（果树学专业论文）番茄抗花叶病毒（ToMV）的鉴定及其类似序列分离.pdf

摘要 番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) ，属于茄果类番茄属，原产秘鲁厄瓜多尔 一带的喜温植物。番茄适应性强，果实风味独特，营养丰富，世界上重要的农作 物之一。番茄花叶病毒病( t o m v ) 是一种世界性的病害，分布广，危害严重，造 成品质下降，产量锐减。按常规培育、改良品种周期较长、效率低，目前为止没 有行之有效的防治t o m v 的措施。在生物技术迅速发展的今天，应用转基因技术 不仅加速育种的进程，而且避免了不良基因留给后代。 本研究应用2 0 个番茄为材料，材料来源：四川农业大学保存的种质资源和 四川优良的栽培品种。研究的主要内容：用间自然条件下和室内接种t o m v 后对 各材料病情指数的调查，并对接种前后抗性酶( 过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙 氨酸解氨酶) 的活性进行测定及显著性分析，鉴定2 0 个材料对t o m v 抗性程度。 同时应用r a p d 对2 0 个番茄材料进行亲缘关系的分析，根据植物抗病基因的同源 性和保守序列的特性及前人的研究设计特异引物进行p c r 扩增。研究结果如下： 1 通过田间、室内发病指数的调查结果与分析及抗性酶活性测定，鉴定2 0 个材料对番茄花叶病毒病的抗性程度，将材料分成三类：第一类为抗病材料：中 杂9 号、早红宝、w 。、黄化黄叶番茄、黄圣果和美国番茄；第二类为耐病材料： 美味樱桃番茄、加州大红l 号、川杂一1 0 和o h 一2 2 1 1 ；第三类为感病材料：l - 4 0 2 、 今科红玫、大红番茄合作9 0 3 、加州大红4 号、改良美国9 0 3 、宝岛巨星、宝大 9 0 3 番茄、w 。、o h 一2 2 6 和金刚2 号大番茄。 2 r a p d 聚类分析结果：聚类距离从0 到0 7 2 ，以0 3 6 为标准将2 0 个参照 材料分为三大类。第一类为美味樱桃番茄、o h 一2 - 2 1 1 、黄化黄叶番茄。第二类 为中杂9 号；最后一类为l - 4 0 2 、今科红玫、加洲大红番茄4 号、改良美国9 0 3 、 宝岛巨星、早红宝、宝大9 0 3 、大红合作9 0 3 、加洲大红番茄1 号、w 。、中杂一 1 0 、o h 一2 2 6 、黄圣果、金刚2 号大番茄、w 。美国番茄。 3 根据植物抗病基因的同源性和保守序列的特性及前人的研究设计两对特 异引物对筛选材料扩增，结果如下：抗病材料扩增出一条比较亮的谱带，耐病材 料扩增出一条相对较暗的谱带，扩增条带分子量的大小相似；感病材料没有扩增 出谱带，我们初步认为这条带是抗番茄花叶病毒病的类似序列。 关键词：番茄：番茄花叶病毒病；材料鉴定；基因序列筛选 i d e n t i f yo ft o m va n ds e p a r a t i o ni t ss i m i l a rs e q u e n c e f r o mt o m a t ov a r i e t y l im i n ( p o m o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rl ih u a n x i u ( c o l l e g eo f f o r e s t r ya n dh o r t i c u l t u r a lc o l l e g e ，s i c h u a na g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y y a a n 6 2 5 0 1 4 ，c h i n a ) a b s t r a c t t o m a t o ( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) b e l o n g s t o l y c o p e r s i c o ng e n u so f s o l a n a c e o u s i ti sw a & - i n s e a s o np l a n t e da n dd e r i v e sf r o me c u a d o ri np e r u t o m a t o b e c o m e sak i n do fw i d e l y - p l a n t e d v e g e t a b l ea r o u n d t h ew o r db e c a u s eo fi t s a d a p t a b i l i t y , i t se x c e l l e n tt a s t ya n di t sh i g ha l i m e n t a t i o n b u tt h ed i s e a s eo ft o m v e f f e c t so nt h et o m a t o e s q u a l i t ya n dq u a n t i t ya l lo v e rt h ew o r l d i tw i l lt a k eal o n g t i m et oc u l t i v a t es o r t i er e s i s t a n tv a r i e t yb yt r a d i t i o n a lb r e e d i n gw a y s a sar e s u l t ，t h e r e i sn oe f f e c t i v em e t h o dt op r e v e n ta n de 1 i r ei tn o w s ow eh a v et os e e ko u tt h em o s t r e a s o n a b l ew a yw h i c hc a na c c e l e r a t et h eb r e e d i n gc o u r s ea n da v o i di l lg e n e sp a s s i n g t o f o l l o w i n gd e s c e n d a n t s w i t ht h ed e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o n o fb i o l o g i c a l t e c h n o l o g yw et a k em e a s l l r eo ft r a n s f e r r i n gr e s i s t a n tg e n et o e n d u r a b l ev a r i e t yt o o b t a i nar e s i s t a n tv a r i e t y t w e n t yv a r i e t i e so f t o m a t ow h i c hc o m ef r o mc u l t i s p e c i e so f s i c h u a na g i c u l t u r a l u n i v e r s i t ya n dt o m a t og e r m p l a s mw i t hd i f f e r e n tr e s i s t a n c ew e r eu s e di nt h i sr e s e a r c h w ei d e n t i f i e dt h er e s i s t a n c et ot o m vt h r o u g hi n v e s t i g a t i o ni nf i e l da n di nl a b o r a t o r y m e a n w h i l e ，i s o z y m e ( p p o 、p o d 、p a l ) a c t i v i t yi nn o n - i n o c u l a t e da n di n o c u l a t e d v a r i e t i e sw e r em e a s u r e da n da n a l y s i s e d p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po ft w e n t yt o m a t o v a r i e t i e sw e r es t u d i e db a s e do np h y l o g e n e t i et r e eb yu s i n go f u p g m a m e t h o d b a s e do nt h eh o m o l o g ya n dc o n s e r v a t i o no ft h er e s i s t a n c eg e n e , t w op a i r so f p r i m e r sw e r ed e s i g n e d ，b yw h i c hp c ra m p l i f i c a t i o nw e r ep e r f o r m e dt oa m p l i f y r e s i s t a n tv a r i e t i e s 、e n d u r a b l ev a r i e t i e s 、s u s c e p t i b l ev a r i e t i e s ；i i h em a i nr e s u l t so f t h i sr e s e a r c ha r es h o w na sf o l l o w s ： 1 t w e n t yv a r i e t i e so ft o m a t ow e r ec l a s s i f i e di n t ot h r e ed i s e a s e - r e s i s t a n tg r o u p s a c c o r d i n gt ot h e i re x h i b i t i o ni nf i e l d sa n di nl a b o r a t o r y n l cf a s tg r o u pw a sr e s i s t a n t v a r i e t i e s ，i n c l u d i n g z h o n g z a n 0 9 、z a o h o n g b a o 、w 2 6 2 - 4 、y e l l o w - l e a f t o m a t o 、h u a n g s h e n g g u oa n da m e r i c a nt o m a t o ；t h es e c o n dg r o u pw a se n d u r a b l ev a r i e t i e s ， i n c l u d i n g d a i n t yc h e r r y t o m a t o 、c a l i f o r n i a n o l 、c h u a n z a n o l o a n d o h - 2 2 1 1 ；t h e t h i r dg r o u pw a ss u s c e p t i b l ev a r i e t i e s ，i n c l u d i n gl 一4 0 2 、j i n - k eh o n g - m e i 、b i gr e d t o m a t o9 0 3 、c a l i f o r n i an 0 4 、g a l d i a n ga m e r i c at o m a t o 、b a o d a oj u - x i n g 、b a o d a 9 0 3 、w 2 6 2 、o h 一2 2 6a n dj i n g - g a n gb i gt o m a t on 0 2 2 r a p dc l u s t e r i n gd i s t a n c ew a sf r o m0t o0 7 2 t h r e eg r o u p sw e r ec l u s t e r e d b a s e do nt h ed i s t a n c eo 3 6 t l l cf i r s tg r o u pi n c l u d e sd a i n t yc h e r r yt o m a t o 、o h 一2 2 1 1 、 y e l l o w l e a ft o m a t o ；n l es e c o n dg r o u pi n c l u d e sz b o n g - z an 0 9 ；t h et h i r dg r o u p i n c l u d e sl 一4 0 2 、j i n k eh o n g - m e i 、c a l i f o r n i an 0 4 、g a i - l i a n ga m e r i c at o m a t o 、 b a o d a oj u x i n g 、z a oh o n g - b a o 、b a o d a9 0 3 、b i gr e dt o m a t o9 0 3 、c a l i f o r n i an o l 、 w 2 6 2 、c h u a n - z a n o l 0 、o h 一2 2 6 、h u a n gs h e n g g u o 、j i n g g a n gb i gt o m a t on 0 2 、 w 2 6 2 4a n da m e r i c at o m a t o 3 b yp c ra m p l i f i e ds t r a t e g yw i t hg e n es p e c i f i cp r i m e r s t h er e s i s t a n tg e n e s e q u e n c ew a sa m p l i f i e df r o mr e s i s t a n ta n de n d u r a b l ev a r i e t i e s ，b u tt h a tw a sn o t a m p l i f i e df r o ms u s c e p t i b l ev a r i e t i e s t h em o l e c u l a rw e i g h to fa m p l i f i e dg e n ew a s s i m i l a r w et h i n kt h a tt h i ss e q u e n c ei sr e s i s t a n ts e q u e n c ea b o u tt o m v k e yw o r d s ：t o m a t o ；t o m v ；i d e u t i 母o f t o m a t ov a r i e t i e s ；s i m i l a rg e n es e p a r a t i n g 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或 集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学 位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：耋稻 1 研年f 月押日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川i 农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被杏阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文。同意四川i 农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容。 研究生签名：摊 导师签名 嗲祈 1z 阿厂年f 月砷日 h 1 巧一年f 月卯日 1 引言 番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) ，又名西红柿，属于茄果类番茄属，是原产秘 鲁厄瓜多尔一带的喜温植物。番茄适应性较强，具有露地、保护地、盆栽等多种栽培 方式，番茄果实具有独特的风味，果实中含有极为丰富的营养，产量高、经济效益好。 由于其食用性广，既可以鲜食又可作加工。近一个多世纪以来，已经发展成为全世界 年总产量最高的3 0 种农作物之一，然而在番茄的生产过程中，由于病虫危害，经常 造成大面积的减产。 番茄病毒病是一种世界性的病害，分布极为广泛，危害十分严重，造成品质下降， 产量锐减，因而一直受到人们的高度重视，杜永臣等报道，目前在番茄生产上经常发 生的病害已达4 0 多种，其中番茄病毒病就是番茄生产中普遍发生的病害之一“1 。人们 对番茄病毒病的最早认识是从番茄花叶病毒( t o m v ) 开始的。1 9 0 9 年美国在番茄植株上 发现的第一种病毒就是t o m v ，此后，世界各地陆续报道了近3 0 种病毒可以侵害番茄， 如黄瓜花叶病毒( c n ) 、马铃薯x 病毒( p v x ) 、马铃薯y 病毒( p v x ) 、番茄斑萎病毒( t s w v ) 、 番茄曲叶病毒( t l c v ) 、番茄丛矮病毒( t b s v ) 、番茄曲顶病毒( t a c v ) 等等。我国对番茄 病毒病的研究也是从t o m v 开始的，现已发现番茄上至少有1 2 种病毒，其中经全面鉴定 的有t o m v 、c m v 、p v x 、p v y 、苜蓿花叶病毒( a m v ) 、烟草蚀纹病毒( t e v ) 等。经初步鉴 定的有t s w v 、番茄不孕病毒( t a v ) 、烟草坏死病毒( t n v ) 和番茄环斑病毒( t r s v ) 等，经 过血清学鉴定的有番茄黑环病毒( t b r v ) 、绒毛烟斑驳病毒( v t m v ) 等。就世界范围来讲， 在上述病毒中以t w 发生最普遍，其次是c m v ，再次是t s w v 并n p v x 。在我国番茄主产区 鉴定出番茄病毒病的主要毒源有t o m v 、c m v 、p v x 、p v y ，且愈往j l t o m v 表现愈突出， 愈往南c m v 愈严重。 近些年来由于人工驯化、环境的变化及其它因素，番茄病毒病的发生更为严重， 这就给育种工作者提出新的挑战，过去鉴定作物品种抗病性大多是采用苗圃、田间调 查鉴定，虽然结果可靠，但是费时、费工、费地，工作量极大。自8 0 年代以来，人 们已经开始探索新的、更有效的途径来缩短抗病育种进程，最初酶法应用的较多。随 着分子生物技术的飞速发展，抗病育种在分子水平上的应用也越来越普遍。 2 综述 2 1 植物抗病基因分子生物学研究进展 植物在其长期的进化过程中常受到一些病原微生物的侵袭，它们在生态系统中长 期并存，相互影响，乃至协同进化，在这一过程中植物逐渐形成了一系列防御机制来 保护自己。这些机制既有专一性的抗性，也有非专一性的抗性：其表达既有组成型的， 也有诱导型的。在植物与病原微生物的相互作用过程中，关键环节是它们的相互识别 以及随后发生的一系列反应根据f l o r 提出的基因对基因假说( g e n ef o rg e n e h y p o t h e s i s ) ，植物对某种病原物盼特异抗性取决于它是否具有相应抗性基因 ( d i s e a s er e s i s t a n c eg e n e ，r 基因) 。1 ，而同时病原物的专一致病性取决于它是否具 有无毒基因( a v i r u l e n c eg e n e ，a v r 基因) ，只有具有相应抗病基因的寄主植物与具有 无毒基因的病原物相遇时，才会激发植物的抗病反应，两者表现为非亲和，而在其它 情况下寄主感病，表现为亲和。随着研究向分子水平的深人，基因对基因假说得到了 补充：病原无毒基因直接或间接产生激发子( e l i c if o r ) ，与植物抗病基因编码的受体 ( r e c e p t o r ) 相互识别产生信号，通过传导途径传播，诱发植物的防御机制，使植物产 生防卫反应。这被称为激发子受体模型。3 。在分子水平上研究r 基因的结构与功能将 有利于阐明植物抗病性的分子机制，从而进一步改良作物的抗病性。 2 1 1r 基因( d i s e a s er e s i s t a n c eg e n e ) 的结构 己克隆的r 基因虽然来自不同物种，但这些r 基因编码的蛋白产物却具有相对保守 的结构基序。其编码产物都含有下列一种或多种保守结构：核苷酸结合位点 ( n u e l e o t i d eb i n d i n gs i t e ，n b s ) 、亮氨酸富集重复序列区( l e u c i n e r i c hr e p e a t d o m a i n ，l r r ) 、丝氨酸苏氨酸激酶( s e r i n e - t h r e o n i n ek i n a s e ，s t k ) ，跨膜结构域 ( t r a n s m e m b r a n ed o m a i n ，t m ) 、有的还具有亮氨酸拉链结构域( l e u c i n ez i p p e rm o t i f ， l z ) 、果蝇t 0 1 1 蛋白和人类白细胞介素一1 受体类似结构域( t o 1 h u m a ni n t e r l e u k i n 一1 r e c e p t o rd o m a i n ，t i r ) 。 ( 1 ) 核苷酸结合位点( n b s ) n b s 存在于真核生物的许多蛋白中，它由p l o o p 的保守区组成。p - l o o p b p 磷酸结 合环，包括k i n a s e - l a 、k i n a s e - 2 a 、k i n a s e 一3 a 及两个未知功能区，它们共有序列为 g m ( g p ) g x g k t ( a t ) ( x 为任意氨基酸，a 为疏水氨基酸) 。k i n a s e 一2 a 区共有特点是 4 个疏水氨基酸残基后紧跟一个不变的带负电荷的天冬氨酸，但在植物中，这一区域 的两边还具有高度保守的氨基酸。共有序列为k ( k r ) x a a a a d d v ( w d ) 。k i n a s e 一3 a 区与d n a 的嘌呤或核糖结合有关，通常含有一个精氨酸残基，其保守区为s r a a a t ( t s ) r 。 r 基因中n b s 结构域的高度保守性，说明三磷酸核苷酸的结合对r 基因发挥功能是 必要的。蛋白质的磷酸化和去磷酸化可引起构象变化，在这些构象变化的蛋白质中许 多可能是基因转录调控过程中的调节因子，可通过核膜孔与基因顺式作用元件结合， 从而调控基因的转录表达。实验己证明通过定点突变改变r p s 2 蛋白中n b s 的关键氨基 酸可使其失去诱发h r ( h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e ，过敏性反应) 的功能“1 。 ( 2 ) 亮氨酸富集重复序列区( l r r ) l r r 是指连续重复的富含亮氨酸的一段氨基酸序列，每个重复序列约由2 0 至1 j 2 9 个 ( 一般为2 4 个) 氨基酸残基组成，在一定的间隔区域内规律性地含有亮氨酸或其他疏水 氢基酸残基。大部分己克隆的r 基因编码产物都含有l r r 。根据r 基因编码蛋白所含的 l r r 的细胞定位，将其分为2 类，一类是定位于细胞质的l r r ，识别膜内配体，如m 肌 l 6 f 3 c j p s 2 年1 3 r p m l 等，主要见于含有n b s 的r 基因产物中，其l r r 区一般位于蛋白质的c 端； 另一类是定位于胞外的l r r ，识别膜外配体，如a 刃、c 一9 ，c ，决擎，其l r r 的重复数较 高，一般具有完整的重复结构。胞外l r r 第1 4 位上的残基为甘氨酸，这是所有跨膜l r r 的特征，胞外l r r 区一般位于n 端信号肽之后，占据了蛋白质的绝大部分。 r 基因的l r r 区正好提供了结合其它蛋白的受体结构域，其中保守的亮氨酸形成疏 水的与无毒基因编码蛋白配体结合的结构，而非保守的氨基酸残基决定了与配体结合 的特异性，这与受体一配体相互识别的专一性有关”1 。b e n t 等也提出某些r 基因产物中 的i 。r r 是病原体无毒基因产物的结合区域，与植物抗病反应的识别有关。除此之外， l r r 可能还有促进r 基因产物与植物抗性反应信号传导中的其他蛋白质之间互作的作 用，从而参与识别后的信号传导。人们发现l r r 中单一氨基酸的变化可导致抗病反应 的消失或减弱，而且单独在水稻中表达船纠蛋白的l r r ，水稻亦可表现出对水稻白叶 枯病菌部分抗性，这些证据都表明l r r 在植物抗病过程中具有重要作用。 ( 3 ) 丝氨酸苏氨酸激酶结构( s t y ) 丝氨酸苏氨酸蛋白质激酶域包括两个特征区域，分别为d a k x x n 和g t a g y x a p m e ) 。番茄的p r o 与水稻的x a 2 ，基因都编码该结构域。该激酶在抗病反应信号传导中 通过磷酸化及其他信号分子传递信息，并在随后防卫反应的调控中起作用。 ( 4 ) 亮氨酸拉链( l z ) l z 是指蛋白质一侧有规律地出现亮氨酸残基，在a 一螺旋中靠其疏水作用两两相联 而成为排拉链式构型。l z 区一般位于n b s 结构之前，有助于形成蛋自的同源或异源 二聚体，并促进蛋白质之间的特异相互作用。蛋白的二聚体和多聚体对细胞膜受体及 转录因子的活化十分重要。受病原菌激发前的r 基因产物( r 蛋白) ，可能是以单体存在 的，但一经活化则可能形成二聚体或寡聚体：活化前以二聚体或寡聚体形式存在，而 活化后则会发生解聚作用。 ( 5 ) 白细胞介素一1 受体类似结构( t i r ) 噙乳动物自细胞介素一1 受体蛋白( i l 一1 r 蛋自) 和果蝇发育受体蛋自t o l l 的胞质域 都会在病原物信号的作用下，引起有关转录因子的激活和从胞质到细胞核的移位，进 而激活防卫基因的转录和表达“1 ，肌l 6 、r p p k 脬惭基因编码的n h z 一末端区域，与 儿一，的r 基因和t o l l 基因的胞质信号区域同源。1 。r 基因的类似结构可能与激活防卫 基因的转录因子有关，所以植物抗病基因也可能存在与哺乳动物、昆虫自然免疫系统 相似的抗病途径，通过其编码蛋白质使受体触发信号传递途径，最终激活植物防卫反 应。 2 1 2r 基因的分类 根据r 基因保守结构域所编码的蛋白不同，可大致分为6 大类： ( 1 ) 编码n b s l r r 类蛋白 此类r 基因产物的主要特征是含有核萤酸结合位点和l r r 的胞内受体蛋白。大多数 的r 蛋白属于此类。该基因产物的结构特点是在n 一端具有n b s 的3 个保守区p l o o p ( 磷酸 结合环) 、k i n a s e 一2 a 、m n a s e - 3 a ，在其下游具有氨基酸序列为g l p l x a 的疏水域：在c 一 端存在1 4 个或1 4 个以上不完善的l r r ，每个重复单位大约有2 4 个氨基酸残基。这类r 基因的产物根据n b s 上游区域的情况，又可分为3 个亚类，第一亚类r 基因编码 t i r n b s l r r 型r 蛋白，包括肌l 6 、r p p s , 肛n 端的与果蝇t o i l 蛋白和人类白细胞介 素一1 受体类似结构域表明这些基因介导的植物抗病反应类似于动物中免疫反应。第二 亚类r 基因编码l z n b s l r r 型r 蛋白，包括r p s 2 、舻儿、厅 1 1 1 2 ，其产物在n 一端和n b s l r r 间有亮氨酸拉链结构，可能与蛋白质一蛋白质相互识别有关。这类基因编码的蛋白质 可能与植物细胞内的激发子相互作用。第三亚类r 基因编码蛋白在n b s 上游区域不具有 明显特征，包括1 1 、x a l 。 ( 2 ) 编码含有l r r 的跨膜受体蛋白 番茄的c f - 2 ，c f - 4 和口蟪因编码的蛋白，在n 一端存在一个胞) b l r r ，c - 端具有 疏水氨基酸组成的跨膜结构域。跨膜结构域将蛋白锚定在膜上，由l r r 结合激发子后， 将识别信号传递到细胞内其它的信号传导蛋白。基因c f - 2 、f 产卿俨9 编码蛋白的l r r 4 高度同源，后面9 个几乎完全一致的l r r ，与它们所抵抗的是共同的病原物c f u l v w n 的特异小种是吻合的。 甜菜抗胞囊线虫基因胎”7 编码的蛋白不同于上述r 蛋白，它推测的信号肽很短， 含有许多极性氨基酸残基，这与上述功能区域矛盾；另外，其假定的l r r 结构缺少其 它i 。r r 区共有的特征，如亮氨酸间隔，而且也没有其它特殊的氨基酸残基。 ( 3 ) 编码s t k 蛋白 番茄抗细菌叶斑病基因r a 编码丝氨酸一苏氨酸蛋白激酶，在细胞质内直接与病原 a y r 尸 d 基因产物相互作用。s t k 可能参与蛋白质的磷酸化作用，因而在细胞间的信号 传递过程中起作用。 ( 4 ) 编码l r r - t m - s t k 蛋白 水稻抗白叶枯病基因胎2 鹚稿码的跨膜类受体蛋白激酶，n 一端是一个疏水的信号 肽，其后有2 3 个不完备的以2 4 氨基酸为单位的l r r 结构，含有特征性的保守的甘氨酸， 属于末端区域，与皿一珀q r 基因和t o l l 基因的胞质信号区域同源”1 。r 基因的类似结构 可能与激活防卫基因的转录因子有关，所以植物抗病基因也可能存在与哺乳动物和昆 虫自然免疫系统相似的抗病途径，通过其编码蛋白质使受体触发信号传递途径，最终 激活植物防卫反应。 ( 5 ) 编码毒素还原酶( t o x i nr e d u c t a s e ) 玉米抗圆斑病基因h m l ，编码一个依赖于h c 一毒素还原酶，h c 一毒素是真菌 c o c h l i o b o l u sc a r b o m a nl 号生理小种产生的致病因子，它使病原菌能够侵染某些基 因型的玉米。含有z 纠基因的植株能解除病原菌中形成的h c 一毒素而表现抗性，由于不 能产生毒素的病原菌竞不能侵染无砌基因的玉米品种，所以它的抗病机制不符合基 因对基因假说。 ( 6 ) 编码跨膜蛋白 从大麦中分离得到的肼磋因也是抗病基因，该基因编码的蛋白中至少有6 个跨膜 蛋白螺旋，但没有其它r 基因类似结构。它是菌株非特异性抗性基因，对已知的自然 界大麦白粉病具有广谱抗性。 2 1 3 分子标记及发展 人们应用遗传标记的历史悠久，在人类社会发展的很长的一段时间内，人们一直 是利用肉眼可见的生物外表形态特征作为标记进行选择、驯化、改良植物。进入二十 一世纪，随着生物学各个分支科学的发展，遗传标记的范围也相应地开凿，从外观形 态的表现型扩展到生理、生化、细胞、病理和免疫等多方面，诞生了生化标记和细胞 学标记。从检测方法的角度看，生化标记是一类新型的遗传标记，表现的是生物体分 子水平上的差异，但没有突破表达基因的范围。结合其它标记应用与遗传育种研究的 需要。b o t s t e i n 等首先提出的r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 可以作为遗传标记，从此开创了直接应用d n a 多态性发展遗传标记的新阶段。8 0 年 代后期，p c r ( 多聚酶链式反应) 技术的产生，使得d n a 直接扩增多态性成为可能， 在此基础上产生了多种新型的d n a 分子标记，如：r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e d p o y m o r p h i cd n a ，随机扩增多态性d n a ) 标记、a f l p ( a m p i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o y m o r p h i c ，扩增片段长度多态性) 标记、s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，简单序列 重复) 标记等。与此同时，各种电泳技术的发展，提高了电泳分辨多态性的能力，如 分辨单链d n a 构象的电泳技术产生了s s c p ( s i n g l es t r a n dc o m f o r m a t i o n p o l y m o r p h i s m ，单链构象多态性等) 。对目标基因进行鉴定、定位和筛选的重要工具。 人们借助于遗传标记研究目标基因或性状的遗传规律，进行植物品种改良或培育出期 望的高产、优质、抗性强的优良品种。 d n a 分子标记是指生物基因组d n a 经限制性内切酶酶切、聚合酶链式反应( p c r ) 扩增或二者结合等，电泳检测到的结果反映基因组某种变异特征的特异性d n a 片段。 与表型标记相比，分子标记具有许多优点：( i ) 直接反映d n a 分子水平上的变异，能 对各发育时期的个体、组织、器官作检测，不受环境的影响，也不受基因表达与否的 限制，为研究工作提供了极大的便利；( 2 ) 多态性高，不用专门创造特殊的遗传材料； ( 3 ) 数量大，几乎是无限制的，遍及整个基因组；( 4 ) 分子标记对生物体通常没有 不良影响，也不影响生物性状的表现，即表现为“中性”；( 5 ) 多数分子标记表现 为共显性，能分辨所有的基因型。分子标记的所有这些特性，使其迅速得到广泛应用。 ( 1 ) r f l p 标记 r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，限制性片段长度多态性) 是荷兰科学家z a b e a u 等1 9 9 3 年发明的一种d n a 分子标记新技术，其基本原理是选择 性扩增基因组d n a 的限制性酶切片段。r f l p 是指限制酶位点间的插入、缺失、重排 或点突破导致酶切位点的增减所引起的基因型间限制性片段的差异。r f l p 标记是最 早用于构建遗传图谱的d n a 分子标记。截止目前，各种作物的遗传图谱中的r f l p 标 6 记f 宁大多数。其优点是：无表型效应，检测不受环境和发育阶段的影响；共显性，可 以区别纯合基因型和杂合基因型；可以利用的探针多，可以检测到多个遗传位点。缺 点是对d n a 的要求质量高，需要量大，操作复杂，通常接触放射性的物质等”1 。 ( 2 ) r a p d 标记 在p c r 技术的基础上，w i 儿i a m s 等采用一套随机核苷酸序列( 通常为1 0 个碱基) 为引物扩增基因组d n a ，产生随机长度的d n a 片段，获得一种新的d n a 标记，即r a p d 标记“。r a p d 反应产物通常用琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色后紫外光下观察， 但用聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) 分离，银染，能观察到更多的d n a 条带“。与r a p d 相类似的标记还有a p p c r 和d a f 。a p p c r 是任意引物p c r ( a r b i t r a r yp r i m e dp c r ) 的简称，使用的引物长度与一般的p c r 反应中的引物相当，但在反应开始阶段退火温 度较低，允许大量错配，引发具有随机性的扩增。d a f 是d n a 扩增指纹( d n a a m p l i f i c a t i o nf i n g e r p r i n t i n g ) ，使用的引物比r a p d 反应的更短，5 8 个核苷酸， 因此可以和模板d n a 随机结合的位点更多，扩增得到的d n a 条带也更多，需要用聚丙 烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) 分离，银染检测“。“1 。在d n a 多态性程度比较低、难以检测 的作物中，d a f 技术是一种很有用的工具“。有r a p d 、a p p c r 和d a f 组成的多态性 分析方法统称为m 从p ( m u l t i p l ea r b i t r a r ya m p l i f i c a t i o np r o f i l i n g ) ”“，不过应 用最多的是r a p d 标记。与r f l p 相比，r a p d 的优点是对d n a 质量要求不高，需要量 极少，操作简单易行，不需要接触放射性，一套引物可以用于不同生物的基因组分析， 可以检测整个基因组，两条引物配对使用，能产生新的带型，可以找到更多的标记“ ”但绝大部分r a p d 是显形标记，不能区分基因型是纯合还是杂合，每个标记提供 的信息量少，重复性差。r a p d 标记一般为重复序列，若不是重复序列，也可将其转 化为r f l p 标记，进一步验证r a p d 分析的结果。 ( 3 ) s s r 标记 s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，简单序列重复) 是重复序列中的一种类型，又称 微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t ed n a ) ，重复单位很短，只有1 - 5 b p ，总长度为几十个 b p ，分布于整个基因组的不同位置上。微卫星d n a 两端的序列一般是相对保守的单拷 贝序列，据此可通过设计特异引物进行s r p c r 扩增来揭示微卫星d n a 的多态性，称 为简单序列长度多态性( s i m p l es e q u e n c el e n g t hp o l y m o r p h i s m ，简称s s l p ) 。其 特点是多态性强，随机均匀分布在整个基因组，可通过快速检测分析，引物序列公开 发表易于广泛交流使用。 i s s r ( i n t e rs i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，插入简单序列重复) 是另一类分子标 记，与s s r - p c r 相比，用于s s r - p c r 的引物不需要预先测定就可以设计( 长度为1 5 - 1 8 个碱基) ，因此能够与基因组d n a 中的s s r 的5 或3 端结合，通过p c r 反应扩增s s r 之问的d n a 片段 9 - 2 h 。 ( 4 ) s a p 标记 s a p ( s p e c i f i ca m p l i c o np o l y m o r p h i s ，特异性扩增子多态性) 标记是从其它标 记转化来的，常见的有s c a r s 和s t s s 。为提高r a p d 标记的稳定性，将其转化为s c a r s ( s e q u e n c e dc h a r a c t e r i z e da m p l i l i e dr e g i o n s ) 标记”“。首先克隆r a p d 标记片段 并对其末端测序，根据末端测序在原来r a p d 引物从1 0b p 增加1 0 1 4 b p 核苷酸合成 新的特异引物，用此引物对基因组d n a 在进行扩增分析，可扩增出与克隆片段同样大 小的条带，其多态性表现为共显性的s c a r 标记。相对于r a p d 标记，s c a r 标记有许 多优点，如：对反应条件不敏感，稳定性和可重复性比r a p d s 增强了许多，只检测单 个位点等。若待检测d n a 间的差异表现为扩增片段的有无，可以直接在p c r 管中加入 溴化乙锭，在紫外灯下观察有无荧光，判断有无扩增产物，可以省去电泳的步骤。 序列示踪位点( s t s s ，s e q u e n c e t a g g e ds i t e ) 是0 1 s o n 等提出的，最初在人类 基因组物理图谱中用作d n a 陆标( l a n d m a r k ) ，是一种短的单拷贝d n a 序列，能用 特异寡核苷酸引物从基因组文库或基因组d n a 中经p c r 扩增获得。33 。r f l p 标记经两 端测序，可转化为s t s s 。s t s s 能够在实验室间交流，可以用于物理作图的独特方法， 而且s t s 测序的发表使人们不用贮备和分发大量的克隆。用s t s s 进行物理作图，可 以通过p c r 或杂交途径来完成。s c a r s 具有s r s s 的优点，但有两方面不同于后者， 首先s c a r s 在遗传上是明确的，所以不仅能用作基因组中的陆标，还可以用作遗传标 记；其次，在扩增的片段中可能含有重复的d n a 序列，只能通过p c r 进行分析，而不 能通过杂交进行分析。 ( 5 ) r g a s 标记 r g a s ( r e s i s t a n c e g e n ea n a l o g s ，抗病基因类似物) 标记是用于抗病基因保守序 列设计的引物扩增基因组得到的，与已知抗病基因序列有一定同源性的一类d n a 分子 标记。k a n a z i n 等根据亚麻l 6 基因、烟草n 基因和拟南芥r p s 2 基因的氨基酸一致 区域设计引物，将得到的几个r g a 作图与大豆的已知抗病基因附近位点。同样用于n 基因和r p s 2 基因核苷酸结合位点( n u c e o t i d e b i n d i n gs i t e ) 的引物，y u 等把得 到的r g a 作图与大豆已知抗y 病毒基因( 助v l ，印v 2 ) 、抗根腐病基因( r p s l 、助s 2 、 r p s 3 ) 和抗白粉病基因( r m d ) 的邻近区域相似”。用对应于丝氨酸苏氨酸蛋白酶 亚域的保守区域的引物，f e u i l l e t 等成功地分离出小麦抗叶锈病基因，仉绝大多 数报道用琼脂糖凝胶电泳分辨p c r 产物，得到的r g a s 用作探针检测植物基因型间多 态性。由于琼脂糖凝胶上观察到的单条带存在d n a 片段的异质性，据此c h e n 根据 抗病基因保守序列设计9 对引物，扩增小麦、水稻和大麦基因组”，其产物用高分辨 率的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，筛选r g a s ，结果