（分析化学专业论文）纳米磁性功能微球在免疫分析中的应用及生物传感器的研究.pdf

浙江大学博士学位论文 摘要 本论文共分六章。 第一章主要对有关磁性高分子微球的研究意义、结构与特点、现状进行了介 绍，对磁性高分子微球的制备方法进行了系统地阐述，对磁性高分子微球在靶向 药物、酶的固定化、细胞分离、免疫分析、核酸分离等方面的应用进行了全面的 综述。 第二章是在总结现有的合成方法的基础上，采用分散聚合法，制备纳米磁性 羧基微球和磁性氨基微球，对合成条件进行了优化，提出了纳米磁性功能微球的 最佳合成条件。并对纳米功能磁性微球的性能进行了表征，如粒径大小和分布、 磁化性能和表面宫能团的定性检测以及结合生化物质的荧光定性试验。实验表明， 所制得的微球具有超顺磁性，粒径较均匀，能有效结合生化物质，符合生化分析 的要求。 第三章是将纳米磁性功能微球应用于免疫分析的研究。首先将纳米磁性功能 微球与酶联免疫伏安法相结合测定抗原的研究采用化学键合法将抗体固化磁性 微球表面，捕获抗原和酶标二抗，磁分离后加入底物，生成的电活性物用示差脉 冲伏安法测定。该法具有与抗体结合强度高，反应时间短，分离效率高、灵敏度 高等特点，检测限达到0 0 6 n g m l 灵敏度大大高于目前临床采用的酶联免疫吸附 法。另一种方法是将电活性物标记在二抗上，然后用化学键合法将抗体固化磁性微 球表面，捕获抗原和电活性物标记二抗，在外加磁场作用下，磁性免疫微球吸附 在金膜电极表面，直接用电化学法进行测定。该法具有灵敏、简单、快速、无需 加底物便可直接测定等特点，另外由于纳米磁性微球的超顺磁性，当撤去外加磁 场，磁性微球立即分散到溶液中，电极表面立即更新，非常适用于免疫分析的在 线检测。 第四章是将纳米磁性功能微球与电化学石英晶体微天平相结合应用于免疫分 析的研究。首先是设计了一种新的质量放大系统检测超痕量免疫活性分子。将纳 米磁性功能微球表面修饰上二抗，然后和溶液中的抗原起结合到石英晶振电极 表面，由于磁性微球相对于抗体分子的质量大得多，导致测定的灵敏度得以极大 地提高。 浙江人学博士学位论文 第五章提出了一种以红四氮唑作为嵌合剂，采用石墨修饰电极监测核酸杂交 过程和测定特定d n a 片段的灵敏的电化学方法。该物质具有背景电流低，电活性 强和对双链d n a 选择性好等一系列优点，对d n a 的检测限可低达6 1 0 。1 1 m o l l 。 第六章提出了一种丝素膜电极用于测定神经递质的研究。丝素蛋白膜具有两 性荷电效应，丝素膜的等电点大约为4 5 ，在p h 值小于等电点时，呈正电荷膜的特 性；在p h 值大于等电点时，呈负电荷膜的特性，因此，丝素膜修饰电极可以在不同 的p h 值溶液中测定阳离子或阴离子提出了在不同p h 条件下测定神经递质化合 物的方法，并将该法成功地应用于活体分析中 2 浙江大学博十学位论文 第一章磁性高分子微球的研究进展 第一节磁性高分子微球简介 l 磁性高分子微球的研究意义 磁性高分子微球是指内部含有磁性金属氧化物( 如铁、钻、镍及其氧化物) 的超 细粉末而表面由有机高分子材料结合起来形成具有一定磁性及特殊结构的微球。 它除了具有高分子的特性，通过高分子共聚和表面改性在磁性微球表面引入多种 具有生化活性的功能基团( 如n h 2 、c 0 0 h 、一c h o 、o h 等) 等。磁性高 分子微球作为一种新型的功能材料，对它的研究始于2 0 世纪7 0 年代峨因其同时兼 具高分子微球的众多特性和磁响应性，近年来被广泛研究，特别是在生物医学、生 物工程等领域的应用引起了各国研究者的高度重视，成为生物医药研究领域中的 一个研究重点【2 】。磁性高分子微球表面可结合各种功能分子，如酶、抗体、细胞、 d n a 或r n a 等，因而在生物分离、磁靶向给药、固定化酶、免疫分析及测定、生 物化学合成等领域得到了广泛的应用 蛐】。 目前，国家又把纳米材料作为国家重点基础研究项目，随着纳米功能材料的 兴起，作为纳米材料之一的磁性高分子微球，适应不同要求的磁性高分子微球已 成为一个新的研究热点【l o 】，其优越性已被广泛认同，目前科研工作者正不断地拓 展它的应用范围，它必将在分子生物学、生物传感器、诊断技术和纳米药物载体 等方面正发挥越来越重要的作用。 2 磁性高分子微球的特性和结构 2 1 磁性高分子微球的特性 2 1 1 表面效应和体积效应 表面效应是指超细微粒的表面原子数与总原子数之比随着粒径变小而急剧增 大，表面原子的晶体场环境和结合能与内部原子的不同，具有很大的化学活性， 其表面能大大增加。体积效应是由干超细微粒包含的原子数减少使带电能级加大， 从而使物质的一些物理性质因能级间歇的不连续而发生异常。上述两种效应可具 体表现为比表面激增，微球官能团密度及选择性吸附能力变大，达到吸附平衡的 时间大大缩短，粒子的稳定性大大提高1 1 】。 2 1 2 磁效应 浙江人学博士学位论文 具有磁性可使生物高分子微球在外加磁场作用下方便地进行分离和磁性导 向。当磁性四氧化三铁晶体的直径小于1 0 n r n 时，其具有超顺磁性，即在磁场中 有较强磁性，没有磁场时磁性很快消失，从而使生物高分子微球能够在磁场中不 被永久磁化。 2 1 3 功能基特性 由于磁性微粒表面包覆有高分子材料，而生物高分子带有多种具有反应活性 的功能基团，如一c h 0 ，o h ，c o o h ，_ n h 2 ，可通偶联试剂连接具有生物活性的物质 f 1 3 圳】。当颗粒表面偶联上特异性的靶向分子，如特异性配体、单克隆抗体等，通 过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄粒作用下进人细胞内，实现安 全有效地用作靶向性药物、基因治疗、细胞表面标记、同位素标记等。 2 1 4 生物相容性 磁性微球在生物工程尤其是在生物医学工程中的应用，有一个重要方面就是 要有生物相容性。多数生物高分子如多聚糖、蛋白质类、脂质类具有良好的生物 相容性，它们在人体内安全无毒，可降解，不与人体组织器官产生免疫原性，这 种性质在靶向药物中尤其重要。 2 2 磁性高分子微球的结构 磁性高分子微球按照结构可以分为三类，即：核一壳型、壳一核型和壳一核 一壳型。 核一壳型由磁性材料组成核，聚合物组成壳层；壳一核型是将聚合物作为核， 磁性材料为壳；壳一核一壳夹心型的内外层均为高分子材料，中间为磁性材料。 就目前的研究现状来看，其中研究较多且有广泛应用前景的是第一类核壳型的磁 性高分子微球。 2 2 1 构成磁核的材料 磁性高分子微球中所用的磁性材料大多为铁、镍、钴的氧化物的纳米粒子， 一般采用的磁性粒径小于1 0 0 n m ，通常为1 0 2 0 n m 。当磁性材料直径小于3 0 n m 时， 具有超顺磁性，即在较弱磁场中也可以产生较强的磁性，而外磁场消失后，磁性 很快消失，不会被永久磁化，对于f e 3 0 4 磁性粒子，其在磁流体中的超顺磁性临界 尺寸为1 0 m 。由于纯金属镍、钴磁性纳米粒子有致癌作用，不宜在生物体内使用， 4 浙江火学博士学位论文 目前制备的磁性高分子微球磁核的材料主要以f 0 3 0 4 磁性纳米粒子为主。 磁性材料的制备方法有共沉淀法、沉淀氧化法2 2 】等。 ( 1 ) 共沉淀反应原理： f e 2 + + 2 f e 3 + + 8 0 h 。= ：垒f e 3 0 4i + 4 h 2 0 在沉淀过程中，控制溶液中的沉淀剂浓度，使沉淀处于平衡状态，且沉淀在 整个溶液中均匀地出现，构晶离子的过饱和度在整个溶液中比较均匀，因此，均 匀沉淀法得到的粒子较细、均匀，该法是目前使用最普遍的方法。 ( 2 ) 沉淀氧化法反应原理： f e 2 + + 2 0 h 。= = f e ( o h ) 2l 6 f e ( o h ) 2 + 0 2 ：= 2 = 2 f e 3 0 4i + 6 h 2 0 浚法利用f e c l 2 与n a o h 作用，加入极少量的h 2 0 2 作为氧化剂，搅拌下制得 f e 3 0 t 磁性粒子。在沉淀氧化法得到的粒径稍大，但磁响应强。 2 2 2 构成磁球外表的材料 构成磁球外表的材料主要为高分子材料。高分子材料主要分为天然和合成高 分子材料。天然高分子材料包括淀粉、纤维素及其衍生物、多糖、蛋白质、甲壳 素、壳聚糖等；合成聚合物一般有聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯酸和聚乙二醇 等。天然高分子材料价廉易得、毒性低、生物相容性好，但成分复杂，每批之间 的差别较大，制备的磁球均一性差；合成高分子材料纯度高、性能易控制、可选 择性强，但也存在难降解、毒性大等问题。在微球中应用的高分子材料应具有以 下性质：无毒、生物相容性、一定机械强度和稳定性。 3 磁性高分子微球的研究现状及展望 目前，磁性高分子微球的研究多限于实验室阶段和初步的应用，但其中仍有 一些成功应用的例子。如挪威的d y n m 公司开发了一系列的商品化磁性高分子微 球d ”a b e a d s 。该公司的系列产品已经成功地应用于微生物学、免疫学、分子生物 学、癌症研究等领域，同时还在美、英、德、日、澳等国建立了分支机构。另据 报道，澳大利亚联邦科学与工业研究组织( c s 玻o ) 成功研制了磁性离子交换树脂 珠粒，用于除去饮用水中的有机物，该产品即将实现商业化。但由于这些磁性微 球是用专利技术制造，价格昂贵，使用成本非常高，很难得到广泛应用。国内科 研工作者有关磁性微球的制各技术还处于探索阶段，尽管已有较多文献报道，但 浙江大学博士学位论文 面。用此法制得的磁性微球的粒径在7 4 0 0 n m 之间，且所制得的微球具有分散性 好、磁响应性强、生物相容性好、表面含有大量的官能团等特点。邱广亮等闭采 用琼脂为原料，将其融化后，加入适量的f e c l 2 和h 2 0 2 ，搅拌均匀，滴加n a o h 溶 液，制得了粒径为2 0 。3 0 0 n m 磁性琼脂糖复合微球。安小宁等【2 7 】将磁粉和n a 0 h 溶液 均匀混合后，加入壳聚糖溶液，包埋磁粉，然后通过控制p h 值得到磁性壳聚糖微 球，其粒径的大小和溶液中壳聚糖的浓度成正比关系。b a h a r 【2 8 1 等将f e 3 0 4 粉末悬 浮分散于油相中，然后将油相倒入水相中并充分搅拌，在室温的条件下蒸发出油 相溶剂氯仿，制得带有醛基的聚苯乙烯磁性微球。d e k k e r 【2 铷将磁性粒子悬浮于聚 乙烯亚胺( p e i ) 溶液中，通过过滤，干燥处理得到外包p e i 的磁性微球。c u y p e r 等用卵磷脂包埋纳米磁性粒子，制得磁性脂质体微球，g u p t a 等口1 1 将磁性粒子与 牛瓶清清蛋白和棉籽油进行超声处理，然后加热至1 0 5 1 5 0 ，得到外包牛阻清清 蛋白的磁性微球。 共混包埋法制备磁性高分子微球的优点是原理简单，操作方便，且颗粒表面 本身所含的活性功能基团得以保留，不足的是所制得的磁性微球颗粒大小难以控 制，粒度分布宽、形状不规则、颗粒的磁性不均匀，且包埋过程中，为了颗粒均 匀，往往使用乳化剂，因此，制各的磁球中常含有乳化剂等杂质。因此这一类割 备方法得到的磁性高分子微球限制了在生化分析等领域的应用。 2 聚合法 聚合法制备磁性微球是指在磁性粒子和聚合单体、共聚单体存在下，在引发剂、 表面活性剂、稳定剂的作用下，共聚单体以磁性颗粒为种子，在磁性颗粒的表面 发生聚合，形成以磁性粒子为核，聚合物为壳的核壳结构微球。这种方法是制备 磁性微球的最常用的方法，这种制备方法的优点是可以制得粒径均匀、表面活性 官能团多样的磁性微球。通常根据采用的聚合途径的不同，可以将聚合法制各磁 性微球分为悬浮聚合、乳液聚合、分散聚合、辐射聚合等，以下就各种聚合方法 分别进行阐述。 2 1 悬浮聚合法 悬浮聚合是指在磁粉、悬浮稳定剂、水存在的条件下，将溶解有引发剂的单 体在强烈的搅拌下或通过均化器分散均匀，以小液滴状态悬浮于水相中，依靠引 发剂的作用使一种或几种单体在磁性粒子表面发生共聚，将磁性粒子包裹在聚合 3 浙江大学博士学位论文 产物中。由于单体与聚合物共存时，聚合物与单体粒子间有粘性，为了防止粒子 相互粘结，体系中常加有分散剂作稳定剂，使粒子表面形成保护膜，此中分散稳 定剂对悬浮聚合产物的粒度大小具有决定性的影响。用于分散聚合反应的分散稳 定剂通常包括有机稳定剂和无机稳定剂。无机微细颗粒作为悬浮稳定剂的应用已 有很长的历史【3 “。在悬浮分散体系中加入无机微细颗粒分散稳定剂，微细颗粒可 以吸附在单体液滴表面，降低液滴的表面张力。通常通过这种途径可以制得粒径 较大的微球，一般粒径都大于2 0 0 “m 【3 ”。这种大粒径的微球很难在生化分析领域 得到应用。要获得具有使用价值的微米级的聚合物微球，必须强化含无机分散稳 定剂单体的分散作用。超声波和分散剂是减小单体和液滴尺寸的有效手段。通过 在悬浮聚合前期在反应体系中引入分散剂和超声波预处理分散单体，使单体形成 微小的液滴，以便在聚合反应中得到微米级的微球。何虹等f 3 4 1 研究采用铁黑颗粒 作为无机分散剂悬浮聚合制备苯乙烯一丙烯酸丁酯磁性微球，并引入超声波分散 聚合单体，能够明显地降低所得到微球的粒径，最终得到的磁性微球的粒径分布 出现三个峰值o 2 m 、2 5 址m 、3 0 岬。t s u m t a 【3 5 】将磁流体、单体、引发剂、分散 剂混合制得悬浮液，在搅拌的同时施加低频超声波分散，聚合得到粒径范围为 o 1 1 0 岬的磁性高分子微球，超声波的频率直接影响了其粒径的大小。阳承利等 口6 】开发了一种制备磁性高分子微球的喷流式悬浮聚合法。在疏水性f e 3 0 4 磁流体 存在下，采用喷流式悬浮聚合法制备了比较均一的磁性聚甲基丙烯酸酯微球，并 对制备的磁性微球进行了表面修饰，采用振动样品磁强计和扫描电子显微镜检测 了磁性微球的性能和形貌，与传统的聚合方法相比，采用该法制备的磁性微球的 尺寸为1 0 um ，且大小比较均一，表现出较高的比饱和磁化强度，红外光谱检测 表进磁性微球表面含有丰富的醇羟基。万惠文等【3 7 】利用磁粉、s t 、d v b 为原料， p 、m 为分散剂，采用悬浮聚合法和超声波技术相结合，合成粒径为1 哪左右的微 球。t o k u o k a 等【3 8 】采用悬浮聚合法合成出苯乙烯为外壳的磁性微球，并研究了颗粒 大小与聚合条件的关系。m a r g e l 等 3 9 】利用悬浮聚合法制得了粒径范围为0 0 3 岍 8 0 肛m 的磁性聚丙烯醛类微球，并对其袁面醛基、羧基及双键含量进行了测定。 d a n i e l 等【4 0 】采用悬浮聚合得到了粒径范围为o 0 3 心l 一5 “m 的憎水性高分子微球， 但用此法合成的微球，磁性无机微粒往往出现在微球的外壳。c h a m o t 等【4 1 】采用悬 浮聚合合成了粒径范围为0 0 5 肚m 1 0 m 的憎水性交联复合磁性微球，其磁性微粒 浙江大学博士学位论文 集中于复合磁性微球的内部，壳体几乎不含磁性微粒。但所得微球中有大于1 0 的不含磁粉的“空白”微球，需在磁场下分离加以除去。 悬浮聚合法制备的磁性微球存在着明显的缺点，微球粒径分布较宽，不均匀， 很大程度上限制了磁性微球在生化领域的应用。目前采用悬浮聚合法制备磁性微 球不是一种理想的备选方法，较多的研究工作主要集中在乳液聚合法和分散聚合 法。 2 2 乳液聚合法 乳液聚合是指乳化剂在机械搅拌的作用下，单体在水中分散成乳状液进行聚 合的方法。这种聚合法通常以水为分散介质，价廉安全，乳液的粘度低，有利于 搅拌及传热。采用这种技术制备磁性微球，选择有效的分散技术、适当的分散介 质与表面活性剂的种类，是形成微球的关键。乳液聚合是目前合成磁性高分子微 球的最常用方法之一，乳液聚合法又可分为有乳液聚合法、无皂乳液聚合二种。 利用单体聚合制各具有磁性的高分子微球，关键在于既要确保单体聚合发生 在磁性粒子表面，又要赋予生长中的复合胶乳粒子一定的稳定性，以避免因磁相 互作用导致微球破乳凝结。直接利用苯乙烯的乳液聚合，由于成核区域是胶束， 得不到我们所要的磁性高分子微球。因此，要想获得磁性高分子微球，必须加入 乳化剂并控制乳化剂的浓度低于单体的临界胶束浓度，使其既不能形成临界胶束 又可以稳定聚合过程形成复合胶乳粒子。所以乳化剂的选用以及加入的量是一个 非常重要的环节。在反应体系中，乳化剂主要存在于初始粒子表面，可使更多的 单体进入到初始粒子里面，加快聚合反应的速度。此外，表面乳化剂的加入可以 增大初始粒子的稳定性，减少粒子间的聚集，使生成的磁性微球的粒径均匀，在 磁性种子表面营造两亲性结构，合成磁性高分子微球的关键是在磁性种子表面产 生聚合引发点，形成理想聚合场所。同时，聚合单体的加入方式也直接影响微球 的均一性和成球的大小。如果将聚合反应单体一次性全部加入，在反应初始阶段， 磁流体周围单体浓度较高，反应速度较快，产生的初始粒子数较多，则微球的粒 径变小；如果将聚合单体分步加入，则在反应初始阶段磁流体周围单体浓度降低， 反应速度变慢，产生的初始粒子数变少，则微球的粒径增大。高兰萍【蚓等采用乳 液聚合法，在磁流体存在下对苯乙烯、二乙烯基苯和丙烯酸进行三元共聚反应， 得到含f e 3 0 4 的粒径范i 鲴在0 0 6 o 0 7 “m 的磁性聚苯乙烯微球，该微球粒径分布 1 0 浙江大学博士学位论文 窄且，外观呈球形，内部为多相构造，磁响应强和良好的机械强度。s 0 1 c 【4 3 】在分散 有磁性粒子的水相体系中乳化单体，得到稳定的乳化体系，然后应用聚合得到了 胶体尺寸的疏水磁性高分子微球。邱广明等【4 4 1 利用乳液聚合法，制备出单分散的 亚微米级磁性微球，研究了分散介质、单体、种子粒子及p h 调节剂等因素对聚合 行为和磁性微球影响。邱广明等【4 5 】对乳液聚合法进行了改进，采用先吸附后溶胀 的方法，在磁性微粒表面形成良好的聚合环境，得到了单分散性好，又具有良好 机械稳定性和耐酸性的磁性高分子微球。安丽娟等【4 6 l 用乳液聚合法制备了超顺磁 性的高分子微球。首先采用化学共沉淀法制各了f e 3 0 4 纳米微粒，并用油酸和十二 烷基磺酸钠为双层表面活性剂进行表修饰，制备了稳定的水分散性磁粒，再加入 苯乙烯与甲基丙烯酸进行聚合反应，用超导量子干涉仪对微球进行表征，合成的 磁球具有超顺磁性，此外用红外光谱及x 射线衍射仪表征了磁班干部的化学成分 和晶体结构，用热失重方法测得磁球中磁含量为2 3 6 常规乳液聚合法的特点是制成的磁性微球的单分散性好，但产物中存在乳化 剂，限制了微球在生物医学领域的应用，因此人们又开发了无皂乳液聚合技术， 它是一种不含乳化剂或仅含微量乳化剂( 其浓度小于临界胶束浓度) 的乳液剂和 技术。 谢钢等【47 】采用无皂乳液聚合法制备了表面带羧基的、粒径范围为8 0 2 3 0 n m 的 磁性微球，研究了介质的极性对磁性高分子微球的单分散性的影响。在一定范围 内随介质极性的降低，磁性高分子微球的单分散性提高。k o n d o 等制备了热敏 性的磁性高分子微球，用扫描电镜和透射电镜观察胶乳微粒的形态和分布，动态 光散射法测定流体动力学直径，热重法分析磁含量，发现随磁性微粒和聚合单体 重量比的提高，磁性胶乳微粒的流体动力学直径则明显减小。h w e e 等【4 卅采用一步 无皂乳液聚合技术，合成出平均粒径为3 0 m 的磁性高分子微球，并对其平均粒径 和粒径分布、表面羧基含量、磁含量、酸碱稳定性进行了测定，实验发现用丙烯 酸钠代替甲基丙烯酸不但能提高磁性微球的单分散性，还能提高其表面羧基含量。 为了得到粒径均匀的单分散磁性微球，还可以选择加入无机稳定剂。魏树礼等5 0 在制各聚乙烯醇磁性微球时加入了无机材料硫酸钡作为分散稳定剂，不仅有利于 聚合过程的成球作用，而且使最终得到的微球密度适当，易于分散使用。 2 3 分散聚合法 浙江大学博十学位论文 当磁性高分子微球用于细胞分离等领域时，为了能在磁场下快速分离，希望 利用粒径大于lu 证的磁性高分子微球。而乳液聚合法制得的高分子微球粒径较 小，很难得到粒径为微米级的微球，分散聚合法则能弥补这一不足，而且该方法 是向微球表面引入功能基最为简便的方法。 分散聚合法是指由溶于有机溶剂( 或水) 的单体通过聚合生成不溶于该溶剂 的聚合物，并形成胶态稳定的分散体系的聚合方式。由于分散聚合体系粘度较低， 混合和传热较容易，温度易于控制，可避免局部过热，通过这种方法制备磁性微 球方法简便，条件温和，制得的微球单分散性好，粒径比较均匀。在合成体系中， 磁性种子用量、单体用量、分散剂用量和种类、分散介质等因素对分散聚合行为 及最终产物的性质都有一定的影响，其中以分散剂用量和分散介质对合成影响最 大。 分散稳定剂对聚合能否成功进行起关键作用。在分散聚合中，分散剂是通过对 在分散介质中不断生长的高分子链的隔离起分散稳定作用的。因此，分散剂必须 满足易溶于分散介质的要求。聚乙二醇是一种理想的分散聚合稳定剂，它主要是 依靠大分子链的立体效应来起稳定作用的。大分子链在分散介质中溶解并舒展开， 在分散介质中形成许多微小的反应区域，引发剂分解产生的自由基就在这些区域 中引发单体聚合，当反应进行到一定程度以后，聚合产生的高分子链就在搅拌作 用下缠结成球。因此，在高分子微球中通常含有分散剂的大分子链，这也有利于 微球的稳定。另外，分散介质的组成也是影响分散聚合反应好坏的一个重要因素。 常用的乙醇一水分散介质体系中，当乙醇的用量增加，体系的极性和溶解度参数均 降低，对单体和反应初期形成的聚合物的溶解度增加，使反应初期聚合物颗粒数 减少，并最终使得到的微球的粒径变大，范围变宽。因此，选择一个合适的分散 介质体系对于获得粒径均匀合适的微球是很重要的。 史俊杰【5 ”等改进分散聚合的配方和条件，以水和乙醇为分散介质，制得粒径在 3 4 肛1 之间的微球。景晓燕酬研究采用分散聚合法苯乙烯一丙烯酸一丙烯酰氨三 元共聚制各磁性微球，经红外光谱的表征，所制的磁性微球表面含有氨基，同时 还表现出粒径小，粒径分布范围较窄，保存非常稳定的特点。孙宗华等5 3 巧5 1 利用 分散聚合法，以水乙醇为分散介质，合成了含有一c 0 0 h 、c h o 、一o h 等不同 表面功能基的核一壳型磁性复合胶乳微球，并研究了分散介质、引发剂、聚合单体、 浙江大学博士学位论文 种子粒子等因素对复合微球形成的影响。邱广明等研究采用分散聚合法制备含 有羧基官能团的磁性微球，该种微球显示出磁响应性强、表面含有丰富的羧基的 特点。 黜c h a r d 等【5 7 】在磁流体、有机溶剂、单体、稳定剂、共稳定剂、引发剂共存的 条件下利用分散聚合法合成了粒径范围o 1 5 岬，磁含量0 5 5 0 ，粒径分布标准 偏差不大于1 5 的单分散性疏水磁性高分子微球。实验发现，要成功制得单分散 微球必须满足以下条件：成核阶段快，所有核应同时形成；在微球成长的阶段， 连续相中的所有齐聚物自由基在达到l 临界凝聚尺寸之前，必须被体系中已经存在 的微球所捕获，以避免形成新的微球；在微球的成长阶段必须避免微球问彼此的 凝聚。 3 原位法 原位法是首先制得致密或多孔聚合物微球，然而将其浸渍在金属离子溶液中， 如f e 3 + 或者f e 2 十离子溶液，当这些金属离子完全渗透进多孔微球内部以后，加入强 碱，使得微球内部的金属离子形成具有顺磁性的金属氧化物，这样就制得既具有 磁性又具有生物活性的磁性微球。通过这种途径制得的磁性微球具有粒径较小而 且均匀，表面活性基团丰富的特点，微球中磁含量均匀而且容易控制，但同时也 有磁响应性相对较弱的缺点。 u g e l s t a l l d 等【5 8 】用此法制备出了商品化的磁性高分子微球( d ”a b e a d s ) ，该方 法首先合成多孔聚合物微球，此微球含有可结合铁盐的基团( 如与铁离子形成配位 键的_ n h 2 、n 0 2 等含氮基团或者可与铁离子等形成离子键的环氧基、一c o o h 、 一s 0 3 h 、o h 等基团等) ，依靠聚合物微球在金属盐溶液中的溶胀、渗透、提高 溶液的p h 值，以及功能基团与金属离子的作用来制备磁性高分子微球。例如，如 含有n h - n h 2 等还原性基团，可加入三价铁盐，使其还原雨制得磁性高分子微 球；如含有n 0 2 、o n 0 2 等氧化性基团，可加入二价铁盐，使其氧化而得到磁 性高分子微球。如含有_ n h 2 、一0 h 、一c o o h 等能与铁形成配位键或离子键的 基团，可直接加入合适比例的二价和三价铁盐溶液，使聚合物微球在铁盐溶液中 溶胀、渗透，再升高温度和p h 值，制得磁性高分子微球。康继超5 明等首先采用两 步法合成出大粒径、单分散聚苯乙烯微球，然后用硫酸亚铁溶液浸泡，并用浓氨 水处理和浓硝酸作硝化处理，就得到具有良好顺磁性的微球。 1 3 浙江大学博士学位论文 用原位法制得的磁性高分子微球具有以下几个优点：( 1 ) 由于磁性微球的单分 散性取决于聚合物微球本身的大小和粒径分布，。磁化过程中不会改变，所以磁性 微球的单分散性好；( 2 ) 由于聚合物微球在溶液中所处的环境完全相同，因此制得 的各微球的磁含量也相同，从而在磁场环境下微球具有致的磁响应性；( 3 ) 当聚 合物微球直径在o 5 2 0 “m 时，即微球本身有厚的多孔性聚合层，可制各磁含量大 于3 0 的高磁含量微球。 第三节磁性高分子微球在生化医学领域的应用 由于磁性高分子微球具有较大的比表面积、磁导向性和生化活性等独有的特 点，在生化分离、医学检测和医学等领域具有潜在的应用前景，引起了广大科研 工作者的极大兴趣。一方面，磁性微球具有磁导向性，是一种很好的载体，可以 在磁场的作用下准确地定位，将磁性微球和一些药物结合制得的磁性药物微球就 可以实现定向给药。另一方面，由于磁性微球具有很强的磁响应性，当微球表面 修饰上抗体、寡核苷酸等生物探针，能快速将靶向目标物结合在磁性微球表面， 在磁场作用下，微球和底液能很方便地分离，大大缩短了样品的分析时间，这一 新颖的分离方法克服了传统分离方法的不足，使分离效率大大提高，同时磁性微 球应用于生化分析工作中，还能使样品中的痕量组分最大限度地富集起来，使分 离和富集过程同步进行，非常适合应用于样品中痕量组分检测，尤其对于大批量 样品的分离检测，磁性微球更是表现出优越性，并能实现自动或半自动操作。将 磁性微球的强分离特性和一些生化检测手段相结合，能够大幅度提高灵敏度，并 使检测效率大大提高。目前，在国内外的文献报道中，磁性微球已被应用于靶向 药物、固定化酶、细胞分离、免疫分析、d n a 的分离与检测等多个领域。 l 靶向药物 现行所有治疗肿瘤的方法和药物在治愈肿瘤的同时，对入体正常组织细胞的 损伤和破坏也很严重。传统的给药方式主要有口服与注射，口服给药由于受肠胃 上皮细胞和肝脏中的各种酶的降解和代谢作用的影响，许多药物在到达病变组织 之前已经被代谢分解；尤其是新近发现的用于疾病预防和治疗的多肽与蛋白质， 由于能被胃肠道迅速消化降解，药物的利用率很低，另外用于治疗肿瘤的传统剂 1 4 浙江大学| 尊士学位论文 型药物在给药后会形成全身系统性分布，靶向性差，毒性相对较大，治疗指数低， 疗效差，需要多次服药或注射，给病人带来不便和痛苦。要想提高化疗的疗效， 提高病人的康复效率，就必须改变给药途径。 靶向给药是一种全新理念的给药方式，它是以磁性高分子微球为载体，将药 物包封在其中，吸附在高分子层或偶联在表面，通过口服或注人体内，利用外加 磁场引导载药微球到病患处集中并缓慢释放，定向作用于靶组织。靶向给药可使 靶区药物浓度高于正常组织，减少药剂量和药物毒副作用，提高药效。目前已引 起国内外科研工作者的高度重视，成为当今医学学科发展的前沿唧1 ”。 理想的磁性微球应具有良好的磁响应性、在外磁场的作用下，经过靶部位的 载体能全部停筐在靶部位，能自由通过最小内径的毛细血管，不会发生异位栓塞 和滞留，不被网状内皮系统的巨噬细胞所吞噬。 g h a s s a b i a n 等【“j 将地塞米松和f e 3 0 4 包埋于自蛋白微球中，用于治疗淋巴细胞肿 瘤。h a f e l i 等【6 3 】用磁性聚乳酸放射性微球靶向治疗肿瘤细胞，进行了体外和体内放 射效果研究，实验发现，进人体内后在外磁场作用下使微球聚集于病变部位，可 提高靶区内的药物浓度，从而提高疗效，减少用药剂量，降低全身毒副作用。 m o r i m o t o 、w i d d e r 、s e n y e i 等人 6 4 邯6 制备的磁性微球粒径多为l 3 m ，磁响应较 弱，即使加了强大的外磁场，磁性微球还是很难正确定位。由于米托葸醌对乳腺 癌具有突出的疗效，但对心脏有较大毒性，如何降低毒副作用，提高疗效是摆在 医学工作者面前的难题。张志荣等【6 7 】尝试将聚合得到的微球同时固载药物米托蒽 醌和白蛋白，将制得的米托葸醌白蛋白微球和抗人乳腺癌单克隆抗体进行交联制 成纳米微球，以提高药物对肿瘤细胞的选择性，达到提高疗效、降低毒副作用的 目的。m o r i m o t o 等【6 8 】通过动物实验发现，在没有磁场的作用下，药物主要药物主 要积聚在肝脏，而在磁场作用下，通过静脉注射磁性微球却转移到放有磁场的肺 部，使药物在肺部的浓度大大提高，可望用以提高治疗的效果。l a n n o n i 等【删报道 在外界磁场的作用下，5 0 r 8 0 的微球定向到病变区，而无外界磁场时只有2 0 的微球可到达病变区。林世寅等【7 0 】将纯铁粉、丝裂霉素c 共埋于人血清白蛋白载体 中，制成大粒径的磁性微球，对此微球的体外释放研究表明，实验结果证明这种 铁磁性药物微球同时具有药物缓释和栓塞两种作用，微球中的丝裂霉索在前两小 内释放5 0 ，2 4 小时内累积释放7 0 ，在肿瘤局部维持持久、恒定的药物浓度， 浙江大学| 尊士学位论文 同时，这种微球还有栓塞肿瘤阻断营养的作用，从而提高肿瘤药物的治疗效果。 阿霉素也是治疗肿瘤化疗的主要药物，但其毒性很大，如心脏毒性、脱发、恶心、 呕吐等副作用，甚至还会影响造血功能，基于此原因，导致很多病人往往不能坚 持整个化疗过程，不得不放弃治疗。为了解决这个问题，医学工作者想到用磁性 微球固载药物，通过靶向给药，降低药物剂量，达到治疗的目的。陶凯雄等j 利 用加热固化蛋白质的原理制备出磁性蛋白微球，并在微球上固载上阿霉素，用毒 理学方法研究结果体外抑制肿瘤细胞的疗效，结果发现该药剂型的改变未影响其 体外药理作用，与磁场联用可以使化疗达到高效低毒的作用。吴传斌等【72 】采用乳 化交联技术，以明胶、磁流体、阿霉素为原料，制得磁性药物微球，将药物微球 通过动脉导管注入到动物体内，微球在外磁场的作用下定位于靶位，所含的阿霉 素则定位释放，达到高效低毒的目的。陈秀丽等1 73 】由纳米磁粒子、壳聚糖和抗癌 药物包埋制成药物磁性微球，通过动物试验，发现靶向组肺组织中的百分率高于 其他组，磁场距离的改变对靶向药物在肺组织中浓度的分布有很大影响，磁场加 载时间对其影响较小。g u p t a 等【7 4 】实验发现磁性微球载有l ，3 的剂量的药物，在靶区 的浓度是自由药物的8 倍，而且在非靶向区域( 肝、心脏) 的药物浓度明显降低。 总之，用于靶向药物的磁性高分子微球必须满足一定要求：( 1 ) 具有生物降解 性，载药微球及其降解产物无毒或毒性极低；( 2 ) 具有一定的缓释性；( 3 ) 具有最大的生 物相容性和最小的抗原性。 2 酶的固定化 酶的固定化技术已在食品工业、精细化学品工业、医药工业等行业得到广泛 应用，甚至在废水处理方面也采用了此项技术。用酶技术生产化工产品，条件温 和，无三废产生，随着人类对环保的日益重视，酶的应用会更受关注。酶的实质 是一种生物蛋白质，它作为生物催化剂在工业上有非常广泛的用途。然而酶在使 用过程中，出于各种因素容易失活，而且，由于酶被使用后无法与底液分离，酶 的效能不能够得到充分的利用，生产成本居高不下，也不利于工业连续化生产。 磁性高分子微球的出现，为酶的工业化应用打开了一个全新的思路。磁性高分子 微球作为酶的固定化载体有两大优点：一是通过外加磁场可以很方便地把酶从反 应体系中分离和回收，因此固定化的酶可重复使用，降低成本，适合大规模工业 化生产；二是用具有表面功能基团的磁性微球固定酶，通常能保证酶的活性不受 1 6 浙江大学博士学位论文 影响，而且可以提高酶的稳定性，改善酶的生物相容性，因此，磁性微球在工业 化生产方面有广阔的应用前景。 r j m c h 【7 5 】将脱氧核糖核酸酶固化在亲水性磁性微球表面，实验发现，固化酶的 活性比游离态酶的活性高，将固化酶用于染色体d n a 的降解，使用2 0 次后仍有 活性，同时还发现，二价阳离子( 如m 酽+ 、c a2 + 、m n 2 + ) 的存在对固化酶有活化 作用，但与c 0 2 + 作用，活性却有所下降。邱广明等7 印利用吸附交联法，在磁性 胶体粒子表面固定a s l 3 9 8 中性蛋白酶，可以制备出活性达2 5 0 0 u g 的磁性固定 化中性蛋白酶，由于a s l 3 9 8 中性蛋白酶稳定性差，易失活，使用很不方便，但用 磁性微球固定化酶后却增加该酶的稳定性，扩大使用范围，提高酶的利用率，降 低生产成本，可望应用于工业化生产中。邱广亮等【7 7 1 用吸附交联法将a 一淀粉酶 固定在磁性胶体粒子上，固定化酶的活性达3 4 0 0 0 u 幢，活性回收率为3 7 7 ，实 验证明，固定化酶对酸、碱、热的耐受性都大大提高，使贮存过程变得容易。邱 广亮等l 7 8 j 以明胶包埋磁性氧化铁制备出稳定的磁性明胶复合微球，并用于酶的固 定化研究，研究了固化酶的反应条件，发现固定在磁性微球表面的酶相比游离态 的酶，其稳定性有显著提高。黄惠华口9 】等用磁性微球吸附分离菠萝皮汁中的蛋白 酶，回收率达6 1 ，9 6 ，酶活性高达3 8 o u 儋。用该法回收菠萝蛋白酶非常方便。 而且固定化磁性菠萝蛋白酶的热稳定性具有显著地提高，常温下半衰期为2 8 天左 右。安小宁等【8 0 】采用壳聚糖包埋磁粉，经戊二醛修饰、环氧氯丙烷交联制得高磁 性壳聚糖微粒。此微粒共价结合卵清粘蛋自得到磁性亲和吸附剂，应用于胰蛋白 酶的亲和纯化，纯化倍数为1 5 6 ，活性回收率为4 2 1 。任广智等用化学共沉 淀法得到磁性壳聚糖微球，结果表明，磁含量2 0 4 ，平均粒径为2 0 0 4 0 0 “m ， 而用环氧氯丙烷活化的磁性壳聚糖作载体，对脲酶进行固定化，在常温下，对脲 酶的固定化在2 小时内就达到了最大值。 在固定化酶的方式中，有吸附、包埋和化学交联。吸附是指在范德华力的作 用下，酶被物理地固定在载体的表面。通过这种方法固定的酶的活性受到的影响 最小，也是最容易的一种制备固定酶的方法，但通过物理吸附固定的酶不是很稳 定，在使用过程中，由于外力的作用，载体表面的酶很容易从载体表面脱落下来， 造成酶的流失。包埋是指在制备微球的同时，将酶直接包在微球的多孔性结构里 面，通过这种途径固定的酶很多活性点被遮盖而不能充分和底液接触，从而使酶 浙江大学| 尊士学位论文 的催化活性受到较大的影响。化学交联法是指表面带功能基的磁性微球，在偶联 剂的作用下，可以和酶表面的氨基作用形成稳定的肽键，从而使酶能够稳定地固 定在磁性微球的表面。为了防止酶表面的活性中心受空间位阻影响，通常在磁性 微球表面引入一个“空间臂”，如戊二醛、多肽等。然后，在空间臂上固定酶。 通过这种方法固定的酶基本上可以克服空间位阻的影响，而且固化在磁性微球的 表面的酶非常稳定，流失很少，提高酶的利用效率。 3 生化样品的分离和提纯 、 3 1 细胞分离 目前。医学已进入分子生物学时代，细胞的高效分离已成为生物细胞学研究 中一种十分重要的技术，在医疗临床诊断上有广泛的应用。例在临床治疗中，病 人自身骨髓移植已成为某些患有急性白血病、霍奇金氏病和非霍奇金氏淋巴瘤、 神经母细胞瘤的可选疗法，但自身骨髓移植也受到一定的条件限制，如残存的癌 细胞会将骨髓移植试验失败，因此在体外清除骨髓中的癌细胞是保证自身骨髓移 植成功的必要条件。在体外净化骨髓的方法中，用磁性微球物理地清除癌细胞具 有安全、效果好、操作简便的特点。磁性微球净化骨髓的原理是将需要净化的骨 髓在体外和包被有单克隆抗体的磁性微球混合，形成特异性探针分子，然后磁性 微球可以通过表面的单克隆抗体与骨髓液中癌细胞作靶向结合，形成微球一抗体 抗原免疫复合物，将此骨髓、微球的混合物通过外胃有磁场的磁分离装置，与磁 性微球结合的癌细胞就会被滞留，被净化的骨髓自然流下。最后就可以将干净的 骨髓输回到自身骨髓移植病人体内，大大降低癌细胞因骨髓移植而引起的转移， 提高病人骨髓移植手术的成功率。该设想已在动物实验中试验成功，康继超等【8 3 】 研究采用物理吸附结合化学键共价结合的方法，将抗人膀胱癌单克隆抗体连接到 磁性微球的表面制得免疫磁性微球，用于从动物骨髓中分离癌细胞，实验发现此 法可以有效地清除癌细胞，丽骨髓细胞仅有很少量的损失。b i e r k e 【8 4 】用具有生物活 性的磁性微球分离、纯化人血中嗜碱细胞，取得了良好的结果。长期以来，嗜酸 性粒细胞的分离多采用不连续的密度梯度离心法，但是由于外周血中嗜酸性粒细 胞的含量较少，约为白细胞的o 5 5 ，而且其密度范围与中性粒细胞部分重叠， 因此高度纯化外周血中嗜酸性粒细胞有一定的难度。李一荣等研究采用免疫磁 性微球阴性选择法分离富集外周血中嗜酸性粒细胞。其过程是在磁性微球表面包 1 3 浙江大学博士学位论文 面，形成特定序列d n a 探针，将修饰好的磁性微球和已经作变性处理的待测d n a 样品杂交反应，然后经酶、荧光物质、电化学发光物质、电活性物质衍尘化处理， 用相应的检测手段，可以大大地降低检测下限。将磁性微球与核酸杂交法相结合， 这一方法的优点是：由于磁性微球的体积较小，一般在微米级和纳米级，表面固 化容量大，反应过程中磁性微球集分离与富集于一体，故分离富集能力强，在外 磁场引导下，磁性微球很快与本底溶液分离，分离效率得以极大地提高，因此检 测下限大大提高，对于高危传染性疾病如艾滋病、肝炎等疾病和遗传性疾病的早 期诊断具有非常重要的意义。 鉴于磁性微球在生化分析中表现出分离富集能力强，操作简便，易实现流动 检测和自动分析的特点，国外科学家已经尝试将结合磁性微球丌发一种能够快速 诊断、检测生化武器试剂的技术并获得一定的成功。e d e l s t e i n i 驯将d n a 杂交技 术、磁性微球标记技术相结合研制了一种磁性微珠阵列传感器，可用于快速检测 生物战剂，理论上这神检测器芯片能够瞬时检测上千个样品，其检测灵敏度达到 单分子检测的水平。w a n g 【”o 卅研究小组对此进行了大量的研究。他们将探针 d n a 通过生物素一亲和索结合在磁珠表面，与标记有二茂铁分子的靶向d n a 进 行杂交反应，在外加磁场作用下，将磁珠富集之后用乙腈溶解磁性微球，用计时 电位滴定法检测其化学信号。在5 0 此样品中，采用计时电位滴定法最低可测得靶 向d n a 的浓度为5 1 1 0 。2 1 m 0 1 【10 0 1 ，相当于3 1 0 0 0 个分子，当2 0 倍浓度的非互补 的核酸与探针反应测定时，所得信号非常微弱，该法以极灵敏的放大信号为特点， 能检测溶液中超痕量的d n a 片段，并能很好地区别互补和非互补的d n a 片段， 为检测单链d n a 提供了一种超灵敏的分析手段。w a i l g 【埘】还提出另外一种检测方 案，将d n a 探针固化在金包铁的磁性微球表面，与固化在高分子微球的靶向d n a 杂交，在外加磁场作用下，将磁珠富集之后用h b r b r 2 溶解磁性微球，采用悬汞电 极用溶出伏安法测定f e ”离子浓度，测得靶向d n a 的最低浓度为2 0 幽l 。杨清 娟等埔戊二醛将氨基修饰的短链d n a 探针固定子氨基微球表面制成核酸传感 器，传感器与生物素标记的d n a 杂交，再利用亲和素生物素偶联系统，偶联上 亲和素标记的碱性磷酸酶，碱性磷酸酶催化底物d 一萘酚磷酸酯水解形成具有电化 学活性的- 萘酚，用示差脉冲伏安法测定杂交结果。应用这种方法测定短链d n a 片断的浓度的线性范围为1 0 1 0 0 0 肛g l ，并成功测定了乙型肝炎病毒h b v e i n a 片 浙江大学博士学位论文 断。马丽等1 0 6 】利用自组装单分子膜技术，将巯己基修饰的具有乙肝病毒( h b v ) d 咐a 序列特异性的单链d n a 探针固定在余电极表面，制得d n a 电化学传感器； 以电活性的h o e c h s t3 3 2 5 8 为指示剂，考察了该传感器对血清样品中乙肝病毒d n a 的响应，所得的检出限为1 “班；探讨了d n a 电化学传感器在临床检钡中的应用； 将传感器法与荧光聚合酶链反应( p c r ) 法进行对比，两者的分析结果具有一致性。 从试验中得出d n a 电化学传感器具有较好的特异性、重复性，且不需要p c r 扩 增。同时有利子集成化，实现多基因同步检测的目的。 4 2 免疫分析 免疫分析是利用抗体与抗原的特异性结合作用来选取选择性识别和测定可以 作为抗体或抗原的待测物。抗原与抗体反应的特异性和专一性决定了免疫反应具 有很高的选择性晰。吲。所有的免疫分析都是基于测定识别位点的结合率，即直接 或间接测定未结合位点数或测定结合位点数。根据反应性质可分为竞争性免疫分 析和非竞争性免疫分析，根据抗原抗体反应过程中是否分离可分为均相免疫分析 和非均相免疫分析。免疫分析的其中一种类型是竞争性免疫分析是测定样品未结 合的位点数，一般是将样品与已标记待测物混合后再去竞争结合位点，再将复合 物与游离抗原或抗体分离后测定其相对量。在实际分析中，抗原或抗体中的一种 被包被在载体上，当加入样品和一定量标记抗原后，样品中未标记抗原和外加的 标记抗原竞争结合于抗体所提供的点位上，然后测定固相载体上的标记物的含量， 从而测出样品中的抗原含量。由于加入的标记抗原浓度是一定的，当样品中抗原 含量越高，能够竞争结合在固相抗体上的标记抗原越少，最终检测出的标记物含 量与样品中的抗原含量成反比关系。免疫分析中另一类反应是夹心反应，该反应 是将待测物由某种抗体捕获而从样品中分离出来，再与过量的第二抗体结合在一 起形成夹心模式复合物。在实际分析中，第一抗体固化在固相载体上，加入待测 抗原，反应后，洗去游离抗原，再加入带有标i 己的第二抗体，形成夹心式免疫复 合物，通过对夹心复合物上的标记物的测定可以计算出样品中抗原的含量。根据 免