（分析化学专业论文）紫细菌光合反应中心蛋白的能量转移和电子传递研究.pdf

堡皇查堂堕主兰垡垒奎 ! 奎塑墨一 中文摘要 ，一l 生物光电功能材料是自然界数亿万年生物进化的结果，其结构和功能是目前 任何谷成材料均无法比拟和替代的。迄今为止，性能最优越的人工光电器件仅达 到天然蛋白质光电转换效率的1 5 左右。在相关的光电功能蛋白质中，从紫红细菌 肋s p h a e r o i d e s 中分离出来的反应中心复合体( 简称r c ) 是最引人关注的一类 光电功能蛋白质。r c 蛋白复合体由蛋白质亚基和多个参与电子传递的电对组成。 r c 能高效吸收太阳光，并迅速将光能转变为化学能并伴随一系列能量分配与电荷 转移。这些电对共同参与了蛋白质内光诱导的复杂多途径电子与质子传递过程。 有关紫细菌光合反应中心蛋白的研究，特别是对反应中心蛋白内的电子传递过程 的研究，国际刊物上每年有数百篇文章发表，是目前研究的一个热点。但大多数 研究都是采用单纯的光谱法对光电过程进行间接研究，无论是光电反应参数还是 电子转移机理至今仍有许多不清楚的地方，直接采用电化学方法进行该蛋白内电 子的传递过程的研究更不多见。如何深入研究光诱导或电驱动的电子转移过程， 对于揭示蛋白在基态j 激发态专基态过程中能量与物种的变化与转换、构建分子 水平仿生光电器件有十分重要的意义。f 本文围绕r c 蛋白构建的人工蛋白复合膜，主要采用电化学及光电化学手段， 进行了一系列具有原始创新性的研究工作，并取得了以下有意义的结果。 第一，鉴于电极材料与蛋白质的结合是制作生物光电器件的必要步骤，首次 系统地研究了该蛋自在电极表面不同固定方法，如自组装方法、a 1 2 0 3 溶胶凝胶 法等：遗该研究对于制作仿生的光电转换器件、优化其生物光电转换性能具有重要 意对 第二，采用电化学方法详细研究了自组装光合蛋白复合膜的热力学和动力学 特征，直接测定了蛋白内各电子递体的氧化还原电位及电子传递的速率常数，对 于深入理解蛋白内的电子传递及能量转移机理具有重要作用。 第三，采用电场诱导，结合电化学检测方法首次研究了紫细菌反应中心蛋白 内多电对的复杂电子传递过程。有关的技术可以对表面纳克级水平的蛋白质的光 电行为进行现场表征x 根据电化学信号的变化推导出蛋白内原初电荷分离和电子 传递机制，补充和佐证了文献中用超快光谱法获得的电子转移机理。矿 第四，首次研究了在含连二亚硫酸钠的溶液中，该光合蛋白在自组装单层膜、 自组装多层膜、纳米t i 0 2 吸附膜和a 1 2 0 3 胶体膜中的光电化学行为；提出了该蛋 白在含连二亚硫酸钠的溶液中的光电转换机理；也研究了溶液电位、溶液p h 、蛋 白浓度等对光电流的影响。 第五，详细研究了蛋白直接电化学所需要克服的界面特异性、相容性以及蛋 复旦大学博士学位论文 中文摘要 白失活等问题并由此探索了控制功能蛋白质膜界面动力学过程的手段。如首次采 用不同的双功能试剂控制蛋白在电极表面的方位，采用不同水铝比的胶体控制光 电极的性质等。 第六，探讨了采用植物脱镁叶绿素及其它人工色素替代蛋白内细菌脱镁叶绿 素后的电化学和光电化学行为差异以及天线蛋白的直接电化学，补充和佐证了文 献中用光谱、超快光谱法等获得的结果，进一步阐明了光合作用过程中的电子传 量转移机理、解析了蛋白质的结构和功能的关系。 体地，论文共包括以下七部分内容： 一、绪论 在本部分中，首先详细介绍了紫细菌光合反应中心蛋白的结构、各辅助因 子的电化学性质、蛋白内的电子传递过程以及蛋白结构和电子传递的关系。其次 全面总结了紫细菌光合反应中心蛋白内电子传递的研究方法及研究成果。文献中 报道主要的研究方法有：( 1 ) 时间分辨的各种光谱；( 2 ) 电化学方法；( 3 ) 色素 替代和定点突变；( 4 ) 其它研究方法，如x 一光晶体衍射技术、拉曼光谱等。最后 介绍了蛋白质在电极上的固定方法及研究进展。蛋白质在电极上的固定方法主要 有：表面活性剂包埋、自组装方法、溶胶一凝胶方法、纳米材料吸附、l b 膜技术、 共价连接法以及蛋白膜法等。 二、紫细菌光合反应中心蛋白的自组装复合膜的电化学研究 l 、采用自组装单层膜方法在金电极表面形成有序的蛋白复合膜，使用方波伏 安法研究了该蛋白膜的电化学行为，成功地检测到该蛋白内多电对可逆或准可逆 的电子转移过程，探讨了方波伏安图中各氧化还原峰的归属并考查了测试参数、 测试条件等的影响。同时，通过对方波数据的非线性拟合，获得了该蛋白复合膜 内主要电对的标准氧化还原电位、电子转移速率常数及电子转移系数等重要参数。 另外，还研究了选用不同双功能试剂( 如巯基乙酸、巯基乙醇、巯基乙胺、对苯 二胺、邻苯二胺、苯胺亚砜等) 固定蛋白时，该复合膜的电化学行为的差异。 2 、采用方波伏安法首次直接地跟踪到电场诱导下蛋白内多电对的复杂电子传 递过程。外加正电场时，蛋白膜内各电活物质激发态的浓度均增加；而外加负电 场时，蛋白膜内激发态初级电子受体和电子供体的浓度依次降低，并探讨了相应 的电子传递机理。作为对照，也研究了光激发蛋白内的电子传递过程。另外，光 谱电化学结果和光电流实验结果表明，所施加的电场不会破坏蛋白的结构，蛋白 仍具有良好的光电转换功能。 3 、首次采用不同的双功能试剂( 巯基乙胺和巯基苯胺) 固定陔蛋白，发现这 i i 枣 一 两种蛋白膜的电化学特征具有很大的不同。方波伏安的差异、电场驱动电子传递 的差异以及光电流的差异都表明光合蛋自在电极上具有不同的表面结合位点。采 用电场驱动的方法，也首次观测到蛋自在电极上调整方位过程。 三、紫细菌光合反应中心蛋白的自组装复合膜的光电化学研究 首次详细研究了自组装蛋白有序单层及多层复合膜的光电化学行为。对自组装 蛋白单层膜，在连二亚硫酸钠稀溶液中可观测到阳极光电流，测得的光电流的量 级为l o n a c m 2 。详细讨论了在连二亚硫酸钠存在时蛋白的光电流产生机理。 采用自组装多层技术在巯基乙酸修饰的电极上首次制备了聚阳离子( p d d a ) 和光合蛋白的多层蛋白复合膜。通过紫外可见吸收光谱、电化学和光电流测试观 察到了高于2 0 层蛋自膜的线性生长。光电流测试结果表明，对单层蛋白膜，其光 电流约为8 5 n a c m 2 ；对2 4 层蛋白的复合膜，其光电流约为7 7n a c m 2 ，单层蛋白 的平均光电流为3 2n a c m 2 。另外，还研究了电极电位和p h 值对光电流的影响。 四、紫细菌光合反应中心蛋白的凝胶复合膜的光电化学研究 首次采用a 1 2 0 3 胶体固定光合蛋白来制作光电极，测定了该电极连二亚硫酸 钠稀溶液中的光电化学响应：探讨了胶体的水铝比、蛋白的浓度、溶液的电位以 及d h 值对光电流的影响。实验结果表明：( 1 ) 胶体的水铝比影响溶胶一凝胶基体 的孔尺寸，会导致光电极的最大光电流和峰形的变化。( 2 ) 光电流随着胶体中蛋 白浓度的增加而增加。在该玻碳电极上，所用蛋白浓度每增加l m m ( 在该电极上 蛋白量每增加约0 1 g ) ，其平均的光电流增加2 8 n a 。( 3 ) 产生光电流的最佳p h 范围为中性p h 区。根据实验结果，提出了胶体蛋白复合膜的光电转换机理。对采 用不同水铝比的胶体所制成的电极，在不同溶液电位下也观测到完全不同的光电 流曲线( 在光电流曲线上可能观测到一个、两个甚至三个氧化峰) 并讨论了其形 成原因。另外，蛋白在胶体中的吸收光谱、圆二色谱以及光电流测试结果表明， 在胶体中，该光合蛋白仍保持其天然结构和活性。 五、纳米t i 0 2 固定的紫细菌光合反应中心蛋白复合膜的光电化学研究 首次采用纳米t i 0 2 固定该光合蛋白。研究了该复合膜的吸收光谱、方波伏安 特性以及光电转换性质。该纳米材料由电化学沉积法制备，扫描电镜的结果表明， 纳米t i 0 2 薄膜比较均匀，其颗粒尺寸在5 0 7 0 n m 范围内。该光合蛋白复合膜的 吸收差谱和方波伏安结果都表明，蛋白被有效固定在电极表面。光电流实验结果 表明，采用蛋白敏化的纳米t i 0 2 电极的光电流约是无蛋白敏化电极的2 3 倍， 其光电流为2 3 吣c m 2 。实验结果表明，蛋白在纳米t i 0 2 上仍保持其结构和光 1 1 1 复旦大学博士学位论文 中文摘要 电转换特性。本研究也表明，该纳米蛋白复合膜不但能吸收短波长的紫光或紫外 光，而且可吸收红光或红外光，从而能拓宽光电转换器件对太阳光的吸收范围， 更充分利用太阳光能。 六、天然光合蛋白和脱镁叶绿素替代蛋白内电子传递性质差异的研究 采用植物脱镁叶绿素或其类似物替换光合蛋白内细菌脱镁叶绿素，首次用方波 伏安法表征了它们的电化学差异，同时也研究了替换后的吸收光谱、荧光发射光 谱以及光电流特性的差异。荧光光谱的结果表明，在替换的蛋自中，存在更高浓 度的激发态细菌叶绿素二聚体( p ) 。电化学结果表明，在替换的蛋白中，从p 到 脱镁叶绿素及初级泛醌的电子传递部分地被阻止；而且，所替换蛋白的p 比天然 蛋白具有更正的氧化还原电位。电化学结果也充分验证了文献中用光谱法或超快 光谱法获得的结果。光电流的测试结果表明，经替换的蛋白比天然的蛋白具有更 大的短路光电流。整个实验表明，采用自组装技术和电化学检测，可探测相似氧 化还原蛋白之间电子传递的差异，且蛋白消耗量在纳克级水平。 七、紫细菌天线蛋白( l h 2 ) 的电化学及光电化学研究 紫细菌光合反应中心天线蛋白又称集光色素蛋白复合物，其位置环绕在反应 中心蛋白的周围，其功能是接收光能并将其传递给反应中心蛋白。首次采用自组 装方法将该蛋白制成蛋白复合膜，研究了其电化学行为和光电化学行为。本部分 也研究了该蛋白的吸收光谱、荧光发射光谱。实验结果表明，采用不同波长激发 该天线蛋白时，在8 0 0 n m 和8 5 0 n m 处的荧光发射明显不同。所测得的吸收光谱和 文献报道的基本一致，其庵化学行为和光电化学响应非常类似于反应中心蛋e 0 卜 i 关键词：紫细菌光合反应电参天线色素复合物，电子传递，方波伏安法，色素 替代，自组装单层膜 墨呈盔兰竖圭兰焦堡壅茎奎塑墨一 a b s t r a c t b i o p h o t o e l e c t r i cc o n v e r s i o nm a t e r i a li st h ed e r i v a t i o no f t h en a t u r ef o rm i l l i o n so fy e a r s s ot h a ti t ss t r u c t u r ea n df u n c t i o nc a n n tb ea s s i m i l a t e da n dr e p l a c e db ya n ys y n t h e t i cm a t e r i a l s a m o n g t h ep r o t e i n sw i t ht h ep h o t o e l e c t r i cf u n c t i o n ，t h ep h o t o s y n t h e t i cr e a c t i o nc e n t e r ( r c ) i s o l a t e df r o mr b s t ，h a e r o i d e s i st h em o s ta t t r a c t i v eo n e t h er ci s a p i g m e n t - p r o t e i n c o m p l e x ，c o n t a i n i n g3s u b u n i t sa n d9c o f a c t o r s w h e nt h er c i se x c i t e db yl i g h t ，i tc o n v e r t s e f f i c i e n t l yt h el i g h te n e r g yt oc h e m i c a le n e r g y , m e a n w h i l e ，as e r i e so fc h a r g es e p a r a t i o na n d e l e c t r o nt r a n s f e r ( e t ) h a p p e n t h ec o f a c t o r si nr c p a r t i c i p a t ej o i n t l yi nt h ec o m p l i c a t e da n d p h o t o i n d u c e d m u l t i - r o u t e se t p r o c e s s e s t h e s t u d i e so ft h e p h o t o i n d u c e d a n d e l e c t r i c f i e l d - d r i v e ne t p r o c e s s e sa r ev e r yi m p o r t a n tf o rr e v e a l i n gt h em e c h a n i s mo f e l e c t r o n t r a n s f e ra n de n e r g yt r a n s f e ra n db u i l d i n gu pam i m i cp h o t o e l e c t r i ce l e m e n to nt h em o l e c u l a r l e v e l t h es t u d i e s f o r 尺6 s p h a e r o i d e s e s p e c i a l l y f o rt h ee tp r o c e s s e si nr c a r em o r e a t t r a c t i v ea n dh u n d r e d so f p a p e r sa r ep u b l i s h e de v e r yy e a r h o w e v e r , m o s to f t h es t u d i e so n t h ep h o t o e l e c t r i c p r o c e s s e sa r ep e r f o r m e db yt h es p e c t r a la n db i o l o g i c a lm e t h o d sa n da r e i n d i r e c t m o r e o v e r , m a n yp r o b l e m sa s s o c i a t e dw i t ht h ep h o t o e l e c t r i cr e a c t i o np a r a m e t e r sa n d t h ee tm e c h a n i s ma r es t i l lu n s o l v e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n ，t h ei n v e s t i g a t i o n ss u r r o u n d i n gr cw e r e c a r r i e do u tw i t ht h e e l e c t r o c h e m i c a la n d p h o t o e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d s ，a n d as e r i e so f t h ei n n o v a t i v er e s u l t sw e r e o b t a i n e d f i r s t l y , t h em a r r i a g eb e t w e e nt h ee l e c t r o d em a t e r i a la n dt h ep r o t e i nw a sn e c e s s a r yt o f a b r i c a t et h e b i o p h o t o e l e c t r i c e l e m e n t i tw a st h ef i r s tt i m et o s t u d ys y s t e m a t i c a l l y t h e i m m o b i l i z a t i o nm e t h o d so ft h er co nt h ee l e c t r o d e ，s u c ha st h es e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ( s a m s ) ，s o l g e lm e t h o d ，e t c t h i sr e s e a r c hw a s o f g r e a ts i g n i f i c a n c ef o rf u r t h e ru n d e r s t a n d i n g t h ee tp r o c e s s e sa n dt h ep h o t o e l e c t r i cc o n v e r s i o nm e c h a n i s mi nr c ，f a b r i c a t i n gt h em i m i c b i o p h o t o e l e c t r i ce l e m e n t a n d o p t i m i z i n gt h ep e r f o r m a n c eo f t h eb i o p h o t o e l e c t r i ce l e m e n t s e c o n d l y ，i m p o r t a n ti n f o r m a t i o na b o u ti n t r i n s i ct h e r m o d y n a m i ca n dk i n e t i cp r o p e r t i e s ( f o re x a m p l e ，m e a s u r i n gd i r e c t l yt h em i d p o i n tp o t e n t i a l ) w e r eo b t a i n e dw i t he l e c t r o c h e m i c a l r e a c t i o n so f p r o t e i nm o l e c u l eo nt h ee l e c t r o d e ，w h i c hm a d ei tp o s s i b l ef o rf u r t h e re x p l o r i n g t h em e c h a n i s m so fe ta n de n e r g yt r a n s f e ri nr ca n du n d e r s t a n d i n gt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no f p r o t e i n t h i r d l y , t h ee l e c t r i c - f i e l d i n d u c e dc o m p l i c a t e de tp r o c e s s e s i nt h er cs a m sw e r e s t u d i e df i r s t l yw i t ht h ee l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d t h er e s u l t sa b o u tt h em e c h a n i s mo fc h a r g e v 星旦盔兰竖主兰垡堡塞 蒌塞塑矍 s e p a r a t i o na n de tp r o c e s sc o n f i r m e da n ds u p p l e m e n t e d t h ep r e v i o u sr e s u l t so b t a i n e db yt h e t i m e - r e s o l v e ds p e c t r o m e t r y f o u r t h l y , t h ep h o t o e l e c t r i cr e s p o n s e s f o rt h er ci ns a m s ，n a n o - t i 0 2 a d s o r p t i o nf i l ma n d a 1 2 0 3s o l - g e l f i l mw e r es t u d i e d f i r s t l y i us o l u t i o n c o n t a i n i n g s o d i u md i t h i o n i t e ，t h e p h o t o e l e c t r i c c o n v e r s i o nm e c h a n i s mo ft h er ci nt h i ss o l u t i o nw a sa l s o d i s c u s s e d m e a n w h i l e ，t h ee f f e c t so f t h es o l u t i o np o t e n t i a l ，t h er c c o n c e n t r a t i o na n dp ho np h o t o e l e c t r i c r e s p o n s e so f r cw e r ea l s os t u d i e d f i f t h l y , s i n c ed i r e c t e tp r o c e s sw a so b s e r v e do n l ya f t e rt h e p r o b l e m so fi n t e r f a c i a l s p e c i f i c i t y , c o m p a t i b i l i t ya n dd e n a t u r a t i o n h a db e e no v e r c o m e ，w h i c ha l l o w e du st ol e a r n m u c ha b o u tt h ed y n a m i co p e r a t i o no fm a c r o m o l e c u l a ri n t e r f a c e sf o re x a m p l e ，t h ed i f f e r e n t r co r i e n t a t i o no nt h ee l e c t r o d ew a so b s e r v e df i r s t l yw i t hd i f f e r e n tb i f u n c t i o n a la g e n t s ，t h e r e s p o n s e so f t h e e l e c t r o d ew e r ec o n t r o l l e db yt h eh 2 0 a ir a t i oo f t h es o l - g e l l a s t l y , t h ee l e c t r o c h e m i c a la n dp h o t o e l e c t r o c h e m i c a ld i f f e r e n c e sb e t w e e nt h en a t i v er c a n d p h e o p h y t i n - e x c h a n g e dr c a n dt h ed i r e c te l e c t r o c h e m i s t r yo fa n t e n n a p r o t e i n ( l h 2 ) w e r e a l s os t u d i e d t h er e s u l t sc o n f i r m e da n ds u p p l e m e n t e dt h ep r e v i o u so n e so b t a i n e db yt h e p i c o s e c o n do rf e m t o s e c o n dt e c h n i q u e ，w h i c hf u r t h e ri l l u m i n a t e dt h ee tp r o c e s s e sa n dt h e p h o t o e l e c t r i cc o n v e r s i o nm e c h a n i s mi np h o t o s y n t h e s i sa n du n d e r s t a n d i n gt h er e l a t i o n s h i po f t h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no ft h er c t h ed i s s e r t a t i o ni n c l u d e ss e v e np a r t sa sf o l l o w s ： 1 i n t r o d u c t i o n i nt h i sp a r t ，t h r e ea s p e c t so f t h el i t e r a t u r ea b o u tt h ei n v e s t i g a t i o nw e r es u m m a r i z e d ：f i r s t ， t h es t r u c t u r eo fr c ，t h ee l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fc o f a c t o r s ，t h ee t p r o c e s s e si nr c a n d t h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h er cs t r u c t u r ea n de tp r o c e s s e sw e r ed e s c r i b e d s e c o n d ，t h e m e t h o d sa n dt h ea c h i e v e m e n t st o i n v e s t i g a t ee tp r o c e s s e si nr cw e r es u m m a r i z e d t h e m e t h o d sr e p o r t e di nl i t e r a t u r e sw e r ea sf o l l o w s ：( 1 ) t i m e - r e s o l v e ds p e c t r u mt e c h n i q u e s ，( 2 ) e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d ，( 3 ) p i g m e n t e x c h a n g eo rg e n em u t a n ta p p r o a c h ，( 4 ) o t h e rm e t h o d ， s u c ha sx r a yd i f f r a c t i o n ，r a m a ns p e c t r u m ，e t c t h i r d ，t h ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o d so f p r o t e i n o nt h ee l e c t r o d ea n dt h er e s e a r c hw e r ei n t r o d u c e d t h em e t h o d so f p r o t e i ni m m o b i l i z a t i o n i n c l u d e d ：e m b e d m e n tb ys u r f a c t a n t ，s e l f - a s s e m b l e d m o n o l a y e r s ，s o l - g e lm e t h o d ，a d s o r p t i o n b yn a n o - m a t e r i a l s ，l a n g m u i r - b l o d g e rm e t h o d ，c o v a l e n tc o u p l i n g ，e t c 2 d i r e c te l e c t r o c h e m i s t r yo ft h ec o m p o s i t eo r d e r e dr cp r e p a r e db ys e l f - a s s e m b l e d t e c h n i q u e 墨呈奈兰堕主堂垡堡奎 茎苎塑墨一 ( 1 ) s t u d y o nt h ee tf o rr ci nt h es e l f - a s s e m b l yc o m p o s i t ef i l m t h ec o m p o s i t eo r d e r e dp r o t e i nf i l mw a sa s s e m b l e do nt h es u r f a c eo f t h eg o l de l e c t r o d e b ys a m su s i n gm e s o - 2 ，3 - d i m e r c a p t o s u c c i n i ca c i d ( d m s a ) ，p o l y d i m e t h y l d i a l l y l a m m o n i u m c h l o r i d e ( p d d a ) a n dr cm e m b r a n ep r o t e i np u r i f i e df r o mp u r p l eb a c t e r i a ( r s 6 0 1 ) s q u a r e w a v ev o l t a m m e t r y ( s w v ) w a s e m p l o y e d t os t u d yt h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro f t h ep r o t e i n c o m p o s i t ef i l m r e v e r s i b l eo rq u a s i - r e v e r s i b l ee l e c t r o nt r a n s f e rf o r r e d o xc o u p l e st h e r e i nw a s s u c c e s s f u l l y d e t e c t e d t h er e d u c t i o n p o t e n t i a l f o re a c hr e d o x c o u p l e a n dt h e e l e c t r o c h e m i c a l l y d r i v e n e f f e c tw a sa l s od i s c u s s e d t h e t y p i c a l s w vr e s u l t sw e r e n o n l i n e a r l yf i t t e dt og e tt h ek i n e t i cp a r a m e t e r sf o rt h ec o m p o s i t ep r o t e i nf i l m i na d d i t i o n ，t h e e l e c t r o c h e m i c a ld i f f e r e n c e so fr cw e r eo b s e r v e dw h e nt h er cw a si m m o b i l i z e db yd i f f e r e n t b i f u n c t i o n a l a g e n t s ，s u c h a s m e ，2 - m e r c a p t o a c e t i ca c i d ( m a a ) ，p - p h e n y l e n e d j a m i n e ， o - p h e n y l e n e d i a m i n e ，o t o l i d i n e ，e t c ( 2 ) t h ee tp r o c e s s e s f o rr ci ns e l f - a s s e m b l yp r o t e i nf i l mi n d u c e db ye l e c t r i cf i e l d t h ee l e c t r i c - - f i e l d - i n d u c e de t p r o c e s s e si nt h er c s a m sw a so b s e r v e dd i r e c t l yw i t hs w v as e r i e so fr e d o xp e a k sf l u c t u a t i o n ，w h i c hr e f l e c t e dt h ec o n c e n t r a t i o n c h a n g e so fa c t i v e s p e c i e si nr cf i l mw e r eo b s e r v e d w h e n 一0 4v w a s a p p l i e d ，t h ec o n c e n t r a t i o no fb p h e i n r cf i l mi n c r e a s e d ，t h ec o n c e n t r a t i o no f q a 。a n dp + i nr cf i l md e c l i n e di nt u r n w h e no8v w a s a p p l i e d ，a l lt h ec o n c e n t r a t i o n so f a c t i v es p e c i e si nr cf i l mi n c r e a s e d u n d e ri l l u m i n a t i o n ， a l lt h ec o n c e n t r a t i o n so fa c t i v es p e c i e si nr c i n c r e a s e d ，t o o a f t e ri l l u m i n a t i o n ，t h ep r o c e s so f c h a r g e r e c o m b i n a t i o nw a sa l s oo b s e r v e dt h ep h o t o c u r r e n ta n d s p e c t r o e l e c t r o c h e m i c a l r e s u l t ss h o w e dt h a tt h es t r u c t u r ea n da c t i v i t yo ft h ep r o t e i nw e r ek e p te v e ni ft h ep o t e n t i a lo f o 8 vo r 一0 4 vw a sa p p l i e d i ts h o w e dt h a tt h es w v c o u p l e dw i t hb u l ke l e c t r o l y s i sw a sa p r o m i s i n ga p p r o a c ht os t u d yt h ee t i np r o t e i nc o n t a i n i n gm u l t i r e d o x - s p e c i e s ( 3 ) t h ep r o p e r t y d i f f e r e n c e so fp h o t o s y n t h e t i cr e a c t i o nc e n t e ro nt h e g o l d e l e c t r o d e i m m o b i l i z e db yd i f f e r e n tb i f u n c t i o n a lr e a g e n t s t h er c c o m p o s i t ef i l mw a sf a b r i c a t e db ys a m s w i t ht w od i f f e r e n tb i f u n c t i o n a lr e a g e n t s ， 4 - a m i n o t h i o p h e n o l ( a t p ) a n d2 - m e r c a p t o e t h y l a m i n e ( m e a ) ，r e s p e c t i v e l ys w v , b u l k e l e c t r o l y s i sa n dp h o t o c u r r e n tt e s tw e r ee m p l o y e df o rc h a r a c t e r i z i n gt h ec o m p o s i t ef i l m t h e d r a m a t i cd i f f e r e n te l e c t r o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sw e r eo b s e r v e df o rt h et w ot y p e so f f i l m s ， w h i c hs t r o n g l y s u g g e s t e d a no r i e n t a t i o n a ld i f f e r e n c ef o rr ca r i s i n gf r o mt h es t r u c t u r a l d i f f e r e n c eb e t w e e nt h et w ob i f o n c t i o n a lr e a g e n t s f o rr c m e a f i l m ，t h r e er e d o xp e a k sw h i c h i m p l y i n ge t b e t w e e npa n dt h eb a c t e r i o p h e o p h y t i n ( b p h e ) w e r eo b s e r v e d w h i l ef o rr c - a t p f i l m ，t w or e d o xp e a k si m p l y i n ge tb e t w e e nt h en o n h e m ei r o na n dt h ep r i m a r yq u i n o n e ( q a ) w e r eo b s e r v e dt h ee tb e h a v i o rd r i v e nb ye l e c t r i cf i e l da l s os u p p o s e dt h er e s u l tt h a tt h er c v i i 堑呈盔堂壁主堂垡堡皇兰苎查堕l c o u l db el i n k e dt ot h ee l e c t r o d ea td i f f e r e n ts i t e s t h es i t e - s p e c i f i ci m m o b i l i z a t i o na p p r o a c h r e p o r t e dh e r es u p p l i e d am e t h o dt od i f f e r e n t i a t et h ep r o t e i no r i e n t a t i o n 3 p h o t o e i e c t r o c h e m i s t r yo ft h e o r d e r e dc o m p o s i t er c f i l m sp r e p a r e db ys e l f - a s s e m b l y t e c h n i q u e f 1 ) p h o t o e l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h em o n o l a y e rr cf i l mp r e p a r e db ys e l f - a s s e m b l e d m o n o l a y e r s t h er cc o m p o s i t ef i l mw a sf a b r i c a t e db ys a m sw i t hm a a a n dp d d a t h ea n o d i c d h o t o c u r r e n tf o rt h ef i l mw a so b s e r v e di nt r i s - h c ib u f f e r ( p h80 ) c o n t a i n i n g0 01 ms o d i u m d i t h i o n i r e t h e m a g n i t u d e o fp h o t o c u r r e n tw a sa b o u t1 0 n ac m t h em e c h a n i s mo f p h o t o c u r