（植物学专业论文）胚乳自主发生型龙须草fie基因部分cdna序列的克隆和表达分析.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 番 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究x - 作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地3 - 外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生张町囊 帆知7 年石月h 学位论文使用授权书 本人完金了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：印导师签名：e 肥暴力兮 签名日期：p 7 年名月) f 日签名日期：叼年月矽日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 摘要 配子体无融合生殖避开了减数分裂和受精作用，产生具有母本基因型的克隆后 代，在种子生产和杂种优势利用上有诱人的应用前景。龙须草( e u l a l i o p s i sb i n a t a ) 为禾本科一种新型无融合生殖材料，为配子体无孢子生殖，且存在胚乳自主发生类 型，即极核或次生核可不经受精而形成四倍体的胚乳。鉴于农作物如水稻、小麦等 的食用部分主要为胚乳，且产量和品质与胚乳直接相关，那么对胚乳自主发生的无 融合生殖材料的研究就显得很有意义。 我们根据拟南芥，水稻，玉米等物种的f i e 序列的保守区域设计简并引物，以 广东星子居群红杆型龙须草的花序为材料，抽提r n a ，用r t - p c r 的方法扩增到 8 0 0 b p 左右的片断，将其克隆到p g e m t 载体上并测序。同时我们以水稻f i e 的e d n a 克隆制备e r n a 探针，通过原位杂交的方法研究f i e 基因在无融合生殖龙须草中的 时空表达。 主要研究结果： 1 测序结果表明该片断长为8 2 6 b p ，编码2 7 5 个氨基酸，暂命名为e b f i e l 。 e b f i e l 与已报道的玉米，高粱和水稻等物种f i e 基因具有很高的相似性，为龙须草 f i e 基因特异片断。在此基础上我们可以获得全长e d n a ，从而能进一步研究野生 型f i e 基因和突变f i e 基因的同源性及其功能。 2 e b f l e i 与玉米f i e l 、玉米f i e 2 、水稻f i e 和小麦f i e 核苷酸同源性分 别为9 5 、8 3 、8 7 、8 4 ，与玉米f i e i 、f i e 2 、水稻f i e 、高粱f i e 、拟南芥f i e 、 梓树f i e 和桉树f i e 氨基酸同源性分别为9 5 、7 6 、8 8 、9 4 、7 2 、8 0 和8 4 。 3 我们以水稻f i e 的e d n a 克隆制备c r n a 探针作原位杂交，发现龙须草 中f i e 基因的表达确实存在时空的特异性。f i e 仅在雌配子体和雄配子体中表达， 而在花的其他部位无杂交信号。孢母细胞形成至单核小孢子时期，f i e 主要在雄蕊 小孢子中表达，雌蕊中仅大孢子母细胞( 无孢子生殖起始细胞) 显示有杂交信号； 胚囊发育时期，雌配子体细胞有f i e 表达，此时小孢子信号减弱；成熟胚有很强的 杂交信号胚乳中则没有。败育子房和花药中完全没有f i e 表达。这就说明f i e 在 雄配子体中的表达逐渐减弱，而在雌配子体中的表达逐渐增强，在种子形成中控制 和调节胚乳与胚的发育。 胚乳自主发生型龙须草f i e 基因部分c d n a 序列的克隆和表达分析 结论：本研究以胚乳自主发生型的无融合生殖龙须草为材料，采用同源序列法， 通过r t - p c r 克隆了无融合生殖胚乳自主发生相关基因f i e 的部分e d n a 同源序列， 并做了详细的比对分析。此特异片断为f i e 全长的获得和龙须草胚乳自主发育分子 机理的研究奠定了基础。原位杂交的结果表明f i e 在龙须草生殖发育的过程中特异 的时空表达，与雌雄配子体发育有关，并参与调节胚和胚乳的发育。 关键词：f i e ；无融合生殖；胚乳自主发育；基因克隆；原位杂交 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 a b s t r a c t o a m e t o p h y t ea p o m i x i sp r o d u c e sm a t e r n a lg e n e t i cc l o n eo f f s p r i n gw i t h o u tm e i o s i s a n df e r t i l i z a t i o n , w h i c hw i l lh a v eg o o d a p p l i c a t i o n i n s e e d p r o d u c t i o n a n d h e t e r o s i s e u l a l i o p s i sb i n a t a , w h i c hb e l o n g s t ot h es u h t r i b ea p o e o p i d i n a ei ng r a m i n e a e ，i s a p e r e n n i a lg l a s s r e c e n t l y , a p o m i x i sp h e n o m e n o nw a so b s e r v e di ne b i n a t a , w h i c hw a s a p o s p o r y w ed i s c o v e r e da u t o n o m o u se n d o s p e r mt y p ee b i n a t ab a s eo nt h ee m b r y o l o g y a n df c s s i t sp o l a rn u c l e u so rs e c o n d a r yn u c l e u sp r o l i f e r a t i o np r o d u c e st e t r a p l o i d n o n f e r t i l i z a t i o ne n d o s p e r m w h e r e a se d i b l ep a r to fc r o p ss u c ha sr i c e ，w h e a ti s e n d o s p e r m ，a n dw h i c hi sd i r e c tr e l a t e dt ot h ey i e l da n dq u a i l t yo fc r o p s ，t h u st h es t u d yo f a u t o n o m o u se n d o s p e r mt y p ea p o m i x e sm a t e r i a l si sv a l u a b l e r n aw a se x t r a c t e df r o mi n f l o r e s c e n c eo fe u l a l i o p s i sb i n a t aa n du s e da st e m p l a t e f o rc l o n i n gb yr t - p c rw i t hd e g e n e r a t ep r i m e w sw h i c hw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h e f i eh o m o l o g o u ss e q u e n c e so fa r a b i d o p s i s ，r i c ea n dm a i z e a sar e s u l t , o n ea b o u t8 0 0 b p f r a g m e n tw a s o b t a i n e da n dt h e nc l o n e dt ot - v e c t o ra n ds e q u e n c e d a tt h es a m et i m e ，w e s t u d i e dt h es p a t i o - t e m p o r a l e x p r e s s i o no fe b f i ei na p o m i x i se b i n a t ab yi n s i t u h y b r i d i z a t i o nu s i n gc r n ap r o b ew h i c h w a sm a d eo f f i c e sf i ee d n ac l o n e t h em a i nr e s u l t ： t h er e s u l to fs e q u e n c i n gs h o w e dt h el e n g t ho ft h i sf r a g m e n ti s8 2 6 b p ，c o d i n g2 7 5 a m i n oa c i d , n a m e de b f i e l a n a l y s i sw i t he b f i e ie d n as e q u e n c ea n dd e d u c e da m i n o a c i ds e q u e n c es u g g e s t e dt h a tt h ef r a g m e n tw a ss i m i l a rt ot h er e p o r t e df i eh o m o l o g o u s g e n e so fm a i z e ，s o r g h u ma n d r i c e t h ep a r t i a le d n ai sa p a r to ff i eg e n ei ne u l a l i o p s i s b i n a t a o nt h i sc o n d i t i o n ，t h ef u l l l e n g t he d n ao ff i ew i l lb eo b t a i n e da n dw ec a ns 劬d y f u r t h e rt h eh o m o l o g u ea n df u n c t i o no f w i d et y p ea n dm u t a t i v ef i eg e n e n u c l e o t i d es e q u e n c e so f e b f i e ls i m i l a r i t yt om a i z ef i e i ，m a i z ef i e 2 ，a n dr i c ef i e a n dw h e a tf i ei s9 5 ，8 3 ，8 7 ，8 4 a m i n oa c i ds e q u e n c e so fe b f i e is i m i l a r t yt o m a i z ef i e l ，f i e 2 ，r i c ef i e ，s o r g h u mf i e ，a r a b i d o p s i sf i e ，c a t a l p af i e ，e u c a l y p t u sf i ei s 9 5 ，7 6 ，8 8 ，9 4 ，7 2 ，8 0 ，8 4 w ef o u n dt h e r ew a ss p e c i a l s p a t i o t e m p o r a le x p r e s s i o no fe b f i ei na p o m i x i s e b i n a t ab yi n s i t uh y b r i d i z a t i o nu s i n ge r n ap r o b e t h er e s u l ts h o w e df i eg e n eo n l y e x p r e s s e di nm a l eg a m e t o p h y t ea n df e m a l eg a m e t o p h y t e n oh y b r i d i z a t i o ns i g n a li nt h e o t h e r p a r t o f f l o w e r f r o m t h e m m c ( m i c r o s p o r e m o t h e r c e l l ) s t a g e t o t h e m n m ( m o n o n u c l e u sm i e r o s p o r e ) s t a g e , f i eg e n ep r i m a r l ye x p r e s s e di nm i c r o s p o r ei ns t a m e n 3 胚乳自主发生型龙须草f i e 基因部分e d n a 序列的克隆和表达分析 m e g a s p o r ea tt h i st i m e ，o n l ym e g a s p o r em o t h e rc e l l ( a p o s p o r yi n i t i a t i o nc e l l ) s h o w e d h y b r i d i z a t i o ns i g n a l a te m b r y os a cd e v e l o p m e n ts t a g e ，f e m a l eg a m e t o p h y t ec e l ls t i l lh a d f i ee x p r e s s i o na n dt h es i g n a lw e a k e n e di nm i c r o s p o r e m a t u r ee m b r y oh a di n t e n s i t y s i g n a l ，b u tt h e r ew a sn o n es i g n a li ne n d o s p e r m t h e r ew a sn of i ee x p r e s s i o ni ns t e r i l e o v a r ya n da n t h e r t h e s er e s u l ts u g g e s t e dt h a tf i eg e n ee x p r e s s e dg r a d u a l l yw e a k e n i n gi n m a l eg a m e t o p h y t ea n de n h a n c e di nf e m a l eg a m e t o p h y t e t h ed e v e l o p m e n to f e m b r y oa n d e n d o s p e r m w a s r e g u l a t e db yf i eg e n e c o n c l u s i o n ：i nt h er e s e a r c h ，p a t i a le b f i ee d n as e q u e n c ew a sc l o n e db y h o m o l o g o u ss e q u e n c i n gm e t h o dt h r o u g hr t - p c ru s i n gt h ea p o m i x e se b i n a t a , t h e n s e q u e n c e da n da n a l y z e di nd e t a i lb yb i o i n f o r m a t i c s i tm a k e sp r e p a r a t i o n sf o rt h eo b t a i n o ff u l ll e n g t hf i ee d n aa n dt h er e s e a r c ha b o u tm o l e c u l a rm e c h a n i s mo fn o n - f e r t i l i z a t i o n e n d o s p e r mi n i t i a t i o n t h e r e s u l to fi s hi n d i c a t et h a tt h ef i eg e n eh a ss p e c i a l s p a t i o - t e m p o r a le x p r e s s i o ni na p o m i x i se b i n a t ad u r i n gt h er e p r o d u c t i o ng r o w t ha n d c o n t r o l st h ed e v e l o p m e n to f e m b w oa n de n d o s p e m k e y w o r d s ：a p o m i x i s ；a u t o n o m o u se n d o s p e r m ；f i e ；g e n ec l o n e ；i ns i t uh y b r i d i z a t i o n 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 前言 1 1 植物无融合生殖的概念和类型 无融合生殖是相对于有性生殖的雌雄配子融合而言，广义的无融合生殖 ( a p o m i x i s ) 是指不经过雌雄配子的融合而繁衍后代的生殖方式，对被子植物来说 是指在胚珠内不发生受精作用而产生种子的生殖方式。植物中的无融合生殖曾经是 个很广泛的概念，m a h e s h w a r i ( 1 9 5 0 ) 将包括营养繁殖在内的所有无性繁殖都归在 无融合生殖的范畴内，后来b a t t a g l i a ( 1 9 6 3 ) 定义无融合生殖只限定为发生在胚珠 内的、不经过受精作用而形成种子的生殖方式。胡适宜( 1 9 8 1 ) 则将由珠心等体细 胞经过胚胎发育形成的不定胚也归在无融合生殖的范畴。虽然对无融合生殖的确切 定义，研究者们一直都存在争论，但从实际应用价值及其对作物改良的意义出发， 目前植物中无融合生殖一般专指二倍体无融合生殖，是一种发生在胚珠内的不经过 减数分裂和受精作用形成胚( 种子) 的生殖方式。 根据胚胎发生的起源不同，可将无融合生殖分为两类，孢子体无融合生殖( 不定 胚) 及配子体无融合生殖。不定胚是由珠心或珠被细胞直接发育成胚，与有性胚共存 表现出多胚现象。配子体无融合生殖可分为二倍体孢子生殖( d i p l o s p o r y l 和无孢子生 殖( a p o s p o r y ) 。二倍体孢子生殖是大孢子母细胞减数分裂受阻形成未减数成熟胚囊， 而后由未减数胚囊发育形成胚。无孢子生殖是由珠心体细胞直接发育成胚囊后，由 未减数卵细胞发育成胚( a s k e r a n d j e r l i n g , 1 9 9 2 ；k o l t u n o w , 1 9 9 3 ) 。 植物无融合生殖，按照无融合生殖发生的完全程度可分为专性无融合生殖 ( o b l i g a t ea p o m i e t s ) 和兼性无融合生殖( f a c u l t a t i v ea p o m i c t s ) 两种，其中专性无融合 生殖无需经过受精自主发育，所有子代基因型与母本完全一致。而兼性无融合生殖 植株同时发生有性生殖与无融合生殖，子代会发生性状分离。专性无融合生殖与兼 性无融合生殖之间并无明显界限，极有可能受环境改变的影响。多数无融合生殖为 兼性( a n o n y m o u s ，2 0 0 1 ) 。根据胚乳的发生是否需要受精，可将无融合生殖分为假 受精和完全不受精( 胚乳自发产生) 两种类型。假受精是指植物花粉粒中的精子选 择性的与中央细胞极核结合，受精极核将来发育成胚乳，卵细胞不受精发育成胚。 胚乳自主发育类型的无融合生殖是指卵细胞和中央细胞极核都不经过受精作用自发 分裂形成胚和胚乳。前者在无融合生殖物种中占了绝大多数，只有少数几个无融合 胚乳白主发生型龙须草f i e 基因部分c d n a 序列的克降和表达分析 生殖植物属于胚乳自主发生型，如蒲公英属的二倍体孢子生殖种类t a r a x a c u m o j f i c i n a l i a ( k o l t u n o we ta 1 1 9 9 3 ) ，山柳菊属( h i e r a c i u m ) ( k o l t u n o we t a l ，1 9 9 5 ) 以 及雌雄异株植物c o m m i p h o r aw 堙 t ( p r o m i l ae ta 1 ，1 9 9 6 ) 等，它们将是研究胚乳自 主发生的理想实验材料。 1 2 植物胚乳发育的研究进展 胚乳在植物种子发育过程中扮演着极其重要的角色，胚乳是营养物质储藏组织， 是种子发育过程中的营养源，支持种子胚发育并最终被吸收。在大部分的有性繁殖 的成花植物中，胚乳含有两份的母本遗传物质和一份的父本遗传物质，这种2 ：l 的 特定的遗传组成对于种子发育具有极其重要的作用( s c o t te ta 1 ，1 9 9 8 ) ，偏离这种 2 ：l 常导致种子败育。这是因为存在印记作用，即亲本基因组正确的比率对胚乳的 发育很重要，母本和父本基因组2 m ：l p 比例对正常胚乳的形成是必须的。 1 2 1 胚乳发育与基因组印记 孟德尔经典遗传学认为来自父本染色体或母本染色体的等位基因，在后代中基 因型和表现型都是一样的。随着人们对遗传学研究的深入，人们发现了一种被称为 基因组印i ? , ( g e n o m i ei m p r i n t i n g ) 的非孟德尔遗传现象，即在配子或合子发育阶段，来 自亲本的等位基因或染色体在发育过程中产生某种专一性的加工修饰，导致后代体 细胞中两个亲本来源的等位基因产生不同的表达活性，又称遗传印记或亲代印记 ( p a r e n t a li m p r i n t i n g ) 或配子印记( g a m e t i ci m p r i n t i n g ) ( 訾晓渊等，2 0 0 1 ) 。基因组印记是 一种特殊的遗传调节方式，它是基于有丝分裂稳定性的后生遗传调节，受精后持续 抑制某一亲本等位基因的表达。基因印记依靠单亲传递某些遗传学性状，即某些基 因呈亲源依赖性的单等位基因表达，另一等位基因不表达或表达极弱。由于印记基 因不存在d n a 序列的变化，但却产生了可遗传的基因表达的改变，其遗传不符合 孟德尔规律，因此被称为表观遗传。表观遗传学是指以不涉及到核苷酸序列的改变、 但可以通过有丝分裂和减数分裂进行遗传的生物现象为内容的生命学科。 胚乳是植物种子的重要组成部分，也是目前植物中发生印记现象的唯一组织 ( g e h r i n ge ta 1 ，2 0 0 4 ) ，胚乳中来自父本和母本的遗传信息的不同表达将会直接影响到 胚乳的功能。b r i n k 和c o o p e r ( 1 9 4 7 ) 分析不同被子植物种间杂交，认为有些植物的杂 交不亲合是由胚乳的功能障碍引起的，继而导致胚的死亡。拟南芥m e d e a 的母源 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 等位基因发生突变也会形成异常的胚和胚乳，最终导致种子败育，但是对这种种子 进行体外培养，或者在种子干燥前提早进行萌发，就可得到籽粒( c o l l i n g ee ta 1 2 0 0 4 ； g r o s s n i k l a u s 就a 1 ，1 9 9 8 ) 。这些结果表明胚的败育是胚乳缺陷的结果，胚乳特异基因 可能通过调控胚乳发育来影响胚的发育。此外，对玉米和拟南芥进行同种和不同种 染色体倍性问杂交的结果的研究均表明了母源和父源基因组闯的平衡( 2 ：1 ) 是保 持种子正常发育所必需的( s c o t te ta 1 ，1 9 9 8 ) 。这种平衡的必需性是由于两个亲本的遗 传信息在后代表遗传上存在的差异，可能是通过基因组印记来调控性别专一性的基 因表达( v i n k e n o o ga n ds c o t t , 2 0 0 1 ) 。 亲本冲突学说( b i l na n d l r i v e r s ，1 9 9 8 ) 是目前用来解释植物和哺乳动物基因组印 记现象的主要理论。对于植物和哺乳动物的某些基因来说，来自父本和来自母本的 等位基因具有不同的基因表达模式，有时候一个等位基因沉默而另一个具有活性； 有时候这种差别仅在某种组织中出现( 比如胚或胚乳) ，或者在基因表达上存在着剂 量效应，亲本特异基因的表达被推测为母本和父本种系中的等位基因的不同印记效 应所引起的依据亲本冲突学说，相互杂交的种子在不同染色体数杂种上的表现型的 差异是亲本冲突的结果，后代正常种子的基因组成是从母本传递给种子的( h a i ga n d w e s t o b y , 1 9 9 1 ) 。 1 2 2 无融合生殖植物胚乳发育的特点 对于无融合生殖的植物来说，很多是假受精类型，即极核授粉受精对于形成胚 乳是必须的。假受精无融合生殖中两个未减数极核与一个精子受精会产生4 m ：l p 的 五倍体胚乳。而胚乳发育自发型的无融合生殖胚和胚乳的形成都避免了受精过程， 那么父本基因对胚乳的发育没有贡献。自发型无融合生殖胚乳的形成没有精子参与 会产生更严重的不平衡：即未减数的，未受精的极核的自主发育形成4 m ：o p 胚乳基 因组比率。 很多植物种类通过不同的雌配子发育途径或受精方式来维持2 m ：i p 的比率。 p a n i c i u m 的3 n 胚乳核基因组比率为2 m ：l p ，而d i c a n t h i u ma n n u l a t u m 和r a n u n c u l u s a u r i c o r n u s 的一对精子与未减数的极核受精产生4 m ：2 p 的胚乳。这就表明这些种类 即使胚是纯母本的，胚乳的发育仍受基因组印记的影响。但是这些数据与许多假 受精的无融合生殖植物有差异。当花粉供体是四倍体的，与四倍体的假受精无融合 生殖植物t r i p s a c u m 受精会产生亲本比为8 m ：2 p 的胚乳。令人震惊的是发现含有8 m ： 胚乳白主发生型龙须草f i e 基因部分c d n a 序列的克隆和表达分析 l p 的胚乳的种子，在发育着的种子中分析了这些胚乳d n a 含量，可能是由未减数的 四倍体极核和二倍体植株的花粉受精形成。这种亲本对胚乳基因组贡献极度不平衡 的种子很可能是无活力的。但是，近来在p a s p a l u m 种里发现了这种种子。q u a r i n 表 示p n o t a t u m 可以产生胚乳亲本比为2 m ：l p 至8 m ：l p 的种子。显然，在这里种子发育 不需要特别胚乳亲本比。当然极核是需要受精的，因为8 m ：0 p 的种子不能发育 ( v i n k e n o o ge ta 1 ，2 0 0 i ) 。 但是，在胚乳自主发育的无融合生殖种子中人们发现t s m - o p 的种子。早在上 个世纪研究t a r a x a c u m 4 胁- i i e r a c i u m 时就发现这些种的无融合生殖植物的中央细胞分 裂并不经受精而发育成胚乳( v i n k e n o o ga n ds c o a ，2 0 0 1 ) 。这些植物胚乳中缺少父本基 因，它们是如何克服这种需要的? ( 1 ) v i n k e n o o g 等假定：在有性生殖种类和假受精无融合植物中，胚乳发育所必 需的胚乳促进基因只有来源于父本的基因组拷贝才能表达。如果这些基因对胚乳的 发育是必需的，我们就可以认为胚乳自发形成的基因是来源于母本，换句话说，没 有母本的基因印记( v i n k e n o o ga n ds c o t t ，2 0 0 1 ) 。 ( 2 ) 被子植物的进化过程中基因组印记已经消散或经过了多次的修饰，从而在这 些种中表现胚乳自发形成( g r i m a n e l l i e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。这可以解释被子植物无融合生殖的 一些分布方式。比如说几乎所有的自发性无融合生殖是在a s t e r a c e a e ( 菊科) 中发现 的。即认为这个科几乎所有的成员基因组印记消失或是被削弱了( g r i m a n e l l ie t a l ， 1 9 9 7 ) 。 ( 3 ) 无融合生殖种的种子发育以某些方式来克服印记作用。可能印记不再定位在 无融合生殖种了，或是如果基因印记是单亲标记，那么在无融合生殖种胚珠里的这 种标记将不被识别或复制，表明生殖模式和基因组印记之间有相关性。只有当母本 是无融合生殖种时胚乳比率不平衡的种子才具有活力，若母本是有性种时，无论是 二倍体或是四倍体都需要2 m ：l p 的比率( q u a f i n ，1 9 9 9 ) 。因此，克服印记的很大的可 能是无融合生殖本身的某种遗传特性( v i n k e n o o ga n ds c o r ，2 0 0 1 ) 。 1 2 3 胚乳发育相关基因的研究进展 o h a d 等人先后报道从拟南芥中分离了系列归基因，加l m e a ，卢2 ，加3 f i e ，它 们都与胚乳的发育相关( o h a de ta 1 ，1 9 9 6 ：o h a da n df i s e h e r , 1 9 9 9 ) 。基于m e a 、f i e 以及m s i i 在发育过程中父母本表达的差异，人们推测它们可能与基因组印记有关。 8 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 m e a 和f i e 基因编码的蛋白通过物理互作结合其它蛋白，如m s l l ( 1 ( o e h l e re t a 1 ；2 0 0 3 ；s t e v e ne t a l , 2 0 0 3 ) ，形成有活性的中间复合物，并在f i s 2 转录调节子( l u oe t a 1 1 9 9 9 ) 的作用下，可能参与染色质重构，改变染色质的凝聚状态，通过表观遗传沉 默抑制下游基因的表达，控制转录的开关，调控细胞的增殖( g r o s s n i l d a ue ta 1 ，1 9 9 8 ； a b d u le ta 1 1 9 9 7 ) 1 2 3 1m e a 基因 m e a ( m e d e a ) 基因编码有s e t - d o m a i n 的p o l y c o m b ( p c g ) 蛋白质( g r o s s n i k l a u c ta 1 。1 9 9 8 ) 。许多具有s e td o m a i n 的蛋白具有组蛋白甲基转移酶的功能，所以这 类蛋白质常常能够通过对目标基因组蛋白的去乙酰化以及甲基化来改变高度有序的 染色质的凝聚程度，从而调节相关基因的转录以及细胞的增殖( k o e h l e ra n dh e n n i ge t a 1 ，2 0 0 3 ；d a p h n ee ta 1 ，2 0 0 5 ) 。v i e l l e c a l z a d a ( v i e l l e c a l z a d a , 1 9 9 9 ) 等利用原位杂交确 定了m e a 的表达部位，即m e a 集中在植物成熟的雌配子体中表达，而在其它结构， 如雄蕊、萼片、花瓣和心皮中都无表达。而且m e a 在胚和胚乳中持续表达，直到心 型胚后期或鱼雷期以及胚乳细胞化的时期，其表达量才开始明显下降 ( v i e l l e c a l z a d a ，1 9 9 9 ) 。m e a 表达的特点不仅表现在特定的时间和空间，还表现出父 本、母本m e a 基因表达水平的差异。v i e l l e c a l z a d a 等在后续的研究中，通过改进 原位杂交的方法研究m e a 在卵核和极核中的表达情况，发现母本的m e a 正常表达， 但父本的m e a 却处于沉默状态。因此多数研究者认为b l e a 可能受印记基因的影响， 父本的m e a 在种子发育早期几乎不转录，处于沉默状态( o h a de ta 1 。1 9 9 9 ； v i e l l e - c a l z a d a ，1 9 9 9 ) 。 研究表明，在拟南芥中，基因d d m i ( d e c r e a s ei nd n am e t h y l a t i o n i ) 突变型可 以通过激活父本沉默的m e a ，解除基因印记，获得种子( v i e l l e - c a l z a d a ，1 9 9 9 ；a b d u l e t a l ，2 0 0 1 ) 。c h o i 等( c h o ie ta 1 ，2 0 0 4 ；g r o s s n i k l a ue t a l ，1 9 9 8 ) 称m e a 的基因印记效应 还需要一些能编码d n a 糖化酶的d e m e t e r ( d m e ) 的参与。d m e 主要在雌配子体 中央细胞中表达。y a d e g a f i 等认为d m e 可能通过解除雌配子体m e a 印记沉默状态 和基因调控序列的甲基化的移除实现染色质重构从而激活m e a 基因( y a d e g a r ia n d g a r y , 2 0 0 4 ) 。 1 2 3 2f i e 基因 f i e ( f e r t i l i z a t i o ni n d e p e n d e n te n d o s p e r m ) 基因能够编码产生具有w d 4 0 一m o t i f 9 胚乳自主发生型龙须草f i e 基因部分c d n a 序列的克隆和表达分析 的p o l y c o m b 蛋白质。这类w d 型结构的蛋白质能同时与多种多肽结合，特别是具 有s e t - d o m a i n 的蛋白质m e a 编码的多肽，形成稳定的复合物( o h a de ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 o h a d 等( m o s q u n ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 称，f i e 可能通过与控制细胞周期调控元件p r b 发生物 理上的互作，以抑制中央细胞核复制所需基因的表达，从而影响胚乳的发育。此外， f i e 可能还与胚的正常形成和发育有关( o h a de ta l 。1 9 9 9 ) 。v i n k e n o o g 等( v i n k e n o o ge t a 1 ，2 0 0 1 ；v i n k e n o o gc ta 1 ，2 0 0 0 ) 观察野生型的种子，看到胚和合点处的胚乳、周围 胚乳以及中央胚乳发育均正常，而f i e 突变型的种子却没有看到胚的结构，而且只 有贴近种皮的周围胚乳发育良好。对比前两者，授以去甲基化处理后的野生型花粉， f i e 突变植物种子的胚乳发育正常。但仍未见到胚。说明f i e 不仅能在一定程度上 控制胚乳的自主发生，而且与胚的发育也有着密切的联系。与m e a 相似，f i e 基因 在父母本中的表达水平也存在着差异。y a d e g a r i 等( y a d e g a f i e ta 1 ，2 0 0 0 ) 证实母本f i e 在受精后持续表达，而父本f i e 在受精后早期的胚乳细胞中处于沉默状态，几乎不 表达，但是在中后期有表达。这很可能是与基因印记效应的减弱有关，但其具体作 用机制还不清楚。l u o 等( y a d e g a f ie t a l ，2 0 0 0 ；l u o e ta j ，1 9 9 9 ；l u o e t a l ，2 0 0 0 ) 认为， 拟南芥中f i e 基因会因父本基因的缺席而抑制t a t a b o x 启动，阻止胚乳自发形成， 最终导致种子败育，而触突变体的胚乳可以自发形成。 m e a 和f i e 两者有着密切联系。酵母双杂交实验( y a d e g a r ie ta 1 2 0 0 0 ) i 正n ) 了 m e a 和f i e 的产物之间有着十分紧密作用，尤其是m e a 氮末端的1 6 8 个氨基酸， 它们彼此相互作用，形成复合物与d n a 结合，来改变高度有序的染色质结构，从 而调控同源异型基囡的表达( u e l ie ta 1 2 0 0 1 ) 。 1 2 3 3m s i i 基因 除了脚之外，k o e h l e r 等最近还发现了参与胚乳自发形成的另一编码w d 一4 0 蛋白的m s l l ( k o e h l e r e t a l ，2 0 0 3 ) 。在m s i l 突变株中胚乳的发育不依赖受精过程，并 且与突变m e a 、f i e 相比，胚在更早的时候就停止了。在原位杂交实验中m s i i 除了 在胚和胚乳大量表达外，在花粉囊以及花粉中也检测到了特异的杂交信号( k o e h l e r e t a 1 ，2 0 0 3 ) 。免疫沉淀等实验( k o e h l e re ta 1 ，2 0 0 3 ；m o s q u n ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 表明m s i i 与f i e 有着紧密关系，这很可能是m s l l 通过与f i e 发生物理互作的p r b 结合来实现的。 1 2 3 4f i s 与下游基因 在拟南芥中人们发现多梳蛋白m e a 、f i e 、m s i i 以及f i s 2 是以一种负调控方 1 0 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 式来控制胚乳的自发形成。种种迹象显示，除了m e a 、f i e 和f i s 2 这3 个f i s 家族 蛋白外，还需要其它一些因子以及下游目标基因的参与来完成整个种子的发育 ( g u o f ue ta 1 , 2 0 0 2 ；k o e h l e r 吐a 1 ，2 0 0 3 ；l u oe ta i ，1 9 9 9 ；a b d u le ta 1 ，1 9 9 7 ) 。当m e a 、 f i e 、m s l l 和f 1 s 2 正常表达，形成有活性的p e g 复合物结合在下游基因，使得染色 质呈凝集状态，从而抑制胚乳自发形成：当其中任何一个基因突变，就不能产生活 性复合物( k o e h l e re ta 1 ，2 0 0 3 ) 。酵母双杂交实验鉴定出m e a 的相关蛋白 s w i n g e r ( s w n ) ，它是f i s 2 的s e t - d o m a i n 部分。数据显示这三个蛋白都存在于雌 配子体中。在拟南芥受精前，s w n 辅助m e a 完成控制种子起始的部分功能，抑制 雌配子体中央细胞核或胚乳的分裂( w a n ga n d y a d e g a r i 2 0 0 6 ) 。 到目前为止，p h e r e s i ( p h e i ) 是唯一已报道的m e a 、f i e 直接作用的下游基因 ( k o e h l e re ta i ，2 0 0 3 ) 。m e a 、f i e 的活性复合物作用于m a d s - b o x 基因p h e i ，使得 p h e l 只在胚和胚乳中短暂表达，从而控制胚乳的发育( k o e h l e re ta 1 , 2 0 0 3 ) 。 在有性生殖的拟南芥中，相继得到的m e a 、f i e 以及m s l l 突变株都不同程度 地表现出胚乳自主发生的潜力。尽管并不清楚拟南芥与某些无融合生殖植物的胚乳 自发形成是否由同一机制决定，但是这些单基因控制的胚乳自发产生揭示了有性生 殖植物与无融合生殖植物之间的遗传差异并不大( f r e d e r i ce ta 1 1 9 9 9 ) 。 1 3 龙须草无融合生殖的研究进展 龙须草( e u l a l i o p s i sb i n a t a ) 属禾本科多年生草本植物( 耿以礼，1 9 6 5 ；刘亮， 1 9 8 8 ) 。近年来，张友德、杨小菊等对窄叶型龙须草进行了初步的胚胎学研究，认为 其成熟胚囊是四细胞大黍型无孢子生殖胚囊( 张友德等，1 9 9 6 ：杨小菊，1 9 9 8 ) 。此 后，姚家玲等对窄叶型和红杆型龙须草大孢子的发生，胚囊的起源、发生和发育， 胚的起源，胚乳的产生等过程进行了系统研究，得到了龙须草无融合生殖的证据， 探明了龙须草胚和胚乳的发育可以不经过受精而分别由卵细胞和极核自发分裂形 成；并对其龙须草的花粉发育过程进行了观察，其雄性配子的发育过程类似于其它 有性生殖的禾本科植物，最后形成3 细胞型成熟花粉粒( 杨平仿，2 0 0 2 ；y a o j i a 。l i n g e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。陈智慧等在龙须草花粉活性及结实率与其无融合生殖的关系研究中发 现，龙须草花粉对其结实率没有显著影响，龙须草具有很高的无融合生殖程度，是 优良的无融合生殖基因供体( 陈智慧等，2 0 0 5 ) 。 观察窄叶型龙须草去雄套袋后的子房，1 0 左右的胚囊内形成正常的胚和胚乳， 胚乳自主发生型龙须草f i e 基因部分c d n a 序列的克降和表达分析 表明其无融合生殖胚的形成不依赖于受精，而且其胚乳也不需要受精由极核自主分 裂产生( 姚家玲，2 0 0 5 ) 。 传粉生物学实验表明，花粉管在柱头上无法伸长；对窄叶型和红杆型龙须草进 行去雄套袋、去掉柱头以及类型间杂交，统计分