（药理学专业论文）原花青素对缺血性脑损伤保护作用机制的研究.pdf

本人郑重声明 究所取得的成果。 或集体已经发表或 体，均已在文中以 学位论文作者 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者：雇峭 日期：伽l o 年月伽日 原花青素对缺 郑州大学基础医学院药理学教研室 河南郑州4 5 0 0 0 1 摘要 目的： 脑缺血是临床上常见的急性脑血管疾病，具有高致残率和高致死率。目前临 床缺乏理想的治疗药物，因此寻找有效的神经保护药物从而降低后遗症的发生 率仍然是当前脑缺血研究的重点。原花青素( p r o c y a n i d i n ，p c ) 是一种广泛存 在于植物中的天然抗氧化药物，研究表明，它具有减轻脑缺血大鼠的脑组织水 肿、保护神经元的作用。而近年来研究发现酸敏感离子通道( a c i d s e n s i n gi o n c h a n n e l s ，a s i c s ) 在缺血性脑损伤中发挥了重要的作用。本文通过建立大鼠脑 缺血再灌注模型，并用p c 干预后，观察p c 对脑组织中诱导型一氧化氮合酶 ( i n d u c i b l en i t r i co x i d es y n t h a s e ，i n o s ) 、髓过氧化物酶( m y e l o p e r o x i d a s e ， m p o ) 的活性和酸敏感离子通道l a 亚基( a s i c l a ) 表达的影响，进一步探讨p c 的 脑保护作用的机制，为脑缺血的防治提供理论依据。 方法： 将1 2 0 只体重为3 0 0 - 士5 0 9 的清洁级成年雄性s d 大鼠随机分为5 组：假手术组、 模型组及p c 低、中、高剂量( 5 0 、1 0 0 、2 0 0m g k 9 1 ) 组。p c 各组于缺血前3 0 分钟和缺血后2 d , 时分别腹腔注射不同浓度相同体积的p c 溶液，假手术组和模型 组给与等量的生理盐水。采用改良的线栓法制备大鼠左侧脑缺血再灌注模型。 缺血2 d , 时再灌注2 4 d 时采用z e al o n g a 评分法进行行为学评分。评分标准如下： 0 分：无行为学症状；1 分：不能完全伸展对侧前爪；2 分：向对侧转圈；3 分：向对侧倾倒；4 分：不能自行行走，意识丧失。除假手术组外，剔除0 分和4 分及术后死亡动物，剔除部分在后续实验中补足。 评分完毕后，立即在冰台上将大鼠断头处死，随机抽取8 只制作h e 染色的病 理切片观察大鼠脑组织的形态学变化，并用免疫组化的方法测定脑片中a s i c i a 的表达；另外8 只用w e s t e r n - b l o t 法测定左侧海马组织中a s i c l a 蛋白的表达量；剩 下8 只用比色法测定左侧脑组织中i n o s 、m p o 的活性。 结果： 模型组的行为学评分显著高于假手术组( p o 0 1 ) ；p c 低、中剂量组的 评分低于模型组( 尸 o 0 5 ) ；p c 高剂量组的评分显著低于模型组( p o 0 5 ) 。 假手术组神经元形态正常，结构完整，无间质水肿；模型组神经元数量 减少，细胞核固缩、碎裂、溶解，细胞间质水肿；p c 各组均能不同程度的改善 神经元变性、坏死等变化，减轻间质水肿。 模型组脑片中a s i c l a 的表达显著高于假手术组( 尸 o 0 5 ) ；p c 中、高剂量组的a s i c l a 表达低 于模型组( 尸 o 0 5 ) ；且p c 各组之间无显著差异。 各组的a s i c l a 蛋白的相对灰密度值如下：假手术组0 0 9 4 + 0 0 0 8 ，模型 组0 4 0 7 4 - 0 0 0 8 ，p c 低剂量组0 2 1 9 - j ：0 0 1 4 ，p c 中剂量组0 2 0 7 + 0 0 1 2 ，p c 高剂 量组0 1 9 5 + 0 0 1 2 。 ，模型组的a s i c l a 蛋白表达量显著高于假手术组( p 0 0 1 ) ；p c 各组的 a s i c l a 蛋白表达量均显著低于模型组( 尸 0 0 1 ) ；且p c 中剂量组的a s i c l a 蛋白表达量低于p c 低剂量组( p 0 0 5 ) ，p c 高剂量组的a s i c l a 蛋白表达量低 于p c 中剂量组( p o 0 5 ) ，显著低于p c 低剂量组( p o 0 1 ) 。 各组的i n o s ( u g - 1 p r o ) 活性值如下： 假手术组0 4 5 8 + 0 0 1 0 ，模型组 1 2 6 7 士0 0 1 0 ，p c 低剂量组0 8 4 4 + 0 0 0 8 ，p c 中剂量组0 8 0 1 + 0 0 0 9 ，p c 高剂量 组0 8 0 3 + 0 0 1 1 。 模型组的i n o s 活性均显著高于假手术组( 尸 o 0 1 ) ；p c 各组的i n o s 活 性均显著低于模型组( 氏0 0 1 ) ；而p c 中、高剂量组的i n o s 活性显著低于p c 低剂量组( p o 0 1 ) ，且中高剂量组之间无显著差异( 胗o 0 5 ) 。 各组的m p o ( u g - 1 ) 活性值如下：假手术组0 4 0 5 士0 0 1 0 ，模型组 0 6 0 4 + 0 0 11 ，p c 低剂量组0 5 0 9 a ：0 0 0 9 ，p c 中剂量组0 5 0 1 i - 0 0 0 8 ，p c 高剂量 组0 5 0 1 + 0 0 0 9 。 模型组的m p o 活性均显著高于假手术组( p 0 0 1 ) ；p c 各组的m p o 活性 原花青素能对抗大鼠脑缺血时的神经元损伤，保护神经细胞，其机制可能与 它对抗炎性损伤、氧化损伤及a s i c l a 介导的酸性损伤有关。 关键词： 原花青素；脑缺血再灌注；诱导型一氧化氮合酶；髓过氧化物酶；酸敏感离 子通道 i i i t h e a b s t r a c t 0 b j e e f i v e ： c e r e b r a li s c h e r n i a , a r ta c u t ec e r e b r o v a s c u l a rd i s e a s e s ，i s c o m m o n l ys e e ni n h o s p i t a lw i t hh i 曲m u t i l a t i o na n df a t a l i t y h o w e v e r , t h e r ei sn os p e c i f i ce f f e c t i v e m e d i c i n ef o rt h i sd i s e a s e i ti s v e r yi m p o r t a n tf o r u st of i n da ne f f e c t i v e n e u r o p r o t e c t i v ed r u gt or e d u c et h ei n c i d e n c eo fr e s i d u a l p r o c y a n i d i n ( p c ) i sak i n d o fn a t u r a la n t i o x y g e nd r u gw h i c he x t e n s i v e l ye x i s t si np l a n t s i tw a sd e m o n s t r a t e d t h a tp ch a dt h en e u r o n sp r o t e c t i v ee f f e c t so nc e r e b r a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni n j u r y t h r o u g hr e l i e v i n gb r a i ne d e m a r e c e n t l y , i th a sb e e nf o u n dt h a ta s i c s ( a c i d s e n s i n g i o nc h a n n e l s ) p l a ya ni m p o r t e n tr o l ei nc e r e b r a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni n j u r y t h e o b j e c t i v eo ft h i ss t u d yi st oi n v e s t i g a t et h eb r a i n - p r o t e c t i v ee f f e c to fp ct h r o u g h t e s t i n gt h ea c t i v i t i e so fi n o sa n dm p o a n dt h ee x p r e s s i o no fa s i c1ao fb r a i nt i s s u e a f t e ri s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni nr a t sw h i c hi n j e c t e dw i t hp c m e t h o d s ： 12 0m a l es dr a t s ( 3 0 04 - 5 0 i 曲w e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o5g r o u p s ：s h a m g r o u p ， m o d e lg r o u p ，a n dp cl o wd o s e ( 5 0m g k 百1 ) ，p cm i d d l ed o s e ( 10 0m g k 9 1 ) ，p ch i g h d o s e ( 2 0 0m g k g - ) g r o u p s p cg r o u p sw e r ei n j e c t e d w i t hp ca tt h em a t c h e d c o n c e n t r a t i o na t3 0m i n u t e sb e f o r ei s e h e m i a a n dt h er e s tr a t sw e r ei n j e c t e dw i t h s a l i n e a l lr a t sw e r eg i v e no n em o r et i m ei n2h o u r sa f t e ri s c h e m i a t h em o d e lo fl o c a l a f t e rt h eb e h a v i o r a lt e s t ，8r a t si ne a c hg r o u pw e r es a c r i f i c e df o rh i s t o l o g i ca n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t ye x a m i n a t i o n so fa s i c la ，8r a t sw e r et a k e nt oa s s a yt h e a c t i v i t i e so fi n o sa n dm p o ，a n dt h er e s tw e r eu s e dt ot e s tt h ea s i clap r o t e i n e x p r e s s i o n r e s u l t ： t h ee t h o l o g ys c o r ei nm o d e lg r o u pi so b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h a ti ns h a ma n d p ch i g ed o s a g eg r o u p s ( p o 0 5 ) ，a n di ti sh i g h e rt h a nt h a ti ns h a m ，p cm i d d l ed o s a g ea n d p c h i g hd o s a g eg r o u p s ( p o 0 5 ) a n dt h e r ei sn od i f f e r e n c ea m o n g a l lt h ep cg o u p e s ( 胗0 0 5 ) t h er e l a t i v eg r a ys c a l eo fa s i c la se x p r e s s i o ni ne a c hg r o u pa l e 舔f o l l o w ： s h a m0 0 9 4 ：k - 0 0 0 8 , m o d e l0 4 0 7 士0 0 0 8 ，p cl o wd o s a g e0 2 1 9 士0 0 1 4 ，p cm i d d l e d o s a g e0 2 0 7 4 - 0 0 1 2 ，p ch i g hd o s a g e0 1 9 5 + 0 0 1 2 t h ea s i ciae x p r e s s i o no fr a t sh i p p o c a m p u si nm o d e lg r o u pi so b v i o u s l yh i g h e r t h a nt h a ti ns h a ma n da l lt h ep cg r o u p s ( 尸 o o1 ) t h ea s i ciae x p r e s s i o ni np cl o w v d o s a g e a l s oh i g h e rt h a nt h a ti np cm i d d l ed o s a g eg r o u p ( 尸 o 0 5 ) ，w h i c ha r eo b v i o u s l y l o w e rt h a nt h a ti np cl o wd o s a g eg r o u p ( p 0 0 1 ) t h ea c t i v i t i e so fm p o ( u g d ) o fe a c hg r o u pa r ea sf o l l o w ：s h a m 0 4 0 5 4 - 0 0 10 ，m o d e l0 6 0 4 4 - 0 o l1 ，p cl o wd o s a g e0 5 0 9 4 - 0 0 0 9 ，p cm i d d l ed o s a g e 0 5 0 1 4 - 0 0 0 8 ，p ch i g hd o s a g e0 5 0 1 4 - 0 0 0 9 t h ea c t i v i t e so fm p oo fr a t sb r a i ni nm o d e lg r o u pi so b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h a t i ns h a ma n da l lt h ep cg r o u p s ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o n s ： p cc a ne f f e c t i v e l yr e l i e v et h ec e r e b r a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni n j u r y , a n di t s m e c h a n i s mm a yb er e l a t e dt ot h ee f f e c t so fr e l i e v i n gb r a i ne d e m a ，a n t i i n f l a m m a t i o n ， a n t i o x d a t i o na n di n h i b i t i n gt h ee x p r e s s i o no f a s i c1a k e yw o r d ：p r o c y a n i d i n s ；c e r e b r a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o r t ；p r o t e c t i v ee f f e c t s ；i n o s ；m p o , a s i c l a v i 论文部分 中英文 原花青 引言 材料与 结果 讨论 结论18 附录l 9 参考文献一2 3 综述部分 原花青素的研究进展o 2 5 参考文献3 4 附录部分 个人简历3 9 致谢4 0 英文缩写 p c a s i c s n o n o s i n o s m p o o p c p p c c c a e c a i c a p p a m d a s o d l d h i l t n f b c l 2 p 5 3 u v n f - r , b c a s p a s c n f r b p 6 5 l r b o t e r k l 2 k c o x 2 队p k n m d a r n r 2 b j n m d a r c a m k i i m m p 中英文缩略词对照 英文全称 p r o c y a n i d i n a c i d s e n s i n gi o nc h a n n e l s n i t r i co x i d e n i t r i co x i d es y n t h a s e i n d u c i b l en i t r i co x i d es y n t h a s e m y e l o p e r o x i d a s e o l i g o m e r sp r o c y a n i d o l i c p r o a n t h o c y a n i d i no l y m e r s c o m m o nc a r o t i da r t e r y e x t e r n a lc a r o t i da r t e r y i n t e m a lc a r o t i da r t e r y p t e r y g o p a l a t i n ea r t e r y m a l o n d i a l d e l y d e s u p e r o x i d e d i s m u t a s e l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e i n t e r l e u k i n t u m o rn e c r o s i sf a c t o r b c e l ll y m p h o n m ag e n e2 p r o t e i n5 3o rt u m o rp r o t e i n5 3 ， u l t r a v i o l e t n u c l e a rf a c t o r - - k a p p ab c a s p a s e n u c l e a rf a c t o rr d 3 1 1 c bk i n a s e 倪 e x t r a c e l l u l a rr e g u l a t e dk i n a s e l 2 e - i u nn t e r m i n a lk i n a s e c y c l o o x y g e n a s e - 2 m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e n - m e t h y l d - a s p a r t a t er e c e p t o r n - m e t h y l - d a s p a r t a t e - 2 br e c e p t o r c a l c i u m c a l m o d u l i nd e p e n d e n t p r o t e i nk i n a s e 卜i i m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e 8 i 中文全称 原花青素 酸敏感离子通道 一氧化氮 一氧化氮合酶 诱导型一氧化氮合酶 髓过氧化物酶 低聚原花青素 高聚原花青素 颈总动脉 颈外动脉 颈内动脉 翼腭动脉 丙二醛 超氧化物歧化酶 乳酸脱氢酶 白细胞介素 肿瘤坏死因子 b 细胞淋巴霄自血痒2 基因 蛋白5 3 或癌蛋白5 3 紫外线 核因子r b 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 核因子一r b p 6 5 1 抑制蛋白激酶 细胞外信号调节激酶1 2 氨基末端激酶 环氧合酶2 丝裂素活化蛋白激酶 n 甲基一d 一天冬氨酸受体 n - 甲基d 天冬氨酗受体 钙调蛋白依赖性蛋白激酶 l l 基质金属蛋白酶 中英文缩略词对照 一一_ 一 删g p 4 5 0 2 e l n - m e t h y i - n - n i ( x o = n - n i m x d g u a n i d i n e 甲基硝基亚硝基胍 c y t o c h r o m ep 4 5 0 2 e 1 细胞色素p 4 5 0 2 e i 引 原花青素对缺血性脑损 研究生： 导师：张艳教授、张莉蓉教授 郑州大学基础医学院药理学教研室 河南郑州4 5 0 0 0 1 引言 脑缺血是严重危害人类健康的疾病之一，随着世界人口的老龄化，脑缺血 的发病率不断增高，且发病年龄日趋年轻化。在部分国家，其死亡率已经超过 了心脏病和癌症，居三大死因首位，对脑缺血的防治已成为当今医学界的重点。 大量动物实验及临床研究表明，脑缺血再灌注期间发生着复杂的病理生理变化。 近年来，随着分子生物学的发展，对脑缺血再灌注损伤的研究日益深入，发现 它的机制主要包括能量耗竭和酸中毒、细胞内外离子失衡、兴奋性氨基酸在脑 缺血中的毒性作用、氧自由基的损伤、白细胞的浸润、炎性因子的损害、血脑 屏障的破坏及细胞凋亡等等。 随着基础医学的发展，对离子通道的研究也越来越广泛和深入。最近，科 学家发现一种可通透钙离子和钠离子的阳离子通道，它在炎症、肿瘤或缺血的 情况下被激活，引起细胞膜去极化，产生兴奋作用。它就是目前基础医学研究 的热点之酸敏感离子通道( a c i d s e n s i n gi o nc h a n n e l s ，a s i c s ) 。它包括6 个亚 基，即a s l c l a ，a s i c i b ，a s i c 2 a ，a s i c 2 b ，a s i c 3 和a s i c 4 。研究表明，炎症 和脑缺血时周围组织中a s i c l a 亚基的表达显著升高，这提示了a s i c l a 可能与脑 缺血再灌注损伤有关。本研究的目的就是建立大鼠左侧大脑中动脉脑缺血再灌 注模型，并用原花青素( p r o c y a n i d i n ，p c ) 干预后，观察该药物对大鼠的行为 学评分，脑组织形态学，炎性指标及a s i c l a 蛋白表达的影响，进一步探讨p c 对 脑缺血保护作用的机制。、 材料与 材料与方法 1 实验材料 1 1实验动物实验采用健康成年雄性s d 大鼠，体：重3 0 0 + 5 0 9 ，购自河南省 实验动物中心。 1 2 主要药品与试剂 原花青素 i n o s 测定试剂盒+ m p o 测定试剂盒 b c a 蛋白定量试剂盒 a s i c la 抗体 r i p a 裂解液 m a k e r 辣根过氧化物酶标记兔抗羊抗体 p - a c t i n 一抗 p a c t i n 二抗 免疫组化试剂盒 无水乙醇 水合氯醛 。 多聚甲醛 甲醇 碳酸钠 硼酸 硫代硫酸钠 溴化钾 硫酸铝钾 冰乙酸 甘油 2 安阳晶森天然产物有限公司 南京建成生物工程研究所 南京建成生物工程研究所 碧云天生物技术研究所 美国s a n tc n l z 公司 碧云天生物技术研究所 北京全世金试剂公司 北京联科生物试剂公司 北京博奥森试剂公司 北京博奥森试剂公司 北京博奥森试剂公司 天津恒兴化学试剂厂 武汉星空友邦贸易有限公司 广州化学试剂厂 天津恒兴化学试剂厂 天津恒兴化学试剂制造有限公司 天津恒兴化学试剂制造有限公司 天津恒兴化学试剂制造有限公司 天津恒兴化学试剂制造有限公司 天津恒兴化学试剂制造有限公司 郑州派尼化学试剂厂 a m g l e s o d 公司 材料与 丙烯酰胺 甲叉丙烯酰胺 过硫酸铵( a p s ) 亚硫酸钠 磺基水杨酸 吐温 丽春红 二硫苏糖醇( 聊r r ) 甘氨酸 三羟甲基氨基甲烷( s ) 三氯乙酸 e c l 发光液 四甲基二乙胺( t e m e d ) 十二烷基磺酸钠( s d s ) 1 3 主要仪器 超速低温离心机 显微镜 u v 2 1 0 2p c s 型紫外可见光分 光光度计 内切式电动匀浆机 d k - 8 d 型电热恒温水槽 z d 一8 5 恒温振荡器 s k - 1 型快速混匀器 s z 9 3 自动双重纯水蒸馏器 1 0 1 2 型电热鼓风箱 d g 5 0 3 1 酶标仪 电子天平 p h 计 移液枪 低温冰箱 3 天津恒兴化学试剂厂 美国s i g m a 公司 s a n l a n d - c h 锄i n t a n a t i o n a li n c s a n l a n d c h e mi n t e m a t i o n a li n c s a n l a n d c h e mi n t e m a t i o n a li n c s a n l a n d c h e mi n t e m a t i o n a li n c 天津市科密欧化学试剂厂 碧云天生物技术研究所 北京鼎国生物技术有限公司 美国s i g m a 公司 h e r a e u s 公司 日本n i k o n 公司 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 浙西机械厂 上海精宏实验设备有限公司 金坛市诚辉仪器厂 江苏金埴医疗仪器厂 上海亚荣生化仪器厂 上海第二五金厂 华东电子集团医疗装备有限公司 s a r t o r i n s 公司 h a n n a 公司 g i l s o n 公司 新飞公司 材料与方法 超低温冰箱 电泳仪 美菱公司 b i o - r a d 公司 2 方法 2 1分组及给药将1 2 0 只s d 大鼠随机分为5 组，每组2 4 只，即假手术组、模 型组及p c 低、中、高剂量( 5 0 、1 0 0 、2 0 0 r a g k g - 1 ) 组。p c 各组分别在缺血前3 0 分和缺血后2 小时腹腔注射相应浓度的p c 溶液，假手术组和模型组给与等体积的 n s 。再灌注2 4 小时从各组中随机抽取8 只观察病理组织形态学变化和用免疫组化 的方法测定a s i c l a 的表达，8 只测缺血脑组织中诱导型氧化氮合酶( i n d u c i b l e n i t r i co x i d es y n t h a s e ，i n o s ) 、髓过氧化物酶( m y e l o p e r o x i d a s e ，m p o ) 的活 性，8 只用w e s t e r n b l o t 法测定海马组织中a s i c l a 蛋白的表达量。 2 2 脑缺血再灌注模型的制作采用线栓法建立大鼠左侧脑缺血再灌注模 型，步骤如下： 将直径为0 2 4 m m 的尼龙鱼线剪成约5 0 m m 的线段，并将鱼线的一端烫成 光滑的圆球状。在距圆头端2 0 m m 处用黑色记号笔作标记，7 5 乙醇消毒后置于 生理盐水中。 用1 0 的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，剂量为3 5 m l k g - 1 。将大鼠仰卧位 固定于手术台上，常规消毒颈部皮肤后，从颈正中线切开皮肤，钝性分离皮下 组织，暴露颈动脉三角。分离左侧颈总动脉( c o m m o nc a r o t i da r t e r y ，c c a ) ， 颈外动脉( e x t e r n a lc a r o t i da r t e r y ，e c a ) ，颈内动脉( i n t e r n a lc a r o t i da r t e r y ，i c a ) ， 翼腭动脉( p t e r y g o p a l a t i n ea r t e r y ，p p a ) 和迷走神经。 电凝e c a 上的分支枕动脉、甲状腺上动脉等，防止拉断出血，结扎p p a 。 永久结扎e c a 的远心端，在距结扎处3 m m 处的近心端位置结扎并留下 5 c m 的线头，在两个结扎点中间电凝烧断。 用动脉夹夹闭c c a 和i c a ，将e c a 拉直，使之与i c a 在一条直线上， 在e c a 的结扎位置附近用眼科剪剪- - d , 口，由此切口插入备用鱼线，缓缓送入 i c a ，松开i c a 上的动脉夹，同时继续将鱼线向前推进，当插入深度为( 1 9 0 5 ) i t l m 时会感到明显阻力，表明栓线已进入大脑中动脉的入口处。将鱼线和e c a 一起结扎。 4 血2 2 3 的大 展对 丧失。剔除0 分和4 分及术后死亡动物。 2 4 脑组织形态学观察再灌注2 4 d 时，各组随机抽取8 只大鼠，在冰台上断 头取脑，在视交叉处沿冠状面切下厚约3 m m 的脑片，迅速置于4 c1 0 的多聚甲 醛溶液中固定2 4 d 时后，按下列步骤制作病理切片： 将脑组织置于石蜡包埋盒中，用自来水冲洗2 4 d , 时，冲净固定液； 将组织块依次浸于下列溶液中脱水至透明：7 5 乙醇( 5 m i n ) 8 0 乙醇 ( 5 m i n ) 9 0 乙醇( 5 m i n ) 9 5 乙醇( 5 m i n x 2 次) 1 0 0 乙醇( 5 r a i n x 2 次) 二甲苯( 1 0 r n i n x 2 次) ； 石蜡包埋：先将组织浸于5 4 5 6 。c 的软蜡中1 5 2 d 时，使组织浸透石蜡， 再将组织浸于5 6 5 8 。c 的硬蜡中1 5 2 小时，然后在2 0 冰箱中最少冻2 d , 时； 用切片机将包埋好的蜡块切成厚约4 1 a m 的连续石蜡切片，切完后立即在6 0 下烤2 3 d , 时，以防脱片； 将切片依次浸入下列溶液中脱蜡：二甲苯( 1 0 m i n x 2 次) - 1 0 0 乙醇( 5 r a i n 2 次) 一9 5 乙醇( 5 r a i n x 2 次) 9 0 乙醇( 5 m i n ) 8 0 乙醇( 5 m i n ) 7 5 乙醇 ( 5 r a i n ) 蒸馏水( 5 m i n x 4 次) ； 染细胞核：将切片浸入配好的苏木素溶液中2 3 r a i n ，放入蒸馏水中浸洗 5 m i n 后浸入盐酸酒精中1 - 2 s e e ，再马上浸入蒸馏水中l o r n i n 返蓝，再用蒸馏水浸 洗5 m i n x3 次； 染细胞浆：将片子浸入0 5 的伊红溶液中5 r a i n 后，用蒸馏水浸洗5 m i n x 3 次； 将片子浸入下列溶液中脱水至透明：7 5 乙醇( 1 s e e ) 8 0 乙醇( 1 s e e ) 一9 0 乙醇( 1 s e e ) 一9 5 乙醇( 1 s e e x 2 次) 1 0 0 乙醇( 2 m i n x 2 次) 二甲苯( 1 0 m i n x 2 次) ： 5 片 轻轻盖在 观 2 5 免疫组化测定a s i c l a 的表达取左侧大脑，从视交叉后3 m m 处切取厚 约5 m m 的冠状切片，4 。c 1 0 多聚甲醛溶液中固定2 4 d 时后，置于石蜡包埋盒中 用自来水冲洗2 4 d , 时，冲净固定液。 将组织块依次浸于下列溶液中脱水至透明：7 5 乙醇( 5 m i n ) 8 0 乙醇 ( 5 m i n ) 一9 0 乙醇( 5 m i n ) 9 5 乙醇( 5 m i n x 2 次) 一1 0 0 乙醇( 5 m i n x 2 次) 一二甲苯( 1 0 m i n 2 次) ； 石蜡包埋：先将组织浸于5 4 5 6 。c 的软蜡中1 5 2 小时，使组织浸透石蜡， 再将组织浸于5 6 5 8 的硬蜡中1 5 2 小时。然后在一2 0 冰箱中最少冻2 小时； 用切片机将包埋好的蜡块切成厚约4 p m 的连续石蜡切片，切完后立即在 6 0 下烤2 3 小时，以防脱片； 将切片依次浸入下列溶液中脱蜡：二甲苯( 1 0 r a i n 2 次) 一1 0 0 乙醇( 5 m i n 2 次) 9 5 乙醇( 5 m i n 2 次) 一9 0 乙醇( 5 m i n ) 一8 0 乙醇( 5 m i n ) 一7 5 乙 醇( 5 m i n ) 蒸馏水( 5 m i n 4 次) ； 抗原修复：将片子浸入配好的枸橼酸钠缓冲液( p h = 6 o ) 中，在9 2 - 9 8 。c 下加热1 5 分后，冷却至室温，用蒸馏水洗5 m i n x3 次； 在每张片子上滴加新鲜配制的3 过氧化氢溶液各5 0 l a l ，室温放置1 0 分， 灭活内源性过氧化物酶，再用蒸馏水浸洗5 m i n x3 次： 每张片子上各滴加免疫组化试剂盒中的血清各5 0 1 x l ，置于湿盒内，室温 下封闭3 0 m i r a 将羊抗大鼠的a s i c l a 抗体( s a n tc r u z 公司，批号：c 2 8 0 8 ) 用p b s ( p h 7 2 7 4 ) 稀释至1 ：1 0 0 后，在每张片子上各滴加5 0 l a l ，置于湿盒内，室温 下放置3 0 r a i n 后放4 4 c 冰箱孵育过夜； 从冰箱中取出湿盒，室温下放3 0 m i n 后用p b s 浸洗5 m i n x 3 次后，每张 片子上各滴加试剂盒中生物素标记的兔抗羊二抗5 0 j t l ，于湿盒内室温下孵育 3 0 m i r a 二抗孵育完毕后，用p b s 浸洗5 m i n x 3 次，每张片子上各滴加试剂盒中 辣根过氧化物酶标记的三抗5 0 i t l ，于湿盒内室温下放置3 0 m i r a 6 ( 1 0 m i n x 2 次) ； 片子晾干后，用牙签蘸中性树脂滴一滴到片子上，再捏住盖玻片的一角， 轻轻盖在树脂上，再轻按盖玻片，赶出气泡和多余树脂； 观察，照相。光镜下观察到a s i c l a 阳性表达的细胞为棕色，而不着色或 仅呈淡的背景色为非特异性反应。 根据阳性细胞数的多少对染色结果进行半定量分析，分别评为i 级。 阳性细胞数1 0 ( i 级) ；1 1 2 5 ( i i 级) ；2 6 5 0 ( i l l 级) ；5 0 ( i v 级) 。 2 6w e s t e r n b l o t 法测定海马组织中a s i c l a 表达量 蛋白提取：再灌注2 4 小时，随机抽取8 只大鼠，断头取脑，分离出左侧 海马，称重后按l m g ：1 2 t t l 的比例加入细胞裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，匀浆 充分后在4 。c 下，1 2 0 0 0 克离心5 分钟，取上清液按4 ：1 的体积比加入5 份上 样缓冲液，在9 8 水浴中煮5 分钟，变性后的蛋白分装保存； 灌胶、上样：配置1 0 的分离胶1 0 m l ，均匀灌入两玻璃夹板中，加2 m l 无水乙醇压顶，室温放置3 0 分钟倒去水，用吸水纸吸干；配5 的浓缩胶5 m l ， 摇匀后加入，然后将梳子插入浓缩胶中，等浓缩胶凝后拨出梳子，倒入电泳缓 冲液，将m a r k e r 5 t d 和蛋白样品2 0 t t l 孔上样； 7 p v d 缓冲 转膜：在转膜液中制作“三明治”：从下至上分别是海绵、3 张滤纸、胶、 膜、3 张滤纸，并逐层赶气。1 0 0 v 恒压下转2 h 。转膜后凝胶用考马斯亮兰、p v d f 膜用丽春红染色，观察转膜情况； 封闭：将膜放入5 脱脂奶粉中封闭，室温摇动2 h 后用t b s t 缓冲液洗 膜3 次，每次5 分钟； 一抗孵育：a s i c l a 一抗用t b s t 稀释至l ：2 0 0 ，1 3 - a c t i n 稀释比为l ：4 0 0 ， 室温2 h 后4 冰箱孵育过夜。用t b s t 洗膜5 次，每次5 分钟； 二抗孵育：二抗稀释比例为1 ：8 0 0 0 ，室温下摇床上孵育1 小时，用t b s t 洗膜5 次，每次5 分钟； e c l 显色和曝光：在暗室中将p v d f 膜与等量的a b 混合液充分接触， 去尽残液，保鲜膜包好，放入x 光片暗匣中。将胶片剪裁适当大小( 要能覆盖 住整张膜) 后放在膜上，关紧暗匣，开始计时，根据发光的强弱适当调整曝光 时间，一般为1 分钟到3 0 分钟； 显影，定影：曝光完成后，打开暗匣，迅速取出胶片，浸入显影液中显 影，待出现明显条带后，终止显影。将胶片在自来水中涮一下，再浸入定影液 中，待胶片变透明后，取出晾干； 用凝胶成像分析系统扫描胶片上各条带的相对灰密度值，并做统计分析。 2 7 脑组织匀浆的制备冰盒上将大鼠断头处死，迅速取左侧大脑，电子天 平称重后，放入试管中。按1g ：9m l 的比例加n 4 * c 的生理盐水，制成1 0 的脑 组织匀浆。 2 8 蛋白含量的测定取上述脑匀浆，用超速低温离心机在4 。c 下，1 0 0 0 克离 8 应用s p s s l 3 0 统计软件进行数据分析。定量资料以均数标准差( ；- v s ) 表示，定量资料采用单因素方差分析，其中两组间的比较采用q 检验；计数资料 采用非参数检验的方法进行分析。 9 比， 显著 表1p c 对脑缺血再灌注损伤后大鼠行为学评分的影响 叩 o 0 1v s 假手术组； b p 0 0 5 v s 模型组； w o p 0 o lv s 模型组 2 脑组织形态学观察 假手术组神经元形态正常，结构完整，无间质水肿，神经元胞浆丰富、均 匀，核仁清晰；模型组神经元细胞核模糊乃至溶解，神经元数量减少；p c 各组 均能不同程度的改善细胞的肿胀、核固缩、核溶解现象，减轻间质水肿( 见图 1 图5 ) 。 3 缺血区脑组织中a s i c l a 的表达 与假手术组相比，模型组a s i c i a 的表达显著升高( p o 0 5 ) ，而p c 中剂量组的a s i c l a 表达降低( p o 0 5 ) ，p c 高剂量组的a s i c l a 表达明显降低( p o 0 5 ) ( 见图6 图1 0 和表2 ) 。 1 0 结果 表2p c 对脑缺血再灌注损伤后大鼠缺血区脑组织中a s i c i a 表达的影响 组别 剂量( m g k 9 1 ) i 级l i 级i 级级 假手术组0 6200 模型组曲0 0l34 p c 低剂量组5 0223l p c 中剂量组b 1 0 0232l p c 高剂量组蝻2 0 04220 a a p 0 o l v s 假手术组；b e 0 0 5 v s 模型组；w o p 0 0 1 m 模型组 4 海马组织中a s i c l a 的表达 与假手术组相比，模型组a s i c i a 的表达显著升高( p o 0 1 ) ；与模型组相 比