（分析化学专业论文）水杨基荧光酮在生化分析中的应用.pdf

摘要 略 ,3,7一三 。 基 一9一取 代 苯 基 荧 光 ， 、 三 。 基 荧 光 酮 ) 类 试 剂 是 一 类 高 灵 敏 显 色剂，广泛应用于无机离子的光度分析中，但是在生化分析中应用较少，本论 文将三轻基荧光酮类试剂中的水杨基荧光酮作为辣根过氧化物酶及其模拟酶的 氢供体底物进行研究，并测定了人体血液中的葡萄糖含量。利用水杨基荧光酮 是一种良 好的显色剂，提出了测定盐酸环丙沙星，氟呱酸以及异胭脱的新方法， 并 应 用 于 市 售 药 齐。 ) 一 论文共分为五部分: 第一章:综述了三轻基荧光酮类试剂在无机离子分析、药物分析以及生化 分析中的应用并在介绍酶法分析的基础上，探讨了三轻基荧光酮作为过氧化物 酶底物的理论基础。 第二章: 将水杨基荧光酮作为辣根过氧化物酶的 底物，用于测定h 2 0 2 ， 进 一步与葡萄糖氧化酶反应偶联，测定了人血清中的葡萄糖的含量。 第三章:以水杨基荧光酮作为氢供体底物，研究了氧化血红素在阴离子表 面活性剂十二烷基苯磺酸钠存在下的催化性能。 第四章:在阳离子表面活性剂十六烷基三甲基滨化按存在下，利用水杨基 荧光酮与把( i i ) 的显色体系提出了盐酸环丙沙星和诺氟沙星的新方法，并对反应 机理进行了讨论。 第五章:在十六烷基三甲基滨化铰存在下， 利用水杨基荧光酮与t( i i ) 的显 色体系测定了抗结核药物异胭脱。 关键词: 水 杨 基 荧 ja ph .氯化血红素、 、 十 二烷基苯磺酸钠、辣根过氧化物酶、十六烷基 三 甲 基 、 化 。 、 盐 酸 环 丙 旅、 诺 氟 沙 星 、 e (ii)、 异 胭 。 。 ab s t r a c t a s a s e n s it i v e d e v e l o p i n g d y e s , 9 - s u b s t it u t e d - 2 , 3 , 7 - t r i h y d o x y fl o u r o n e s w e r e e x t e n s i v e ly a p p l i e d i n t h e i n o r g a n i c i o n i c a n a l y s i s , b u t s e l d o m i n b i o c h e m ic a l a n a l y s i s i n t h i s p a p e r , w e u s e d s a l i c y l fl u o r o n e a s a s u b s t r a t e o f h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e a n d it s i m it a t i n g o n e , d e t e r m i n e d t h e a m o u n t o f g l u c o s e i n t h e s e r u m . o n t h e o t h e r h a n d , w e p r o p o s e d a n e w m e t h o d s t o d e t e r m i n e c i p r o fl o x a c i n n o r fl o x a c i n a n d i s o - n i c o t i n y l h y d r a z i d e . t h e r e a r e f i v e c h a p t e r s i n t h i s p a p e r : 1 .i t i s a r e v i e w a b o u t t h e a p p l i c a t i o n o f fl u o r o n e r e g e n t i n b i o c h e m i c a l a n a y l s i s ( in c l u d i n g m e d i c a l a n a l y s i s ) ,a n d a n in t r o d u c t i o n o f e n z y m a t ic a s s a y s , e s p e c i a l l y h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e c a t a l y s i s s y s t e m 2 . s a l i c y l fl u o r o n e d e t e r mi n a t i o n wa s u s e d a s a s u b s t r a t e f o r 即p l i c a t i o n . h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e i n o f h y d r i d e p e r o x i d a s e , c o u p l i n g w it h g l u c o s e o x i d a s e , d e t e r m i n e d g l u c o s e i n s e r u m . mn t h e a n i o n i c m i c e ll a r m e d i u m o f s o d iu m d o d e c y l b e n z e n e s u l f o n a t e w it h o u t a d d i n g h y d r o g e n p e r o x i d e , w e s t u d i e d t h e c a t a l y t i c a c t i o n o f h e m i n o n o x id a t io n o f s a l i c y l fl u o r o n e b y o x y g e n d is s o l v e d i n w a t e r . 4 .1 n t h e c a t io n i c m i c e l l a r m e d i u m o f c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u m b r o m i d e , u s e d s a l i c y l fl u o r o n e - p a l l a d i u m ( i i ) c o m p l e x t o d e t e r m i n e c i p r o fl o x a c i n a n d n o r fl o x a c i n . 5 .i n t h e c a t i o n i c m i c e l la r m e d i u m o f c e t y lt r i m e t h y l a m m o n iu m b r o m i d e , u s e d s a l i c y l fl u o r o n e - p a l l a d i u m ( i i ) c o m p l e x t o d e t e r m i n e i s o - n i c o t i n y l h y d r a z i d e . k e y w o r d s : s a l i c y l fl u o r o n e , h e m i n , s o d i u m d o d e c y lb e n z e n e s u l f o n a t e , b r o m i d e , c i p r o fl o x a c i n , h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e , c e t y l t r i m e t h y l a m m o n iu m p a l l a d i u m ( i i ) , is o - n i c o t i n y l h y d r a z i d e . n o r fl o x a c i n , 绪论 第一章 绪论 2 , 3 , 7 一 三轻基一 9 一 取代苯基荧光酮 ( 三轻基荧光酮) 类试剂是一类高灵敏 的显色剂，广泛地应用于无机离子的光度分析中n -0 1 。特别是表面活性剂的加入， 不仅进一步提高了灵敏度和选择性，使其在较高的酸度下可以直接测定高价的 金属离子，而低价离子不干扰，另外体系更稳定，结果的重现性更好，三1 i 基 荧光酮类试剂、金属离子、表面活性剂所组成的一些体系在矿石和合金的金属 离子测定中是非常实用和有效的。 夸 1 - 1三经基荧光酮类试剂的结构和性质 水杨基荧光酮 ( s a l i c y l f l u o r o n e ) ，又名邻轻基苯基荧光酮 ( o - h y d r o x y p h e n y l f l u o r o n e ) ，属三轻基荧光酮类试剂，分子量: 3 3 6 . 0 2 ， 结构式如 图1 - 1 所示: 图1 - 1 . 水杨基荧光酮的结构式 f i g . l 一 1 . t h e s t r u c t u r e o f s a l i c y 1 fl u o r o n e 从结构上看， 其具有刚性、共平面的结构特点， 另外其共扼大兀 键的结 构有利于电子的传递，增强了拨基的活性，使其易与金属离子形成有色的络合 物，而对无机金属离子进行测定。 绪论 随着溶液酸度的改变， 水杨基荧光酮存在着酸碱平衡， 见图 1 - 2所示: 在 不同的酸度下，其存在形式也不同，导致了 不同的酸度下， 其形成络合物的吸 收波长不同。 o h 续奏 十 且 十 oh- h +o h 7 1 t t1 飞，月 11 i 夕派 h , rh , r 了夕|浪矛 夕飞 hr im a 决矛 w 经基荧光酮不易溶于水，易溶于酸化的醇类溶剂。所以增大其在水中的溶 解度，可以提高分析方法的灵敏度。表面活性剂的使用，大大克服了其不易溶 绪论 于水的缺点，使其更广泛的应用于无机分析中。 另一方面，试剂与金属离子形成配合物后，将改变试剂的荧光强度，从而 可更灵敏地用荧光法测定金属离子。电分析化学研究表明，试剂的金属离子配 合物还有灵敏的极谱催化波。 试剂的这些优良分析性能，促使人们进一步研究其在生化分析化学中的应 用。现有的进展主要是日 本大阪药科大学森逸男和藤田芳一的研究，我国在此 方面的工作开展的极少，仅有两个测定蛋白质体系的报道5 s 。而将荧光酮类试 剂用于酶法分析的仅有将水杨基荧光酮用于模拟酶催化体系的报道71 互 1 - 2荧光酮类试剂在药物分析中的应用 药物分析是用以全面控制药物的质量，来保证用药的安全、合理、有效。 它涉及药品的生产、保管、供应、调配以 及临床使用的整个过程。目 前，随着 药物学的迅猛发展，对药物分析提出了更高的要求，药物分析已从静态的常规 检验，深入到生物体内、代谢过程、工艺流程、反应历程和综合分析评价上进 行动态的分析监控。 虽然高效液相色谱法具有分离效率高、快速、重现性好等优点，在药物分 析中可以对大量的药物及生物制剂进行分析，但是，紫外可见分光光度法由于 操作简单、价钱便宜，仍广泛地用于药物分析中，特别是一些新技术的使用， 如差示分光光度法、双波长与三波长分光光度法、导数分光光度法、正交函数 分光光度法等又给其增添了新的活力，使紫外可见分光光度法可不经分离直接 测定混合物的组分，既可用于杂质检查，又可用于复方制剂的含量测定。 将荧光酮类试剂应用于药物分析的，主要是日本学者森逸男和藤田芳一小 组。基于表面活性剂存在下，药物对金属离子的三轻基荧光酮配合物形成的影 响，他们在七十年代末和九十年代初提出了多种药物的光度分析方法。 绪论 1 9 8 2年，森逸男等利用硫化物、有机硫化物在十六烷基三甲基澳化钱存在 下， 。 一 经基氢m酞 ( q n .p h ) 测定s e ( i i ) 有严重干扰，而测定了 硫wig ) ，以及头抱 力新和氨必西林19 1， 他们还利用 q n .p h - u ( i v ) 体 系测定了 碳酸己 酷奎宁 10 1和利血 平 till 森逸男小组基于 c u ( i i ) 易同 咪哩， 菲 咯 琳等含氮原子的化 合物反 应， 利用 q n .p b - c u ( ii ) 体系测定了 多 胺类 化合 物精胺 和亚 精胺o 2 1 。 在表面活性剂十二烷基 硫化钠存在下，分别利用q n .p h - z r ( i v ) 和q n .p h - t i ( i v ) 体系测定了 肌松药氯化筒 箭毒碱 1 3 铆 马来酸盐( 14 1 除了 在药物分析方面，森逸男小组还将三经基荧光酮类试剂应用于蛋白 质 和有机磷化物的分析， 1 9 8 3 年， 森逸男 等利 用邻苯 三 酚红 p r ) 同 金属 离子m o ( i v ) 的 络合物测定了白 蛋白 和尿蛋白 。 1 . 1 9 8 6年， 他们还依据 q n .p h - f e ( i r ) 体系可 同含磷的有机物反应，直接用光度法测定了三磷酸腺昔和黄素腺嚓吟二核昔酸 16 1 。另外，此方法还可以推广至测定生物体内的磷脂和核昔酸。 1 - 3酶法分析简介 酶是细胞产生的，具有催化生化反应的功能的蛋白质分子。几千年来，酶 一直参与人类的生产实践和生活实践。 虽然早在1 8 7 8 年， 就有了“ 酶” 这个名 称，直到本世纪初，人们才对一些酶进行了分离提纯，逐渐认识了许多酶催化 的生化反应。mic h a e l s 和me n t e n 总结了前人的工作，并在 1 9 1 3 年提出了酶促 动力学，为酶学研究莫定了基础。 酶是一种生物催化剂，它不仅具有一般催化剂的 特点， 还有其自 身的特殊 性: l .凡能使蛋白 质变性的因素，如高 温、强酸、强碱等都会使酶丧失活性。 2 酶具有高效率的催化活性， 酶催化反应的反 应速率比非催化反应高1 护 一1 护 “ 绪论 倍。 3 .酶的催化作用具有高度的专一性， 它只能催化某一化合物或某一类化合物的 特定的生化反应。 4 .反应条件温和， 均在常温、常压和p h 近中性条件下反应。 5 . 酶自 身 可对其活性 进行多 种形 式的 调 节 i r 7 6 .酶催化反应同时具有均相和多相的特点。 酶本身是成胶态分散溶解的，接近 于均相;但反应却是从反应物的表面上积聚开始的，所以又和多相反应相仿 l 8 近年来，随着生命科学的不断发展，一些酶制剂也开始逐渐商品化，使科 研工作者更加方便地将酶作为一种分析工具运用于生化分析和有机分析。目 前， 辣根过氧化物酶 ( h r p )是应用较广泛、 较成熟的一种酶。h r p是一种过氧化物 酶 ( e . c . 1 . 1 1 . 1 . 7 ) ，属糖蛋白，由植物辣根菜中提取而得，分子量为 4 4 0 0 0 0 每个h r p 分子中 含一个血红素， 其辅基结构为f e 一 原叶琳 ( i x ) ( ii i ) ， 第五 个配位 基为咪哇。 h r p 的催化机理” ， : _k , h r p - o h + h o o r严h r p - o o r - i + h 2 o hrp - oor- i h r p - o o r - i i +a h 2hr p - o h +r oh + a r o o h为氢受体底物， a h z 为氢供体底物。 h r p为氢受体底物是专一的，除 h 2 o 1 外，甲 基过氧化物和乙基过氧化物 也是良好的氢受体底物，它的氢供体底物是非特异性，人们对其氢供体底物的 研究一直没有停止过。目前，常见的氢供体底物主要有三类:苯酚或蔡酚及其 绪论 衍生 物， 苯胺衍生 物和染料隐 性体， 它们均是在 h r p催化下 被 h , o : 氧化成酮 式结构而发色的，目 前的研究表明，酚类化合物作为h r p光度法的底物，在其 被 h 2 0 2 氧化的反应中还有二聚体和三聚体产生2 0 1 ，在有机合成中也可利用 h r p 低。 : 体系 合成二聚体z i 。 本实验室 在研究中 发现， 偶 氮蔡酚 类物质也 可作 为h r p 的氢供体 底物(2 2 1 ， 来测定h 2 o , o 早在六、 七十年代，g u i l b a u lt 等对酶法分析进行了研究， 在开发 h r p新 的 氢供体底物的同时， 利用酶催化反应测定了 h 2 0 2 ，并与其它的酶偶联测定了 葡萄糖、胆固醇、尿酸等2 3 1 。由于早期开发的酶底物存在着灵敏度不高、选择 性差、试剂不稳定、试剂毒性大、需要偶联试剂等缺点，对于酶底物的开发工 作仍在不断进行。不仅利用光度法、而且还利用荧光法、化学发光和电化学传 感器等手段，不断提高方法的灵敏度和更深入地对酶催化反应进行研究。 在 g u i l b a u lt 提出对轻基苯乙酸可作为荧光底物的基础上12 4 1 ，日本学者 2 a it s u等研究发现 3 一 对轻基苯丙酸、对轻基苯乙醇、对乙基酚等一类对轻基苯 基化合物是h r p的良 好的荧光底物【2 5 1 利用 对 一 碘苯 酚、 对一 香 豆酸、 苯 酚、 苯胺 可以 增强鲁 米诺 一。 2 - h r p化 学 法 光体系， d i a z 等灵敏地测定了大 气中的玩012 6 ,2 7 1h 2 0 2 日 本学者 t a d a s h i 等，详细地研究了阳离子胶束 c t a c( 十六烷基三甲 基 氯 化 按) 对h r p催化h 2 o : 的 荧光 素 化学 发 光 体系 的 增 敏 作 用， 而阴 离 子 和非 离子胶束没有明显作用。他们认为是阴离子荧光素和 c t a c之间的静电作用所 形成的12 8 1 。同样，李庆阁等也通过对缓冲溶液、溶剂和表面活性剂对h r p 一 对轻 基苯丙酸一 玩o : 的影响发现，阳离子表面活性剂 c t m a b( 十六烷基三甲 基澳化 钱) 、和c t a c对该体系有增敏作用，其原因是表面活性剂的增溶作用(2 9 1 邓家祺等在研究中发现，染料甲基绿可以作为第二代电流生物传感器的探 针介体和h r p 共同固定在蒙脱土修饰的牛血清白蛋白 一 戊二醛基体上， 构成凡q 传感器l l q s c h u b e rt等利用将 h r p固定在聚氨酷膜上.与光纤探针连接构成 绪论 一个酶反应器， 催化高香草酸形成二聚体， 测定凡q .b h z o 2 新技术的使用不仅使反应的灵敏度越来越高，而且选择性也越来越好，操 作更加简便，为酶法分析开拓了广阔的前景。 辣根过氧化物酶一 过氧化氢一 水杨基荧光酮催化体系的研究与应用 第二章 辣根过氧化物酶- 过氧化氢一 水杨基荧光酮 催化体系的研究与应用 酶法分析具有高度的专一性， 采用分光光度法、荧光光度法、 化学发光法 和电 化学传感器等检测技术，己 广泛应用于生化分析。辣根过氧化物酶 ( h r p ) 应用较广泛、 较成熟， 可 利用 其催化反 应体系 测定 h 2 0 2 ， 并与 一些氧化酶催化 的体系联用，用于测定临床上多种重要的生物物质，如葡萄糖、胆固醇、尿酸 等2 1 a h r p的氢供体底物有很多，但实际应用中不少底物具有试剂不稳定、反 应副产物多、 灵敏度不够高、需用偶联试剂等缺点。 三轻基荧光酮类试剂作为一类灵敏度高、 选择性较好的显色剂和荧光试 剂，在表面活性剂增敏作用下，己 广泛应用于金属离 子的高灵敏测定t i -4 1 。水杨 基荧光酮 ( s a f ) 含有三个轻基， 适当条件下， 可以被氧化。己 有研究表明一些 无机金属离子 可催化试剂被 h 2 0 2 氧化to t ， 因 此， 有可能 过氧化物酶也 催化此反 应。s a f被氧化后，其吸收光谱、荧光光谱、化学发光特性将改变。因此可用 光谱分析方法监测反应。本文将水杨基荧光酮作为h r p的氢供体底物，研究了 催化 体系性 质， 提出了 测定h z o : 的 新方 法， 不需 偶 联试剂， 且 灵敏度较高。与 葡萄糖氧化酶 ( g o d ) 联用，测定人血清中的葡萄糖有较满意的结果. 1 实验部分 1 1 仪器与试剂 u v -2 4 0 分光光度计，附t b -8 5 型恒温水浴箱 ( 日本岛津公司) 。 p h s - 2 型酸度计 ( 上 海第二 分析仪 器厂) . 吸光度测量均用1 0 m m吸收池。 辣根过氧化物酶 ( h r p ) :以 水 溶解1 4 .8 m g h r p( 华美生物工程公司， 酶 活力1 5 0 2 0 0 u l m g . r z 2 3 .0 ) ，并 定容至1 0 0 m l ，由4 0 3 n m处酶溶液的 吸光 辣根过氧化物酶目 过氧化氢一 水杨基荧光酮催化体系的研究与应用 度按 摩 尔吸 光系 数 s . . = 1 .0 2 x 1 0 5 l .m o l-.c m ， (3 2 1 计 算 得 h r p浓度为 2 .3 x 1 0 -6 mo l / l g o d( 酶活力 i o o u m g ， 北京百 泰生 化公司) 配制 成3 .4 u l m l 的 溶液。 s a f乙醇 溶液: 称 取 。 0 8 2 0 0 g s a f( 本实 验室 合成并提纯) ， 用无水乙 醇 溶解，滴加6 滴浓硫酸酸化，并用无水乙 醇稀释至 1 0 0 0 m l ， 浓度为2 .4 4 x 1 0 4 m o l1 l ,避光贮存。 玫 仇: 用优 级纯玫仇 ( 3 0 % ) 溶液 稀 释 成4 .5 x 1 0 2 m o l tl ( 用k 1v f n q法标 定) 贮备液，临用前稀释 成9 .o x 1 0 5 m o 比 的工作溶液。 葡 萄 糖: 称取d - ( + ) 葡 萄 糖1 .8 0 1 6 g , 以 水 溶 解， 配 成1 0 0 m l 溶液， 浓 度 为0 . 1 0 0 m o l / l ，工作溶液为l o x 1 丫m o l几的稀释液。 n h 3 -h 2 o - n h ,c i 缓冲溶液: 将1 .0 m o l / l n h 3 -h 2 0 和1 .0 m o u l n h , c i 按体积 比1 :8 混 匀， 在 酸 度计 上 调 至州8 .6 fl 所用试剂除注明外均为分析纯，水为去离子水。 1 .2 实验方法 1 2 1 动力学常数的测定 用n f l o h - n h , c i 缓冲溶液1 5 .0 m l , s a f 溶液1 0 .0 m l , h e l p 溶液1 2 0 川 和水配成1 o o m l 混合试剂( 临用时配制 ) 。 在1 0 m m吸收池中， 加入i s o m l 混合 试剂 后， 再 加入 不 同 体 积 的9 .0 x i 0 m o l/ l 氏 q溶液， 迅速 混 匀， 在5 0 8 n m处， 以 水作参比， 记录吸光度一时间( a - -t ) 曲 线，由a -t曲 线计算反应初速度 v , 由 不同的h 2 0 2 浓度 对应的v ，以l in e w e a v e r - b u c k 作图 法，计 算酶催化 动力学 常数。 1 .2 . 2 氏o : 的 测定 于l o m l 比色管中， 加入s a f溶液 1 .0 0 m l , 缓冲溶液 1 . 5 m l , 2 .3 x1 了m o u l h r p 8 .0匹， 适量玫q溶液， 用水稀释至刻度，1 5 m a n 后在5 0 8 n m处，以 水 辣根过氧化物酶一 过氧化氢一 水杨基荧光酮催化体系的研究与应用 为参比， 测量吸光度a ， 同时作空白实验， 测量吸光度人， 由 a = 人- a计算h z o z 的浓度。 1 .2 .3葡萄糖的测定 血清样用硫酸锌一氢氧化钡法3 3 脱蛋白质制得试液。于 1 0 m l 比色管中， 加入适量葡萄糖溶液或血清试液， 3 4 u / m l 的g o d溶液。 . 3 0 m l ，加入水 1 .0 m l , 在室温下放置 1 5 m i n 后取出，依次加入0 .0 5 m o l/ l e d t a溶液 1 .0 m l , s a f 溶 液1 .0 0 m l ， 缓冲溶液1 .5 m l , 2 .3 x1 0 m o u l h r p 8 .0 闪 ， 定容1 5 m i n 后在5 0 8 n m 处， 以 水作参比， 测定吸光度a ， 同时不加g o d作空白实验， 测得a o ， 由 a = a , - a 计算葡萄糖的浓度。 2 结果与讨论 2 . 1 催化体系吸收光谱与性质 水杨基荧光酮属 2 , 3 , 7 一三轻基一 9 一取代苯基荧光酮类试剂，分子具有刚 性、平面和共辘大二 键结构，在一定的酸度下，可在金属离子催化下， 被 h 2 0 2 氧化成酮式结构。由图2 - 1 可知， 在未加残仇条件下，s a f 在5 0 8 n m处有一个 吸 收 峰， 随 着h z o : 加 入 量的 增 加， 峰 值 不断 降 低， 而加 入大 量h z o : 条 件下， 仍 具 有 很小 的 吸收。 s a f 含 有苯 酚的 基 本结 构， 故 其被h r p 催化h z o z 氧 化物 反应机理与苯酚作底物的反应机理类似，也是 s a f的轻基被氧化成酿式结构而 引起了吸收峰的变化。 2 .2 酶催化反应动力学常数 当 h r p浓度固定为 2 . 8 x 1 0 -9 m o l/ l和温度为 1 4 下，s a f的浓度远远高 于h 2 0 2 浓度时， 用l i n e w e a v e r - b u r k 双倒数曲 线法求得玩0 2 浓度c与反应初 速度v 的 关系( 见图2 - 2 ) : i / v = 9 .3 1 1 + 2 . 5 3 x w/ c r = 0 . 9 9 7 7 ( n = 7 ) 因此，在此条件下最大反应速度 v m - 0 . 1 0 7 s ，米氏常数 凡= 2 . 7 1 x 1 0 5 辣根过氧化物酶一 过氧化氢一 水杨基荧光酮催化体系的研究与应用 m o i/ l 计 算得催化常数 k _ = 3 . 8 9 x 1 0 l . s .m o p . .专一性常数 k _ / k _ = 1 .4 3 x 介l .s _ m o l z o 0 0 0 08 0 0 八八0 6 0 0 0 4 00 02 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 入( n m ) hr p : 1 . 8 4 x 1 o m o l / l . s a f : 2 . 4 4 x 1 0 mo u l h 2 o , a : 0 m o 比 ; b : c : 1 . 4 4 x 1 0 - 5 m o 以d : 7 . 2 x 1 护 m o l 几; 4 . 5 x 1 0 0 m o u l 图2 - l . h r p - h , o 2 s a f 体系的吸收光谱图 f i g .2 - 1 a b s o r p t i o n s p e c t r a o f i -i r p - 氏o z - s a f s y s t e m a t p h 8 . 6 2 8 / 2 4 / 厂 i / v ( s ) 2 0 1 6 i 2 0 - . - 6 7 8 9 i / c ( x 1 0 5 l / m o l) 1 0 辣根过氧化物酶一 过氧化氢一 水杨基荧光酮催化体系的研究与应用 h r p : 2 . 8 x 1 4 - m o l / l s a f : 2 . 4 4 x 1 o -5 m o l / l 图2 - 2 . h r p - h o , 一 s a f 体系的l i n e w e a v e r - b u r k 曲 线 f i g . 2 - 2 . l in e w e a v e r - b u r k c u r v e o f h r p - h -2 o 2 - s a f s y s t e m a t p h 8 .6 2 .3 ho : 的 测定方 法 2 . 3 . 1 反应条件的优化 酶催化活性受反应溶液的酸度的影响。 在本体系中，酸度对s a f的峰位及 其吸收强 度也 有影响， p h 5 .0 8 . 0 时， s a f 具有两个较弱的吸收峰， 分别在4 7 5 n m和5 0 0 n m附 近。 如图2 - 3 所示， 测定玩。 : 的 适宜 酸 度为p h 8 _ 3 9 , 1 ， 本 文 选用p h 8 .6 n h ; ,h z o - n h , c i 缓冲溶液， 缓冲液浓度为1 .0 m o l/ l 时，1 . 0 3 .0 m l 为宜， 选用1 . 5 m i . 人a 一 0 9ph do 1 . 8 4 x l o - m o 比 ; s a f : 2 . 4 4 x 1 0 -5 m o v l : 1 .0 8 x l o - 6 m o u l 辣根过氧化物酶一 过氧化氢一 水杨基荧光酮催化体系的研究与应用 图2 - 3酸度对h r p - h z o z - s a f 体系a a的影响 f i g .2 - 3 . e ff e c t o f a c i d i t y o n a a o f h r p - h 2 o 2 - s a f s y s t e m 体系中的h 2 0 2 和s a f 浓度一定时， a a与h r p的 浓度相关。 如图2 - 4 所 示，在h r p的浓度小于1 .8 4 x 1 0 4 m o v l时，a a逐渐增加;当h r p的浓度大于 1 . 8 4 x 1 0 4 m o v l时，a a值基本保持不变，故选用 1 . 8 4 x 1 护m o u l的h r p进行实 验。 s a f的 浓度为1 . 8 x 1 0 5 2 .8 x 1 0 s m o l/ l 时， 对于1 . 0 8 x 1 0 s m o l/ l矶0 , 的 测 定， a a 保持 基 本恒 定 ( 见图2 - 5 ) ， 本文 选 择2 .4 4 x 1 0 5 m o l/ l s a f p 一. 户一一 户 卜、 ， . _. aa 2 4 b 8 c at 斌x 1 0 9 m o l 几) s a f : 2 _ 4 4 x 1 0 s m o l/ l 玫仇:1 .0 8 x 1 护m o l 几 图2 - 4 . h r p 浓度对催化体系活性的影响 f i g , 2 - 4 e ff e c t o f c o n c e n t r a t io n o f h r p o n a c t i v it y o f c a t a l y t i c s y s t e m 辣根过氧化物酶一 过氧化氢一 水杨基荧光酮催化体系的研究与应拜 一 . . a a 1 2 3 4 c s a f ( x 1 0 s m o t / l ) h r p : 1 . 8 4 x 1 0 m o u l h 2 o z : 1 .0 8 x 2 0 知o u l 图2 - 5 . s a f浓度对体系 a的影响 f i g .2 - 5 .e ff e c t o f c o n c e n t r a t i o n o f s a f o n a a 反应温度对酶催化反应以及空白反应溶液的速度均有影响。如图2 一所示， 在室 温下( 1 4 - 2 4 0c ) a a值 基本 保持 恒定， 随着温度的 升高， 空白 反 应溶液的a o 值逐渐降低，导致a a值不断降低。在室温下，反应溶液在 1 5 m in后达到平衡， 在 i h 内，a a值基本保持恒定，随着温度升高，a a值的稳定时间随之减少。 辣根过氧化物酶一 过氧化氢一 水杨基荧光酮催化体系的研究与应用 aa o w布0 一 2 0 3 0 4 0 t ( ) 5 0 6 0 h r p ; 1 .8 4 x l o m o l/ l ; s a f : 2 .4 4 x 1 0 - $ m o v l ; h z o 2 : 1 .0 8 x 1 0 - m o 比 图2 - 6温度对a a的影响 f ig .2 - 6 . e f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n a a a t p h 8 . 6 2 . 3 . 2线性范围和灵敏度 在拟定的最佳条件下， 测量不同r a 浓度c时对应的 a a ， 表明9 . o x 1 0 -7 - 2 _ 0 x 1 0 -5 m o l/ l范围内，a a与浓度c分段呈良好的线性关系，即; 9 o x 1 0 - -1 . 1 x 1 0 5 m o 1/ l ho , 时， a a = 0 .0 0 6 6 + 3 .7 4 x 1 0 c , r = 0 .9 9 9 8 ( n = 6 ) i . 1 x 1 0 -5 2 . 0 x 1 0 5 m o v l 风0 : 时， a a 二 一 0 ,0 0 1 6 + 3 . 4 8 x 1 0 0 c, r = 0 . 9 9 9 6 由空白9次测定的标准偏差的3 倍， ( n = 6 ) 计 算得h 2 0 2 检 测限 为7 .8 x 1 0 -$ m o l/ l . 辣根过氧化物酶一 过氧化氢一 水杨基荧光酮催化体系的研究与应用 本法测定h 2 0 2 的 表观摩尔吸光系 数为3 . 7 4 x 1 护 l .m o l . o m o 2 .3 3共存物质的影响 常见的金属离子大多与s a f 形成有色络合物，在o . o l m o u l e d t a掩蔽下， 对于1 .4 8 x l o $ m o u l玖。 : 的测定，加入下列离子5 g g / m l . 结果由表2 - 1 可知， 相对误差均 ( 5 %, e d t a共存对 a值并无影响。 表2 - 1 .共存物质的干扰: 共存物质 加入量 ( 9 9 / m l )测定值( a a ) 相 对误差( % ) 0 . 3 5 9 月3 + b a c a t c d + c o l c r , c u l l e dt a f e 3 m g t mn ni p d 2 p t e s e 4 1 z n 2 5 . 00 . 3 4 4- 4 . 1 8 0 . 3 610 . 5 6 5 . 00 . 3 5 4- 1 34 0 _ 3 6 722 3 0 . 3 4 7- 3 34 0 . 3 5 7_ 05 6 0 35 7- 0 . 5 6 0000 月t. 、讨、分 i . o x l 0 - 3 m o v l 0 . 3 5 6- 0 . 8 3 0 . 3 7 2 0 . 3 5 8 3 、 6 2 - 0 . 2 8 00 户、 0 . 3 5 3一 1 . 6 7 5 . 00 34 5 一 39 0 0 . 3 6 92 . 7 9 0 34 9- 27 9 0 . 3 7 1 0 35 3 3 . 3 4 - 1 . 6 7 门000 、j砂、份种、jl、 辣根过氧化物酶一 过氧化氢一 水杨基荧光酮催化体系的研究与应用 2 .4 血清中 葡萄糖的测定 将 g o d与h r p 催化体系偶联可测定葡萄糖。反应式为: p - d - 葡 萄 糖 十 o z+ h zo习 n np - d - 葡 萄 糖 酸 十 玩 q s a f + h z o 2 - ii -. 产物十 h 2 o 按前述方法，测定葡萄糖的线性范围为 。 -2 .5 x i 0 -s m o v l ,线性方程为: a a = 0 . 0 5 1 + 1 .9 1 7 x 1 0 0 c , r = 0 .9 9 7 6 ( n = 8 ) 分析血清时，样品中的蛋白质对测定有干扰，用硫酸锌一氢氧化钡法除蛋白 质后，加入 e d t a掩蔽 z n 2 1 , b a t 等， 测定人血清中的葡萄糖含量。回收实验 时，在 1 0 m l比色管中直接加入适量己处理的样品后，再加入 1 .0 0 x 1 0 - m o l / l 的葡萄糖标准溶液5 0 汕 进行测定，结果一并列于表2 - 2 4 表2 - 2人血清中的葡萄糖测定结果* 样品测定 平均值r s d ( s / - )(%) 存在量 ( l x g / m l ) 回收 加入量测得量 回收率 ( g 岁 - i) (%) 0 . 5 10 . 2 5 61 . 1 81 0 2 2 0 . 7 3 0 280. 5 8 0 ( n 创m l ) 0 . 9 0 0 0 . 9 0 01 4 石9 7. 80 . 7 2 0. 4 50 . 6 0 30 . 9 0 01 4 . 9 9 890 . 7 3 0 . 5 20 . 8 4 00 . 9 0 0 1 7 . 61 0 3 3 2 . 5 1 66010224 众ill *n = 6 o 2 . 5结语 本文研究表明 s a f可以作为一种高活性、 高灵敏度的过氧化物酶氢供体底 物应用于酶法分析，不需偶联试剂，体系简单。以 g o d催化反应为例，研究 表明， h r p - h 2 0 2 - s a f催化体系 可与 氧化酶催 化体系 联用，以 测定临床上重要 的分析物。 无外加过氧化氢时氯化血红素催化性能的研究 第三章 无外加过氧化氢时氯化血红素催化性能的研究 血红素辅基酶如: 过氧化物酶、 过氧化氢酶、细胞色素 p - 4 5 0等的活性单 元均为金属叶琳结构。 研究表明金属叶 琳化合物具有超分子功能， 催化h 2 0 2 参 加的 氧化体系，故金属叶 琳化合物包括天然存在的氯 化血红素 ( h e m i n ) 常作为模 拟酶应用于生化分析13 4 .3 5 1 。但常见金属叶琳化合物的催化性能研究报导多在外 加氧化剂如 h 2 o : 的 存在下， 而 对于 无外 加 h 2 o : 的体系， 仅有 鲁米诺碱性化学 发光体系的报导3 4 3 7 1 ，其反应机理也不很清楚。 水杨基荧光酮( s a f ) 作为一种常见的显色剂和荧光试剂， 广泛应用于无机离 子的 测定， 本文 报道在无外 加h 2 o , 情况 下， 研究了s a f 作为h e m i n 的 底物， 在 氨性缓冲介质中，氯化血红素的催化性能，结果表明在阴离子胶束十二烷基苯 磺酸钠( s d b s ) 存在下， h e m i n的催化性能类似于酶催化， 基于此可测定h e m i n e 1实验部分 1 . 1 仪器与试剂 l n- 2 4 0记录式双光束分光光 度计，附t b - 8 5 型恒温水浴箱 ( 日 本岛 津) ， 1 0 m m吸收池， 水作为参比。 氯 化血红 素 : 称 取1 9 .6 m g h e m i n ( 生 化 试 剂，中 国 科 学院 上 海生 物 化学 研 究 所) ， 用0 .0 0 5 m o v l k o h溶解并 稀释至。 . 1 l ， 浓度3 .0 x 1 0 m o l/ l ， 冷藏保 存。 使 用液 用。 . 1 m o v l n h , h , o - n h , c i 缓冲溶液 ( p h = 8 . 6 ) 稀释至 所需浓度。 水 杨 基荧光 酮 ( s a f ) : 取0 .0 8 4 2 3 g s a f ( 本实 验室 合 成 提 纯 ) ， 用无 水乙 醇 溶解并稀释至5 0 0 m l ，浓度为5 .0 x 1 0 m o v l ， 使用液用无水乙醇稀释至 i . o x 1 0 mo l 几。 s d b s 溶液: 将3 .4 8 5 g s d b s 溶于水中， 稀释至0 . 5 l ， 浓度为2 .o x i o m o l/ l . 无外加过氧化氢时氯化血红素催化性能的研究 n h , .h , o - n h , c i 缓冲溶液: 将1 . 0 m o v l n h 3 .h 2 0和n h , c i 按体积比1 : 8混 合， 在酸度计上调至p h 8 . 6 0 所用水为离子交换纯水，试剂除注明外均为分析纯。 1 .2实验方法 1 . 2 . 1动力学常数的测定 用s d b s 溶液5 m l , 3 .0 x 1 0 m o l/ l h e m i n 1 5 0 匹，缓冲溶液5 0 m l和水 配成1 0 0 m l混合液 ( 临用时配制) 。 在1 0 m m吸收池中， 注入不同量 ( 2 0 - 8 0 匹) s a f 溶液， 加入混合液2 . 5 m l ， 迅速混匀， 记录5 1 0 n m处的吸 光度一时间 ( a t )曲线，求出反应初速率 v ，由不同的 s a f浓度对反应初速率 ， ，以 l i n e w e a v e r - b u r k作图法求算动力学常数。 1 .2 2 平衡法测定h e m i n 于1 0 m l比 色管中，依次加入s a f溶液2 . 5 m l , s d b s 0 .5 m l ，缓冲溶 液2 . 5 m l ，不加h e m i n ( 作为空白 ) 或加入3 .0 x 1 0 m o u l h e m i n溶液适量，以 水定容。室温下放置 1 5 m i n后， 在 5 1 0 n m处，测量吸光度 a o 和 a ，计算 d a = a a - a . 结果与讨论 反应条件对 h e m i n 催化活性的影响 以平衡法检测 3 .0 x 1 0 - m o v l h e m i n存在下，反应体系吸光度降低值 a 为