用 其他的产热机制如寒战性产热来维持体温p 】。 1 1 2u c p 2 基因 1 9 9 7 年，f l e u r y 等1 6 发现了人的u c p 2 基因，并定位于1 1 号染色体l l q l 3 上。德国l e n t e s 研究小组用p c r 和序列分析法获得了人的u c p 2 基因结构，u c p 2 基因全长8 7 k b ，由8 个外显 子组成，其中有2 个不翻译的外显子，编码3 0 9 个氨基酸，与u c p l 有5 5 的氨基酸同源性。1 9 9 9 年，w e m e r 等首次克隆了猪的u c p 2 基因全部编码序列的e d n a ，并定位在9 0 2 1 一p 2 4 上。方 美英等 8 1 于2 0 0 2 年克隆到包含外显子3 和4 的3 7 9 b p 的d n a 片段。 u c p 2 广泛存在于动物脑、肌肉、白脂等组织中，d a n i e l 采用n o r t h e r n 分析了小鼠的脑、心 脏、骨骼肌、肝脏、小肠、肺脏、脾脏、睾丸、输卵管、白脂肪、棕脂肪，发现u c p 2 在小肠、 中国农业大学硕士学位论文解耦联蛋白基因结构与功能的研究进展 肺脏、脾脏、白脂肪表达量较大，除在肌肉中表达量较少外其它组织均有表达，这提示u c p 2 在 能量平衡、体重和热量调节都具有重要意义【9 l d 1 1 3u c p 3 基因 u c p 2 基因发现后不久，b o s s 等i 】o j 首次克隆了人的u c p 3 基因，并将其定位于1 1 号染色体 1 1 q 1 3 上【】”，并与u c p 2 基因紧密连锁，以基因簇的形式存在于染色体上。人u c p 2 和u c p 3 基因相距约6 0 0 0 b p 氨基酸相似性为7 1 。u c p 3 存在两种转录形式，u c p 3 s 和u c p 3 l ，u c p 3 l 的c 端比u c p 粥多一个跨膜域和核苷酸结合位点，嘌呤核苷酸与该位点结合后抑制u c p 的功 能，u c p 3 s 缺乏这段氨基酸，其解耦联功能可能会更强【1 “。 猪的u c p 3 基因也是由w e r n e r 等i 7 j 于1 9 9 9 年克隆的，并定位在染色体9 p 2 1 一p 2 4 上。由于 该基因序列是从m r n a 克隆得到的c d n a 序列，所以该基因的结构尚不清楚。u c p 3 主要在骨 骼肌、脂肪组织( 包括自脂和红脂) 中表达最为显著1 9 j 。 1 1 4l i c p 4 f 1 1u c p 5 基因 1 9 9 9 年，m a o 等1 1 3 l 首次发现了u c p 4 基因，其基因定位丁人类6 号染色体( 6 p 1 1 ，2 q 1 2 ) 上， 由3 2 3 个氨基酸组成，u c p 4 基因仅在胎儿和成人脑组织中表达。u c p 4 基因在哺乳动物细胞中 的异常表达能降低线粒体的膜电位，表明u c p 4 可能参与体温调节的生热作用和脑组织代谢。 1 9 9 8 年，s a n c h i s 等【1 4 】首次发现了脑线粒体载体蛋白一1 ( b m c p l ) 。2 0 0 0 年，y u 等【1 5 】也克隆 出了b m c p l 基因，但其是在发现u c p 4 基因之后才被命名为u c p 5 。u c p 5 基因定位丁人类x 染色体( xq 2 4 ) 上，由3 2 2 个氢基酸组成，u c p 5 具有一个其他u c p s 所不具有的疏水氨基末端 序列，由2 2 个氨基酸组成，这一独特的序列可能与线粒体膜发生相互作用。u c p 5 主要存在脑和 睾丸组织中，在其他组织中含量很低。研究表明i l ”，u c p 5 可降低线粒体膜电位，具有解耦联活 性。 1 1 5u c p 6 基因 u c p 6 是刚刚被鉴别的u c p 基因家族的另一新成员，存在丁无脊椎动物中。最初是从疟蚊的 基因组中扩增出来的，因u c p 6 的基因的编码序列与哺乳动物u c p 2 和u c p 3 的序列具有很高的 同源性，所以命名为u c p 6 ”，该基因的全序列和结构到目前均未知。 2 中国农业火学硕士学位论文解耦联蛋白基凶结构与功能的研究进展 1 2u c p 基因家族结构和功能 1 2 1u c p 基因家族结构 小鼠、大鼠和人的u c p l 的基冈组已分析清楚，分别定位于8 、1 9 和4 号染色体，这三种动 物的u c p l 基因结构具有很高的保守性，有6 个外显子编码一个蛋向质跨膜域。u c p 2 和u c p 3 的结构与u c p l 结构比较相似，但与u c p l 不同的是，它食有1 2 个不翻译的外显子，分别位于 u c p 2 、u c p 3 的5 端1 1 “。u c p 2 基因5 端7 5 b p 上游存在一很强的顺式调控增强子，人u c p 2 基 因为8 7 k b ，共有8 个外显子，与u c p l 有5 9 的相似性，编码氨基酸为3 0 9 个1 1 ”。人和小鼠的 u c p 2 开放阅读框，在外显子2 编码3 6 个氨基酸，u c p 2 编码序列开始于外显子3 ，与u c p l 不 同，小鼠和人u c p 2 启动子区缺乏t a t a 和c a a t 盒，但富含g c l ” 。研究发现，u c p 2 和u c p 3 基因紧密连锁以基因簇的形式存在于染色体上，因此研究者们推测这两个基因可能是起源于同一 祖先基因或是同一基因的重复扩增。在小鼠、人u c p 2 基因中，s p l ，a p 1 ，a p - 2 ，c r e b ( c a m p - r e s p o n ce l e m e n tb i n d i n g p r o t e i n ) ，m y o d ，g r ( g l u c o c o a i c o i dr e c e p t o r ) ，p p a r 等参与u c p 2 起始转录的调控。小鼠u c p 2 基因启动子区域的1 2 5 0 b p 显示显著的启动子活性，在1 6 0 一- 6 7 8 b p 显示显著的正调节活性，人u c p 2 基冈启动子区的1 4 0 0 b p 在脂肪细胞系中显示显著的启动子活 性。有人在6 0 2 上游和内含子1 中发现沉默子1 1 9 - 2 0 1 。人的u c p s 基因结构见图1 - 1 。 图l 一1u c p s 基田结构图( 引自d a n i e lr ) f i g - 1 - 1s t r u c t u r e o f u c p s ( c i t e d a n i e l r ) 3 目前，研究时间晟长、结构和功能最为清楚的是人的u c p 基因家族，见表1 - 1 所示。 表1 - 1 人u c p 单因家族的结构特征与功能 t a b l e l 1c h a r a c t e ra n df u n c t i o no fu c pf a m i l y 线粒体内膜代谢载体蛋白家族成员都具有相似的结构和功能，这类载体蛋白最典型的结构特 征是二重结构，即由3 个u 型跨膜单位构成，每个单位由1 0 0 个氨基酸组成，包括2 个疏水延伸 和一个k 的亲水环，形成了6 个由a 一螺旋组成的跨膜结构域。全部蛋白质结构中包括5 0 的a 螺旋、3 0 的8 一折叠、1 5 的b 转角和7 的无规则卷曲。u c p 的氨基酸排列顺序在备物种间具 有高度的同源性。u c p 的功能单位是个二聚体，u c p 多肽链分子6 次穿过脂质双层的线粒体内 膜，碳末端和氮末端最终都停留在线粒体膜间隙中( 见图1 - 2 ) 。 1 2 2u c p 基因家族功能 嘴管 基置 图卜2 解耦联蛋白的分子结构 f i g ，1 - 2m o l e c u l es t r u c l t l l eo fu c pg e n e u c p 最主要的生理功能是氧化磷酸化的解耦联作用，即决定能量流向是氧化磷酸化反应还 是生成a t p 产热。机体摄入的能量除有一部分以脂肪的形式储存外，大部分经能量释放、转移、 利用的过程后以热能的形式散发或转变为a t p 用于体内各种化学反应的化学功、用于离子转运 的转运功及骨骼肌对外界所做的机械功等形式。机体产热部位主要在线粒体，产热量主要取决 于u c p ，即位于线粒体内膜介导h + 内流的跨膜蛋白质形成的质子渗漏的程度。线粒体内经三 羧酸循环产生的还原当量沿电子传递链传递时释放出的能量可将从线粒体基质转移至内膜 的胞液面，形成一个跨线粒体内膜的质子电化学梯度牡r 卜。当质子从胞液面顺梯度回至基质面 4 中国农业人学硕士学位论文解耦联蛋白基因结构与功能的研究进展 时，其中蕴含的能量用以推动a d p 与磷酸结合生成a t p ，此过程称为氧化磷酸化耦联。若h + 进 入线粒体内膜而不与a t p 合成过程耦联( 氧化磷酸化解耦联) ，能量则以热量的形式散失，形成 质子渗漏。 冈此，产热的多少是影响能量消耗的重要因素，而这个关键的产热机器就是u c p o 通常机体 在静l e 代谢状态下以w 计形式储存的能量通过u c p 质子渗漏产生热量；在a t p 利用少时，a d p 水平低，与a t p 合成酶耦联的质子转运低，“计升高，使u c p 介导的质子渗漏提高，产热增加。 当a t p 利用增加时，a d p 水平提高，与a t p 合成酶耦联的质子转运提高，蛳降低，u c p 介 导的质子渗漏降低，使大部分质子转运与a t p 合成酶耦联，生成a t p ，即由于u c p 质子渗漏的 存在使a t p 需求增加时质子渗漏和a t p 台成之间得以转换，而无须依赖于底物代谢和线粒体呼 吸的增加加快a t p 的大量产生( 见图1 - 3 所示) 。肌肉组织中a t p 的利用常有火幅度的提高，这 与肌肉组织中u c p 2 和u c p 3 的基因表达丰富存在密切关系。 止代捷鸯盘量措害增抽袄盎 图1 - 3 u c p 与a t p 合成的代谢关系 f i g 1 - 3t h er e l a t i o nb e t w e e nu c p a n da t p s y n t h e s i s 由于组织分布和表达的差异，不同u c p 成员在功能上也存在差异。 u c p l 主要分布于b a t 中，b a t 是机体产热的主要组织，人类及大多数哺乳动物的脂肪 组织为白脂，b a t 仅婴儿体内有少量存在。 u c p 2 和u c p 3 具有降低活性氧产物( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 的作用，在a d p 耗竭，a t p 合成酶( a t p s y n t h a s e ，a t p a s e ) 活性f 降时，线粒体膜外的质子通过a t p a s e 回流 减少，引起4 时升高，升高的舶一可导致线粒体呼吸链电子传递阻力增大( 图l - 4 b ) ，致使 电子发生泄漏而产生月0 s 产物o - 2 0o 一：为超氧阴离子的自由基，是导致机体损伤和衰老的重 要物质因素之一【2 ”。u c p 降低胁艘进氧耗，维持呼吸链电子传递，抑制r o s 的产生。u c p 2 和u c p 3 通过解耦联作用，防止蚶的过度提高，减少r o s 产量，在减缓由于氧化赢激而产 生的老化效应方面起重要作用。 u c p 2 在组织中分布广泛，但该基因的表达受组织类型和生理状态的影响也很大，因此 多数研究者认为u c p 2 基因具有多种基因功效。u c p 2 基因敲除小鼠( u c p 2 - - ) 表现出较强 的抵抗力：巨噬细胞产生出大量的自由基，并产生较多的活性氧( n o s ) ，表明线粒体膜存在 较高的电压口2 】；而另一个研究小组的研究则发现u c p 2 基因敲除小鼠( u c p 2 + ) 的胰岛维持 5 中国农业大学硕士学位论文解耦联蛋白基凼结构与功能的研究进展 了较高的a t p 水平，同时伴随了胰岛素的分泌量增加口3 j ；来自u c p 2 + 小鼠胸腺细胞的研究 发现细胞内5 0 的质子渗透由u c p 2 基因分配口“，u c p 2 基因在氧化剂的存在f 表达量增加， 在这种情形fu c p 2 基因通过限制线粒体活性氧的含量来保护细胞免受损伤，进而避免细胞 凋亡 2 5 j 。巨噬细胞通过降低u c p 2 基因表达量而提升活性氧的含量，进而抵抗传染。目前普 遍认为，u c p 2 基因作为过氧化物阴离子的载体行使降低活性氧含量的使命。 u c p 3 基因敲除小鼠( u c p 3 - j ) 肌肉线粒体的能量旺盛，表现出解耦联蛋白作用，同时 通过基冈表达研究发现，高脂饮食可以提高b a t 中u c p l 、u c p 3m r n a 、w a t 中u c p 3 及 骨骼肌中u c p 3m r n a 水平 2 6 1 ( 图1 4 a 1 。禁食或饮食限制时肌肉内u c p 2 、u c p 3 基因表达 提高，机体代谢率降低，此时肌肉底物利用转换为以脂类氧化为主；当继以低脂高碳水化合 物饮食喂养时，肌肉内u c p 3 、u c p 3 基因表达下降，此时脂类利用亦下降。由此多数学者认 为u c p 3 、u c p 3 具有提高脂肪酸利用和调节脂肪代谢的能力口”( 图1 - 4 b ) 。 i 辞蛰；篡”a r 。e v 一 西 | ! ：王一磊1 h ，一。 m l _ _ _ ，7 默、 蠢蔚触 蝗置霹内曩l毒 w p t 台 曩毽体生铀台匪 il 热量a d p h 日 一 台康 一辔 蚤始麻 肼冉 图卜4u c p 基凶家族的代谢调控机制 f i g 1 4r e g u l a t i n gm e c h a n i s mo fu c p f a m i l y a u c p 基因家族的氧化磷酸化解耦联调挣过程； a u f l c o u n p j i n go x i d a t i v ep h o s p h o d , l a f i o no fu c pf a m i l y b 脂肪细胞和肌肉细胞中u c p 基因家族的降低活性氧、调节脂肪代谢的调控过程。 b d i m i n i s h i n g r o sa n dr e g u l a t i n g f a t m e t a b o l i s m o f u c p f a m i l y i nc e l lo f f a t a n d m u s d e u c p 4 和b m c p l 的基因功能还不十分清楚，但都具有解离氧化磷酸化耦联的作用【”1 。u c p 4 和b m c p l 的基因结构较为相似，与u c p l 、u c p 2 、u c p 3 差别较大。 6 霉1 髓 厂m 唪峄矿象_|i 中国农业大学硕士学位论文解耦联蛋白基因结构与功能的研究进展 综上所述，u c p 基因具有调节a t p 产生、维持体温、控制体内超氧自由基( 活性氧) 的生 成、调控脂肪代谢和维持氧化磷酸化平衡等多方面功能。u c p 基因家族是当前发现的展直接影响 能量代谢的功能基因。 1 3u c p s 基因起源和进化 u c p s 是线粒体内膜上一种具有调肯质子跨膜转运作用的转运蛋f 1 ，因可以使呼吸链和a t p 合成解耦联而得名。目前，有关u c p 基冈家族的起源和进化存在多种假说。b o r e c k y 等口”研究表 明，u c p l 、u c p 2 和u c p 3 在结构上具有相似性，属于线粒体阴离子转运家族的一个亚族，而 u c p 4 和u c p 5 关系较近，属于转运家族的另一个亚族，所以，从分子的、生物化学的和动植物 进化史的角度分析，u c p 2 基因可以看作是u c p 基因家族的原型。h a n f i k 等咖】通过对果蝇、人和 植物的u c p l 、u c p 2 、u c p 3 和u c p 4 的聚类比较发现，u c p 4 是u c p 基因家族的祖先，但这种 假说未被，“泛认同，因为u c p 基囡家族具有多种功能，而u c p 4 基因仅在大脑中特异表达，这 两者之间似乎有些矛盾。但新近的研究结果表明【1 i ，动物u c p s 在原肢动物和节肢动物分化之前 丰要存在3 个分支( 见图1 5 ) ，刚刚被鉴别的u c p 基因家族的另一新成员一劂是u c p l 、u c p 2 、 u c p 3 的共同祖先，这是其中的一个分支。而u c p 4 、u c p 5 分别是另外两个分支。这个蛋白家族 进化的多样性与其具有调节a t p 产生、维持体温和控制体内活性氧生成等功能的多样性是一致 的。 图卜5 动物u c p s 进化聚类图( 引自s o k o l o v a2 0 0 5 ) f i g 1 5h y p o t h e s i so f e v o l u t i o no f a n i m a lu c p s 7 中国农业大学硕士学位论文 解耦联蛋亡l 基因结构与功能的研兜进展 1 4u c p s 基因多态性研究 在人类疾病中，与能量代谢最直接的性状都是当今医学和制药业研究和关注的焦点，包括肥 胖、体形( 如腰臀比、体重指数) 、高血脂、糖尿病等。研究发现u c p 2 或u c p 3 基因的碱基突 变可引起肥胖，例如u c p 2 基因外显子4 的a l a n a l 的错义突变和外显子8 非翻译区3 端的4 5 b p 片段的插入或缺失。u c p 3 外显子3 的c t 突变都可影响能量代谢i j l 。”j 。目前，对人的u c p l 、 u c p 2 和u c p 3 基因已经进行了广泛的多态性研究，并发现存在广泛的多态性位点，但有关它们 对肥胖和糖尿病等方面的影响许多资料是相互矛盾的，不同种族、不同人群甚至不同生理阶段的 人群对u c p s 变异存在不同的反映，不能得出肯定的结论。但有一点是肯定的，u c p s 与机体能 鞋代谢所涉及的疾病或性状都有着直接或间接的联系，u c p 2 在保护脑神经死亡方面具有重要作 用p 3 j ；在m d m a 中毒导致体温升高而引起死亡的事件中，u c p 3 具有不可推卸的责任1 3 “。 在猪的u c p 基因家族的研究中，研究最多的是u c p 2 和u c p 3 基因，u c p 2 和u c p 3 基因紧 密连锁，定位在染色体9 p 2 1 p 2 4 上1 7 】。国外对猪u c p 基因的研究主要集中在基因在特异组织或 特定生理状态下的表达规律及调控上，目前已证实猪u c p 2 ，u c p 3 基因在不同品种猪中存在基 羽表达的差异瞰3 7 1 ，m o s t y n 等研究表明1 3 8 1 ，仔猪出生重与u c p 基囡在特异组织中的表达餐有关。 但这些差异是否直接影响重要经济性状尚需进行基因功能的相关研究。但新近的研究还表明p w ， 猪u c p 2 和u c p 3 基因在皮下脂肪组织中表达的变化与体内葡萄糖的代谢水平无显著差异，也就 是说，u c p 基因的表达量与体内新陈代谢活动的关系可能不密切。猪u c p 基因在遗传结构上的 筹异在国外没有被广泛研究。 国内对猪u c p 基因的研究上起步较晚，相关的研究报道还较少，其研究主要集中在对u c p 基： 内多态性的筛选上。方美英等1 4 ”对猪u c p 3 基因3 调控区进行了克隆测序，通过序列比对分析发现 莨白猪、内江猪、民猪、二二花脸猪存在1 5 个碱基位点的多态，利用p c r - r f l p 分析长白猪、大向 猪、内江猪、民猪、二花脸猪及梅山猪存在连续的9 个多态位点，经f 检验发现二花脸与瞄白猪、 人白猪、内江猪、民猪差异极显著，与梅山猪差异显著，梅山猪与长白猪、民猪差异显著，提示 太湖猪具有独特的种质特性。涂荣剑等1 4 2 1 在u c 丹基因的编码区发现了3 个s n p s 位点，分别位于 开放性读码框架( o r f ) 的第6 2 1 b p ( c t 突变) 、第6 3 0 b p ( c g 突变) 和第8 4 2 b p ( c - - t 突变) ，其中 第三个突变位点导致氨基酸的改变( 甲硫氨酸一苏氨酸) ，该多态性位点导致猪肉质、生长性状 呈现不同程度的差异，研究者推测姗基因可能是影响猪胴体、肉质性状主效基因或与主效基 凼紧密连锁的标记基因。有关猪u 日，基因多态性的研究未见其它更多报道。 1 。5 展望 目前以u c p 3 作为减肥药的试验在小鼠上已取得成功，服用u c p 3 减肥药的小鼠在比正常 小鼠多吃5 4 的食物的情况下，体内的脂肪组织仍比正常小鼠少4 4 - 5 7 ，并且没有任何副作 用的影响，同时还发现试验小鼠的胆固醇水平比正常小鼠低7 0 ，而且其体内具有更有效产生 胰岛素的潜能，这意味着，如果肥胖者服用u c p 3 减肥药时即使大量进食，也不会增加体重， u c p 3 可以使脂肪燃烧速度加快，却不会消耗体力和流汗，因此u c p 3 基因是未来几年能量代 8 中国农业大学硕士学位论文解耦联蛋白基因结构与功能的研究进展 谢相关疾病中最具研制开发前景的药物。 我国是世界第一养猪大国，猪肉是我国人民最广泛喜食的蚩白食品。我国猪的品种资源十 分丰富，地方品种适应性强、肉质好( 如金华猪、香猪) 、繁殖力高( 如太湖猪) ，但生长发育速 度慢、饲料转化效率低、屠宰率和瘦肉率不高，影响和限制了我国猪品种资源的开发与利用。 在保持原有地方品种品质特性的前提下提高饲料转化效率和生k 发育速度，无疑是未来我国猪 育种的发展方向，也是当前我国畜牧科技工作者急待解决科学问题之一。 目前国际上分离畜禽重要经济性状基因的研究正处于蓬勃发展时期，但至今未能从机制上 阐释饲料转化效率、增重等能量代谢相关性状的分子机理。目前，通过候选基阒进行排查、筛 选和鉴定功能基因被认为是目前最为行之有效的研究方法。 1 6 小结 解耦联蛋白基因( u n c o u p l i n gp r o t e i n ，u c p ) 参与机体能量代谓f ，对机体能量平衡涉及的体 重( 肥胖) 、静i p 代谢率和食物转化效率等性状具有显著的效应，因此，近年来解耦联蛋白基因 为众多遗传学家和营养学家所关注，在动物遗传育种中具有广阔的应用前景。u c p s 基因在动物遗 传育种中的应用正在不断的深入研究中，但u c p s 对不同动物类群、不同生长阶段作用的机理， 其他基因如何与u c p s 协同影响动物的能量代谢与肥胖以及u c p s 在特定组织中对组织特异功能 的影响等都有待丁i 进一步研究。 1 7 本研究的主要内容及目的 解耦联蛋( u c p ) 是线粒体阴离子转运家族( m a c f ) 成员，是当前发现的最直接影响能量 代谢的功能基因，u c p 最主要的生理功能是氧化磷酸化的解耦联作用。分析猪u c p 2 和u c p 3 基因遗传多态性，筛选出有价值的多态性位点，确定群体中的优势基冈型，初步探讨u c p 基冈 对猪重要经济性状日增重等与能量代谢相关性状的影响，为进一步研究猪u c p 基因的表达规律， 筛选出表达有利基因型奠定基础。鉴于此，本研究将从咀下几个方面进行研究： 1 ，通过比较基因组学的方法利用人、鼠u c p 基因家族的相应基因进行比较，设计引物，通 过p c r 步移克隆u c p 基因，从而获得u c p 2 和u c p 3 基因的全序列。 2 通过基因扫描技术( r f l p 、s s c p 及测序) ，检测u c p 2 和u c p 3 基因单核苷酸多态( s n p ) ， 并进一步测序验证，确定突变类型。对引起转录因子结合位点改变的多态性位点进行重 点分析，确定优势单倍型。 3 结合不同品种猪的平均生产水平对各多态性位点的基困型及单倍型进行统计分析，进一 步筛选出有价值s n p 和重要转录因子。 9 中国农业大学硕士学位论文 实验材料和方法 2 1 实验动物 第二章实验材料和方法 所用实验猪品种均采自各地猪场，包括大白猪、 香猪、荣昌猪、八眉猪、内江猪、姜曲海猪、藏猪、 猪品种随机抽取3 0 头为实验样本。 2 2 分析工具软件 & 自猪、杜洛克、民猪、金华猪、五指山猪、 野猪、太湖猪、。j 乡猪共1 5 个猪种，每个 ( 1 ) 引物设计： o l i g op r i m e r ( 6 0 版) ( 2 ) 突变位点检测：d n a m a nf 3 0 版1 ( 3 ) 测序胶图分析软件：c h r o m a sr 2 0 、 ( 3 ) 同源序列比较：b l a s t ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t b l a s t c g i l ( 4 ) 聚类分析：s a s8 0 2 ( 5 ) 转录因子预测：t f s e a r c h y e r1 3 ( h t t p ：w w w c b r c d p r e s e a r c h d b f l t s e a r c h h t m l 、 2 3 引物设计和p c r 条件优化 依据g e n b 柚k 上已发表的人( a c c e s s i o nn o 掣a f 0 9 6 2 8 9a n da f 0 5 0 1 1 3 ) $ h ，j 、鼠( a c c e s s i o nn o 剑囤堑2 竖a n d 盟g 墅幽的u c p 2 、u c p 3 基因的保守区序列设计引物，可分别从猪的基因组d n a 中扩增出相应的基因片段。引物序列及扩增长度如表2 1 所示： 1 0 中国农业大学硕上学位论文实验材料和方法 表2 1 猪u c p 2 f lu c p 3 基因引物序列 t a b l e 2 1p c r p r i m e r su s e df o rp o r d n eu c p 2 ，3g e n e sa m p u f i e d 引物 引物序列位置产物长度 望竺竺! 要竺! 竺型! 墨! 竺! 塑! ! 型堡二! ! 型 一 些! 塑婴 l e n g t h 一 f5 a c g a a g c c a g a t t c c g o c a g a g - 3 u c p 2 e x o n l u c p 2 e x 。“1 2 r5 ，一g c g c 兀a a c c g g a c c t l i _ 3 u c p 2 i n t r o n 2 1 4 7 2 b p u c p 2 i n t r o n 4 u c p 2 e x o n 5 6 u c p 3 e x o n t u c p 3 i n t r o n l u c p 3 i n t r o n 3 u c p 3 i n t r o n 5 u c p 3 e x o n 6 f5 a r g a c c t c a t c a a g g a c a c g c r c 一3 r5 g a a g t l 3 g c a g g g a a g g l a t c - 3 f5 a t g a c c 耵c c c c t g c c 山c 兀3 r5 - t c a a a a g g g a g c c t c t c g g g 3 f 5 1 ，1 t c 兀、( r g g a c c t c c r c ! r - 3 r 5 c r l ) 巴缸) g c g g a c c i t g g c 一3 f 5 一g g c a g a g c c c c t g g g a c a t 3 r 5 c c g a t c c c t i j g g g c g t g t a 一3 f 5 一g g a c t r g g a c g c c i a c a g a a c c - 3 r 5 - c a t a g g t c a c c a t c t c g g c a c a 3 f 5 - t g l g g t g a a g a c c c g g i a c a t 一3 r