（蔬菜学专业论文）番茄抗坏血酸生物合成酶gme和miox的功能分析.pdf

黼 y 1812 i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密琰 如需保密，解密时间 川口年7 月日 独创性声明 本人声明所里交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：扫i 孚伍时间：私矽尹年历月2 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的 论文) 在解密后适用于本授权书 籼黼张蚺霞 摊名：州 签名日期： 卿7 年6 月，2 日 签名日期：叩年多月，2 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 8 3 4 番茄抗坏l “l 酸生物合成基冈g m e 和m i o x 的功能分析 目录 摘 要i a 】i i s t r a c t i l i 缩田各词表v 1 前言1 1 1课题的提出1 1 2抗坏血酸在植物中的生理功能2 1 2 1在抗氧化系统中的作用2 1 2 2作为酶的辅助因子3 1 2 3在植物生长中的作用3 1 3高等植物中抗坏血酸的生物合成途径4 1 4抗坏血酸合成相关酶的研究进展5 1 4 1 g d p d 一甘露糖焦磷酸化酶( g m p ) 研究进展5 1 4 2 g d p 甘露糖3 ，5 差向异构酶( g m e ) 的研究进展6 1 4 3肌醇氧酶( m i o x ) 的研究进展7 1 4 4l 半乳糖酸1 ，4 内酯脱氢酶( g l d h ) 研究进展8 1 5本研究的目的与内容9 2材料与方法lo 2 1实验材料1 0 2 1 1植物材料1 0 2 1 2 菌株、基因及质粒载体一1 0 2 1 3 试剂与引物一l o 2 1 4所用溶液配方1 1 2 2实验方法1 1 2 2 1小量法提取番茄d n a 1 1 2 2 2t r i z o l 法提取植物总r n a 1 2 2 2 3反转录r n a 获得c d n a 第一条链1 3 2 2 4农杆菌介导番茄遗传转化1 3 2 2 5转基凶番州衍卣株的分予检测1 4 2 2 6转基因番茄植株a s a 含量的测定1 5 2 2 7添加a s a 、m i 对g m e 、m i o x 酶活性的影n i 匈1 5 华中农业丈学2 0 0 9 届硕士学位论文 2 2 8转基因材料抗逆性的初步分析1 5 3 结果与分析1 7 3 1转基因植株的获得1 7 3 2转基因植株的分子检测。1 8 3 2 1 t o 代转基因番茄的p c r 检测1 8 3 2 2t o 代转基因番茄植株靶基因表达量分析1 9 3 2 3t l 代转基因番茄的遗传分析2 1 3 3 基因组织表达特异性分析2 3 3 3 1g m e l 基因在番茄不同组织中的表达分析2 3 3 3 2g m e 2 基因在番茄不同组织中的表达分析2 4 3 3 3m i o x 基因在番茄不同组织中的表达分析2 4 3 4转基因番茄t o 代a s a 含量测定2 5 3 4 1g m e l 转基因番茄t o 代a s a 含量测定2 5 3 4 2g m e 2 转基因番茄t o 代a s a 含量测定2 6 3 4 3m i o x 转基因番茄t o 代a s a 含量测定2 8 3 5添加a s a 、m 1 分别对g m e 酶活性、m i o x 酶活性的影响2 9 3 5 1a s a 对g m e 酶活性的影响2 9 3 5 2m i 对m i o x 酶活性的影响3 0 3 6转基因材料抗逆性的初步分析3 0 3 6 1逆境下基因表达分析3 0 3 6 2种子发芽耐盐性实验3l 3 7 转基因植株离体叶片失水率3 3 3 8转基因植株抗氧化能力检测3 4 4讨论3 6 4 1 有关g d p 甘露糖一3 ，5 差向异构酶3 6 4 2有关肌醇氧酶3 6 4 3k m 喷施方法研究转基因植株后代遗传分离的初步探讨3 7 4 4抗坏血酸含量测量方法3 8 4 5转基因调控抗坏血酸生物合成的效果3 8 4 6通过调控v c 合成基因达到提高植物抗逆性的可行性分析3 9 参考文献4 0 致谢4 8 番茄抗坏m 酸生物合成基因g m e 和m i o x 的功能分析 摘要 抗坏血酸( a s a ) 且o 维生素c ，一种水溶性的维生素，是普遍存在于植物组织的一 种高丰度小分子物质，在生物体中具有极为重要的代谢和抗氧化功能。它与植物的 抗逆性有关，也是保证人类健康所必需的营养物质，但是人类和大多数动物由于缺 乏抗坏血酸生物合成途径的最后一步酶，丧失了合成能力，必须从新鲜蔬菜和水果 中摄取。 植物抗坏血酸生物合成途径的发现意味着我们可以通过基因工程调控植物抗坏 血酸的合成，从而增加植物产品的营养价值，增强其本身对逆境的抗性。 g d p 甘露糖3 ，5 差向异构酶( g m e ) 和肌醇氧酶( m i o x ) 都是抗坏血酸合 成途径中的关键酶。而番茄是一种世界上广为栽培的高营养、高价值的蔬菜作物， 因此，本实验以番茄为研究对象，将g m e 、m i o x 超量表达载体用农杆菌介导法导 入番茄植株中，探讨这两个基因在番茄抗坏血酸生物合成中的功能，分析转基凼番 茄抗氧化逆境等特性，最后得到具有应用价值的抗坏血酸含量增加的番茄材料。本 研究获得的结果主要如下： 1 利用农杆菌介导的遗传转化方法将p b z g m e l 、p b z g m e 2 、p b p g m e 2 、 p b m i o x 四个载体导入番茄实验品种a 5 7 中，得到p c r 检测阳性植株6 5 棵。 2 对g m e 基因的正义转基因植株t o 代的抗坏血酸含量测定结果表明：z g m e l 、 z g m e 2 和p g m e 2 正义转基因植株的抗坏血酸都比对照显著增加，在z g m e l 转基因株系中，叶片和果实的抗坏血酸含量最高的分别比对照提高了5 6 和 6 l ，z g m e 2 转基因株系叶片和果实的抗坏血酸含量最高的分别比对照增加 了31 和5 7 ，p g m e 2 转基因株系叶片和果实的抗坏血酸含量最高的分别比 对照增加了5 4 和1 0 3 。 3 对m i o x 基因的正义转基凶植株t o 代的抗坏血酸含量测定结果表明超量表达 m i o x 可以提高番茄植株的抗坏血酸含量，其中叶片和果实的抗坏血酸含量最 高的转基因株系分别比对照增加了3 8 和6 1 。 4 转基冈植株的r t - p c r 结果表明，部分转基冈植株靶基因的表达鼍比对照明 显增加。 5 对非转基因番茄材料a 5 7 进行逆境处理，发现g m e 表达受低温诱导，m i o x 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 表达受高温诱导。 6 对g m e l 、g m e 2 正义转基因番茄材料饲喂a s a ，发现a s a 对g m e 酶活性 有抑制作用。对m i o x 正义转基因材料饲喂肌醇，发现m i o x 正义转基因材 料合成抗坏血酸能力比对照显著提高。 7 对部分转基因植株后代的抗逆性进行了初步观察，结果表明超量表达g m e l 、 g m e 2 基因的转基因植株后代的耐盐性、抗旱性和抗氧化性都有一定程度的 提高，而m i o x 正义转基因植株的抗氧化性有一定的提高。 关键词：番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) ；抗坏血酸；生物合成与代谢；遗 传转化；基因表达；肌醇 i i 番茄抗坏血酸生物合成幕凶g m e 和m i o x 的功能分析 a b s t r a c t l - a s c o r b a t e ( v i t a m i nc ，a s a ) ，aw a t e r - s o l u b i l i t yv i t a m i n ，o n eo ft h eb e s tk n o w n p l a n tm e t a b o l i t e s ，h a sm u l t i p l ef u n c t i o n si no r g a n i s m i np l a n t ，i t si n v o l v e di nr e s i s t a n c e t oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s ，i t sa l s oa l le s s e n t i a l c o m p o n e n to fh u m a nn u t r i t i o n ，b u t h u m a n sl o s tt h ea b i l i t yt os y n t h e s i z ea s ab e c a u s eo fam u t a t i o ni nt h el a s te n z y m e r e q u i r e da s ab i o s y n t h e s i z ep a t h w a y t h e r e f o r eh u m a nm u s tb ea c q u i r ea s ar e g u l a r l y f r o md i e t a r ys o u r c e s f r u i ta n dv e g e t a b l e t h ed i s c o v e r yo fp l a n ta s a b i o s y n t h e s i sp a t h w a y sm a k ei tp o s s i b l et oi n c r e a s et h e a s ac o n t e n t si np l a n t sb yr e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no fg e n e si n v o l v e d ，t h u si m p r o v et h e n u t r i t i v ev a l u e so fp l a n ta n de n h a n c et h ep l a n t st o l e r a n c et oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s g d p d m a n n o s e y , 5 一e p i m e r a s e ( g m e ) a n dm y o i n o s i t o lo x y g e n a s e ( m i o x ) a r e b o t hk e ye n z y m e si nt h ea s a b i o s y n t h e s i sp a t h w a y t o m a t oi saw o r l d w i d ev e g e t a b l e w i t hh i g hn u t r i t i v ev a l u e s i nt h i s s t u d y , w et r a n s f o r m e dp b z g m e1 ，p b z g m e 2 ， p b p g m e 2 ，p b m i o xi n t o t o m a t ou s i n gt h e a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sm e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n ( a t m t ) m e t h o r d ，d i s c u s s e dt h ef u n c t i o no fg m ea n dm i o xi na s a b i o s y n t h e s i sp a t h w a y , a n da n a l y s e dt h ea b i l i t yo ft r a n s g e n i cp l a n t sr e s i s t e dt oo x i d a t i v e s t r e s s a tl a s t ，w eo b t a i nt o m a t om a t e r i a l sw i t hh i g hc o n t e n to fa s a t h em a i nr e s u l t s w e r ea sf o l l o w s ： 1 f o u rp l a n tv e c t o r st r a n s f o r m e dt o m a t o o b t a i n e d6 5t r a n s g e n i cl i n e s ，a n dc o n f i r m e d b yp c r 2 a s s a yo fa s a c o n t e n t si nt ot r a n s g e n i cp l a n t ss h o wt h a tt h ea s ac o n t e n t si nm o s t g m eo v e r - e x p r e s s i o nt r a n s g e n i cl i n e sw e r eh i g h e rt h a nc o n t r 0 1 z g m e1i n c r e a s e d 5 6 i nl e a v e sa n d61 i nf r u i t si nt h eh i g h e s tt r a n s g e n i cl i n e s ；z g m e 2i n c r e a s e d 31 i nl e a v e sa n d57 i nf r u i t si nt h eh i g h e s tt r a n s g e n i cl i n e s ；p g m e 2i n c r e a s e d 5 4 i nl e a v e sa n d10 3 i nf r u i t si nt h eh i g h e s tt r a n s g e n i cl i n e s 3 a s s a yo fa s a c o n t e n t si nm i o x o v e r - e x p r e s s i o nt ot r a n s g e n i cp l a n t si n d i c a t e dt h a t t h ea s ac o n t e n t sw e r eh i g h e ri n t r a n s g e n i cl i n e st h a nt h ec o n t r o l ，t h eh i g h e s t t r a n s g e n i cl i n e si n c r e a s e d38 i nl e a v e sa n d61 i nf r u i t s 4 r t - p c rr e s u l t ss h o wt h a t t a r g e tg e n ee x p r e s s i o nl e v e lw e r ep r o m o t e di nm o s t t r a n s g e n i cl i n e s 华中农业大学2 0 0 9 届硕上学位论文 5 i nn ot r a n s g e n i cp l a n ta 5 7 ，g m et r a n s c r i p tw a su p - r e g u l a t e di nr e s p o n s et oc o l d s t r e s s ，m i o xe x p r e s s i o nw a sr e d u c e db yh i g ht e m p e r a t u r e 6 f e e d i n ga s at og m e l ，g m e 2o v e r - e x p r e s s i o nt r a n s g e n i c l i n e s ，f o u n dg m e e x p r e s s i o nw a si n h i b i t e db ya s a f e e d i n gm it om i o xo v e r - e x p r e s s i o nt r a n s g e n i c l i n e s ，f o u n dt h ea s as y n t h e s i z ea b i l i t yw a sh i g h e rt h a nt h ec o n t r 0 1 7 t h er e s i s t a n c et od i f f e r e n ts t r e s s e so fs o m et r a n s g e n i cp l a n t sw e r ei n v e s t i g a t e d p r e l i m i n a r i l y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eg m e l ，g m e 2 - o v e r e x p r e s s i o np l a n t s i n c r e a s e ds a l t ，d r o u g h ta n do x i d a t i v et o l e r a n c e ，a n dm i o x - o v e r e x p r e s s i o np l a n t s o n l yi n c r e a s e do x i d a t i v er e s i s t a n c e k e yw o r d s ：t o m a t o ( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) ；l - a s c o r b i ca c i d ；b i o s y n t h e s i sa n d m e t a b o l i s m ；g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ；g e n ee x p r e s s i o n ；m y o - i n o s i t o l 番茄抗坏m 睃生物合成基因g m e 和m i o x 的功能分析 v 华中农业大学2 0 0 9 庙坝十学位论文 m v m e t h y l v i o l o g e n 百草枯 n a d +n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 n a d p hn i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 p h o s p h a t e n p ti i n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e i i 磷酸新霉素转移酶i i p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 p p o p o l y p h e n o lo x i d a s e 多酚氧化酶 r o sr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s活性氧自由基 r t p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p c r反转录p c r z tz e a t i n玉米素 v i 番茄抗坏l f j l 酸生物合成皋【大| g m e 和m i o x 的功能分析 1 前言 1 1 课题的提出 g d p 甘露糖3 ，5 差向异构酶( g m e ) 和肌醇氧酶( m i o x ) 都是a s a 合成途 径中的重要酶，众所周知，a s a 在生物体中具有重要的抗氧化作用和代谢功能。在 植物中，a s a 与植物的抗逆性有关。一般，提高植物体内的a s a 含量，能增强植物 耐寒冷、高温、干旱和盐碱等逆境的能力。在动物中，a s a 是人类和动物维持生长、 繁殖和保证健康所必需的营养物质。a s a 能防治坏血病；可以促进牙齿和骨骼的生 长，防止牙床出血；具有抗氧化作用，能阻断致癌物亚硝胺的生成，阻止癌细胞扩 散，降低外来致癌物在体内的活性，从而起到防治癌症的作用；能够改善脂肪和类 脂特别是胆固醇的代谢，预防心血管病；具有抗衰老作用，维生素a 、e 及维生素c 的共同作用，可促进皮下组织代谢，改善皮肤供血状况，防止皮肤过早出现皱褶； 还可以增强肌体对外界环境的抗应激能力和免疫力。但是，人类和其他一些哺乳动 物自身已经丧失了合成能力( c h a t t e r j e e ，1 9 7 3 ；v i c t o r i a n oa n dm i g u e l ，2 0 0 4 ) ，必须 从食物中摄取，新鲜水果和蔬菜富含抗坏血酸。 早在1 9 3 3 年就鉴定出a s a 的分子结构，目前人们提出了a s a 生物合成的四条途 径：甘露糖l 半乳糖途径( w h e e l e re ta 1 ，1 9 9 8 ) 、半乳糖醛酸途径( a g i u se ta 1 ，2 0 0 3 ) 、 古洛糖途径( w o l u c k aa n dm o n t a g u ，2 0 0 3 ) 、肌醇途径( l o r e n c ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 。g m e 同时影响甘露糖l 半乳糖途径和古洛糖途径，是一种异构酶。而古洛糖途径的发现 正是由于w o l u c k a 发现g m e 不仅可以催化g d p 一甘露糖合成g d p l 半乳糖，还可以催 化g d p d 一甘露糖合成g d p l 占洛糖( w o l u c k aa n dm o n t a g u ，2 0 0 3 ) ，但该途径的发 现只有生物化学方面的汪据，遗传学方而的证据尚不足。m i o x 催化肌醇合成d 葡 萄糖醛酸，对拟南芥m i o x l j 勺克隆与转化分析l o r e n c e 提出了肌醇途径，但这条途径 尚有争议。 番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) 系茄科番茄属一年生或多年生草本植物，起 源于南美洲秘鲁、厄瓜多尔、玻利维哑等地，是一种高营养、高价值、风味较好的 食用作物，也是世界上主栽蔬菜之一。番茄中含有丰富的柠檬酸、苹果酸所以呈酸 性环境，而a s a 有较强的还原性，性质不稳定，易被空气中的氧气氧化，极易受温 度、p h 值、光等因素的影响，在碱性条件下易破坏，在酸性条件下较稳定，故在同 样条件下，番茄中a s a 的保存率比其它蔬菜要高许多( 冯彦博，2 0 0 2 ) 。目d 玎所研究的 大部分番航品种a s a 含量在1 0 3 0 r a g l o o g 。凶此，本课题以番茄为材料，用农杆菌 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 必脚量表达载体导入番茄植株中，从遗传转化方面证明古 ，并初步鉴定g m e ，m 删功能，期望得到抗逆性提高的高 物中的生理功能 明，a s a 作为植物组织内广泛存在的高丰度小分子物质对于植 物自身的抗氧化作用、作为某些重要酶类的辅助因子、参与调节植物细胞的分裂、 生长过程等方面都具有非常重要的生理功能( s m i m o f f , 1 9 9 6 ；h o r e r n a n s e t a 1 ， 2 0 0 0 a ，2 0 0 0 b ) 。 1 2 1 在抗氧化系统中的作用 作为植物细胞内最重要的抗氧化剂，a s a 的一个重要功能就是清除体内活性氧 ( r o s ) ，光合作用和光呼吸过程可以产生r o s ( 陈坤明等，2 0 0 4 ) ，但是在逆境下 也会产生r o s ，例如干旱、高温、高盐、紫外线、过量光照等等。过量的r o s 可 以破坏脂类、核酸和蛋白质，造成氧化逆境损伤，导致正常的生理过程遭到破坏， 引起植物细胞未成熟衰老和死亡( w a n ge ta l ，2 0 0 3 ) 。a s a 作为自由基消除剂，可以作 为初级抗氧化物直接清除体内r o s 。a s a 与r o s 反应形成单脱氢抗坏血酸( m d h a ) 和脱氢抗坏血酸( d h a ) ，d h a 可分解为酒石酸和草酰乙酸；而单脱氢抗坏血酸还 原酶又可在n a d p h 或谷胱甘肽的还原作用下将m d h a 和d h a 还原为a s a ，从而 形成a s a g s h 循环消除r o s ( 耿兴元等，2 0 0 9 ) 。果品在加工时极易发生褐变，多 酚氧化酶( p p o ) 是引起果蔬酶促褐变的主要酶类，是引起果汁褐变的最主要因素，原 理是由于p p o 催化酚类物质的氧化反应所引起的，a s a 对p p o 活性有明显的抑制 作用，能将氧化的醌及其衍生物还原为酚类物质，阻止醌类物质自发聚合成色素物 质，从而抑制酶促反应进行，另外还可降低体系p h 值，抑制酶活性( 程建军等， 2 0 0 2 ；杨昌鹏和黄华梅，2 0 0 8 ) 。丙二醛( m d a ) 是膜质过氧化的产物，其含量的多少 代表植物细胞受伤害的程度，即膜透性的大小，a s a 对膜质过氧化具有抑制作用， 可以降低脂质过氧化产物m d a 的含量，稳定细胞膜的结构，延缓细胞衰老，对细 胞起到保护作用( 李珍珍和韩阳，2 0 0 0 ) 。同时，a s a 能维持另一重要抗氧化剂维生 素e 的还原态( 安华明等，2 0 0 4 ；许丙军等，2 0 0 6 ) 。a s a 还可能在植物逆境反应 中通过信号分子起着调节器的作用( p i g n o c c h ia n df o y e r , 2 0 0 3 ；p a s t o r ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 番茄抗坏i | l 酸生物合成基因g m e 和m i o x 的功能分析 1 2 2 作为酶的辅助因子 在动物和植物中，a s a 作为酶的辅助因子，调节一系列酶促反应，从而调节酶 的活性( p a d h ，1 9 9 0 ) ，通常这些酶是含f e 或c u 的单或双加氧酶。a s a 的作用就是使 这些酶反应中心的金属离子保持还原状态，同时提高酶的活性( d a v e ye ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 在植物中，a s a 作为f e 一二氧化物酶的辅酶，参与了细胞壁蛋白的翻译后修饰，d h a 可以和这些蛋白的赖氨酸和精氨酸侧链发生反应以阻止蛋白质的交联( a r r i g o ne ta 1 1 9 9 4 ，1 9 9 7 ；f r y , 1 9 8 6 ) 。a s a 还能够活化芥子酶，即葡萄糖硫苷葡糖水解酶( 李定琴 和张家明，2 0 0 7 ) 。a s a 可作为赖氨酸和脯氨酸羟化酶的辅基，催化羟赖氨酸和羟 脯氨酸的合成( p a d h ，1 9 9 0 ) ，此外，a s a 可以作为氨基环丙烷羧基氧化酶( a c c 氧化酶) 矛i g a 3 二氧化物酶的辅酶而参与植物激素乙烯和赤霉素的生物合成。另外，a s a 也 是紫黄质脱环氧酶的辅助因子，参与黄素循环中光保护色素的生物合成( d a v e y e ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。 1 2 3 在植物生长中的作用 高等植物的生长是细胞分裂，分化和伸长的结果。研究发现，抗坏血酸、抗坏 血酸氧化酶a o 、抗坏血酸过氧化酶a p x 都能直接或问接影h 向细胞的生长。a s a 能够 直接清除参与木质素合成的单木质素自由基，控制木质素单体的聚合作用从而调节 胞壁的木质化过程。同时a s a 还能可逆性的抑制对单木质素自由基形成负责的质外 体过氧化物酶活性，抑制这些自由基的翻转和向质外体的分泌，从而调节植物细胞 壁的木质化过程( t a k a h a m a ，1 9 9 4 ；d e l c a r m e ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。此外，a s a 还可以作为草 酸生物合成的底物，而质外体草酸能够结合c a 2 + ，冈而影响果胶质的交联和细胞壁 的伸长，同时质外体草酸的浓度反过来又受具有氧化酶活性的一种胞壁南集蛋白的 调节，该酶阻断草酸与c 0 2 和h 2 0 2 的结合，促使c a 2 + 和h 2 0 2 的释放，从而刺激细胞 壁的硬化( s m i m o f f , 1 9 9 6 ；d a v e ye ta 1 ，2 0 0 0 ) 。a s a 和h 2 0 2 的平衡直接影响细胞壁 物质交联。另外a o 、a s a d h a 在细胞分裂周期起着至关重要的作用。细胞壁内的 a s a 和d h a 能够影响胞壁蛋白和多糖的交联从而导致细胞壁的疏松( p a d h ，1 9 9 0 ) 。a o 氧化a s a 所形成的m d h a 通过质膜上的细胞b 色素还原，该过程有电子的跨膜运输从 而促进细胞的生长( s m i r n o f f , 1 9 9 6 ) ；如添加外源m d h a 可以促进葱的生长和生根， 而a p x 通过减少h 2 0 2 的生成而维持细胞壁的塑性( h i d a l g oe ta 1 ，19 8 9 ； g o n z a l e z r e y c s e ta 1 ，l9 9 4 ，l9 9 5 ；d e c a b o ，l9 9 6 ) 。 3 2 黧爹一 雾西蔡搏6 碡磋：囊墨墨墨囝盈固2 蚕 图1 1 植物和动物抗坏血酸的合成途径 f i l l 1b i o s y n t h e s i sp a t h w a yo fl a s c o r b i ca c i di np l a n t sa n da n i m a l s 1 甲基酯酶；2 d 一半乳糖醛酸还原酶( g a l u r ) ；3 醛糖内酯酶；4 葡萄糖6 埘军酸异构酶( g p i ) ： 5 甘露糖。6 磷酸异构酶( p m i ) ：6 磷酸甘露糖变位酶( p m m ) ；7 g d p 甘露糖焦磷酸化酶 ( g m p ) ；8 g d p 甘露糖一3 ，5 差向异构酶( g m e ) ； 9 磷酸二酯酶；1 0 l - 半乳糖1 磷酸酶； 11 l 半乳糖脱氢酶( g a l d h ) ； 1 2 l 一半乳糖酸1 ，4 内酯脱氢酶( g l d h ) ；1 3 磷酸二激酶； 1 4 糖磷酸酶；1 5 l - 古洛糖脱氢酶；1 6 磷酸葡萄糖变位酶；1 7 u d p 一葡萄糖焦磷酸化酶； 1 8 u d p 一葡萄糖脱氢酶；1 9 葡萄醛酸1 一磷酸尿苷酰转移酶；2 0 葡萄醛酸激酶；2 1 葡萄醛酸 还原酶；2 2 醛糖内酯酶；2 3 l _ 古洛糖酸一1 。4 一内酯氧化酶；2 4 肌醇氧酶( m i o x ) d 半乳糖醛酸甲酯前体物饲喂试验引起水芹幼苗( i s h e r w o o de ta 1 ，1 9 5 4 ) 不h 拟南 芥培养细胞( d a v e ye ta 1 ，1 9 9 9 ) a s a 含量的显著增加。另有同位素示踪实验显示在分 4 番茄抗坏血酸生物合成基【大lg m e 和m i o x 的功能分析 离的成熟草莓果实中由d 半乳糖醛酸1 1 4 c 可以合成出l 抗坏血酸6 - 1 4 c ( l o e w u s a n dk e l l y ，1 9 6 1 ) 。近来随着草莓果实中d 半乳糖醛酸还原酶的克隆和验证，从d 半 乳糖醛酸合成a s a 的半乳糖醛酸途径得到了分子方面的证据( a g i u se ta 1 ，2 0 0 3 ) 。在拟 南芥中超量表达草莓d 半乳糖醛酸还原酶使转基因拟南芥叶片抗坏血酸含量提高了 2 3 倍。 w o l u c k o 等研究发现g d p d 甘露糖经g d p 甘露糖3 ，5 差向异构酶的5 异构化 可产生g d p l 古洛糖，同时外源l 古洛糖和l 古洛糖酸1 ，4 一内酯可作为植物细胞抗 坏血酸合成的直接前体物( w o l u c k aa n dm o n t a g u ，2 0 0 3 ) ，从而提出了古洛糖途径。另 外在水芹、烟草、草莓、大豆等植物中也表明l 古洛糖可转换成抗坏血酸( i s h e r w o o d e ta 1 ，19 5 4 ；j a i na n dn e s s l e r , 2 0 0 0 ；b a i ge ta 1 ，19 7 0 ) ，在生菜和烟草中超量表达大鼠l 古洛糖酸1 ，4 一内酯脱氢酶基因使得转基因植株中抗坏血酸的含量增加了4 7 倍( j a i n a n dn e s s l e r ，2 0 0 0 ) 。l 古洛糖酸1 ，4 内酯脱氢酶是动物抗坏血酸合成途径最后一步 酶，因此古洛糖途径把植物与动物抗坏血酸生物合成途径联系起来。 早期示踪实验显示，在分离的草莓果实和香芹叶片中饲喂放射性标记的m i ，并 未探测到有放射性的a s a 合成，反而在构成细胞壁物质一果胶多糖中有大量的放射性 标记( l o e w u s ，1 9 6 3 ) ，有研究表明肌醇氧酶参与植物细胞壁的构建。2 0 0 4 年l o r e n c e 等研究肌醇氧酶基因( m i o x ) ，超量表达m i o x 使转基因拟南芥的抗坏血酸含量增 加了2 3 倍，通过n o r t h e r n 杂交分析发现，转基因材料叶片中抗坏血酸含量的提高与 肌醇氧酶基因表达量的提高紧密相关，进而提出了植物抗坏血酸生物合成的肌醇途 径，该酶催化肌醇( m i ) 形成d 葡萄糖醛酸。 1 4 抗坏血酸合成相关酶的研究进展 1 4 1 g d p d 一甘露糖焦磷酸化酶( g m p ) 研究进展 g m p 催化d 一甘露糖1 磷酸形成g d p d 甘露糖，是a s a 合成途径的第一个关键 酶，其催化所得产物g d p d 甘露糖足抗坏血酸生物合成的重要中间产物。目前国内 外关于g m p 基因的研究还不是很多，已从拟南芥、烟草、马铃薯、玉米、番茄中克 隆了g m p 基因。c o n k l i n 等对拟南芥抗坏血酸缺陷突变体v t c l 的研究结果表明v t c l 基 因编石q g m p ( c o n k l i ne ta 1 ，1 9 9 9 ) ，与野! e 型拟南芥相比，缺陷突变体中的g m p 酶活 性要低很多。经甲基磺酸乙脂( e m s ) 诱导的拟南芥抗坏血酸缺陷突变体，其抗坏血 酸的含量只有野生刑t - 士j l v a 南芥的3 0 4 0 ；而c o n k l i n 等对野生拟i 柯芥g m p 基因转化突 变体的研究表明，转基因拟南芥抗坏血酸的含黾恢复到野生型水 j ( c o n k l i ne ta 1 5 g d p l 半乳糖，另一个反应是通过5 差向异构化产生一个新的中间产物g d p l 古 洛糖( w o l u c k aa n dm o n t a g u ，2 0 0 3 ) ，g m e 酶是在糖核苷水平上植物抗坏血酸生物合 成的第一步。该酶第一次在蛋白核小球藻中被分离和定。| 生( b a r b e r , 1 9 7 5 ，1 9 7 9 ；h e b d a e ta 1 ，1 9 7 9 ，1 9 8 2 ) 。在高等植物中，g m e 的活性分别在拟南芥和豌豆中曾报导过 ( w h e e l e re ta 1 ，1 9 9 8 ) ，但这些植物的g m e 没有分离纯化，相应的基因也不清楚。 w o l u c k a 等综合运用传统的生化和质谱的方法从拟南芥悬浮细胞中分离得到高度纯 化的g d p d 甘露糖3 ，5 差向异构酶。该酶是一个8 4 k d 的二聚体，由两个相同的亚 基组成。g m p 基因位于拟南芥第5 染色体上，包括6 个外显子。g m e 酶由于含有n a d 结合域，因此受至i j n a d ( p ) h 的抑制，n a d + 的催化，而且研究也表明，该酶活性还 受g d p 、g d p d 海藻糖、a s a 抑带1 ( w o l u c k aa n dp e r s i a u ，2 0 0 1 ；i s h i k a w a le ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 w o l u c k a 等( 2 0 0 3 ) 在纯化g m e 实验中，无论是从大肠杆菌h i s 矛i ；i g s t 标签融合蛋白 中纯化，还是从拟南芥悬浮细胞中纯化，都出现了g m e 酶与热激蛋h s p 7 0 共纯化 的现象，结合分子伴侣的生物学功能与表型异构酶可能与h s p 7 0 相互作用的事实，推 测拟南芥h s p 7 0 蛋白可能参与g d p 甘露糖3 ，5 表型异构酶的折叠与调节( w o l u c k a a n dm o n t a g u ，2 0 0 3 ) 。v a l p u e s t a 等认为g m e 与热击蛋白共纯化的现象在一定程度上说 明这种相互作用是植物在逆境条件下的一种调控机, 佑l j ( v a l p u e s t aa n db o t e l l a ，2 0 0 4 ) 。 但对其如何调节g m e 酶活性并未见报道。 g m e 属于短链脱氢酶还原酶家族中的一个成员，2 0 0 3 年r u n n i n g 等在研究甘露 糖l 半乳糖途径时正式提出了g m e 与抗坏血酸的积累有关，而且认为g m e 是抗坏 血酸合成的限速酶。拟南芥细胞悬浮培养实验证明了抗坏血酸合成的“瓶颈”刚好 发生在d 甘露糖和l 一半乳糖之间，由于具有较低的v m a x 值，该酶义被认为是抗坏血 酸生物合成的限速酶。 w o l u c k a 等指出茉莉酸甲酯通过调控g d p 露精3 ，5 。差向异构酶、l 古洛糖酸 6 番茄抗坏血睃生物合成基闪g m e 和m i o x 的功能分析 1 ，4 内酯脱氢酶的转录水平，来提高拟南芥和烟草b y 2 悬浮细胞a s a 含