（海洋生物学专业论文）花鲈肌肉生长抑素基因（mstn）克隆、表达及其基因打靶载体的构建.pdf

花鲈肌肉生长抑素基因( m s t n ) 克隆、表达及其基因打靶载体的构建摘要本研究采用同源克隆和染色体步移的策略首次分离、克隆了5 3 9 6b p 的花鲈m s t n 基因组序列。花鲈m s t n 基因具有3 个外显子，2 个内含子，整个开放阅读框编码着3 7 4 个氨基酸，具有9 个保守的半胱氨基酸及一个r v r r 的蛋白酶解加工位点。通过r t p c r 分析表明m s t n 基因在花鲈肌肉、脑、眼睛中表达量最高，其次是小肠，鳃、脾脏、肝脏和心脏中只有极少量表达；在早期的胚胎发育中，直到孵化后1 5 天的仔鱼才检测到m s t n 的表达；在不同细胞系中，m s t n在花鲈胚胎干细胞( u e s l ) 中表达，但在其它几个花鲈体细胞系( i - 皮、成纤维、淋巴样细胞) 中都没有检测到表达。此外，我们用1 1 2 5b pm s t n 的5 ，启动子区域与g f p 基因连接，构建了p m s t n g f p 质粒。将p m s t n g f p 转化l j e s l细胞，获得了表达；通过显微注射，将p m s t n g f p 质粒转入斑马鱼1 细胞期的胚胎，在孵化后1 0 天左右的仔鱼躯干部检测到了绿色荧光的表达。为了提高外源基因转化胚胎干细胞的效率，通过三种脂质体分别介导花鲈胚胎干细胞( u e s l ) 转化效率的比较，建立了一种简单而有效的基因转移方法。优化了影响外源基因转化效率的因素，如细胞接种时间、初始接种密度、d n a 和脂质体用量以及它们之间的比例等。以g f p 为报告基因，用g e n e j a m m e r 介导l j e s l 细胞的基因转移，转化效率最高可达2 7 3 。经过药物筛选，建立了表达g f p 基因的阳性克隆细胞株，经p c r 检测证实了g f p 基因已经整合蛰j l j e s l 细胞的基因组中，并获得了正常表达。通过体外诱导，g f p 阳性细胞能够分化为肌肉细胞、成纤维细胞、神经细胞等。进一步通过悬滴法培养，g f p 阳性细胞形成了拟胚体，证实了经过长期的药物筛选后，l j e s l 细胞仍然保持着发育的多能性。根据克隆的m s t n 基因序列，用长p c r 方法扩增了3 2 k b 和1 5 k b 同源片段。3 2 k b 的长同源臂包括m s t n 基因的5 区域、外显子1 、内含子1 、外显子2 、内含子2 和部分的外显子3 ；1 5 k b 的短同源臂包括m s t n 基因的部分外显子3 和3 区域。质粒骨架为细菌克隆载体p b l u e s c r i p ti ik s ，n e o 基因为正选择基因，t i ( 基因为负选择基因。i l e o 基因被插入到长、短同源臂之间，t i 基因插入到长同源臂外侧。通过正中国海洋大学博士论文负选择程序构建了m s t n 同源重组载体，命名为p m s t n n k 。同源重组载体p m s t n - n k 被转移到l j e s l 细胞中，2 天后，5 0 0p g m lg a l 8用于正选择，2 5p g m lg a n c 用于负选择。经过2 5 天的药物选择，转化空载体p b l u e s c r i p ti ik s 的对照组细胞全部死亡；经g 4 1 8 筛选转化t p m s t n n k 的一组-细胞形成了大约2 0 0 0 个抗性克隆；经g 4 1 8 和g a n c 双选择转化t p m s t n n k 的另一组细胞平均获得了4 3 个双抗性克隆，负筛选使同源重组富集效率大约为5 1 倍。最终，在多批转化的细胞中，2 8 个双选择克隆被扩增培养。总之，本文首次克隆获得了5 3 9 6b p 的m s t n 基因组序列。通过r t - p c r 技术和m s t n 基因启动予驱动g f p 基因的表达，特征了m s t n 基因在不同组织、不同胚胎发育时期及几个不同细胞系中的表达方式。另一方面，优化了脂质体介导的转化条件，建立了表达g f p 基因的e s 细胞株，通过长期药物筛选，该细胞株仍保持多能性。构建了m s t n 同源重组载体，通过g 4 1 8 和g a n c 双选择，进行了基因打靶初步实验。关键词：花鲈，肌肉生长抑素，基因克隆，表达分析，胚胎干细胞，绿色荧光蛋白，基因转移，同源重组花鲈肌肉生长抑素基因( m s t n ) 克隆、表达及其基因打靶载体的构建t h ec l o n i n g ，e x p r e s s i o na n a l y s i sa n dc o n s b c t i o no fag e n e协r g e f i n gv e c t o ro fm y o s t a t i n ( m s t n ) f r o ml a t e o l a b r a xa b s t r a c ti nt h i ss t u d y m s t ng e n ew a sc l o n e df 舢s e ap e r c hb yh o m o l o g yc l o n i n ga n dg e n o m i cw a l k i n g 。i nt h e5 3 9 6b pg e n o m i cs e q u e n c e s ，t h r e ee x o n s ，t w oi n t r o n s ，5 a n d3 f l a n k i n gs e q u e n c e sw e r ei d e n t i f i e d t h es e ap e r c hm s t ng e n ee n c o d e sa3 7 4a m i n oa c i dp r o t e i n ，i n c l u d i n gas i g n a lp e p t i d e ，c o n s e r v e dc y s t e i n er e s i d u e sa n dar x x rp r o t e o l y t i cc l e a v a g ed o m a i n e x p r e s s i o na n a l y s i so fm s t nr e v e a l e dt h a tm s t nw a se x p r e s s e dh i g h l yi nm u s c l e ，b r a i na n de y e s ，i n t e r m e d i a t e l yi ni n t e s t i n e ，a n dw e a k l yi ng i l l ，s p l e e n ，l i v e r ，a n dh e a r t i ne a r l ye m b r y o n i cs t a g e s t h et r a n s c r i p tw a su n d e t e c t a b l et 1 5d a y sl a r v a ea f t e rh a t c h i n gb yr t - p c r i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a tm s t nm r n aw a sh i g h l ye x p r e s s e di ne m b r y o n i cs t e mc e l ll i n e ( l j e s l ) ，b u ti tw a su n d e t e c t a b l ei ns e v e r a lt y p e so fs o m a t i cc e l ll i n e sf r o ms e ap e r c h ，i n c l u d i n gf i b r o b l a s t - l i k ec e l l ，e p i t h e l i o i dc e l l s ，l y m p h o c y t e - l i k ec e l l s f u r t h e r m o r e ，ap m s t n g f pp l a s m i dd d v e nb yt h e11 2 5b pm s 丌n5 - u t rw a sc o n s t r u c t e d w h i c hc o u l de x p r e s sg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( g f p ) i nl j e s lc e l l s b ym i c r o i n j e c t i o n 。p m s t n - g f pp l a s m i d sw e r et r a n s f e r r e di n t oo n e - c e l le m b r y oo fz e b r a f i s h 。a n dg r e e nf l u o r e s c e n ts i g n a l sw e r ed e t e c t e di nt r u n ko f1 5d 仃y f o ri m p r o v i n gt h et r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yo fe x o g e n o u sg e n ei n t oe sc e l l sas i m p l ea n de f f e c t i v em e t h o do fg e n et r a n s f e rw a se s t a b l i s h e dw i t hs e v e r a ll i p s o m e s - m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c i e so ft h r e el i p s o m e s - m e d i a t e dl j e s lc e l l sw e r ec o m p a r e d ，a n de f f e c t so fv a n o u sf a c t o r sw e r eo p t i m i z e d ，s u c h9 1中国海洋大学博士论文a si n c u b a t i o nt i m eo fc e l l s 。l n i t i a i n c u b a t i o nd e n s i t y t h ed o s e so fd n aa n dl i p s o m e s a n dr a t i o so fd n aa n dl i p s o m e s ，e ta lb a s e do nt h e s er e s u l t s t h eh i g h e s tt r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c y 。a b o u t2 7 3 。w a so b t a i n e dt h a tg f pg e n ew a st r a n s f e r r e di n t oe m b r y o n i cs t e mc e l l sd e r i v e df r c 粕s e ap e r c h ( u e s l ) w i t hg e n e j a m m e r - m e d i a t e d b yd r u gs e l e c t i o n ，a ne m b r y o n i cs t e mc e l l l i n ee x p r e s s i n gg f p ( g f p +l j e s l ) g e n ew a se s t a b l i s h e d i tw a sv e r i f i e dt h a tg f pg e n ew a si n t e g r a t e di n t og e n o m i cd n ao fl j e s lb yp c rd e t e c t i o n 。a n de x p r e s s i n gn o r m a l l y ，疗v i t r o 。g f p + l j e s lc e l l sc a nd i f f e r e n t i a t ej n t om u s c l ec e l l s ，f i b r o b l a s tc e l l s a n dn e u m nc e l l s ，f u r t h e r m o r e , w h i c hc a nc o m ei n t ob e i n ge m b r y o i db o d i e s ( e b s ) i tw a sv e r i f i e dl j e s lc e l l ss t i l lh a dr e t a i n e dp l u r i p o t e n c yt h r o u g hd r u gs e l e c t i o nf o ri o n g - t e r m b a s e do nt h es e q u e n c eo fm s t n ，3 2k ba n d1 5k bm s t ng e n ef r a g m e n t sw e r eo b t a i n e db yl o n gp c r t h el o n gh o m o l o g o u sa r mw a s3 2k bc o n t a i n i n g5 e n dr e g i o n ，e x o n l ，i n t r o n l ，e x o n 2 ，i n t r o n 2a n dap o r t i o no fe x o n 3o fm s t ng e n e t h es h o dh o m o l o g o u sa m 3w a s1 5k bc o n t a i n i n gap o r t i o no fe x o n 3a n d3 e n dr e g i o no ft h em s t ng e n e t h ec l o n i n gv e c t o ri sp b l u e s c r i p ti ik sw i t hn e og e n ea sap o s i t i v es e l e c t i o n 。a n ds v - t kg e n ea san e g a t i v es e l e c t i o n n e eg e n ew a si n s e r t e db e t w e e nt h el o n gh o m o l o g o u sa r ma n dt h es h o r th o m o l o g o u sa r m ，a n dt kg e n ew a si n s e r t e di n t ot h eo u t s i d ef l a n ko fl o n gh o m o l o g o u sa r m h e r e ，ah o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nv e c t o rn a m e da sp - m s t n - n kh a db e e nc o n s t r u c t e db yp o s i t i v e - n e g a t i v es e l e c t i o nt e c h n i q u e t h eh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nv e c t o rp - m s t n n kw a st r a n s f e r r e di n t ol j e s lc e l l s ，a f t e r2d a y s ，5 0 0p g m lg 4 18w a su s e df o rp o s i t i v es e l e c t i o n ，a n d2 5p g m lg a n c y c l v i r ( g a n c ) f o rn e g a t i v es e l e c t i o n f o ra b o u t2 5d a y sd r u gs e l e c t i o n ，c o n t r o lg r o u pt r a n s f e c t e dw i t hv a c u o u sp l a s m i dp b l u e s c r i p ti ik sd i e do u tb yg 4 18s e l e c t i o n ，t h eg r o u pt r a n s f e c t e dw i t hp - m s t n n kc a m ei n t ob e i n ga b o u t2 0 0 0n e o - r e s i s t a n tc o l o n i e sb yg 4 1 8s e l e c t i o n ，a n d4 3n e o - t k - r e s i s t a n t花鲈肌肉生长抑素基因( m s t n ) 克隆、表达及其基因打靶载体的构建c o l o n i e sb yc - , 4 18a n dg a n cs e l e c t i o n e f f i c i e n c yo fe n n c h m e n to fh o m o l o g u e sr e c o m b i n a t i o nw a sa b o u t5 1b yn e g a t i v es e l e c t i o n f i n a l l y , t h ec e l l so f2 8n e o - t k r e s i s t a n tc o l o n i e sw e r ee x p a n d e d i ns u m m a r y , i ti st h ef i r s tt i m et h a t5 3 9 6b pm s t ng e n o m i cs e q u e n c ew a sc l o n e d t h ee x p r e s s i o np a f f e mo fm s t nw a sc h a r a c t e n z e di nd i f f e r e n tt i s s u e s ，d e v e l o p m e n t a le m b r y o ，a n ds e v e r a lc e l ll i n e sb yr t - p c rt e c h n o l o g y a n dg f pe x p r e s s i o nd n v e nb ym s t np r o m o t e rw e r ed e t e c t e di nc e l ll i n e sa n dd e v e l o p m e n t a lf r y a ta n o t h e ra s p e c t ，t h el i p s o m e - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o nw a so p t i m i z e d ，a n da ne sc e l ls t r a i ne x p r e s s i n gg f pw a se s t a b l i s h e da n dr e t a i n e dp l u r i p o t e n c ya f t e rl o n g - t e r md r u gs e l e c t i o n ah o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nv e c t o ro fm s t nh a db e e nc o n s t r u c t e d ，a n dp o s i t i v e n e g a t i v es e l e c t i o nw a sp e r f o r m e db yg 4 18a n dg a n cr e s i s t a n td r u g k e yw o r d s ：l a t e o l a b r a xj a p o n i c u s , m y o s t a f i n ，g e n ec l o n i n g ，e x p r e s s i o na n a l y s i s ，e m b r y o n i cs t e mc e l l s ，g f rg e n et r a n s f e r ,h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nv花鲈肌肉生长抑素基因( m s t n ) 克隆，表达及其基因打靶载体的构建第一章、综述1 鱼类懿w 基因的研究进展肌肉生长抑素( m y o s t a t i n 。m s t n ) 是转录生长因子( t g f - b ) 家族的一个成员，对骨骼肌的发育和生长具有负调控作用，该基因缺失会导致骨骼肌增生。1 9 9 7 年m c p h e r r o n 和l e e ( m c p h e r r o ne ta 1 ，1 9 9 7 a ) 首先在小鼠中发现了肌肉生长抑素基因，并克隆了该基因。通过基因敲除使m s t n 基因c 端的生物活性区缺失，获得的m s t n 基因敲除小鼠骨骼肌是正常野生型小鼠的2 - 3 倍，其脂肪含量并没有改变，而肌纤维数量的增加导致敲除m s t n 基因的小鼠单块肌肉重量增长了2 3 倍。同年，l e e 等( m c p h e r r o ne ta 1 ，1 9 9 7 b ) 克隆并分析了双肌表型牛一皮埃蒙特牛( p i e d m o n t e s e ) 和比利时蓝白花牛( b e l g i a nb l u e ) 的m s t n 基因，发现比利时蓝白花牛的m s t n 基因在第三个外显子的第9 3 7 9 4 7核甘酸处发生了1 1 个核甘酸的缺失，导致m s t n 的阅读框架发生了改变，分子活性区域消失。皮埃蒙特牛的m s t n 基因有两处发生了突变。第1 个突变点是外显子1 中的一个c 变成a ，使保守的第9 4 个氨基酸p h e 被l e u 取代；第2个突变点是外显子3 中的一个g 变成了a ，使得第3 1 3 个氨基酸处c y s 被t y r取代，此突变可能导致了m s t n 功能完全或几乎完全丧失，因为这个c y s 在所有动物的m s t n 和t g f - b 家族的其他成员中也都是保守的，从而导致了“双肌”表型的发生。由于m s t n 基因对肌肉生长具有负调控作用，因此受到广泛关注，大量的哺乳动物特别是家畜的m s t n 基因已被克隆出来，m s t n 基因的功能及应用研究也在大量进行( m ae ta 1 ，2 0 0 5 = 李绍华等，2 0 0 2 = 姜运良等，2 0 0 4 ) ，在哺乳动物里已报道获得了m s t n 基因的抗体并具有生物学功能( 杨兴元等，2 0 0 3 ；马现永等，2 0 0 5 ；吕文发等，2 0 0 3 ) 。m s t n 基因相关研究目前已成为分子生物学领域的研究热点。由于鱼类物种的多样性，多种鱼类的m s t n 基因已克隆，通过表达研究初步表明鱼类m s t n 基因可能与哺乳动物的功能不同，但目前鱼类m s t n 基因功能方面做的工作还有待深入，在这里，我们对鱼类m s t n 基因的研究进展做个概述。中国海洋大学博士论文在鱼类方面，1 9 9 7 年m c p h e r r o n 和l e e ( m c p h e 盯o ne ta 1 。1 9 9 7 a ) 分离克隆了斑马鱼的c d n a 。2 0 0 1 年，m a c c a t r o z z o 等( m a c c a t r o z z o 。e ta 1 2 0 0 1 )从金鲷上分离克隆了m s t n 基因，分析发现与其它的脊椎动物编码蛋白具有6 0 - 7 4 的同源性，同年，r o b e r t s 等( r o b e r t s ，e ta 1 ，2 0 0 1 ) 首次从美洲溪红点鲑中分离得到了m s t n 基因的两个基因型，一种基因型是从肌肉和脑中分离，另一种是从卵巢中分离的，两个基因型在氨基酸水平上具有9 2 的同源性此后，对于鱼类m s t n 基因的研究迅速发展起来，到目前为止，m s t n 基因在斑马鱼及一些重要养殖鱼类，如沟鲶、金鲷、虹鳟、大西洋鳟、莫桑比克罗非鱼、自狼鲈等上克隆出来( x u ，e ta 1 。2 0 0 3 ；g r e g o r y ，e ta 1 ，2 0 0 4 ；k o c a b a s ，e ta i 。2 0 0 2 ；o s t b y e ，e ta 1 。2 0 0 1 ；r o d g e m ，e ta 1 ，2 0 0 1 a ，b ) 。本实验室最近也克隆出了真鲷和花鲈的m s t n 基因并对它们的表达进行了分析( 叶寒青等；y ee ta i 。待发表) 。由于m s t n 基因具有肌肉生长和发育负调控作用，因此，鱼类m s t n的研究对于基因工程育种将具有重要的意义。1 1 鱼类i i s t n 基因的分子结构鱼类m s t n 基因和其它哺乳动物及禽类的m s t n 基因一样，都是由3 个外显子和2 个内含子所组成，编码着3 7 2 - 3 8 9 个氨基酸，外显子和内含子的边界处通过严格的a t - g c 连接。m s t n 基因在进化过程中相当保守，即使脊椎动物与无脊椎动物之间也具有相当的保守性，尤其是在c 末端成熟的蛋白活性区域，保守性更高，条纹斑鲈和白狼鲈的蛋白序列达到9 7 9 9 的相似性，与罗非鱼、斑马鱼、哺乳动物以及禽类的分别为9 1 、8 1 、6 8 和6 7 ，条纹斑鲈和白狼鲈的成熟的蛋白活性区域达到9 9 1 0 0 的相似性，与罗非鱼、斑马鱼、哺乳动物以及禽类分别为9 9 、9 5 、8 8 、8 8 的相似性( r o d g e m e ta 1 。2 0 0 1 a 。b ) 。m s t n 基因编码的蛋白生物活性区域有一个4 个氨基酸组成的r x x r 的蛋白水解酶加工位点，m s t n 基因成熟区通过其中9 个保守的半胱氨基酸形成二硫键，c 末端的“半胱氨酸”结构在所有t g f - 昼超家族中是保守的，对于m s t n基因的功能活性具有重要的作用。2 0 0 3 年x u 等( x u 。e ta 1 。2 0 0 3 ) 用染色体步移的方法克隆了斑马鱼的m s t n 基因5 的调节区域，并克隆、分析了斑马鱼m s t n 基因组结构( 图1 ) 。启动子序列分析证实了在a t g 启始位点的上游1 1 0 b p具有一个t a t a 框，以及7 个推测的肌肉特异性的e - b o x 位点( m y o d 结合位2花鲈肌肉生长抑素基因( m s t n ) 克隆、表达及其基因打靶载体的构建点( c a x x t g ) ) ，其中2 个相互靠近的e - b o x 位点( e 4 和e 5 ) 可能为m y o d结合区域，由于m y o d 总是以二聚体的形式发挥功能，这一结构也表明m y o d可能调节着m s t n 基因的表达。图1 斑马鱼m s t n 基因结构示意图( x ue t a l )f 码1 s t r u c t u r a lm a po fz e b r a f i s hm y o s t a t i n ( m s t n ) g e n e ( x ue ta f )1 2 鱼类i i s n 的不同基因型，在小鼠及大量的哺乳动物上，m s t n 基因被克隆，但并没有发现有其它的基因型报道。最近，在多种鱼类，如金鲷、斑马鱼、鲑鳟鱼等( r o b e r t s 。e ta 1 。2 0 0 1 ；o s t b y e ，e ta 1 ，2 0 0 1 ；m a c c a t r o z z o e ta 1 ，2 0 0 1 ；r e s c a n ，e ta 1 ，2 0 0 1 ；p e g g y ，e ta l ，2 0 0 5 ) 鱼类中发现了两个基因型，这两个基因型之间的保守性很高，有人认为，在鱼类上发现m s t n 有两个或者更多个基因型( 或许目前在鱼类上还没有发现的基因型) ，实际上是由于进化过程中基因倍增导致了两个基因型甚至更多个的基因型出现( p e g g y ，e ta l ，2 0 0 5 ) 在金鲷上的研究表明，这2 个基因型编码的蛋白具有6 8 的相似性( m a c c a t r o z z o ，e ta 1 ，2 0 0 1 ) ，而溪红点鲑的两个基因型在核甘酸序列上具有9 2 的相似性( r o b e r t s ，e ta 1 ，2 0 0 1 ) ，鳟鱼的两个基因型在核甘酸序列上具有9 3 的相似性( o s t b y ee ta 1 。2 0 0 1 ) 。最近，k e r r 等( 2 0 0 5年) 通过进化树对所有鱼类m s t n 的2 个基因型分析显示，在这些鲑鳟鱼及河豚中发现的2 个基因型实际上都归属于m s t n l ，进一步，他们通过对m s t n 两个基因型的序列比对显示了这两个基因型在多个蛋白区域存在着差异，即使是c 末端的蛋白活性区域也存在着一些差异。对斑马鱼两个基因型的启动予区域分析也显示m s t n 2 基因型的启动子上具有多个在肌肉发生和形成中起作用的c i s 调节元件，但在m s t n l 中没有发现这些c i s 调节元件。这一研究基本上澄清了m s t n 两个基因型分类上的混乱，但在鲑鳟及黑青斑河纯上发现的两个基因型是否是另一中国海洋大学博士论文个基因型，目前仍保持未知。1 3 鱼类i i s t n 基因的表达m c p h e r r o n 等研究表明小鼠m s t n 在发育的体节期及骨骼肌中表达( m c p h e r r o ne t a l 。1 9 9 7 a ) ，最近的研究表明除了肌肉细胞外，m s t n 在少数、几个组织，如心肌细胞、胰腺等组织中也有表达，同时在脂肪中也发现了低水平的表达( s h a r m ae ta 1 。1 9 9 9 ) 鱼类的m s t n 的表达尽管在物种之间存在着一定的差异，但基本肯定了m s t n l 型基因在鱼类几乎所有的组织中都发现了表达( o s t b y ee ta 1 2 0 0 1 ) ，而且研究表明在不同组织和胚胎中，两个m s t n 基因型的表达方式是不同的。这也暗示了m s t n 两个基因型可能具有不同的功能。1 3 1 不同组织的表达m s t n 在鱼体各种组织中( 如肌肉、眼睛、鳃、脑、脾脏、卵巢、肝脏、小肠等) 都有表达，但表达量有很大的差别，目前在一些鱼类m s t n 基因的组织分析显示，m s t n 基因在鱼类肌肉中表达量最高。在溪红点鲑上的表达显示( r o b e r t se ta 1 。2 0 0 1 ) ，两个基因型具有不同的表达，一个特异性的在卵巢中表达，另一个基因型在红肌和脑中都有表达，进一步研究表明m s t n 主要在溪红点鲑和黄鲈的红肌中表达，白肌中也有表达，但表达量比红肌中低得多。r e s c a n 等研究也显示鳟鱼m s t n 2 型基因主要在红肌中表达( r e s c a ne ta 1 。2 0 0 1 ) 。在金鲷上表达研究表明( m a c c a t r o z z oe ta 1 ，2 0 0 1 a ，b ) ，m s t n l 型基因在骨骼肌、心肌和脂肪组织中都有表达，m s t n 2 型基因几乎只在中枢神经系统中表达，而且只在后期的仔鱼中才开始表达。在斑马鱼d p ( p e g g ye ta 1 ，2 0 0 5 ) ，m s t n 在所有探测的组织中都有表达，而与m s t n 同源的g d f - 1 1 基因在肌肉和脑组织中表达最高，m s t n 基因在肌肉组织中相对比在脑组织中表达更高。o s t b y e 等通过r t - p c r 技术证实了大西洋鲑的m s t n l 和m s t n 2 型基因在白肌、小肠、脑、鳃、咽齿和眼睛中都能表达，除此之外，m s t n l 型基因在红肌、心脏、脾脏和卵巢组织中也探测到了表达( o s t b y e e t a l ，2 0 0 1 ) 。通过w e s t e r nb l o t 技术，用多克隆抗体在红肌，白肌、心脏、小肠和脑中探测到一个5 5 - k d a的蛋白前体；在鳃、咽齿、脾脏和头肾中探测到了3 5 - 4 0k d a 的免疫活性多肽，同时在眼睛和血清中发现了2 5 一k d a 成熟m s t n 蛋白。通过免疫组织学方法，m s t n 被定位在红肌和自肌的肌浆、小肠上皮细胞、鳃原始环骨板层基部以及咽4花鲈肌肉生长抑素基因( m s t n ) 克隆、表达及其基因打靶载体的构建齿的成牙质细胞和成釉细胞上。1 3 2 不同发育时期的表达在鱼类发育的整个过程中该基因都有表达，在沟鲶的不同发育时期的表达显示( k o c a b a se ta 1 ，2 0 0 2 ) ，从刚受精卵到2 龄的鱼体，其表达量逐渐提高，再随着年龄的增加，表达量逐渐减少，其表达的时序性与肌肉形成一致，这表明该基因在鱼类中可能还有另外一些功能。v i a n e l l o 等通过r t o p c r 和原位杂交技术对m s t n 基因在斑马鱼发育早期的胚胎中的表达做了研究( v i a n e l l oe ta 1 。2 0 0 3 ) ，他们在斑马鱼刚受精的卵中就探测到了m s t n 基因的表达，受精后8个小时，表达有所下降，他们认为这些m r n a 转录本是从母性遗传而来，随着早期发育逐渐降解；到受精后1 6 小时，m s t n 的m r n a 转录本又开始升高，。表明肌肉细胞分化过程中，m s t n 开始自身转录合成。受精后2 4 小时，m r n a转录本又略有下降，直到胚胎孵化后，又再次上调。他们认为斑马鱼胚胎中这一表达方式与其是小型鱼类，具有较慢的生长速度，和有限的肌肉增生有关。在金鲷不同发育时期中( m a c c a t r o z z oe ta 1 。2 0 0 1 b ) ，通过r t - p c r 和原位杂交显示，m s t n 2 型基因只在发育的后期表达，在早期的胚胎及刚孵化的仔鱼中也没有探测到m s t n 2 的表达。从早期的仔鱼( 2 5 - 3 1 天) 到成年鱼，m s t n 2 的表达有上升的趋势，而且。显示跟仔鱼的变态发育有关，在变态的前期比变态后的，m s t n 2 表达增加了2 4 倍。由于m s t n 2 的表达在变态时期增加，而在这一时期，鱼类的中枢神经系统完成分化，因此，他们认为m s t n 2 的功能与脑发育相关。在斑马鱼上( p e g g y e t a l 。2 0 0 5 ) ，通过r t - p c r 研究表明，g d f 1 1 ( m s t n 2 )早在受精后1 0 小时之前就已经表达了，但m s t n l 只在受精后2 4 小时后才有少量的表达。1 4 鱼类i i i s t n 基因的功能分析鱼类m s t n 基因具有肌肉生长和发育负调控的功能，目前在斑马鱼上通过反义核酸技术敲除m s t n l 转录子表明( a m a l ie ta 1 ，2 0 0 4 ) ，沉默的胚胎发育明显加快，通过表型观察发现m s t n l 沉默的斑马鱼身体尺寸增加，受精后2 0小时的沉默m s t n i 胚胎在尺寸上和对照组受精后3 0 小时的胚胎大小相似。原位杂交显示，受精后1 2 - 1 3 小时，m s t n l 沉默的斑马鱼胚胎体节数量比对照组增加了3 4 对，体节长度也有所增加，通过r t - p c r 技术表明，沉默了m s t n l5中国海洋大学博士论文的斑马鱼胚胎中m y o d ，m y o g e n i n ，和m c k 表达明显上调，i g f - 2 有微弱的上调，但i g f - 1 ，d e s m i n 和m y f 5 表达没有变化。通过这些结果表明，斑马鱼m s t n l在肌肉发生过程中具有重要的作用，其通过上调m y o d 。m y o g e n i n 和m c k 等肌肉特异性转录因子的表达，从而抑制了肌肉的增殖和分化。，一2 0 0 5 年，a c o s t a 等根据罗非鱼m s t n ( 与斑马鱼m s t n 具有大约7 4 的序列同源性) 蛋白d 末端从第2 6 8 氨基酸到最末端的活性区域的基因序列设计了3 3 3 b p 长的双链r n a ，通过显微注射技术将双链r n a 注射到斑马鱼胚胎中，检测胚胎发育和生长表明，注射双链r n a 的鱼平均体重比对照组鱼增加了3 9 - 4 5 ，而且体重的增加随着注射的双链r n a 剂量增加而增加。沉默m s t n的斑马鱼肌纤维比对照组增加，产生了过度生长现象。总之，通过反义核酸技术对斑马鱼胚胎早期发育过程中的m s t n 转录子沉默证实了m s t n 在胚胎早期发育中具有抑制肌肉发生和分化的功能；而r n a 干涉的研究也同样证实了m s t n 对于肌肉的生长和发育具有负调控作用，但目前的研究仍然不清楚鱼类m s t n 是否具有其他方面的功能，以及2 个基因型是否具有不同的功能。1 5 鱼类i i s t n 基因与其他基因的互作关系m s t n 基因在斑马鱼发育过程中的表达及其通过反义核酸技术敲除对各种基因，如m r f s ( 肌肉调节转录因子) 、m s p ( 肌肉特异性蛋白) 、i g f s ( 胰岛素样生长因子) 的效应表明( a m a l ie ta 1 ，2 0 0 4 ) ，m s t n 基因不仅仅限于抑制肌肉细胞的增殖和分化，而在整个肌肉形成过程中起着重要作用，但目前仍然不清楚m s t n 是否直接影响以及如何影响这些基因的表达。通过r t - p c r 和w e s t e r n 技术检测过量表达生长激素( g h ) 的银大麻哈鱼体内m s t nm r n a 转录本和蛋白表达分析表明( r o b e r t se ta 1 。2 0 0 4 ) ，成年的转g h 基因鱼比对照组鱼的免疫蛋白活性小，在快速生长的鱼体中，m s t n 基因表达的减少表明g h 合成代谢的作用能够被m s t n 所调节。1 6 鱼类i l s t n 基因的微卫星标记及多态性沟鲶m s t n 基因包含着多个微卫星位点( k o c a b a se ta 1 。2 0 0 2 ) ，其中在第1 个外显子上有一个( c a g ) 1 1 的重复序列导致了一个1 1 个连续的q 氨基酸残基，同时在第1 个内含子发现了3 个微卫星重复序列，第2 个内含子和3 非翻6花鲈肌肉生长抑素基因( m s t n ) 克隆、表达及其基因打靶载体的构建译区分别发现了一个微卫星序列。m a c c a t r o z z o 等在金鲷m s t n 的第2 个内含子和3 非翻译区分别发现了一个微卫星重复序列，初步的结果显示3 非翻译区的微卫星具有高度的多态性，从2 个不同的养殖群体的2 7 个个体中发现了8 个等位基因，长度从2 5 4 2 7 6 b p ，因此，他们认为这一微卫星可能作为肌肉生长性状相关的一个非常有用的分子标记( m a c c a t r o z z oe ta 1 。2 0 0 1 ) 。1 7m s t n 基因研究的意义及前景展望朱作言等( z h ue ta 1 ，1 9 8 5 ) 成功地将生长激素基因导入鱼类受精卵，于1 9 8 4 年研制出世界上第一批转基因鱼。转“全鱼”生长激素基因黄河鲤鱼生长速度比对照鱼快1 4 以上( w ue ta 1 ，2 0 0 3 ) ，尽管他们认为所转的基因产物为多肽，经过加热等物理处理后，食用是安全的；不育三倍体转基因鱼不能繁殖产生后代，能及时有效地控制种群规模，对环境也是安全的，但目前消费者心理上仍然难以接受。m s t n 基因是继生长激素( g h ) 、胰岛素样生长因子( i g f ) 之后新发现的生长方面的功能基因，由于它的负调控基因作用，与生长激素的作用正好相反，它的存在抑制了鱼类肌肉的生长。目前，在海水鱼类上，花鲈胚胎干细胞已经建立并体外分化证实长期培养仍具有多能性( c h e ne ta 1 ，2 0 0 3 ) ，而且正一负选择程序在鱼类上也已经建立( c h e ne ta 1 ，2 0 0 2 ) ，因此，未来有可能利用基因工程技术，如基因打靶、r n a 干涉等技术手段，结合胚胎干细胞技术，生产灭活m s t n 基因的k n o c k o u t 鱼类，使鱼类的肌肉含量提高，改良肉质，由于m s t n 基因是被灭活，而不是引入新的基因，因此，可避免应用生长激素所造成的潜在的副作用( m a c l e a ne ta 1 2 0 0 0 ) 其次，由于m s t n 基因上有多个微卫星序列，具有高度的多态性，这些微卫星序列是否跟肌肉性状连锁，还需要进一步证实，如果得以证实，这将为鱼类分子辅助育种提供一个非常有作用的候选遗传标记。另外，m s t n 基因在进化的过程中高度保守，而鱼类物种的多样性为m s t n 基因在进化过程中的演变过程的研究提供了很好的材料。2 鱼类胚胎干细胞及其介导的遗传操作研究进展胚胎干细胞( e s ) 是从动物早期胚胎内细胞团中分离的能在体外长期培养、高度未分化的细胞，在解除分化抑制的条件下能参与各种组织器官包括生殖系的发育。它具有发育上的全能性，在体外诱导的情况下，可以分化为各种细胞，并7中国海洋大学博士论文且具有自我更新的能力。胚胎干细胞具有以下几个特征：a 来源于胚胎的内细胞团或原始生殖细胞；b 能够在体外长期培养、扩增、转化和筛选，是一种无限增殖的细胞系；c 具有正常的染色体核型；d 具有分化潜能，能够参与包括原始生殖系在内的三个胚层( 内胚层、中胚层、外胚层) 的形成；e 能由单个细胞形成克隆群体，形成的克隆群体具有与原单个细胞相同的特性；f