（高分子化学与物理专业论文）金属离子kmn2对丝素蛋白构象影响的研究.pdf

复旦大学坝士学位论文金属离子k + 。m 一对丝素蛋白构象影响的研究 中文摘要 1 用固体核磁共振波谱( l i d s t a t e1 3 cc p m a s ) 研究了k + 对丝素蛋白构象转 变的影响。并利用广义二维核磁共振相关光谱( g e n e r a l i z e dt w o d i m e n s i o n a l n m r n m r c o r r e l a t i o n ) 证明了在自然生理条件下的碱金属k + 离子浓度增加( 从 0 t 0 3 7 5 m g k g s f ) 诱导下，丝素蛋白构象的转变顺序是h e l i x r a n d o m o 衄一h e l i x l i k e 一声- s h c e tl i k e 一, 8 - s h e 圮t ，这与丝素蛋白从蚕的后部运动到前部过程中p h 降 低所引起的丝素蛋白构象转变相一致。通过研究拉曼光谱及其酪氨酸( t y r o s i n e ) 费米( f e r m i ) 双共振强度之比i s 5 0 1 8 3 0 随k + 离子浓度的变化，表明在k + 诱导所 引起的丝素蛋白构象转变中，丝素蛋白g a g a g y 和或者g a g a g v g y 序列中 酪氨酸残基( t y r o s i n e ) 的酚羟基基团( p h e n o l i c - o h ) 经历了从无氢键相互作用 寸弱氢键受体一中强氢键受体一强氢键受体的转变过程。通过紫外可见光谱得 出丝素蛋白g a g a g y 和或者g a g a g v g y 序列中的酪氨酸残基在丝素蛋白的 构象从h e l i x r a n d o mc o i l 一卢s h e e t 转变过程中从蛋白质内部暴露到蛋白质表面， 再通过疏水相互作用重新有序折叠镶嵌进入到延伸的- s h e e t 的结构两侧。 2 利用荧光光谱，紫外光谱，拉曼光谱初步研究了m n ( ) 浓度变化对丝素蛋 白构象转变的影响。荧光光谱研究表明，在由m n ( i i ) 所引起的丝素蛋白构象变化 中，色氨酸( t r p t o p h a n ) 空间位置以及其在蛋白质中的环境发生了改变；紫外光 谱表明，酪氨酸( t y r o s i n e ) 的环境也发生了变化；拉曼光谱a m i d ei 区的振动 峰的变化表明m n ( ) 引起丝素蛋白构象从r a n d o mc o i l 一卢s h e e t 的转变。 关键词：丝素蛋白，构象变化，核磁共振波谱，广义二维相关光 谱，光谱学 中图分类号：0 5 8 1 ，0 6 3 6 复旦大学硕士学位论文金属离子k + ，m n 2 + 对丝袭蛋白构象影响的研究 a b s t r a c t 1 i np r e s e n tw o r k , w eu s et h es o l i ds t a t e1 3 cc pm a s s p e c t r o s c o p yt oi n v e s t i g a t et h e e f f e c t so fa l k a l ip o t a s s i u mi o no nt h es i l kf i b r o i nc o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o n , a n dt h e g e n e r a l i z e dt w o - d i m e n s i o n a ln m r - n m rs p e c t r au s e dh e r er e v e a lt h a tt h es i l kf i b r o i n e x p e r i e n c et h ec o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o nf i o mh d i 】【r a n d o mc o i l _ h e l i x _ p s h e e t l i k e ，一s h e e tw i t ht h ei n c r e a s eo f t h ep o t a s s i u mi o n sc o n c e n t r a t i o nf r o m0t o3 7 5 m gk gs f ，c o n s i s t e n tw i t ht h ep hd e c r e a s ef r o m6 8t o4 8w h e nt h es i l kf i b r o i n m o v e sf r o mt h ep o s t e r i o rt ot h ea n t e r i o rp a r to ft h es i l kg l a n d t h er a m a ns p e c t r aa n d t h et y r o s i n ef e r m id o u b l er c s o n a n c cr a t i oi s s 0 i s m v a r i a t i o n h e r ed e m o n s t r a t et h a tt h e t y r o s i n ep h e n o l i c - o hg r o u pi nt h eg a g a g ya n d o rg a g a g v g ys e q u e n c e e x p e r i e n c e st h et r a n s i t i o nf r o mt h en o nh y d r o g e n ( h y d r o p h o b i c ) s t a t et ot h ew e a k h y d r o g e nb o n da c c e p t e r 。t h em i d d l es t r e n g t hh y d r o g e nb o n da c c e p t e r t h es t r o n g s t r e n g t hh y d r o g e nb o n da c c e p t e r t h et y r o s i n eu v a b s o r b a n c er a t i ov a r i a t i o nu n d e r t h ei n d u c eo fp o t a s s i u mi o n si n d i c a t e st h a tt h et y r o s i n ei nt h eg a g a g ya n d o r g a g a g v g y s e q u e n c eh e r ee x p e r i e n c 璐t h et r a n s i t i o nf r o mt h ei n n e rh y d r o p h o b i e s t a t et ob ee x p o s e dt ot h es o w e n ta n dt h e nb e c o m er e o r i e n t e da n dl o c a t e da tt h ee n do f t h ee x t e n d e d 卢一s h e e tt h r o u g ht h eh y d r o p h o b i ca n d h y d r o p h i l i ci n t e r a c t i o n s t h e i n v e s t i g a t i o no ft h ee f f e c to fk + i o no ns i l kf i b r o i nc o n f o r m a t i o n a lt r a n s i t i o nw o u l d p r o v i d et h et h e o r e t i c a lb a s i sf o ru n d e r s t a n d i n gt h es i l k w o r ms p i n n i n gp r o c e s s ，w h i c h u n d e r g o e st h ec o n f o r m a t i o n a lt r a n s i t i o ns t e a d i l yf r o mt h es o l u b l eh e l i xs t a t et ot h e i n s o l u b l ei f - s h e e ts t a t e ，a sw e l la sf o rt h ea r t i f i c i a ls y n t h e s i sa n dp r o c e s so f h i g h - p e r f o r m a n c em a t e r i a l s 1 i 墨兰查兰丝兰兰丝堡塞 垒星壹三堡：坚型丝耋重鱼塑墨堂堕塑竺塞 2 w eu s et h ef l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y , u v s p e c t r o s c o p ya n dr a n l a ns p e c t r o s c o p y t oi n v e s t i g a t et h ei n f l u e n c eo ft h ep h y s i o l o g i c a lm n ( i i ) i o nc o n c e n t r a t i o no nt h es i l k f i b r o i nc o n f o r m a t i o np r i m a r i l y t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r as h o wt h a tu n d e rt h ei n d u c e o ft h em n ( i i ) i o n s ，t h et r y p t o p h a nr e s i d u ei nt h es i l kf i b r o i nc o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o n e x p e r i e n c e st h es t a t u sv a r i a t i o na n dt h et y r o s i n er e s i d u ei nt h es i l kf i b r o i na l s o e x p e r i e n c e st h ee n v i r o n m e n t a lc h a n g ef r o mt h eu v s p e c t r a r a m a ns p 烈2 t r aa m i d ei f e 西o ns h o wt h a tt h ep h y s i o l o g i c a lc o n c e n t r a t i o nm n ( 1 1 ) i o n sc o u l di n d u c et h es i l k f i b r o i nc o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o nf r o mh e l i x r a n d o mc o i lt o ，s h e e t k e yw o r d s ：s i l kf i b r o i n , c o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o n , g e n e r a l i z e dt w o d i m e n s i o n a l n m r - n m r s p e c t r a , r a m a ns p e c t r a , u v - v i ss p e c t r a 1 l i 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均己在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名：邀 日期：2 哗 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名： 盛导师签名： 茸 _ 一 么 日期：竺三一 复旦大学硕士学位论文 金属离子k ，i d _ n 2 对丝素蛋白构象影响的研究 第一章综述 1 1 蚕丝蛋白的天然性质和应用 蚕丝蛋白，作为一种动物丝的纤维蛋白，古往今来有着优秀的美誉和优良特 征，它被称为丝绸之王，丝中的绞绞者。在中国传统的蚕丝应用中，蚕丝被用在 纺织，食品，加工制造业。蚕丝蛋白是一种优良的天然生物材料。用蚕丝制造的 棉被和纺织品，其性质保暖，经久耐用。在现代对蚕丝蛋白的利用中，蚕丝在生 物医学上的应用日益广泛。比如说，蚕丝丝素蛋白的生物相容性和可降解性能， 可以使蚕丝丝素蛋白质在组织工程，药物载体释放，人工皮肤，心脏瓣膜中都有 应用。在用蚕丝丝素蛋白和其它优良高分子所综合制备的材料中，可以支持干细 胞的成长，繁殖，传代，分化成组织器剖埘。 邵正中等在最近的研究中发现【4 】，从蚕吐丝口中直接拉出的丝蛋白的力学性 质较从蚕丝以“8 ”字形的方式从口中直接吐出的丝，在各方面的性质，如拉伸， 挤压和抗压力，模量等综合性能方面都较强。通常商业中从蚕茧中得到的家蚕丝 的可拉伸强度约为0 5g p a ，断裂拉伸率为1 5 ，断裂能量( 韧性) 为6 2 1 0 4jk g - l 1 4 l 。从蜘蛛丝得到的丝的抗张力强度为i 5g p a ，断裂拉伸率为4 0 ，断裂能量 ( 韧性) 为1 6 2 1 0 4jk g - 1 。 此外，从蚕吐丝口中直接抽出的蚕丝其力学性质和抗断裂的程度( 韧性) 高 达1 2 2 1 0 4jk g ，接近蜘蛛丝的韧性1 6 2 1 0 4jk g 1 。改变拉丝的速度，对蚕丝 的韧性改变也较大。因此从另一个方面来看，随着蚕丝的抗断裂能力的增强，蚕 丝纤可能成为制备高强度高分子纤维材料的替代品。 1 2 蚕丝蛋白的组成，一级结构和二级结构 蚕丝蛋白的结构由四部分构成，见图1 - 1 所示。一部分是由内部两股交缠在 一起的丝素蛋白组成，包括重链亚单元，轻链亚单元和p 2 5 蛋白【孓s l 。其中重链 ( h 链) 是由5 2 6 3 个氨基酸残基所组成的长链状分子，平均分子量为3 9 1 k d a ； 轻链( l 链) 亚单元，由2 6 6 个氨基酸残基组成，平均分子量为2 8 k d a ，与h 链以 一个二硫共价键相结合；p 2 5 蛋白，分子量为2 5 k d a ，与l 链大小相近，但氨基 复旦大学颈士学位论文金属离子r ，m 对丝素蛋白构象影响的研究 酸组成则完全不同，并且不与h 链共价结合，只是通过其它非共价键结合。另 一部分是包裹在丝素蛋白外面的多层丝胶蛋白。其中在构成丝素蛋白的这四种组 分中，丝素蛋白重链所占的质量比例最大，占7 5 ，蚕丝蛋白的力学性质主要由 它决定【9 i 。我们通常研究的结构转变的对象是丝素蛋白的重分子链( h 链) 。研 究丝素蛋白重分子链在外界条件诱导下其内部主要二级结构的演化过程，从而揭 示家蚕丝素蛋白在从蚕腺体的后部运动到前部的过程中，其中间一系列相关结构 的过渡态。 在丝素蛋白的重链中存在着四种重复序列，它们分别对应的是g a g a g s ， g a g a g y 和g a g a g v g y ( 疏水性有规则排列的氨基酸序列) 以及1 2 个重复的 g t g s s g f g p y v a ( n h ) g g y s g y e y a w s s e s d f g t ( 亲水性无规则排列的氨基酸 序列) m 这些疏水的序列组成了丝纤维的结晶区和半结晶区结构。重复的亲水 序列组成y _ e 纤维中由o 1 0 0 p 结构构成的无定型区域【i i , 1 2 。已有研究者通过x - 射线衍射【n 1 4 1 ，拉曼光谱【1 5 , 1 6 ，1 3 c 和1 5 n 的固体n m r 1 7 - 2 4 的研究发现，在桑 蚕丝素蛋白中存在有两种晶体结构。一种是由3 1 - h e l i x l i k e 和3 1 - h e l i x 组成的s i l k i 结构，主要存在于纺丝之前从丝腺体中或者从再生的丝素蛋白溶液中制得的丝 素蛋白膜。另一种是由7 0 的反平行夕s h e e t ( 见图1 - 2 ) 和3 0 的p t u r n 构象 组成的s i l ki i 结构，主要存在于纺丝后的丝纤维中( 见图1 4 ) 【l o ，1 2 , 2 s i 。+ 伴随 着剪切应力应变，p h 值降低，金属离子影响和蛋白质浓度的增加，s i l ki 结构 能转交为s i l l 【n 结构。 2 复旦大学硕士学位论文金属离子k + ，蛐一对丝素蛋亡l 构象影响的研究 f i g u r e1 1 t h es t r u c t u r eo fb o m b y xm o r is i l k a t h ec o m p o s i t i o no fs i l k b yt w ob u n d l eo fi n n e rs i l kf i b r o i na n dt h eo u t e rl a y e ro fs e r i c i n ：b t h em u l t i l a y e rs e r i c i n ：c t h es i l kf i b r o i nf i b e rc o m p o s e db y9 0 0 1 4 0 0 b a s e so ff i l a m e n tw i t had i a m e t e ro f0 2 0 4 岬：d f i l a m e n tc o m p o s e d b y8 0 0 - 9 0 0b a s e so fm i c r o f i l a m e n tw i t ha d i a m e t e ro f 一1 0 0 a ，t h e r ei ss p a c e a m o n gt h em i c r o f i l a m e n t s ： e t h e c r y s t a l l i n ea n dn o n c r y s t a l l i n e s t r u c t u r a lr e g i o n so fs i l kf i b r o i n 图1 - 1 a ：蚕丝通常由两根丝素蛋白纤维和外层涂覆的丝胶组成；b ：丝胶可能 有几层；c ：丝素蛋白纤维是a h 9 0 0 - 1 4 0 0 根直径约0 2 - o 。4 i l 的纤维构成；d ：纤 维又是e h 8 0 0 - - 9 0 0 根直径约1 0 0a 的微纤维构成，微纤维之间存在有空隙；e ：结 晶区和非晶区相间的构造。 3 复旦大学硕士学位论文金属离了k ，m n “对丝素蛋白构象影响的研究 f i g u r e1 - 2 t h es c h e m a t i cd i a g r a mo ft h ep a r a l l e la n da n t i - p a r a l l e lp - s h e e ts t r u c t u r ea n d t h e i rh y d r o g e n - b o n d i n gs t y l e 图1 - 2 平行和反平行f l 够s h e e t 结构以及它们之间的氢键结合模式 l “删f b h f i g u r e l - 3 h i e r a r c h i c a l s t r u c t u r eo f b o m b y xm o r is i l k 图1 - 3 b o m b y x m o r i 蚕丝的 分级结构模型。 向删附一 口) 耐如g 陆 ( g 啦蜘籼f 豳 a - h ：l i x c r r e t i n a l _ 日舢l e j ( n 球妇_ l i 响 f i g u r e1 - 4 m o d e lo fm i c r o s t m c t u r eo ft h eb m o r is i l kf i b r o i n l 4 2 1 图l - 4 最m o r i 丝素蛋白微观结构示意图1 4 2 】 4 复旦大学硕士学位论文金属离了：k ，m a z * 对丝素堂亡】构象影响的研究 f i g u r e 1 - 5c o n t o u r p l o t o ft h e c o n f o r m a t i o n - d e p e n d e n t1 3 ( 2c h e m i c a ls h i f t s ( i np p m ) f o rt h ec ac a r b o no ft y rr e s i d u e si n 4 0p r o t e i n s ，s h o w na saf u n c t i o no ft o r s i o n a n g l e s 驴a n d 弘c h e m i c a ls h i f tv a l u e si nt h e r e g i o n - 1 8 0 爹0a n d - 1 8 0 1 t h e r a n d o mc o i lc h e n d c a ls h i f tf o rt h et y rc a c a r b o nc o n s i d e r e di s5 5 4p p m t h ea r e a so f s i l kic h e m i c a ls h i f t ( 5 6 0 0 5p p m ) a n do f s i l ki ic h e m i c a ls h i f t ( 5 4 2 0 5p p m ) a r e s h o w ni ng r a y t h eb o x e sw i t hb r o k e nl i n e s i n d i c a t ea - h e l i c a l ( 1 0 w e r ) 柚d 鼻s h e e t ( u p p e r ) r e g l o n s 图卜54 0 种蛋白质当中的t y r 残基的c a 构象依赖的1 3 c 化学位移值和扭曲角( 由， 1 l ，) 的函数关系式。图中显示了当密度函 数大于l 时在- 1 8 0 毋 0 和- 1 8 0 妒 3 0 时， t y r 的酚羟基基团处在疏水的内部环境中，以无规卷曲的无序状态存在，没有形 成氢键的相互作用。第二阶段( s t a t e ) ，当增加的k + 浓度达到1 2 5m g ( k ) g ( s f ) 时，l a s o l s 3 0 比值从3 0 降为1 8 表明此时t y r 在丝素蛋白的结构中形成了弱的氢 键相互作用。当k + 的浓度继续增加，从1 2 5 m g ( k ) g ( s f ) 提高到3 7 5 m g ( k ) g ( s f ) ，i s s o l s o o 的比值开始上升，从1 8 上升到2 2 。表明在丝素蛋白构象转变的 第三阶段( s t a t e l i i ) ，t y r 酚羟基的氢键作用的强度得到增强。当k + 浓度达到3 7 5 m g ( k ) g ( s f ) 时，从核磁谱定量拟合的结果发现，在第四阶段( s t a t ei v ) ，丝素 蛋白中总s i l ki i 的含量达到最高，此时对应的i s s j i m o 比值达到一个拐点，揭示 在此k + 浓度存在下，t y r 残基在丝素蛋白中形成了强的氢键相互作用。然而，当 我们继续增加k + 浓度时，如从3 7 5 增加到6 2 5m g ( k ) g ( s f ) ，l s s o l s 3 0 比值又略 有下降。当k + 离子浓度达到1 2 5m g ( k ) g ( s f ) 时，1 8 5 0 1 南比值又达到了2 7 ，与 丝素蛋白第一阶段( s t a t ei ) 中t y r 所处的r a n d o mc o i l 状态接近。 2 3 3 丝素蛋白中酪氨酸的紫外吸收谱 蛋白质中t y r o s i n e 残基的紫外吸收谱通常用来反映t y r o s i n e 残基在蛋白质中 暴露和隐藏的环境。当t y r o s i n e 残基处在蛋白质的内部时，其紫外吸收比t y r o s i n e 残基暴露在蛋白质表面时的紫外吸收要低 2 9 3 0 1 。 图2 - 7 a 是一系列的丝素蛋白溶液在加入r 浓度为o ，1 2 5 ，2 5 0 ，3 7 5 ，5 0 0 , 6 2 5 ，1 2 5m g ( k ) g ( s f ) 时的紫外吸收谱。图2 - 7 b 表示的是t y r o s i n e 在九= 2 7 6a l l l 处时的c 浓度依赖性的紫外吸收值。我们发现，t y r o s i n e 的紫外吸收值的波长并 没有随着k + 浓度的变化而改变，这表明k + 与t y r o s i n e 的苯环并没有发生直接的 相互作用。 复旦大学硕士学位论文金属离了r ，m n 2 + 对丝索蛋亡j 构象影响的研究 卸卸卸锄卸 h d 日d 州m b 02468 1 91 2 * 曲d 肉，叼约研 f i g u r e2 - 7 ( a ) t y r o s i n eu va b s o r p t i o ns p e c t r ao fs i l kf i b r o i ns o l u t i o n ( o 0 3 喇) w i t ha d d e dk + i o nc o n c e n t r a t i o n so f ( a ) o ，c o ) 1 2 5 ，( c ) 2 5 0 , ( d ) 3 7 5 ，( e ) 5 0 0 , 6 2 5 ，( 曲1 2 5m g ( k ) g ( s f ) ；) i n t e n s i t yd e p e n d e n c eo f t h et y r o s i n eu v a b s o r b a n c ea t 九= 2 7 6n mo l lt h efi o nc o n c e n t r a t i o na d d e di n t ot h es i l kf i b r o i n 图2 7 ( a ) 丝素蛋白溶液中t y m s i n e 在加入k 十浓度为( a ) o c o ) 1 2 5 ，( c ) 2 5 0 m g , ( d ) 3 7 5 ，( e ) 5 0 0 ，6 2 5 ，( g ) 1 2 5 0m g ( k ) g ( s f ) 时的紫外吸收谱。( b ) 丝素蛋自 溶液中t y r 随着加入的k + 浓度从0 到1 2 5m g ( k ) g ( s f ) 变化过程中，在九= 2 7 6 n m 处的紫外吸收值的变化曲线。丝素蛋白溶液的浓度为0 3m r d m l 。 有趣的是，从t y r o s i n e 紫外吸收谱随k + 浓度变化曲线的变化中( 图2 7 b ) ， 我们也观察到有四个阶段存在，与在r a m a n 谱( 图2 - 6 b ) 中观察到的趋势相对 应。在无额外k + 加入时( s t a t ei ) ，t y r o s i n e 在九= 2 7 6n l n 处的紫外吸收值最低。 这表明t y r o s i n e 以无规卷曲或者和h c l 奴的状态存在，隐藏在丝素蛋白疏水内部， 而亲水性的氨基酸则暴露在蛋白质的表面【3 1 , 3 2 1 。 在图2 7 b 中的第二阶段( s t a t en ) ，当外加k + 浓度从0 增加到1 2 5m g ( k ) g ( s f ) 时，t y r o s i n e 的紫外吸收逐渐增加。这表明在此f 浓度条件下，丝素蛋白中 位于g a g a g v g y 或者和g a g a g y 序列中的t y r o s i n e ( y ) ，从隐藏在h e l i x 结 构内暴露到蛋白质的表面。第三阶段( s t a t eh i ) 是，当k + 浓度从1 2 5 继续上 升到3 7 5m g ( k ) g ( s f ) 的过程中，丝素蛋白中t y r 的紫外吸收又逐渐下降，并降 到一个低谷。表明丝素蛋白分子链进行调整，苯环上酚羟基的相互作用使得 t y r o s i n e 发生聚集。t y r o s i n e 基团的苯环相互堆积镶嵌进入到丝素蛋白分子内部， 令一 痣l 。vi2参 s筝eosq。，、)。量墨扫 复旦丈学顾上学位论文金属离子k ，m n 2 + 对丝素蛋白构象影响的研究 同时t y r o s i n e 在延伸性的反平郁- s h e e t 周围通过氢键相互作用形成有序的取向， 也使得t y r o s i n e 基团有序地堆积在丝素蛋白三层折叠的反平行i f - s h e e t 的空间中。 因此成为t y r o s i n e 紫外吸收下降的原因。此外，( a g ) n 序列的疏水相互作用也使 得丝素蛋白分子有序地折叠形成f l - s h e c t 结构。在第四阶段( s t a t ei v ) ，当k + 的浓 度上升到3 7 5 n a g ( k ) g ( s f ) 时，即丝素蛋白的构象转变达到最大时，丝素蛋白的 紫外吸光度在这个时候的数值是较低的。表明，t y r o s i n e 有序地折叠到丝素蛋白 的内部，导致形成强的氢键相互作用。这一结果与t y r o s i n e 高的l s s d l s 3 0 比值相一 致( 见图2 6 b ) 。 进一步增加k + 浓度，从3 7 5 增加到6 2 5m g ，g ( s f ) t y r o s i n e 的紫外吸收 略微上升。表明过量的k + 浓度可以打断t y r o s i n e 在丝素蛋白内部通过酚羟基基团 形成的氢键相互作用，使得t y r o s i n e 部分暴露到蛋白质的表面，导致s i l ki i 的含 量下降。这与表2 - 2 中的n m r 拟合结果相一致。继续增加k + 的浓度到1 2 5m g ( k ) g ( s f ) ，过多的k + 离子强度打断了反平行芦- s h c c t 结构以及堆积形成的三层 f l - s h e c t 链结构中的氢键作用 3 3 1 ，导致丝素蛋白构象转变成h e l i x 或者r a n d o mc o i l 结构。t y r o s i n e 重新隐藏到丝素蛋白的内部，并在紫外吸收谱中反映出t y r o s i n e 的紫外吸收有所下降。虽然t y r o s i n e 的紫外吸收变化不如r a m a n 光谱中i s s o i s 3 0 比值强度的变化明显，这是因为紫外光谱测量中丝素蛋白的浓度低于r a m a n 光 谱测量的浓度，但是，紫外光谱的实验结果仍与g a m a n 实验的结果基本一致， 都得到相同结论。即，当丝素蛋自从蚕丝腺体的后部运动到前部的过程中，k + 浓度从0 5 上升到3 1 m g ( k ) g ( s f ) ，丝素蛋白的构象经历了从h e l i x r a n d o mc o i l h e l i xl i k e _ 卢s h e e tl i k e _ ，s h e e t 的转变阻。 2 4 结果讨论 上述研究揭示了t y r o s i n e 残基随k + 浓度的变化在丝素蛋白中各种存在状态。 t y r o s i n e 属于疏水性的氨基酸，通常存在于蛋白质的内甜3 0 m 1 ，以获稳定的能 量状态。a s a k u r a 2 2 l 证明了丝素蛋白膜中，t y r o s i n e 的构象是r a n d o mc o i l 与 s i l ki 结构共同存。在丝纤维中，t y r o s i n e 的构象是反平行的俨s h e e t 结构。 对t y r o s i n e 残基的动力学研究表n t 3 4 j ，在丝素蛋白膜中，沿着苯环c r o 键的 x - f l i p 运动的频率较高，为1 0 6 h z 。但在丝纤维中，该运动的频率较低，为1 0 3 h z 。 复且大学颈士学位论文金属离了k + ，m n “对丝素蛋白构象影响的研究 这表明在丝素蛋白膜中，t y r o s i n e 在r a n d o mc o i l 构象中的翻转运动较快，比 处在反平行俨s h e e t 结构中的运动更为灵活。在t y r o s i n e 残基从h e l i x r a n d o m c o i l 到h e l i x - l i k e 的转变过程中，t y r o s i n e 从蛋白质的内部暴露到蛋白质的表 面，与水形成氢键。这个作用与t y r o s i n e 在九：2 7 6a m 处的紫外吸收值的增加 和i s s d l s 3 0 值的降低相一致，见图2 - 7 b ( s t a t ei i ) 。当丝素蛋白的构象进一步从 h e l i x - l i k e 向俨s h e e tl i k e 转变，t y r o s i n e 形成氢键的强度进一步增加，在 t y r o s i n e 的酚羟基上的氧原子与氢的供体之间形成氢键，同时t y r o s i n e 有序地 隐藏到p - s h e e t 的结构中。氢键的作用使得t y r o s i n e 残基自由运动的性质受到 固定。 t y r o s i n e 残基中亚甲基基团中的碳原子与其羟基基团中的氧原子的距离为 5 7 a 。这个大小使t y r o s i n e 残基正好可以镶嵌到反平行的p - s h e e t 的间隙中，使 得t y r o s i n e 残基中羟基上的氧与主链上甘氨酸g l y c i n e 上的n h 基团上的氢原子 形成氢键相互作用。从而使得t y r o s i n e 稳定在p - s h e e t 的间隙中。进一步的疏水 相互作用使得( s g a g a g ) 重复肽链间通过强的氢键相互作用形成反平行的 伊s h e e t 结构。其中所有的丙氨酸a l a ( 或者丝氨酸s e r ) 残基中的c f 基团都位于 a - s h e e t s 的同一侧，稳定了p - s h e e t 结构，使得俨s h e e t 层中一边的间距是5 7 a ， 另一边的间距是3 5 a 1 3 5 l 。 在研究模型肽链( a g ) 4 和a g a g y g a g 中1 3 6 l ，当这些肽链以s i l ki i 的结构存 在时，t y r o s i n e 可以很好地通过其基团之间自身的聚集而不影响邻近的由( a g ) n 序列形成的卢s h t 结构。除此之外，当t y r o s i n e ( 残基被p h e n y l a l a n i n e 残基 取代时，( a g ) t f g ( a g ) 7 肽链 土( a g ) v y g ( a g ) 7 更容易形成s i l ki i 结构。通过”f s o l i d - s t a t en m r 研究证明，当取代的氟原予是在苯环上时，( a g ) 7 4 - 1 9 f 】f g ( a g ) v 毫无例外地更容易形成s i l k i i 结构。这表明t y r o s i n e 残基中的羟基基团( o h ) 无 疑作为氢键受体发挥了氢键相互作用，从而成为稳定丝纤维中半结晶区结构的重 要作用之一p q 。类似的t y r o s i n e 羟基参与形成氢键相互作用而稳定蛋白质二级结 构的例子也存在于其它的蛋白质中。比如，在f i b r i l l i n 1 中c b e f g ( c a l c i u mb i n d i n g e p i d e r m a lg r o w t h - l i k ed o m a i n ) 结构域。x - r a y 衍射研究表明，t y r o s i n e 在3 5 残基 位置处与邻近结构域中的g l y c i n e - n h 上的h 原子通过氢键相互作用稳定了蛋白质 的二级结构。此外，通过圆二色谱( c i r c u l a rd i c h r o i s m ) i 正明，t y r o s i n e 在侧链上的 取向也非常接近于富含g i y c i n p 植物的r n a 结合蛋白( g r r b p s ) q a 3 1 复旦大学顾士学位论文金属离了= l c ，m n 2 + 对丝素蛋凸构象影响的研究 g 1 g 2 y 3 g 4 g 5 g 囔7 r s d 9 g 1 0 序列上g l y 5 的n h 基团上的质子，以及 g 1 g 2 r 3 r 4 d 5 g 6 g 7 p c g g l o 序列中g l v l l n h 基团上的质子【3 8 】。t o t e m 等1 3 9 1 通过紫外 和荧光光谱研究了疯牛病中朊蛋白( p r p 。蛋白) 1 3 2 - 1 6 0 区问中1 h 1 5 0 和p h e l 4 1 结 构和作用。它们在p r p c 转变为致病性的p r p 过程中，通过有序取向的氢键相互 作用稳定了朊蛋白中的发夹结构，并作为成核区促进了继而通过分子问和分子内 的相互作用形成的不溶性；- s h e e t 结构。这种蛋白质由螺旋态到臆的错误折叠， 导致了疯牛病、阿尔海默茨疾病，帕金森疾病，亨廷顿疾病等脑神经退行性疾病 【柏】。 在丝素蛋白中，当k + 的浓度达到3 7 5m g ( k ) g ( s f ) 时，k + 与v - g y - g 的摩 尔比在1 5 ，1 0 。由此可以推断，k + 极有可能引起丝素蛋白中v - g - y - g 序列的运 动。通过k + 与羰基上的氧原予形成的静电相互作用，使得r 位于由j u g y - g 序 列形成的通道当中，从而使v - g y - g 序列稳定地位于反平 t p - s h e e t 结构的两侧。 这种现象也在k + 通过s t r e p t o m y c e sl n 4 d a n sk c s ak ，1 ，4 2 l 通道的选择性通透膜中 的结合作用方式中发现。f 的半径为1 3 3 足通透膜孔径的空间结构由1 0 与 v g y - g 序列中羰基上的氧原子通过静电相互作用形成的配合物结构决定。在 能量稳定的结构控制下，使得k + 与o 之间的配位距离为2 8 5a l 叫。此外，u v c m k y ， vn 等人m 通过荧光光谱发现c 也可以使得神经纤维化蛋白人类共核蛋 白中的t y r o s i n e 残基重新形成有序的取向。 2 5 结论 我们通过固体1 3 cc p m a sn m r 谱、广义二维n m r - n m r 相关光谱、紫外 光谱及拉曼光谱证明，k + 在丝素蛋白的构象转变过程中发挥了重要作用。在蚕丝 腺体末端的分泌吐丝器中相对高的k + 浓度对丝的自然形成有着重要意义。本工 作提出了详细的构象转变机理。当外加k + 浓度从0 增加到3 7 5m g ( k ) g ( s f ) 时， 即类似蚕在吐丝中k + 从后部i ! i i i 部的浓度变化( 从0 5 增加到3 1 m g ( k ) g ( s f ) ) 5 , 1 1 】。丝素蛋白构象演变的次序是从h e l i x ( a n d o rr a n d o mc o i l ) _ h e l i x 1 i k e f l - s h e e t 1 i k e 一伊s h e e tc o n f o r m a t i o n s 。与p h 从6 8 下降到4 8 的过程中，所引起 的丝素蛋白在蚕腺体腔内从后部到前部运动的过程中构象转变次序一致【4 5 l 。更高 k + 浓度将导致f l - s h e e t 重新解折叠转变为h e l i x r a n d o mc o i l 构象。此外，丝素蛋白 复旦大学顾， 学位论文金属离子1 c ，m 一对丝索蛋亡j 构象影响的研究 中的t y r o s i n e 残基在蛋白质的二级结构中也起到了重要作用。在k + 浓度的控制 下，由t y r o s i n e 的酚羟基( - o h ) 形成的氢键相互作用使得丝素蛋白在腺体中运 动时中间过渡态的t y r o s i n e 最优化取向，以稳定过渡态蛋白质结构。大量位于 p - t u r n 区或者位于反平行f l - s h e e t 肽链末端的t y r o s i n e 确保了自然界的丝素蛋白 逐步稳定地形成同时具有高强度和高弹性的# - s h e e t 结构丝纤维。 参考文献 ( 1 ) z o n g , xh ；z h o u , e ；s h a o , z z ；c h e n ，s m ；c h e r t , x ；h u ，b w ；d e n g , e ；y a o , w i lb i o c h e m i s