（动物学专业论文）可溶修饰型绿色荧光蛋白（smgfp）的原核表达纯化及多克隆抗体制备.pdf

摘要 可溶修饰型绿色荧光蛋t ! t ( s o l u b l e - m o d i f i e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i ns m g f p ) 是绿色 荧光蛋i 刍( g f p ) 的一种突变体，由2 3 8 个氨基酸组成，其分子量约为3 0k d a 。作为种 新型的报告基因它能够自身催化形成生色团形成荧光，与其他报告基因相比具有独特的 优点：产生荧光无需底物或辅助因子，荧光信号强且稳定，无种属特异性，对细胞毒性 作用弱等。近年来s m g f p 在生物学各个领域已经得到广泛应用。本研究对可溶修饰型 绿色荧光蛋白s m g f p 进行原核表达、纯化并制备其多克隆抗体。 通过体外d n a 重组技术，将来源于p c a m b i a l 3 0 1 s m g f p 质粒上的目的基因 s m g f p 片段在t 4d n a 连接酶的作用下，插入到原核表达载体p e t - 2 8 a ( + ) 的h i n d l l l 和 e c o ri 酶切位点之间，构建重组质粒p e t - 2 8 “+ ) 。s m g f p 。经过p c r 扩增鉴定、酶切鉴 定以及d n a 序列分析，插入的目的基因s m g f p 的序列完全正确。将重组质粒 p e t - 2 8 a ( + ) - s m g f p 转化到大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，加入终浓度为1 0m m 的异丙基b - d 硫代半乳糖苷( i s o p r o p y l b d t h i o g a l a c t o s i d e ，i p t g ) 进行诱导，诱导后表达出肉眼可见的 分子量大约为3 0k d a 的s m g f p 融合蛋白，该s m g f p 融合蛋白以可溶形式存在，扩大 培养浓缩后在变性条件下经n i 离子亲和层析得到纯品s m g f p 融合蛋白。用b r a d f o r d 法测定该融合蛋白含量约为7 0 0 e c m t 。用纯化的s m g f p 融合蛋白免疫三只6 8 周龄的 b a l b e 小鼠( 1 5p 只，次) 三次后，进行e l i s a 检测，获得的s m g f p 融合蛋白的多 克隆抗体以1 ：3 2 0 0 0 的比例稀释后仍可检测到0 0 2 5p g 左右的抗原( 融合蛋白s m g f p ) 。 用制备的多克隆抗体w e s t e r n - b l o t 检测s m g f p 融合蛋白，a e c 化学显色后，在硝酸纤 维素膜上显示出明显的单一的特异性目的带。以上结果表明通过原核表达系统在大肠杆 菌中表达出了s m g f p 融合蛋白，并得到大量纯化的s m g f p 融合蛋白及其多克隆抗体。 可溶修饰型绿色荧光蛋白s m g f p 的多克隆抗体，为以绿色荧光蛋白作为报告基因的生 物学研究提供了一种辅助检测方法，另外为g f p 的体外应用及定量检测的发展奠定了 基础。 关键词：可溶修饰型绿色荧光蛋白( s m g f p ) ；报告基因；生色团；原核表达 a b s t r a c t s o l u b l e m o d i f i e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i ni sam e m b e ro fg f pv a r i a n t sc o n t a i n i n g2 3 8 a m i n oa c i d sa n di t sm o l e c u l a rw e i g h ti sa b o u t3 0 k d a t h ep r o t e i nc a nc a t a l y z ei t s e l fi n t o c h r o m o p h o r s ，a n de m i t ss t a b l eg r e e nf l u o r e s c e n ta n df l u o r e s c e n tr e a c t i o nd o e sn o tn e e da n y s u b s t r a t eo ra c c e s s o r yf a c t o r s m e f e f b r ei ti se a s yt ob ed e t e c t e d m e a n w h i l ei ti se x p r e s s e d i n d e p e n d e n t l yi nc e l l sr e g a r d l e s so ft h es o r tt h e yb e l o n gt o t h el o c a t i o n , o rm e i rs p e c i e s ，a n d i ti sn o t o x i ct or e c e p t o r sa n dh a sn oi n f l u e n c eo ng e n ee x p r e s s i o n r e c e n t l ys m g f ph a s b e c o m eas t a n d a r dr e p o r t e ri nm a n yb i o l o g i c a ls y s t e m s i nt h i ss t u d y 锄g f pi sh i g h l y e x p r e s s e db yp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e m ，p u r i f i e di nv i t r oa n du s e d 勰a n t i g e nf o rm a k i n g i t sp o l y c l o n a la n t i b o d i e s t h es m g f pg e n ef r o mt h ep l a s m i dp c a m b i a l 3 0 1 - s m g f pw a si n s e r t e di n t ot h e p e t - 2 8 a ( + ) v e c t o rb e t w e e nt h es i t eo f e c o r ri a n dl - l i n d 7 配lt oc r e a t ear e c o m b i n a n tp l a s m i d p e t - 2 8 a ( + ) - s m g f et h e nt h er e c o m b i n a n tp e t - 2 8 a ( + ) 一s m g f pw a sc o n f i r m e db yp c i l r e s t r i c t i o n , e n z y m ed i g e s t i o na n dd n as e q u e n c i n g t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f e r r e d i n t ot h ec o m p e t e n tb l 2 1 ( d e 3 ) c e l l sa n da p p r o x i m a t e l ya3 0k d af u s i o np r o t e i nw a si n d u c e d b yt h ea d d i t i o no fi s o p r o p y l - p - d - t h i o g a l a c t o s i d e ( i p t g ) ( 1 0m m ) d u r i n gc u l t i v a t i o n t h e s o l u b l ef u s i o np r o m i ns m g f pw a sp u r i f i e da r e re x p e n d i n gc u l t i v a t i o nb yn i n t aa f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h yu n d e rt h ed e n a t u r i n gc o n d i t i o n t h ec o n c e n t r a t i o no ft h ef u s i o np r o t e i n s m g f pw a sa b o u t7 0 0l a g m ld e t e r m i n e db yb r a d f o r da s s a y s t h r e e6t o8w e e k so l d b a l b cm i c ew g l ei m m u n i z e dw i t hp u r i f i e df u s i o np r o t e i ns m g f pt h r e et i m e su s i n g1 5p g a n t i g e ne a c ht i m e w eh a v eg e n e r a t e dt h ep o l y c l o n a la n t i b o d y t h ea n t i b o d yt i t r a t i o nw a su p t o1 ：3 2 0 0 0d e t e r m i n e db ye l i s aa s s a y s w e s t e r nh y b r i d i z a t i o no fa n t i b o d ya n ds m g f p s h o w e das i n g l eb a n di nt h en i t r o c e l l u l o s ef n om e m b r a n e t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a tw e h a v eo b t a i n e dt h es m g f p p r o t e i nb yi nv i t r oe x p r e s s i o ns y s t e ma n di t sp o l y c l o n a la n t i b o d i e s k e yw o r d s ：s o l u b l e m o d i f i e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( s m g f p ) ，r e p o r t e rg e n e ，c h r o m o p h o r e ， p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东 北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示 谢意。 学位论文作者签名：乏盈兰兰丝日期：磋z ：! ：1 2 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的 规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名幽 日 期：丕盈堑乡 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：! 隧 日 期：盗岔堑! 1 2 电话：堕丝2 矽 邮编：z2 翌至：兰 1 引言 1 1 绿色荧光蛋白( g f p ) 的概述 绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i ng f p ) 是近年来新兴的一种报告分子【l 弓】，在 生物学领域已经得到广泛应用。g f p 是源于海洋无脊椎动物多管水母属体内的一种天然 发光蛋白，由2 3 8 个氨基酸组成，其分子量约为3 0k d a 【4 】。早在1 9 6 2 年，s h i m o m u r a 等【3 1 就发现在多管水母似钾加，v i c t o r i a ) 中存在绿色荧光蛋白；1 9 7 4 年由m o r i s e 等 5 】 从海洋生物水母中分离并纯化出g f p 蛋白；1 9 8 2 年w a r d 和b o k m a n 6 对其结构和性质 进行了深入研究；然而取得突破性进展的是p r a s h e r 等【7 】在1 9 9 2 年从水母中成功克隆到 g f p 基因e d n a ，并分析了g f p 的一级结构；在1 9 9 4 年c h a l f i e 掣2 】首次在大肠杆菌和 线虫异源表达了g f p ，开创了g f p 应用研究的先河，之后很快发现g f p 能够在多种异源 细胞中表达，g f p 在细胞生物学、分子生物学和医学、病毒学等领域迅速掀起一股热潮； 1 9 9 5 年n i e d z 9 等首次在甜橙原生质中表达了g f p ，g f p 在植物研究中逐渐被广泛应 用；1 9 9 7 年1 0 月1 8 2 2 日在美国专门召开了一次关于g f p 的国际会议；此后g f p 在 生物学领域被广泛应用。近几年来又从其他海洋生物中克隆到一系列g f p 基因，如 s t e w a r t s m 【9 1 在2 0 0 1 年从r e n i l l a s 中克隆到g 即基因；2 0 0 3 年k e l m a n s o n 和m a t z j o 又 从m o n t a s t r a e a c a v e r n o s e 中克隆到g ! f p 基因。研究表明，从不同动物体内提取的荧光 蛋白的结构、性质也不尽相同】。 作为一种新型的报告基因，与以往l a c z 、c a t 等报告基因相比，g f p 有很多优越性： 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达【1 2 】；荧光信号稳定性高；检测 方便不需要反应底物与其他辅助因子，用荧光显微镜或肉眼就可以观察到，且可以进行 活体观察，不伤害正在生长的细胞和组织 t 3 1 ；受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体 内的即时检测；另外g f p 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安 全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研 究需要【1 4 1 。正是由于g f p 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来 g f p 作为报告基因广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信 号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域d s - 1 6 。采用g f p 作为标记基因， 可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可以作为活体 标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段 1 7 - 1 8 】。尽管g f p 作 为报告基因或分子探针有许多无可比拟的优点，但野生型g f p 发光较弱，甚至在某些 植物细胞中并不表达【1 9 - 2 0 。目前，为适应在植物研究中的应用，已有许多改造的g f p 可以满足人们研究的需要。 1 2 g f p 的结构特点 1 2 1g f p 的结构 由正常野生型g f p ( w t g f p ) 的e d n a 序列推出的蛋白质一级结构【2 ”，由2 3 8 个氨基 酸组成，其分子量约为2 7 - 3 0 k d 。晶体学证据【2 副表明，g f p 中央是一个b 罐( b - c a n ) 结 构。g f p 的生色团位于6 4 6 9 的六肽内。生色团在翻译后2 4 h 内自动催化形成，并且 g f p 在合成后需经过一定的折叠过程形成正确的构象后才有功能。g f p 生色团的形成 需要0 2 ，使6 6 位氨基酸残基的a 、b 键脱氢，这就意味着g f p 在严格厌氧条件下不能 形成荧光【2 3 - 2 4 。这也是至今对g f p 表达系统的唯一限制，氧化是g f p 的生色团形成过 程中最慢的一步反应【2 4 1 ，它是监测基因表达快速变化的限制因素。 1 2 1 1 一级结构 野生型水母g f p 的一级序列已由其c d n a 序列推导出来【2 ”，至少存在四种同工g f p ， 但这些突变似乎都不影响g f p 的功能【2 5 】。另外，根据e d n a 序列重新合成了g f p 基因，按 需要改变了部分密码子及翻译起始序列，使表达出的变种g f p 具有新性质。g f p 的生色 基团由位于第6 5 6 7 位的3 个氨基酸：丝氨酸一脱水酪氨酸一甘氨酸形成的对羟基苯咪唑啉 酮( 4 - p - h y d r o x y b e 5 i m i d a z o l i n o n e ) 构成。g f p 的生色基团是蛋白质自身催化环化的结 果。h e l m 等【2 6 】发现重组g f p 的发光特性需在有分子氧存在的环境下才能出现。c u b i t t 掣2 7 j 认为生色基团自身环化的驱动力来自蛋白质三维结构的形成，由此k o l b 掣”l 提出一个假 说，即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行。g f p 被包含体捕获后完全失去形成生色 基团的能力，因为此时新合成的g f p 不可能正确折叠。为了确定g f p 荧光发射中需要分 子的哪些部分，d o p f 等2 9 】构建了g f pn 末端和c 末端部分缺失的表达载体。通过表达 和检测发现，g f p 的2 2 3 2 个氨基酸对维持发光特性是必需的。截短c 末端7 个以上氨基 酸或n 一末端两个以上氨基酸，则荧光全部丢失。但h e i m 掣3 0 】的研究表明去掉了c 一末端 1 2 个氨基酸的g f p 基因与h c vc o r e 抗原基困融合，融合蛋白的荧光光谱与强度均无变 化，最大发射波谱变宽( 4 9 0 5 1 0n m ) 。岳莉莉等【3 l 】将g f p s 6 5 tc 端分别截短1 2 个氨基 酸和7 5 个氨基酸，发现截短1 2 个氨基酸时，对荧光特性无明显的影响。但截短7 5 个氨基 酸后，激发波长更短( 3 6 0 n m ) ，荧光微弱。她们表达的g f p h b v e 抗原和g f p h c v e 抗原 两种功能融合蛋白的荧光特性与h e i m 等【3 2 】的结果一致。 。麒他鼻折叠，丧稿堑曼l 一 构童 “加m j m 展夥 ，it 靠二锄。；，。， 图1 为生色团形成机制【2 ”。 1 2 1 2 晶体结构 虽然早在1 9 7 4 年就得n g f p 结晶，1 9 8 8 年报道了它的衍射图谱，但至u 1 9 9 6 年才解出 结构旧。g f p 是由两个相当规则的内含一个a 螺旋和外面包围1 1 个b 折叠链的桶状结构 ( 3 - b a r r e l ) 组成的二聚体。b 桶状结构的直径约为3 衄，高约4n n l 。螺旋片段的一部分是 修饰的酪氨酸侧链。其顶部和底部是由小片段弘螺旋形成的“帽子”。o r m o d o 等【2 2 】也 独立地得出了类似的结论，并认为b 一桶状结构从卜末端始依次是三条反平行的b 一折 叠链，中心的一螺旋和另外三条反平行的折叠链( 其中由第儿8 位氨基酸残基至第1 2 3 位氨 基酸残基组成的第三条链与n 一末端由第1 1 位氨基酸残基至第1 3 位氨基酸残基组成的b 折叠链平行) ，然后多肽主链穿过其底部形成该结构的另一半，即由五个折叠链组成的 希腊花边基元( g r e e kk e ym o t i f ) ，其顶部和底部分别是由三个和一个扭曲的短a 螺旋覆 盖。b 折叠彼此紧密结合，象桶板一样形成桶状结构的外围，并且形成一个规则的氢键 带。桶状结构和位于其末端的短螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密结构域， 没有可供扩散的配体进入的缝隙。这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗变性剂的特 点，同时也解释了生色基团为什么只能自身环化，因为酶是很难进入其内部催化生色基 团生成的。生色基团位于螺旋中部，距离桶状结构的几何中心不n o 2n m ，在其周围是 极性和非极性的氨基酸侧链。p h e 6 4 和p h e 4 6 在生色基团附近将t r p 6 3 与生色基团分开， 使生色基团得到保护，几乎完美地包埋于圆柱体中心( 图2 ) 这种方式被称为p 桶( p - b a r r e l ) d 2 。 3 毗 t。liiitf； 图2 g f p 的三维立体结构 3 2 】 野生型g f p 既可以单体形成结晶3 3 1 ，也可以二聚体形式结晶3 2 1 ，二聚体的形成似 乎是高度依赖于晶体生长条件而非g f p 固有的特，征【。 。 1 2 2g f p 的生化特性 g f p 在4 5 0 - 4 9 0 n m 蓝光下最稳定，在3 4 0 3 9 0 n m 或3 9 5 - 4 4 0 n m 的范围内，会发生光漂 白现象；强还原剂如5 m mn a 2 s 0 4 ，或2 m mf e s 0 4 能使g f p 转变为非荧光形式，但一旦 重新暴露在空气或氧气中，g f p 荧光便会立即恢复；弱还原剂和中度氧化剂( 如生物材 料的固定脱水剂戊二酸或甲醛等) 对g f p 荧光影响不大，但g f p 对某些封片指甲油特别敏 感：在离体状态下，g f p 对高温( 7 0 ) 、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶( 链 霉蛋白酶p r o n a s e 除外) 有较强抗性，g f p 荧光在p s 7 0 1 2 0 时稳定，在p h 5 5 7 0 时开始受 到影响，在高温( 7 0 ) 、极端p h 或胍基氯化物条件下，g f p 会变性，荧光消失，一旦外 界条件恢复正常，荧光将部分恢复【3 5 】。 1 2 3g f p 的发光机制 目前对g f p 的荧光发光机制还不清楚，m o r i s e 掣5 】人曾提出一个能量传递模式图 来解释水母的发光机制，但并未获得认同。c h a t t o a j 等【3 6 】对g f p 进行了光谱分析，结 合前人工作提出，g f p 有两个明显的吸收带，对应于6 f p 的两种不同构象的基态a 和b 。 基态a 对应于3 9 5 n m 的吸收峰，基态b 对应于4 7 5 n m 的吸收峰，基态a 占优势，基态b 的分子数量约是基态a 的1 6 ，两种基态间能缓慢地转换，但激发态( ) 之间的转换很 快发生了质子转移，斛快速高效地衰变至另一激发态，应该存在一个中间过渡态i ， 质子转移使胁转变成i $ ，i 回迁到基态i 时产生发射峰为5 0 4 n m 的荧光，构象改 变使i 转变成胁，由胁到b 发射荧光而不发生质子转移。目前，对于g f p 的作用机 4 理较为认同的仅仅是：g f p 是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同 的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。 1 2 4g f p 的光谱特性 w t g f p 的光谱是所有g f p 中最复杂的，其荧光激发主峰在3 9 5 n m ，在4 7 5 n m 处有 一个峰高仅为主峰1 3 的小峰，溶液中，3 9 5 n m 激发的荧光发射峰在5 0 8 n m ：4 7 5 n m 激发 的荧光发射峰在5 0 3 n m ，这类g f p 的生色团至少由两种不同的化学组分组成，即中性 酚和阴离子酚。4 7 5 n m 峰随着g f p 分子生色团的去质子化或阴离子生色团的增加而增 加：3 9 5 n m 则随着g f p 分子生色团的质子化或中性生色团的增加而增加。野生型g f p 在室温或低于室温下表达时，g f p 几乎都能正确而快速地折叠，但高于室温时，折叠速 度却剧烈下降，这种温度的敏感性无碍于水母，因为在它们的生活环境中是不可能遇到 温水的，但g f p 折叠受温度影响限制了g f p 的应用；另外，w t g f p 具有两个激发峰的 光谱，在应用中也是弊大于利。因此，为拓宽g f p 的应用，有必要根据不同的用途， 对w t g f p 进行适当的改造。 1 3g f p 的应用 1 3 1g f p 韵应用特点 g f p 这一新型报告基因，在短短几年时间内就得到了众多研究者的青睐，其原因就 在于它具有以下优点： 。 ( 1 )检测方便：因为g f p 荧光反应不需要外加底物和辅助因子，也就不存在这些物质 可能难于进入细胞的问题，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜 甚至肉眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。 ( 2 )荧光稳定：g f p 对光漂白有较强的耐受性，还能经受长时间的光照；g f p 在p h 7 1 2 范围内也能正常发光：对高温( 7 0 ) 、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶( 链 霉蛋白酶p r o n a s e 除外) 都有较强抗性。 ( 3 ) 无毒害：从目前的研究结果来看，g f p 对生活的细胞基本无毒害，对目的基因的 功能也没有影响，转化后细胞仍可连续传代。 ( 4 )共用性和通用性：首先表现在g f p 的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、 植物、动物中都获得了成功的表达；其次是g f p 没有细胞种类和位置上的限制，在各个 部位都可以表达发出荧光。 ( 5 )易于构建载体：由于g f p 分子量较小，仅为2 7 3 0 k d ，编码g f p 的基因序列也很短， 所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。 ( 6 )可进行活细胞定时定位观察：对活细胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真实的 状态。通过g f p 可实时观察到外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助于近来广泛 使用的激光扫描共聚焦显微镜，结合强大的计算机软件，可进行三维显示。 ( 7 )易于得到突变体：g f p 中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体，而且还增 强了荧光强度，适合在不同物种中专性表达。 1 3 2g f p 的应用现状 ( 1 ) 作为转基因植物和动物的筛选标记 在植物系统中，g f p 已广泛用于基因转移的报道分子。h u 等用野生型g f p 转化玉米 原生质体，在再生转基因植株中检测到绿色荧光；c h i u 等d t 用突变型g f p ( s 6 5 t ) 转化拟 南芥获得成功；v a i n 等【3 8 】用基因枪法转化水稻未成熟胚，通过愈伤组织再生得到转基因 植株；s h e e n 等p 9 1 的研究表明，在植物原生质体的流式细胞计量分选技术中，g f p 可作 为报道分子对阳性克隆进行筛选。g f p 应用于动物成体的研究主要是作为转基因动物研 究中的报告分子，用来标记外源基因在导入动物胚胎或卵后在成体中的表达，研究证实 g f p 能有效和方便地在桑椹期及胚胎阶段检测到荧光。t a k a r d a 等【删将s 6 5 t g f p 连接巨 细胞病毒立即增强子和延长因子一1 启动子，使s 6 5 t g f p 在植入母体前的鼠和牛的胚胎 中进行表达，结果在桑椹胚和囊胚中检测到s 6 5 t g f p ，1 2 个小鼠中有1 1 个转基因产物； g u b i n 等证实g f p 在哺乳动物细胞内的长期表达( 3 0 周) 对细胞的生长发育没有影响，这 表明g f p 不但可以作为一个瞬时表达用的标记物，而且完全可以用于长久的高水平表达 的标记物。另外刘艳红【4 1 】等采用显微注射法将绿色荧光蛋白( g f p ) 基因重组表达质粒导 入金鱼受精卵中，得到了发绿色荧光的金鱼，这将促进转基因动物新品系的开发。 ( 2 ) 用于定位标记 g f p 分子量小，能与多种不同的蛋白质n 端或c 端融合而保持其天然蛋白的特性，可 特异地进行蛋白质及细胞器的定位研究。大量实验表明，g f p 可定位到细胞核、细胞骨 架、叶绿体、线粒体、质膜、细胞板、中心体、高尔基体等细胞器中，如美国康奈尔大 学r h k o e h l e r 等将拟南芥叶绿体蛋白的r e c a 序列连接g f p ，结果表明g f p 标记的r e c a 序 列存在于叶绿体的基质中，同时还发现活体条件下细胞内的叶绿体能在表面形成多个细 长的突起状结构，其中不含叶绿体，证明类囊体不能到达该结构中。 另外，将g f p 作为活细胞内蛋白质的标记分子，利用荧光共振能量转移显微术可以 研究细胞内蛋白质之间的相互作用。近年来，该方法与荧光寿命成像显微术结合形成荧 光共振能量转移一荧光寿命成像显微术，得到广泛应用。 ( 3 ) 跟踪观察微生物 传统方法中，一般用荧光染料标记微生物，由于微生物的分裂，染料被稀释，因此 长期以来未能观察到微生物侵入活细胞的实时动态过程，g f p 基因能克服上述缺点，且 在活细胞中能直接观察到，无需破坏原有细胞而阻止感染的继续进行。c a s p e 4 2 将 g f p c d n a 插入到的基因组t m r ，导入烟草植株，在植株的局部组织( 感染的叶片) 和系统组 织( 整个植株) 中，都观察到了病毒的感染和g f p 基因的表达。董越梅等【4 3 】将g f p 标记植 物内生固氮菌，用荧光显微镜观察该菌对玉米植株的侵染过程以及在植物体内的定殖。 张庆华等1 4 4 用绿色荧光蛋白标记嗜水气单胞菌，研究其在越冬水体( 8 - i o 。c ) 饥饿存活及 复苏的试验，表明国内已注意到用6 f p 作为标记来跟踪观察微生物的巨大潜力。 ( 4 ) 发育机理研究 g f p 作为活体标记，可用于示踪细胞发育过程中基因表达的变化情况，对于那些透 明的动物，还可观察其发育过程。如c h a l f i e 等口佣线虫m e o 7 基因( 编码b t u b u l j n ) 启动 6 子控制基因转化线虫，发现g f p 可在特定的神经元中表达，并且可以非常方便地检测到。 ( 5 ) 用于细胞筛选 利用细胞表面标记，通过流体细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪，可以分离与 纯化特殊类型的细胞；同时还可利用不同颜色g f p 衍生物标记相关蛋白质，来观察在单 细胞内相互作用的靶细胞，再借助于荧光激活细胞分离器、等聚焦显微镜分离出目的细 胞，从而可方便地用于大规模筛选新的药物。 ( 6 ) 用于免疫学 可采用基因工程的方法生产g f p 标记的抗原或抗体，以取代传统的免疫学标记方法， 建立一种简便、快速的免疫诊断新技术，它比一般的标记物有如下优点：对光稳定；对 抗原或抗体的标记率为1 0 0 ；因是直接的抗原抗体反应，不需再添加任何底物，可以 避免非抗原抗体结合的背景干扰。 1 4g f p 的改进 尽管g f p 作为报告基因或分子探针有许多无可比拟的优点，但野生型g f p 发光较弱， 甚至在某些植物细胞中并不表达【1 9 - 2 0 。目前，为适应在植物研究中的应用，已有许多改 造的g f p 可满足人们研究的需要。 ( 1 ) 除去g f p 基因中隐蔽剪接位点( c r y p t i cs p l i c s i t e ) 或隐蔽型内含子( c r y p t i c i n t r o n ) g f p 片段中第4 0 5 4 8 8 碱基序列转录的m r n a 被植物误识别为内含子，从而被错误加 工，导致g f p 不能正确表达。改变碱基组分，消除隐蔽型内含子，可以逃避植物细胞的 错误剪接。如突变型m g f p 改变了碱基组分后，在转基因拟南芥中检测到荧光，但荧光 强度仍较弱【4 5 】。 ( 2 ) 消除编码蛋白的积累 h a s e l o t l 4 5 】认为消除隐蔽型内含子后的突变体m g f p 荧光较弱，可能是由于编码蛋白 的积聚。增j j i e r 定位信号可部分消除编码蛋白的积累，增加荧光强度。 ( 3 ) 将g f p 定位到特定细胞器中 大量实验报道表明，g f p 可定位到细胞核、线粒体等细胞器【4 5 4 7 】。各种基因突变体 的产生( 蛋白变小，光强增加) 也使得定位在很小区域内的g f p 能很灵敏的检测到。 n a o h i r ok a t o i 4 明认为细胞核是细胞器中相对较大的细胞器，能积聚大量蛋白。而且细胞 核中自发荧光物质少，又与细胞壁分开，将g f p 定位到细胞核能增强检测的灵敏性。而 m a n k i n 4 9 1 研究表明，增加e r 定位区能减少光毒害。 ( 4 ) 改变碱基组分 d a v i s 和v i e r s t r a l 5 0 1 通过改变荧光蛋白的碱基组分，得到“可溶修饰型”s m g f p ，能 增加荧光信号的强度。为适合g f p 基因在植物中表达，可增加g 和c ，降低a 和t 的含量， 把密码子改为植物偏爱的密码子【5 ”。 ( 5 ) 更换g f p 生色团氨基酸 将第6 5 位丝氨酸换为苏氨酸( $ 6 5 t ) 或半胱氨酸( $ 6 5 c ) ，荧光强度提高4 倍，将p h e - 6 4 换为l n ，荧光强度可提高1 5 3 倍”。n a o h i r ok a t o ! 硐将第6 5 位丝氨酸换为半胱氨酸 ( $ 6 5 c ) ，突变体e l o f p 6 荧光强度至少为m g f p 5 的2 7 倍。把第6 6 位酪氨酸换为组氨酸 ( y 6 6 h ) ，可以得到蓝色荧光蛋白。 ( 6 ) 插入内含子 许多真核启动子能在细菌细胞中表达口 ”l ，而农杆菌通常需4 - 6 周才能从植物组织中 消失i 划。所以，在转化早期检测荧光表达时，不能确定检测到的荧光是由农杆菌还是由 植物发出的。如果在o f p q b 插入内含子，而这些内含子中带有几个终止子，这样，这些突 变体在细菌中不能表达，而在植物中能正常表达，如突变体e r g f p 6 n t ，e 帕f p 7 m 和 口g f p 8 t l p q 。p a n g l 5 5 1 研究表明，在g f p 中插入一个植物内含子，还可增加荧光强度。 ( 7 ) 增加增强子和更换强启动子 g f p 在受体内的表达水平的提高有赖于寻找到更为通用的转录翻译的增强子和更换 更强的启动子。周盛梅等 5 ”目前已获得了多种含g f p 的质粒。美 c l o n - t e c h 实验室 得到了一系列功能较强的质粒载体，用这种载体转染的细胞，g f p 基因的表达频率大大 提高，荧光强度也高的多。 1 5s m g f p 的获得及特点 g f p 虽然在很多植物中都能表达，但是由于m r n a 的错误拼接和g f p 蛋白的可溶 性比较小，荧光信号比较弱，使得g f p 在很多高等植物中的应用受到限制。为了解决 这个问题，d a v i s 和v i e r s t r a 5 0 以m g f p 为模板，利用定点突变技术，通过改变绿色荧 光蛋白的碱基组分，得到一种g f p 的突变体：可溶修饰型绿色荧光蛋白 s m g f p ( s o l u b l e - m o d i f i e dg f p ) ，和g f p 相比s m g f p 在植物中表达后荧光信号明显强。 定点突变主要是m g f p 中的3 个氨基酸的改变，分别是苯丙氨酸突变成丝氨酸( f 9 9 s ) 、 第1 5 3 位的苏氨酸突变成甲硫氢酸( m 1 5 3 t ) 、第1 6 3 位的缬氨酸突变成丙氨酸( v 1 6 3 h ) ， 为了满足研究的需要在此基础上通过改变生色团的氨基酸又得到s m r s - g f p ( s 6 5 t ) 和 s m b f p ( y 6 6 h ) 。和野生型的g f p 、m g f p 相比这些突变体主要是几个氨基酸的突变。 ( 图3 ) i _ w t g f p 二二： = = 二= = = = = = 二 a m 帕f w 二= = 二【= = = 二 a 啊f m l a m v 1 1 l l k _ 日睁f- i i f0 mf _ m 日”“ 、 _ 附稻由f pin i _ _ m i mw m ，b 井i at 图3 s m g f p 与野生型的g f p 、m g f p 的结构比较 g 1 6 多克隆抗体技术 1 6 1 抗原和抗体 1 抗原( a n t i g e n ) 凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特异性结合的物质称为抗原。物质所具有 的这种特性称为抗原性。 2 抗体( a n t i b o d y ) 是机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种能与相应抗原发生反应的肌球蛋白，称 免疫球蛋白( i m m u n o g l o b u l i n ，k ) 。含有免疫球蛋白的血清称为免疫血清。 3 抗原与抗体的关系 抗原是引起机体产生免疫反应的主要外因，决定免疫反应的特异性，机体与抗原物 质的斗争过程中为加速循环和排除抗原而产生抗体、致敏淋巴细胞等物质，是机体排除 异体物质的保护性反应。没有抗原的刺激，机体不能产生抗体；没有抗原物质，也无法 检测抗体的存在。 4 抗体形成的机理 一般来讲，机体在抗原物质的刺激下产生特异性免疫反应的过程，大体可以分为3 个阶段。 ( 1 ) 致敏阶段当颗粒性抗原初次进入人体内时，首先被巨噬细胞吞噬，通过巨噬细胞 浆内溶酶体酶的作用，把抗原物质消化降解，而保留其抗原决定簇。经过加工处理的抗 原分子结构比原来的小，抗原性比原来的强。处理过的抗原与巨噬细胞的r n a 结合成为 抗原一r n a 复合物时，就具有强烈吸引免疫活性细胞的作用，能把抗原一r n a 传递给免疫 活性细胞，启动免疫反应。 ( 2 ) 反应阶段免疫活性细胞受到抗原刺激后，大量增值。由于抗原性质不同，刺激胸 腺依赖淋巴细胞( t 细胞) 分化成致敏淋巴细胞。抗原信息刺激非刺激胸腺依赖淋巴细 胞( b 细胞) 使其分化成浆细胞。在分化过程中小部分成为记忆细胞。由于记忆细胞的 存在，即使抗原在浆内消失很久以后，仍能够与再度进入体内的相应抗原迅速引起较强 的免疫反应。 ( 3 ) 效应阶段当致敏淋巴细胞再次遇到相应抗原的刺激后，能够释放出多种具有生物 活性的物质，参与细胞免疫反应；浆细胞可形成各种类型的免疫球蛋白参与体液反应。 5 影响抗体的因素 ( 1 ) 抗体的质与量 不同性质的抗原对机体的刺激的强弱不一，表现为抗体形成的速度的快慢不一，抗 体持续的时间长短不一。使用的抗原的量不同，影响也不同，在一定范围内抗原增多， 抗体反应加强；但是抗原量过多，超过一定限度，抗体反应量会受到限制，这称为免疫 抑制或免疫麻痹。 ( 2 ) 免疫途径 9 免疫途径不同，抗原在体内滞留的时间不同，抗原接触机体的免疫反应组织也不同。 局部使用仅引流抗原的局部淋巴结中产生抗体；粘膜表表面使用，常在粘膜下淋巴细胞 组织中形成抗体；静脉内注入抗原引起广泛的产生组织反应，但抗原中的毒性物质常可 引起严重反应。静脉注入抗原只适用于急用动物。 ( 3 ) 免疫次数及间隔 初次免疫抗体出现慢、效价低、持续时间短，为建立基础免疫，至少在一定时间 内连续免疫2 3 次。用动物制备抗血清蛋白等抗体时，追加免疫注射，注射剂量、途径、 间隔都要严加注意，以免动物发生过敏反应死亡。 ( 4 ) 佐剂( a d j u v a n t s ) 可以增强免疫作用。佐剂伴随抗原注射体内，可使弱抗原物质成为有效抗原。如明 矾沉淀类毒素可刺激免疫活性细胞增值，是抗原在体内持续较久。油剂、卡介苗等可广 泛刺激吞噬细胞的吞噬作用。实验室常用弗式佐剂( f r e u n d sa d j u v a n t s ) 、明矾和氢氧化 铝等。弗式佐剂中羊毛脂类物质和石蜡油均能延缓抗原的吸收、裂解和消除，使抗原的 刺激持久；抗酸杆菌成分能够引起淋巴结、脾、肌肉中广泛增生浆细胞提高抗体生成； 石蜡油对刺激网状内皮系统有协同作用。佐剂与可溶性抗原水溶液一般等体积混合。 1 6 2 多克隆抗体的制备 1 多克隆抗体 大多数由大分子蛋白组成，但是抗原上有限部位的特殊分子能够与其相应抗体结合， 此部位为抗原决定簇或表位。一种天然抗原性物质往往具有多种不同的抗原决定簇，而 每一种决定簇都可刺激一种抗体形成细胞产生一种特异性抗体。在机体淋巴组织内可存 在千百种抗体形成细胞( b 细胞) ，每种抗体形成细胞只识别其相应的抗原决定簇，当 受抗原刺激后可增值分化为一重细胞群，这种由单一细胞增值形成的细胞群体称之为细 胞克隆。由于抗原性物质具有多种抗原决定簇，故可以刺激多种抗体形成细胞克隆，合 成和分泌抗各种决定簇抗体到血清或体液中，血清实际上是含多种抗体的混合物，这种 用体内免疫法获得的免疫血清为多克隆抗体。 2 多克隆抗体制备方法 在早期，传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经过各种途径免疫动物，抗原不易纯 化，且通常得到的量较少。现在利用基因工程的方法，直接可以将编码抗原的基因重组 到原核表达载体上，在原核生物如大肠杆菌中大量表达目的蛋白，加以纯化，得到大量 纯化的蛋白用于免疫产生抗体1 5 7 1 。 1 6 3 多克隆抗体与单克隆抗体的比较 多克隆抗体( p o l y - c l o n a la n t i b o d y ，p c a b ) 用抗原免疫动物后得到的动物血清，是由体内分别针对抗原物质上的多个抗原决定 簇的多个b 细胞克隆产生的免疫应答后产生的，因此成为多克隆抗体。 单克隆抗体( m o n o - c l o n a la n t i b o d y ，m c a b ) 通常是指由一株b 淋巴细胞杂交瘤增生而形成的单一细胞克隆抗体所产生的一种高 度均一、高度专一的抗体。 1 0 多抗与单抗相比特异性识别多种抗原决定簇，特异性较低；免疫球蛋白类别不均一； 敏感性较弱，但是多抗制备比较简单快速，而且成本低。 1