（预防兽医学专业论文）猪链球菌潜在毒力因子SsnA和ADS的分子生物学研究.pdf

摘要 猪链球菌的致病性主要与其毒力因子相关，目前猪链球菌的毒力因子主要有溶菌酶释放 蛋白、胞外蛋白因子、溶血素、黏附素、荚膜多糖、纤维蛋白原结合蛋白；近几年还发现了 潜在毒力因子，主要有：分泌型核酸酶a ( s s u 捃s e c r e t e d n u c l e e a ，s s n a ) 、3 8 k d 免疫保 护性抗原、致病性基因- o r f 2 、谷氨酸脱氢酶蛋白、精氨酸脱亚氨酸酶系统( a r g - a m i n o p e p t i d a s ， a d s ) 、酪蛋白酶、类胰凝乳蛋白等。 核酸酶的作用底物是d n a 这种在细胞中起重要作用的大分子，并且分泌型核酸酶的表达 水平和分离的位置有密切的关系，提示这可能是一种新型的毒力因子。精氨酸脱亚氨酸酶作 为机体产生的水解酶也可以使微生物逃避宿主的免疫机制，该酶通过水解精氨酸产生游离的 p 和缓激肽，来抑制感染部位平滑肌的自由伸缩以及改变局部血管渗透压，因此精氨酸脱亚 氨酸酶也被认为是链球菌的潜在毒力因子。 本实验为研究这两种潜在毒力因子的某些生物学特性，设计测序引物克隆测序了核酸酶 a 基因，根据核酸酶a 基因的测序结果建立扩增片段长度为3 0 1 b p 的p c r 检测方法，能特异 性的检测猪链球菌核酸酶a 基因。并用甲苯胺蓝d n a 酶琼脂检测猪链球菌分泌性核酸酶a 活性，该方法可以定性检测核酸酶活性的。设计测序引物克隆测序了精氨酸脱亚氨酸酶基因， 根据精氨酸脱亚氨酸酶基因基因的测序结果建立扩增片段长度为2 3 t o p 的p c r 检测方法，能 特异性的检测猪链球菌精氨酸脱亚氨酸酶基因。 对8 株猪链球菌2 型重庆分离株的核酸酶a 全基因进行克隆测序，结果表明该基因长度 为3 1 2 6 b p ，与g e n b a n k 发表的唯一的该基因的序列相比，核苷酸同源性高于9 8 ，推导的氨 基酸同源性高于9 4 ；对9 株猪链球菌2 型重庆分离株的精氨酸脱亚氨酸酶基因进行克隆测 序，结果表明该基因长度为1 2 3 1 b p ，与g e n b a n k 发表的该基因序列相比，核苷酸同源性高于 9 9 ，推导的氨基酸同源性高于9 6 。 用核酸酶a p c r 检测方法和活性检测方法对猪链球菌国内分离和重庆地区猪链球菌扁桃 体分离株进行了检测，从病猪内脏分离的猪链球菌致病株3 5 株，3 3 株核酸酶a 基因p c r 检 测阳性( 阳性比例为9 4 3 ) ，其中有2 4 株分泌活性检测阳性的( 阳性比例6 8 6 ) ；正常猪 扁桃体分离株1 4 株( 重庆分离) ，p c r 检测阳性的l o 株( 阳性比例7 1 4 ) ，其中有核酸酶a 分泌活性为8 株( 阳性比例5 7 1 ) ，检测菌株中有2 型猪链球菌“株，3 8 株扩增出核酸酶 a 基因的片段p c r 检测阳性其中分泌活性为阳性的有3 2 株，猪链球菌1 型、7 型、9 型、1 4 型、l ，2 型各一株，均能扩增出核酸酶a 基因的片段，但只有1 4 型猪链球菌有核酸酶a 分泌 活性。重庆地区分离的8 株致病性链球菌均能检测到核酸酶基因，但有3 株没有核酸酶活性， 核酸酶分泌阳性和阴性的菌株的基因差异不大，仅个别碱基发生了变化。对猪链球菌在不同 生长时期核酸酶活性的检测显示，猪链球菌在培养4 小时、8 小时、1 6 小时、3 2 小时和4 8 小时均有核酸酶a 的分泌，并且c a 2 + 和m 9 2 + 为分泌性核酸酶a 的活性必需因子。 用精氨酸脱亚氨酸酶基因p c r 检测方法对猪链球菌国内分离和重庆地区猪链球菌扁桃体 分离株进行了检测，3 5 株猪链球菌致病株中，3 0 株精氨酸脱亚氨酸酶基因的p c r 检测阳性， i i i 西南大学硕士学位论文 有5 株精氨酸脱亚氨酸酶基因的p c r 检测阴性；1 4 株猪扁桃体分离株( 重庆分离) ，1 1 株为精 氨酸脱亚氨酸酶基因的p c r 检测阳性，3 株为精氨酸脱弧氨酸酶基因的p c r 检测阴性；猪链 球菌1 型、7 型、9 型、1 4 型、1 2 型各一株，均能扩增出精氨酸脱亚氨酸酶基因片段。 关键词：猪链球菌分泌性核酸酶精氨酸脱亚胺酸酶活性检测p c r 检测 i v a b s t r a c t t h et h r i t y - f i v ed i f f e r e n ts c r o t y p e s ( t y p e l 2a n d1t h r o u g h 3 4 ) o fs s u i sh a v eb e e nd e s c r i b e d o f t h e3 5s c r o t y p o s ，t y p e2i st h em o s tf r e q u e n t l yi s o l a t e ds e r o t y p o sf r o mp i g sw i t hd i s e a s e ，w h i c hc a n c a u s em a n yd i f f e r e n td i s e a s es u c h ：m e n i n g i t i s ，s e p t i c e m i aa r t h r i t i s ，e n d o c a r d i t i sa n ds u d d e nd e a t h i np i g so rh u m a n a tp e s e n t ，an u m b e ro fp o t e n t i a lv i r u l e n c ef a c t o r sh a v eb e e ni d e n t i f i e da n d p a r t i a l l yc h a r a c 把五砒i n c l u d i n g e x t r a c e l l u l a rf a c t o r , m u r i m i d a s e - r e l e a s e dp r o t e i n , s u i l y s i n , i n n u n o g l o b u l i ng - b i n d i n gp r o t e i n , c a p s u l a rp o l y s e c c h a r i d c ，b a c t e r i a la d h e r e n c ea n df i b r o n e c t i n - b i n d i n gp r o t e i n n o wt h e t ew o r es o m ep o t e n t i a lv i r u l e n c ef a c t o r sh a sb e e nf o u n dt h e yi n c l u d es s u i s s e c r e t e dn u c l e a s ea ，o r f 2 ，3 8 - k i l o d a h o nl m m u n o g e n i ca n dp r o t e c t i v ea n t i g e n , g l u t a m a t e d e h y d r o g e n a s e ，a r g a m i n o p e p t i d a s ，c a s i n s e ，c h y m o t r y p s i n - l i k e ，d p pi v a n ds oo n s s u i ss e c r e t e dn u c l e a s ea ( s s n a ) a c t i v i t yd e t e c t i o ns h o w e dt h a tc l i n i c a li s o l a t e sf r o ms u r f a c e ( n a s a lm u c o f l ao rp a l a t i n et o n s i l ) o ri n t e r n a lo o i n t , b r a i no ro t h e ri n t e m a lo r g a n ) l o c a t i o n sr e v e a l e da s i g n i f i c a n tr e l a t i o n s h i pb e t w e e ne x p r e s s i o no fn u c l e a s ea n di s o l a t i o nf r o ma l li n t e r n a ls i t e p r o t e a s e s i d e n t i f i e da sc r i t i c a lv i r u l e n c ef a c t o r si nn u m e r o um i c r o b i a lp a t h o g e n s w h i c ha t eh y d r o l y t i c l h l z y l u e sc a t a l y z i n gt h ec l e a v a g eo fp e p t i d eb e n d si np r o t e i n sa n dp e p t i d e s ，m a yb eak i n do f v i r u l e n c ef a c t o r so f & s u i s i n d e e d , t h e s ee n z y m e sm a ya c t0 1 1av a r i e t yo fh o s tp r o t e i n si n c l u d i n g s e r u m a n dt i s s u ec o m p o n e n t st h u sc o n 仃i b u t i n gt on e u t r a l i z a t i o no ft h ei m m u n ed e f e n s es y s t e ma n d t i s s u ed e s t r u c t i o n i t s h o w e d t h a t a r g - a m i n o p e p t i d a s ( a d s 、m a y b ea l a r v a p e o u s v i r u l e n c e f a c t o r s t oe s t a b l i s ham e t h o df o rn u c l e n t i d es e q u e n c i n go fs s u i ss e c r e t e dn u c l e a s ea 。a n de s t a b l i s ha m e t h o df o rd e t e c t e db yp c r , t h er e s u l ts h o w e dt h i sm e t h o dh a da d v a n t a g eo fh i g h e r s e n s i t i v i t y ，s p e c i f i c i t ya n ds t a b i l i t y t h es s u i sn u c l e a s ea c t i v i t yw a sd e t e c t e db y t o l u i d i n eb l u ea g a r f r b a ) ，t h i sm e t h o dw a sc o n v e n i e n ta n dt h ec o n s e q u e n c ew a sa c c u r a t i s s i m e ，i tw o u l db eu s e f o li n a c t i v i t yd e t e c t e d t oe s t a b l i s ham e t h o df o rn u c l e o t i d es e q u e n c i n go fs s u i sa d s a n de s t a b l i s ham e t h o df o r d e t e c t e db yp c r , t h er e s u l ts h o w e dt h i sm e t h o dh a da d v a n t a g eo fh i g h e rs e n s i t i v i t y ，s p e c i f i c i t ya n d s t a b i l i t y t h es s n af r o mt h e8s t r e p t o c o c c u ss u i ss e r o t y p e2c h o n g q i n gi s o l a t e sw a sa m p l i f i e db y p c r u s i n g3p a i r so f p r i m e r n u c l e o t i d es e q u e n c i n ga n da n a l y s i sr e s u l t sr e v e a l e d t h a tt h es a n ag e n e i s3 ，1 2 同o p t h es i m i l a r i t yo fs s n ag e n ea n da m i n oa c i df r o m8c h o n g q i n gi s o l a t e sw a sm o r e t h a n9 8 a n d9 4 ，r e s p e c t i v e l y t h es s n ag e n ew a sd e t e c t e db yp c rw i t ht h ee x p e c t e ds i z ew a s 3 0 1 b da n dt h e & s u i sn u c l e a s ea c t i v i t yw a sd e t e c t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t3 5p a t h o g e n i c s t r e p t o c o c c u ss u i si s o l a t e sf r o md i s e a s e dp i g s v i s c e r a , 3 2i s o l a t e sd e t e c t e db yp c rw e r ep o s i t i v e a n d2 4i s o l a t e sw e r et h en u c l e a s ep h e n o t y p e s1 0i s o l a t e sd e t e c t e db yp c rw e r ep o s i t i v ea n d8 i s o l a t e sw c i et h en u c l e a s ep h e n o t y p e si n1 4d e t e c t e ds t r e p t o c o c c u ss u i si s o l a t e sf r o mp i g s t o n s i l t h i r t y - e i g h ti s o l a t e sd e t e c t e db yp c r w e r ep o s i t i v ea n d3 2i s o l a t e sw e r et h en u c l e a s ep h e n o t y p e si n v 西南大学硕士学位论文 4 4d e t e c t e ds t r e p t o c o c c u ss u ss e r o t y p e2i s o l a t e s s s i ，s s 7 ，s s 9 ，s s l 4a n ds s l 2d e t e c t e db yp c r w e r ea 1 1p o s i t i v eb u to n l ys s l 3w a sn u c l e a s ep h e n o t y p e s 1 kr e q u i r e m e n to fc a 2 + a n dm 矿+ f o r s s n aa c t i v i t yw a sd e t e r m i n e d s s u sg r o w t hs t u d ys h o w e dt h a ts s n aw a se x p r e s s e dt h r o u g h o u ta l l s t a g e s n ”a d sf r o m9c h o n g q i n gs t r e p t o c o c c u ss u i ss e r o t y p e2i s o l a t e sw a sa m p l i f i e db yp c r n u c l e o t i d es e q u e n c i n ga n da n a l y s i sr e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h ea d sg e n ei s1 , 2 3 1 b p 1 1 l es i m i l a r i t yo f a d sg e n ea n da m i n oa c i df r o m9c h o n c r q i n gi s o l a t e sw a sm o r et h a n9 9 a n d 9 6 ，r e s p e c t i v e l y t h ea d s g e n ew a sd e t e c t e db yp c rw i t ha2 3 7 i , pe x p e c t e d 缸g tn er e s u l t ss h o w e dt h a ti n3 5 p a t h o g e m es t r e p t o c o c c u ss u i si s o h t e sf r o md i s e a s e dp i g s v i s c e r a , 3 0i s o l a t e sw g i ep o s i t i v e ；1 1 i s o l a t e sw g r ep o s i t i v ei n1 4d e t e c t e ds t r e p t o c o c c u ss u i si s o l a t e sf r o mp i g s t o n s i l s s l ，s s 7 ，s s 9 ， s s l 4a n ds s l ，2d c t e c t lb yp c rw e r ea l lp o s i t i v e k e y w o r d s ：s t r e p t o c o c c u ss u i ss e r o t y p e2 ：s t r e p t o c o c c u ss u i ss e c r e t e dd n a s e a ：a c t i v i t yd e t e c t ； a r g - a m i n o p e p t i d a s e ； v i 独创性声明 学位论文题目：猹垡鏊莹澄在盎左固王墨曼垒塑业数佥生麴堂丑究 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 叶4 学位论文作者：认小签字日期：2 0 0 7 年歹月j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：狠奇、 签字日期：d - ，哆年f 月日 引言 引言 猪链球病是世界各国常见的一种猪传染病，临床症状复杂，危害严重，也是多年来困扰 我口养猪业的主要传染病之一猪链球菌病分布范围极广，荷兰、英国、美国、加拿大、澳 大利亚、新西兰、比利时、巴西、丹麦、挪威i 芬兰、西班牙、德国、爱尔兰、日本、中国 台湾及大陆等先后报道了该病，该病由不同的链球菌引起，如马链球菌兽疫亚种。马链球菌 亚种。猪链球菌等；二十世纪七、八十年代，在我国流行的猪链球菌病的病原主要是c 群的 马链球菌兽疫亚种：近几年主要以猪链球菌2 型为主。 1 9 9 1 年，我国广东省首次报道证实猪感染猪链球菌2 型的疫情；1 9 9 8 年，我国江苏南通 等地暴发猪链球菌2 型疫情并造成2 0 多人发病，1 4 人死亡，2 0 0 5 年夏季，四川省资阳，内 江等地爆发猪链球菌2 型疫情。期间共死亡猪6 4 7 头。同时爆发人感染猪链球菌的病例，累 计报道2 0 4 例，其中死亡3 8 例，可见我国猪链球菌的发病呈上升的趋势。 目前，我国对猪链球菌的研究工作主要集中在链球菌的致病性方面和已知毒力因子的研 究上，普遍认为链球菌的致病性是由于链球菌的毒力因子所导致的，目前已经发现的毒力因 子主要有：溶菌酶释放蛋白、胞外蛋白因子、溶血素、荚膜多糖等，但并非所有的致病株菌 株都有这几种毒力因子，对链球菌的毒力因子的研究仍在进行，最新发现了一些潜在毒力因 子的如分泌性核酸酶a 、3 8 k d 免疫保护性抗原、谷氨酸脱氢酶蛋白、精氨酸脱亚氨酸酶系统 等，有证据显示这些潜在的毒力因子在链球菌的致病性中起一定的作用，因此对猪链球菌潜 在毒力因子的研究工作为链球菌致病机理提供了新的方向。 潜在毒力因子中分泌性核酸酶a 是一种具有脱氧核糖核酸酶的活性的核酸酶。它直接作 用于d n a 这种细胞中关键的大分子物质，因此普遍认为链球菌分泌的核酸酶是潜在的毒力因 子。精氨酸脱亚氨酸酶是菌体产生的一种蛋白酶，蛋白酶可以作为判断微生物是否有致病性 的标准，它作为一种水解酶可以水解蛋白质，甚至于可以在宿主体内扮演各种角色而使微生 物逃避宿主的免疫机制，精氨酸酶系统中的精氨酸脱亚氨酸酶作为一种水解酶也可以起到相 应的作用，因此作为猪链球菌的潜在毒力因子受到广泛的重视。目前我国还没有猪链球菌潜 在毒力因子方面研究的报道，国际上对潜在毒力因子的报道也不多见，因此对我国猪链球菌 潜在毒力园子分泌性核酸酶a 和精氨酸脱亚氨酸酶的研究就显缛十分必要了。 本实验对猪链球菌2 型重庆分离株的分泌性核酸酶a 和精氨酸脱亚氨酸酶基因进行序列 测定与分析，并建立了分泌性核酸酶a 和精氨酸脱亚氨酸酶基因的p c r 检测方法。以及核酸 酶a 活性检测的方法。运用建立的各种检测方法对国内分离的致病性猪链球菌2 型和重庆地 区健康猪扁桃体分离的猪链球菌2 型以及部分其他型的链球菌进行了检测，以期研究这两种 潜在毒力因子在致病株和非致病株中的存在情况，以及不同毒力的菌株中该基因的突变情况， 为研究这两种潜在毒力因子的致病性方面打下基础。 第一章猪链球菌毒力因子研究进晨 第一章猪链球菌毒力因子研究进展 猪链球菌病( s t r e p t o c o c c o s i so fs w i n e s ) 是链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 中马链球菌兽疫亚种 ( s t r e p t o c o c c u se q u is u b s pe q u o 、马链球菌类马亚种( s t r e p t o c o c c u se q u i5 却e q u i s i m i l i s ) l a n e e f i e l d 分群中d 、e 、l 群链球菌以及猪链球菌( s t r e p t o c o c c u ss u 妇) 引致猪疫病的总称。猪链 球菌根据其多糖英膜抗原差异，至少有3 5 个血清型( 1 3 4 型和l ，2 型) 1 1 。近年来。多以r 群的猪链球菌2 型为主，2 型猪链球菌不仅可引起猪关节炎( a r t h r i t i s ) 、脑膜炎( m e n i n g i t i s ) 、 肺炎( p n z n o n i a ) 、败血症( s 印6 c a e r n i a ) 、心内膜炎( e n d o c a r d i t i s ) 、脑炎( c 印h a l i t 埘、多浆膜炎 ( p o l y s c r o s i t i s ) 、流产( a l x m i o n s ) 2 殳脓肿( a b s c e s s e s ) ，而且可感染人并致死，是一种重要的人畜共 患病病原口棚。我国于1 9 9 1 年在广东省首次证实此病存在。1 9 9 8 1 9 9 9 年夏季在我国江苏省 部分地区猪群中暴发流行并导致特定人群感染致死的疫病，以及2 0 0 5 年在四川发生链璩菌感 染人群并致死的病历，经鉴定系由猪链球菌2 型所致 3 , 4 , 5 a 7 1 。 1 1 猪链球菌概述 1 1 1 链球菌血清型 s s u i s 常栖居于猪上呼吸道( 尤其是鼻腔和扁桃体) 和生殖道，有时也可以从其它哺乳动物 ( 包括人类) 和鸟类中分离到。1 9 6 3 年d e m o o r 将最s u s 归类到兰氏弗尔德链球菌r 、s 、r s 和t 群 6 1 ，后来e l l i o t t 进一步研究发现s 群链球菌与其他一些链球菌相似并进而划分为d 群 链球菌。并命名为& s u b 血清2 型 7 1 ：w i n d s o r 等学者从猪体内分离到与r 群链球菌相似的链 球菌，命名为& s u i s 2 型；而r s 群为最s u i s l 2 型8 ，“。 在对ks 群相类似链球菌研究时进一步发现。参与血清学反应的多糖抗原来源于细菌荚 膜，而不是细胞壁。依据细菌荚膜多糖的差异性将& s u i s 分为3 5 个血清型，分别为1 2 型和 1 3 4 型，其中2 型ss u i s 致病性强、流行范围广 1 1 , 1 2 , 1 3 】。大多数s s u i s 血清型分离自猪，个 另0 型来自人和其它动物如牛、羊以及鸟类 1 4 , 1 5 , 1 6 , 1 1 。在不同地区和时期血清型流行情况不一致， 过去几年中加拿大的2 型ss u i s 的比例由2 2 下降至1 5 【1 3 】，但在法国有7 0 的ss u i s 分离 菌株为2 型“。 1 1 2 链球菌病的流行病学及致病机理 猪链球菌2 型与猪临床疾病有一定的相关性，但不是所有的2 型菌株均能致病，也并非 引起同一种疾病。各年龄的猪均能感染猪链球菌，但大多在3 1 2 周龄的仔猪暴发流行，尤 其在断奶及混群时出现发病高峰。口、鼻腔是主要的入侵门户，而后在扁桃体定居繁殖。人 的感染与职业有密切关系，与猪或猪肉密切接触的人员比其他人群感染的几率高1 5 0 0 倍，该 菌主要通过伤口或经口感染人。引起脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎。导致永久性耳聋 等后遗症。并可引起死亡 2 0 1 。 猪链球菌2 型是粪便、尘埃及水的重要污染物，对环境的抵抗力较强 2 1 1 。据证实其污染 物，如粪肥及注射针头，都可以传播猪链球菌。猪链球菌2 型对消毒剂抵抗力不强很容易被 5 的漂白粉灭活o “。拥挤、通风不良，气候骤变、混群、免疫接种等应激因素均可激发本病 的发生与流行，昆虫媒介在疾病的传播中也起重要作用田】。 3 西南大学硕士学位论文 猪链球菌2 型的致病机理的研究还不是很清楚。目前相关是研究主要限于2 型菌株是如 何引起脑膜炎的，一般认为猪链球菌2 型首先定殖于扁桃体中，突破扁桃体及上呼吸道的屏 障后进入血液循环f 2 4 1 。有关s s 2 和上皮细胞相互作用的研究认为s s 2 在某种程度上能侵袭人 源上皮细胞，具有溶血素的菌株对上皮细胞有较强的毒力，而溶血素单抗能抑制此作用口”。 s s 2 的黏附作用被认为是由细胞壁上的某种物质介导。而荚膜多糖的存在降低了这种作用， 但英膜多糖不能抑制s s 2 对脑微血管内皮细胞的黏附作用，血液中的猪链球菌穿过血脑屏障 ( b l o o db r a i nb a r r i e r ，b b b ) 进入蛛网膜下隙4 q 。s s 2 是以游离状态或黏附于吞噬细胞表面以及 被吞噬在胞内这三种方式和b m e c 作用。试验表明s s 2 只能黏附于b m e c ，所以黏附在感染 中显得尤为重要，只有在黏附后。s s 2 可以穿过细胞层，并在黏附作用和溶血素的联合作用 下，使细菌穿过b m e c 进入中枢神经系统；而溶血索阴性菌株。黏附后不直接损伤b m e c ， 可能通过刺激白细胞或b m e c 产生细胞因子，改变b b b 的通透性，从而使溶血素阴性菌株 穿过b b b 2 7 2 8 。m r p 作为s s 2 的黏附素，在细菌对其嗜性器官的定殖及进一步的感染中起 重要作用，其表达和菌株的毒力相关，但它不是唯一的黏附素，从理论上推断应该还存在其 他起黏附作用的蛋白1 2 ，j s s 2 突破黏膜屏障后，通过血流传播，可能的机制有三种：o ) 在血 液中，s s 2 被吞噬细胞吞噬，非致病株在细胞内被杀死，而致病株却以某种机制存活下来， 随单核细胞运行至大脑，继而入侵中枢神经系统旧；( 2 ) 由于荚膜具有抗吞噬作用，使细菌游 离存在于血液中随血液循环进行扩散3 2 ，3 目；( 3 ) 黏附于巨噬细胞上而不被吞噬，故以黏附在 细胞表面的方式进行扩散的嗍。 1 1 3 临床症状与病理学变化 因感染猪群日龄及猪链球菌血清型不同，发病猪群呈现的临床症状各异：超急性病例， 病猪不表现任何症状即突然死亡；急性病例中的临床症状主要是发热、抑郁、厌食，随后表 现一种或几种以下症状，如共济失调、震颤发抖、角弓反张、失明、听觉丧失、麻痹、呼吸 困难、惊厥、关节炎、跛行、流产、心内膜炎、阴道炎等 3 5 , 3 6 , 3 7 , 3 8 , 3 9 , 4 0 , 4 1 , 4 2 , 4 3 删。 超急性和急性感染猪链球菌而引起死亡的猪通常没有肉眼可见的病变，部分表现为脑膜 炎的病猪可见脑脊膜、淋巴结及肺发生充血p t ”, 4 5 , 4 6 。 在关节炎的病例中，最早见到的变化是滑膜血管的扩张和充血，关节表面可能出现纤维 蛋白性多发性浆膜炎。受影响的关节，囊壁可能增厚，滑膜形成红斑，滑液量增加，并含有 炎性细胞 2 4 , 3 5 1 。 心脏损害包括纤维蛋白性化脓性心包炎、机械性心瓣膜心内膜炎、出血性心肌炎m 。猪 链球菌感染普通引起肺脏实质性病变，包括纤维素出血性和问质纤维素性肺炎、纤维素性或 化脓性支气管肺炎，部分病例有血管外周、支气管外周及细支气管外周的淋巴细胞套，支气 管、细支气管炎，肺泡出血，小叶间肺气肿以及纤维素化脓性胸膜炎 3 7 , 4 8 , 4 9 】。猪链球菌引起 的败血症，全身脏器往往会出现充血或出血现象【3 8 】。 1 2 猪链球菌2 型的毒力因子 猪链球菌根据其多糖英膜抗原差异，至少有3 5 个血清型。主要的致病血清型为l 型，2 型，7 型，9 型，1 4 型，l 2 型，其中以猪链球菌2 型的流传最广，致病性最强。但研究发现 4 第一章猪链球菌毒力园子研究进展 并不是所有的猪链球菌2 型都致病，致病性的强弱与其是否表达相关毒力因子有关，近年来 发现的毒力因子主要有溶菌酶释放蛋白和胞外蛋白因子，溶血素，黏附素，荚膜多糖，纤维 蛋白原结合蛋白等 1 2 1 溶菌酶释放蛋i 刍( m u r a m i d a s e r e l e a s e dp r o t e i n ) 和胞外蛋白因子( e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n f a e t e r ) 溶菌酶释放蛋白( m r p ) 和胞外蛋白因子( e f ) 被认为是猪链球菌的两种重要的毒力因子，病 猪体内分离的菌株一般含这两种分子，而从健康猪体内分离的菌株大多没有这两种大分子t s o m r p 为溶菌酶释放蛋白，又称类m 蛋白，存在于细胞表面，分子量为1 3 6 k d 。对猪链球 菌致病菌株的m r p 的克隆测序，显示其n 端有一信号肽，游离于菌体表面，c 端有一类似 于a 群链球菌m 蛋白基因的锚式序列；锚式序列前有一高度重复区，其中包括与纤连素结合 所需的氨基酸序列，但不与人的纤连素结合；重复区前是一段富含脯氨酸的序列，可能与胞 壁肽聚糖的结合有关；细菌的黏附是决定病原菌能否感染的关键一步【5 ”，有实验证明m r p 可单独作为s s 2 的毒力因子【5 2 1 。e f 为胞外蛋白因子分子量l l k d ，仅能从培养上清中检出。 对e p f 的基因序列分析表明该基因存在三个开放阅读框；进一步分析发现还存在另外一种在 抗原性上与e f 相关，分子量在1 5 k d 以上的e f 类似物( e f ) 。对e f 和e f * 的氨基酸序列分 析表明，e f * 在n 端的8 3 3 个氨基酸与e f 一致，但在c 端两者有着明显的区别，e f * 含有多 个重复单元，而e f 缺少e p f 和e p f i - 。基因序列上的差异可能导致表型为m r p + e f + 、m r p + e f * 的菌株毒力差异。不同的e f * 蛋白，其重复区的数量和排列情况均不同；一些重复区的氨基 酸序列高度保守，而另一些具有变异性，这种特性可能是细菌逃避宿主免疫系统的一种机制。 e p f 和e p f * 基因5 端的一致性提示这两种基因其中之一可能起源于其中的另一种，或两者来 原于同一基因p ” m r p 和e f 与毒力之间存在密切内关系，但这两种蛋白对2 型菌株的致病性并非不可缺 少，有试验表明m 肿基因的突变株与原菌株的致病性一致，不产生m r p 和e f 的菌株不一 定是非致病株，因此还存在其他毒力因子。 1 2 2 猪链球菌溶血素( s u i l y s i n ) 溶血素是细菌最常见的一种毒力因予，如嗜水气单胞菌的i - i f a 2 毒紊a 群链球菌的s l o 和s l s 以及单核细胞李氏秆茵的溶血素。s s 的溶血素又称猪溶素，是一种琉基活化类毒素， 被普遍认为是2 型s s 的毒力因于之一。从病猪中分离的菌株有很高比率的能在体外产生此种 蛋白，其与链球菌溶血素o ，李氏杆菌溶血素o 等有较高的同源性。实验证明，2 型菌株的 溶血素对人的o 型红细胞最为敏感，其次为马、绵羊、母牛及猪的红细胞，它们的敏感性是 一致的，对兔的红细胞敏感性最差。溶血素是一种胆固醇结合类细胞毒素，对氧及氧化剂敏 感，可被还原剂活化，被低浓度的胆固醇所抑制，n p r t o n 等认为溶血素可能在猪链球菌侵入 和裂解细胞的过程中发挥着重要作阶。此外，纯化的溶血素制成的疫苗免疫小鼠可以完全抵 抗2 型强毒菌株的攻击，说明溶血素亦是一种高免疫原性的抗原。虽然人们普遍认为其是一 种毒力因子但其做为毒力因子的功能仍未得到证实t 5 4 1 。 溶血素分泌于上清中，属于硫醇激活的穿毒素家族，和肺炎球菌产生的肺溶素属穿孔毒 5 西南大学硕士学位论文 素有胆固醇结合特性，分子量为5 4 k d 。根据溶血能力的不同，链球菌可分为不完全溶血( d 溶 血) 、完全溶血( 口溶血) 、不溶血0 溶血) ”。猪链球菌2 型的溶血素是细菌生长过程中分泌的 一种蛋白质，其他一些血清型如1 、1 2 、4 、5 、1 4 、1 5 、1 7 、1 9 和2 0 等亦能从其培养液中 检测出溶血素；其溶血活性与温度、血清白蛋白、氧气等因素相关。细菌在r p m ，1 6 4 0 培 养基中，于4 0 1 2 ，6 c 0 ：的环境下或3 7 c 在t h b 培养基中的厌氧条件下可达最高溶血程 度。加入胎牛血清后丧失溶血活性，加入胰岛素、淀粉酶可降低溶血活性，而加入牛血清白 蛋白能够提高溶血活性。猪链球菌2 型的溶血素的活性依赖于细菌的生存环境，溶血素阳性 的菌株培养上清及纯化的溶血素均具有细胞毒性作用，经胆固醇预处理抑制毒性作用【5 q 。 1 2 3 ig g 结合蛋( i m m u n o g l o b u l m g - b i n d i n gp r o t e i n ) i g g 结合蛋白，分子量6 0 k d ，属于热休克蛋白质家族，该蛋白是所有猪链球菌血清型( 包 括毒力株和无毒株) 的共同抗原，其与毒力的关系尚不清楚p ”。i g o 结合蛋白不仅存在于细胞 表面也存在于培养上清中。该蛋白通过亲和层析进行纯化，电镜观察发现i g o 呈细丝状结构， 直径约4 n m ，尿素和乙醇胺会破坏这种结构。i g g 结合蛋白结合i g o 的作用弱于蛋白a 、蛋 白g ，但可与蛋白a 、蛋白g 竞争结合i g g ，且能够特异性结合鸡的i g g ，而其它i g g 结合 蛋白则不能。直接在硝酸纤维素膜上培养链球菌，之后用人工的i g g 作用即可得到菌体表面 的i g g 结合蛋白；在酸性环境中加热或使用变溶菌素可增加i g g 的溶解度哪l 。 1 2 4 黏附素a c t e r i a la d h e r e n c e ) 黏附素是具有黏附作用的各种细菌表面结构之统称，它是直接介导细菌对宿主细胞黏附 的物质。在化学性质上，黏附索通常是细菌表面某种特定的蛋白质结构或糖脂成分，可存在 于细菌的细胞壁、外膜蛋白、鞭毛、菌毛及微毛( 一种毛发样突出物) 等结构q b l 5 9 1 。 猪链球菌黏附素可以分为1 8 k d 和3 9 k d 两种，依据结合特异性的不同可以将1 8 k d 的黏 附索分为p o 和p n 两种亚型，p o 亚型只被半乳糖抑制，而p n 亚型可以被半乳糖和n 乙酰 半乳糖胺所抑制。纯化后的1 8 k d 黏附素不仅可以有强的免疫原性，而且能诱导小鼠体内的 杀菌活性；3 9 k d 黏附素在猪链球菌的有毒株和无毒株中都有发现，有一定的黏附作用，可以 提高链球菌对小鼠的致病作用i s 9 , 叫。 1 ，2 5 荚膜多糖( c a p s u l a r p o l y s a c c h a r i d e ，c p s ) 猪链球菌2 型的荚膜多糖由葡萄塘、半乳糖、n 乙酞葡萄糖胺、鼠李糖和唾液酸f n a n a ) 构成，它能保护此菌在非免疫动物中不被吞噬。有实验证明英膜厚度增加提高了提高了菌株 抵抗猪多形性核白细胞杀伤的能力【5 ”。根据荚膜多搪的差异，用协同凝集试验等方法，将猪 链球菌分为诸多血清型，已鉴定出3 5 个血清型：1 3 4 型及1 2 型【l 】。诸多研究表明荚膜多糖具 有抗吞噬作用，是一种重要的毒力因子。早在1 9 7 7 年，w i n & o d 依传统观念即提出决定s s 2 侵袭力的是其荚膜多糖，它能保护细菌在免疫动物体内不被吞噬口7 1 。s m i t h 等克隆了与2 型 荚膜多糖生物合成有关的基因位点，含有1 4 个开放式阅读框架，其中1 2 个同属一个转录单 位。1 1 个基因表达产物与细菌多糖生物合成所需的蛋白质相似【6 “。通过插入突变得到的无荚 膜的等位基因突变株在体外非常容易被猪肺泡k 噬细胞摄入，更重要的是，通过无菌仔猪鼻 6 第一章猪链球菌毒力园子研究进展 腔接种的突变株对猪完全无致病性。由此看来，荚膜与细菌致病力有关。在猪体内，荚膜多 糖能刺激产生具有调理作用的抗体，用弗氏不完全佐剂可提高其免疫原性。最近c h a r l a n d 等制备了两株荚膜多糖缺失的变异株，与其原型菌株相比，荚膜多糖的缺失可明显提高菌株 的疏水性及被小鼠巨噬细胞与猪单核细胞吞噬的作用，变异株更易从血液循环中被清除( 原 型菌株在血液中存留时间为4 8 h ) ，而且2 株变异株均不引起小鼠及猪的人工发病，可见荚膜 多糖对2 型菌株来说是一种非常重要的致病因子。其可能的作用机理是影响菌体粘附到上皮 细胞与巨噬细胞上的活性c 6 2 , 6 3 1 2 6 纤维蛋白原结合蛋白( f i b r o n e c t i n - b i n d i n g p r o t e i n ，f b p s ) 在许多链球菌和葡萄球菌中都有几种f b p s 蛋白，而且分子量很大，大部分在1 3 0 k d 左 右。通过克隆测序并提纯猪链球菌2 型的纤维蛋白原结合蛋白，证实它可以粘附到人的血纤 黏蛋白原和纤维蛋白原上，并对猪具有免疫原性，可以产生特异性抗体。但存在一种以上的 f b p s 蛋白，所以在某些只缺失一种f b p s 蛋白的突变株中，还能黏附到血纤黏蛋白原和纤维 蛋白原上，并没有被致弱。在猪链球菌中几乎所有的血清型( 3 2 ，3 4 型除外) 和s s 2 的三个表型 菌株中都存在f b p s 基因。但是否所有的血清型中i b p s 基因都表达还不清楚。f b p s 对猪具有 免疫原性，能产生特异性抗体，几乎所有菌株都存在这个基因，所以，它可以作为交叉保护 性抗原进行进一步的研究 e 4 , 6 5 6 6 1 。 1 3 猪链球菌2 型潜在毒力因子 1 3 1 分泌型核酸酶a ( s s u i ss e c r e t e dn u c l e a s ea ，s s n a ) f o n t a i n e ( 2 0 0 4 ) 在致病2 型菌株s x 3 3 2 和后来的1 - 9 型中，发现了一种分泌型核酸酶s s n a 。 s s n a 基因大小为3 1 2 6 个b p ，通过软件分析预测，包括3 5 个氨基酸为分泌信号肽序列，2 2 个氨基酸为d n a 结合区域和典型的g + 细胞壁基序。此核酸酶的底物为单链和双链d n a , c a 2 + 和m 9 2 + 为s s n a 的活性必需因子。反转录p