（分析化学专业论文）共振光散射技术测定hrp及磁性纳米粒子的制备应用.pdf

摘要 摘要 d n a 杂交检测及免疫分析在生命科学研究中具有重要的意义，广泛应用于生物学 研究、医学诊断等方面。随着生命科学的迅速发展，已有方法如放射性标记、酶标法等 的局限性已日益显露出来，所以研究普遍适用性好、操作简便、灵敏度高的d n a 杂交 检测及免疫检测新方法显得越来越迫切。 本文第一部分是测定生化分析中常用的一种标记物一辣根过氧化物酶( h i 冲) ，原理 是h r p 催化h 2 0 2 氧化四甲基联苯胺( t m b ) 生成大分子聚合物并产生强烈的共振光散 射，由此建立了操作简单快速、高灵敏度测定h r p 的新方法。探讨了酸度、t m b 浓度、 h 2 0 2 浓度、温度等对散射信号的影响。在最佳实验条件下测定h r p 的线性范围为 l x l 0 7 1 x 1 0 击g l ，最低检出限为1 8 x 1 0 一g l 。 第二部分是以1 ，6 一己二胺为氨基功能化试剂，利用水热一溶剂热的技术，一步合 成了带有氨基功能团、在水溶液中分散较好、尺寸合适的f e 3 0 4 纳米粒子。 第三部分是发现f e 3 0 4 纳米粒子能够催化h 2 0 2 氧化四甲基联苯胺生成蓝色物质， 当加入硫酸终止反应后颜色由蓝色变为黄色，最大吸收峰在4 5 0n l i l 处，且吸收峰强度 与f e 3 0 4 浓度成正比关系，应用这一现象我们设计利用固相杂交技术实现间接测定特定 的d n a 序列的含量。以标记特定序列寡聚核苷酸的磁性纳米粒子为探针，通过杂交反 应生成三明治复合体，其中f e 3 0 4 纳米粒子的量与待测靶序列的寡聚核苷酸浓度成正比。 然后用紫外分光光度法测定复合体上纳米粒子的含量，以确定待测靶序列的含量。 关键词辣根过氧化物酶四甲基联苯胺磁性四氧化三铁纳米粒子共振光散射 l ，6 己二胺 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ed e t e c t i o no fd n a h y b r i d i z a t i o na n di m m u n o a s s a yp l a yav e r yi m p o r t a n t r o l ei nl i f e s c i e n c e s t h e yh a v eb e e nw i d e l yu s e d i nb i o c h e m i s t r y , m o l e c u l a rb i o l o g ya n dm e d i c a l d i a g n o s t i c s w i t ht h ed e v e l o p m e n to ft h el i f es c i e n c e s ，t h ed i s a d v a n t a g e so ft h er o u t i n e m e t h o d s ，s u c ha st h er a d i o a c t i v ea s s a y , e n z y m a t i ca s s a y , h a v ea l r e a d yb e e nr e v e a l e d t h e n ，i t i sv e r yn e c e s s a r yt od e v e l o pn e w a n a l y s i sm e t h o d s w i t hh i g hs e n s i t i v i t y , s i m p l eo p e r a t i o na n d u n i v e r s a la p p l i c a b i l i t y h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) i sw i d e l yu s e da st h el a b e l sf o rb i o a s s a y an o v e la s s a y f o rd e t e c t i o no fh r pu s i n gr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) h a sb e e ne s t a b l i s h e d t h e m e t h o di sb a s e do nt h a t 3 , 3 ，5 ，5 - t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e ( t m b ) i s o x i d i z e dt of o r m m a c r o m o l e c u l ep o l y m e rb yh 2 0 2w i t hh r p c a t a l y s i s ，w h i c hr e s u l t si nt h ei n t e n s er l ss i g n a l t h i sa s s a yi s s i m p l e ，r a p i da n ds e n s i t i v e t h eo p t i m u ma n a l y s i s c o n d i t i o n sh a v e b e e n i n v e s t i g a t e d ，i n c l u d i n ga c i d i t y , t h ec o n c e n t r a t i o no ft m b a n dh 2 0 2 ，a n dr e a c t i o nt e m p e r a t u r e t h e r ei sag o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ei n t e n s i t yo fr l sa n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft h e h r pi nt h er a n g eo fl x1 0 7 - 1 x l o 6g la n dt h ed e t e c t i o nl i m i ti s1 8 1 0 一g l w i t h1 , 6 h e x a n e d i a m i n ea sa m i n e - f u n t i o n l i z a t i o nr e a g e n t ，af a c i l eo d e - s t e ps t r a t e g yi sp u t f o r w a r dt op r e p a r ea m i n e - f u n c t i o n a l i z e df e 3 0 4n a n o p a r t i c l e sw i t hg o o dm a g n e t i s m ，s u i t a b l e s i z e s ，g o o dd i s p e r s i b i l i t ya n dc r y s t a l l i n i t y t h eo x i d a t i o no f3 , 3 ，5 ，5 t e t r a m e t h y l b e n z i d i n eb yt h ef e 3 0 4 一n a n o p a t i c l e s h 2 0 2s y s t e m y i e l d sc o l o r e dp r o d u c t s w h e na d d i n gh 2 8 0 4 ，t h ep r o d u c t sf i n a l l yb e c o m ey e l l o wf r o mb l u e t h em a x i m u ma b s o r b a n c ep e a ki sa t4 5 0n l na n dt h e r ei sal i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e m a x i m u ma b s o r b a n c ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no ff e 3 0 4 s ow ed e s i g nam e t h o dt od e t e c t s p e c i f i cs e q u e n c ed n ai n d i r e c t l yw i t hu t i l i z i n g s o l i d h y b r i d i z a t i o n b yu s i n gs p e c i f i c s e q u e n c eo l i g o n u c l e o t i d em o d i f i e df e 3 0 4 - n a n o p a r t i c l e s ，t h es a n d w i c h t y p eh y b r i d sc a nb e f o r m e da f t e rt h eh y b r i d i z a t i o nr e a c t i o n t h ea m o u n to ff e 3 0 4 - n a n o p a r t i c l e sw a sp r o p o r t i o n a l t ot h ec o n c e n t r a t i o no ft a r g e to l i g o n u c l e o t i d e s w h e nt h ef e 3 0 4 一n a n o p a r t i c l e s a r e q u a n t i t a t i v e l y d e t e r m i n e d b yu s i n g u vm e t h o d ，t h ec o n c e n t r a t i o no ft h et a r g e t i i o l i g o n u c l e o t i d e sc a l lb eo b t a i n e d a b s t r a c t k e y w o r d sh o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e3 , 3 。，5 ，5 - t e t r a m e t h y l b e n z i d i n ef e 3 0 4 一n a n o p a t i c l e s r e s o n a n c et i g h ts c a t t e r i n g 1 , 6 - h e x a n e d i a m i n e 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名： 型弛 日期：竺生年上月上日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密叮。 ( 请在以上相应方格内打“ ) 保护知识产权声明 枞揿所掌蒯撅冽一易用 的学位论文，是我个人在导师( 撕指导并与导师合作下取得的研究成果， 声明人：查纽日期：塑! 年生月上日 作者签名： 导师签名： 日期：土犁年月生日 日期：j 趔上年厶月上日 第1 章引言 第1 章引言 蛋白质和核酸都是生命活动中最基本的物质，承载着生物体完成各种生物功能的任 务，所以，蛋白质及核酸的分析一直是生命科学中的重要课题。生命科学和化学在相互 渗透及彼此促进的发展进程中不断的向分析化学提出更高的挑战。在生命科学和化学的 研究中，不仅需要了解各种类型的蛋白质及核酸在结构和性能关系、存在状态及其与小 分子的相互作用等方面的知识，而且还必须在生物化学和临床分析中建立这些物质含量 的检测方法。因此研究普遍适用性好、操作简便、灵敏度高的蛋白质及核酸检测技术已 日益迫切。 酶( e n z y m e ) 大多数是由蛋白质组成，广泛的存在于生物体内。生物体每时每刻都在 进行着新陈代谢，而推动这一生命活动的动力便是酶。酶是存在于生物体内的一种催化 剂，在温和条件下催化生物体内几乎所有的化学反应，使生命进程得以延续。 1 1酶 酶是生物体内产生的能催化热力学上允许进行的化学反应的催化剂，其化学本质大 多数为蛋白质。酶类似于一般的催化剂，在催化反应进程中自身不被消耗，不改变化学 反应的平衡点，也不改变化学反应的方向，但能加快化学反应到达平衡点的时间。酶所 催化的反应叫酶促反应，发生化学反应前的物质称为底物，而反应后生成的物质称为产 物。酶除了具有一般化学催化剂的特征外，还具有一些特性：( 1 ) 高效性：酶的催化效 率比无机催化剂更高，使得反应速率更快；( 2 ) 专一性：一种酶只能催化一种或一类底 物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽【1 】；( 3 ) 多样性：酶的种类很多，大约有4 0 0 0 多种；( 4 ) 温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的。( 5 ) 活 性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。 1 1 1 酶的结构和功能 按照酶的化学组成可将酶分为单纯酶和结合酶两大类。单纯酶分子中只有氨基酸残 基组成的肽链，结合酶分子中则除了多肽链组成的蛋白质，还有非蛋白成分，如金属离 子、铁卟啉或含b 族维生素的小分子有机物。结合酶的蛋白质部分称为酶蛋白 ( a p o e n z y m e ) ，非蛋白质部分统称为辅助因子( c o f a c t o r ) ，两者一起组成全酶 l 河北大学理学硕十学位论文 ( h o l o e n z y m e ) ；只有全酶才有催化活性，如果两者分开则酶活力消失。非蛋白质部分如 铁卟啉或含b 族维生素的化合物若与酶蛋白以共价键相连的称为辅基( p r o s t h e t i c g r o u p ) ，两者以非共价键相连的称为辅酶( c o e i 亿舯e ) 1 - 2 】。结合酶中的金属离子有多方 面功能，它们可能是酶活性中心的组成成分；有的可能在稳定酶分子的构象上起作用； 有的可能作为桥梁使酶与底物相连接。辅酶与辅基在催化反应中作为氢( h + 和e ) 或某些 化学基团的载体，起传递氢或化学基团的作用。 酶的活性中心( a c t i v ec e n t e ro f e n z y m e ) 是由酶分子中必需基团所组成的特定空间 结构。这些必需基团是酶分子中直接参与催化反应的氨基酸残基的侧链基团。活性中心 包括结合部位( b i n d i n gs i t e ) 和催化部位( c a t a l y t i cs i t e ) 。前者决定酶与什么样的底物 结合，是决定酶专一性的部位；后者决定酶的催化能力。是酶催化性质和类型的决定部 位。结合基团的氨基酸残基数目因酶的种类的不同而异，可能是1 个，也可能是多个； 催化基团一般由2 3 个氨基酸残基组成【1 1 。 酶活性中心的氨基酸残基在一级结构上可以相距甚远，也可能位于不同肽链上，但 在空间结构上却相距很近，从空间结构上看，构成活性中心的氨基酸残基通过肽链的盘 绕折叠而彼此处于邻近位置，从而构成具有特定结构的活性中心。在结合酶类中，辅基 和辅酶大多数也参与活性中心的组成。构成酶活性中心的必需基团主要有h i s 的咪唑 基、s e r 的羟基、c y s 的巯基、g l u 的丫羧基等【2 】。当酶蛋白变性时，肽链展开，活性中 心被拆散，酶的活性因此丧失。 当然酶的催化活性仅有活性中心是不够的，其他结构成分也必不可少，因为这些结 构成分不仅维系着活性中心三维结构的骨架，还能与作用物广泛结合，近来结构研究表 明，除酶活性中心外其余结构部分还可以决定酶促反应的特异性，酶分子的调节区使酶 活性能够受到某些因子的正负调控。 1 1 2 酶活力及其测定 1 1 2 1酶活力【2 】是指一定条件下，酶催化某一化学反应的能力，酶活力大小就是指在 一定条件下所催化的某一化学反应速率的快慢，一般可以用在一定时间内反应物的减少 或产物的增加来表示，但由于酶促反应中，底物往往过量，不容易测定其减少量，而产 物的生成量容易准确测量，故一般都是选择测定产物的增加量。 1 1 2 2影响酶活力的因素 2 第1 章引言 ( 1 ) 酶浓度对酶促反应速度的影响 酶促反应的速度一般与酶分子的浓度成正比。当底物分子浓度一定时，酶分 子越多，底物转化的速度越快。但当酶浓度很高时，并不保持这种关系，变化曲 线逐渐趋向平缓。 ( 2 ) 底物浓度对酶促反应速度的影响 在生化反应中，若酶的浓度为定值，底物的起始浓度较低时，酶促反应速度 与底物浓度成正比，即随底物浓度的增加而增加。当所有的酶与底物结合生成中 间产物后，即使在增加底物浓度，中间产物浓度也不会增加，酶促反应速度也不 增加。在底物浓度相同条件下，酶促反应速度与酶的初始浓度成正比。酶的初始 浓度大，其酶促反应速度就大。 在实际测定中，即使酶浓度足够高，随底物浓度的升高，酶促反应速度并没 有因此增加，甚至受到抑制。其原因是：高浓度底物降低了水的有效浓度，降低 了分子扩散性，从而降低了酶促反应速度。过量的底物聚集在酶分子上，生成无 活性的中间产物，不能释放出酶分子，从而也会降低反应速度【2 1 。 ( 3 ) 温度对酶促反应速度的影响 酶是蛋白质，温度升高会使其逐渐变性而失去活性，所以各种酶都有适宜的 温度范围，在最适温度范围内，酶活性最强，酶促反应速度最大。在适宜的温度 范围内，温度每升高1 0 c ，酶促反应速度可以相应提高2 倍【2 1 。过高或过低的温 度都会降低酶的催化效率，即降低酶促反应速度。 ( 4 ) p h 对酶促反应速度的影响 酶在最适p h 范围内表现出活性，大于或小于最适p h ，都会降低酶活性。主 要表现在两个方面【2 】：过高或过低的p h 可以使酶的空间结构遭到破坏，引起酶 构象的改变，使酶遭受不可逆破坏，以致酶的活性丧失；当p h 改变不是很剧烈 时，酶虽未变性，但活力受影响。一方面p h 影响了底物的解离状态，或是使底物 不能与酶结合或是结合后不能生成产物；另一方面p h 影响了酶分子活性部位上有 关基团的解离，从而影响了与底物的结合或催化，使酶活性降低。 ( 5 ) 激活剂对酶促反应速度的影响 河北大学理学硕士学何论文 能激活酶的物质称为酶的激活剂。激活剂种类很多 1 - 2 1 ，有无机阳离子，如 钠离子、钾离子、铜离子、钙离子等；无机阴离子，如氯离子、溴离子、碘离 子、硫酸盐离子、磷酸盐离子等；有机化合物，如维生素c 、半胱氨酸、还原 性谷胱甘肽等。许多酶只有当某一种适当的激活剂存在时，才表现出催化活性或 强化其催化活性，这称为对酶的激活作用。而有些酶被合成后呈现无活性状态， 它必须经过适当的激活剂激活后才具活性。 ( 6 ) 抑制剂对酶促反应速度的影响 能减弱、抑制甚至破坏酶活性的物质称为酶的抑制剂1 。2 1 。它可降低酶促反应 速度。酶的抑制剂有重金属离子、一氧化碳、硫化氢、氢氰酸、氟化物、碘化乙 酸、生物碱、染料、对一氯汞苯甲酸、二异丙基氟磷酸、乙二胺四乙酸、表面活性 剂等。 1 1 2 3 酶活力测定的方法【1 - 2 】 ( 1 ) 分光光度法这一方法主要利用底物和产物对不同波长紫外或可见光部分吸收 的不同，选择某一适当波长的光，测定反应过程中反应进行的情况。 ( 2 ) 荧光法主要是根据底物或产物对荧光吸收性质的差别进行测定，该方法的优 点在于其不仅灵敏度比分光光度法要大若干数量级，而且荧光强度和激发光的光源有 关，特别适合于快速反应的测定。 ( 3 ) 同位素测定用放射性同位素的底物经酶作用后，所得到的产物通过适当的分 离，测定出产物的脉冲数即可换算出酶的活力单位。 ( 4 ) 电化学法最常用的是玻璃电极，配合一高灵敏度的p h 计，跟踪反应过程中 矿变化的情况，用p h 的变化来测定酶的反应速率。 1 1 3 酶免疫分析法 1 9 7 1 年e n g r a l l 和p e r l m a n n 3 】等发展了酶免疫分析法。最初发展的酶免疫测定方法， 是使用酶标记于抗体或抗原上，用以检测组织中相应的抗原或抗体的存在。后来发展为 将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行酶免疫染色，底物显色后用肉眼或分光光 度法判定结果。这一技术就是目前应用最广泛的酶联免疫吸附实验，简称e l i s a ( e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ) 。酶免疫分析就是将抗原与抗体的免疫反应与酶的 催化反应相结合而建立起来的一种新技术。酶标记到抗体或抗原上后既不改变抗体或抗 4 第1 章引言 原的免疫反应学特异性，也不影响酶本身的活性，即在相应而合适的底物参与下，可生 成催化反应产物，通过检测催化反应产物可证明酶的存在，从而证明发生了相应的免疫 反应，继而对抗原或抗体进行检测。所以其是一种特异而敏感的技术，可以在细胞或亚 细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克( p l ) 甚至纳克( n g ) 水平上对其进行定 量。 1 1 4 辣根过氧化物酶 辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 简称h i 强) 是应用最广泛的一种酶制剂。 其广泛存在于辣根体内，相对分子质量为4 4 0 0 0 ，它是一种糖蛋白，糖的含量约1 8 ， 酶活性中心含有一个正铁血红素卟啉环化合物，在4 0 3 衄和2 7 5n l t l 处有两个吸收峰， 纯的h r p 呈米色。h r p 具有高度多态性，功能多样而且互异，根据电泳行为将h r p 分为酸性、碱性和中性同工酶，其中中性同工酶最具有应用价值【4 j 。h r p 是结合了氧化 血红素的糖蛋白，除f e 外每分子中还含有两个c a 2 + 。肽链由3 0 8 个氨基酸组成，另有 8 个糖链分别与1 3 、5 7 、1 5 8 、1 8 6 、1 9 8 、2 1 4 、2 5 5 和2 6 8 位的天冬酰胺残基连接，它 们分布在分子表面。肽链n 末端为一个吡咯烷酮羧基所封闭，c 末端为丝氨酸1 5 j 。由于 其具有稳定性好、相对其它酶分子量小、比活性高、特异性强和易于分离等特点，被广 泛地用于酶免疫分析中作标记物【6 】。 通过测定辣根过氧化物酶的活性可以间接地测定抗体或抗原的含量，因此建立和研 究辣根过氧化物酶的测定新方法，在临床免疫学及临床疾病诊断研究中具有很重要的意 义。早在1 8 4 5 年o s a n n 【7 】就采用h r p 对过氧化物进行了测定。本世纪六十年代初 g u i l b a u l t 8 】小组对h r p 进行了深入研究，利用建立的h r p 催化反应体系，测定了临床 化学反应中的重要产物h 2 0 2 进而将其与多种氧化酶联用，测定了葡萄糖、胆固醇、尿 酸等多种人体内重要的有机物质和无机物质，开展了h r p 在分析化学中的应用。 由于辣根过氧化物酶是一种过氧化物酶，它可以催化( h 2 0 2 ) 氢受体氧化另一氢供 体的物质。h r p 是对氢受体有特异性而对氢供体缺乏特异性的酶，因此基于h r p 体系 多种分析方法【9 彩】的研究成果随之问世，包括紫外可见分光光度法、荧光法、化学发光 法、电化学法及传感器法等。h r p 的固定化技术【孙2 9 】和与其它酶的联用技术也得到了 较快的发展，特别是h r p 作为抗原和抗体的标记物，被应用于酶免疫分析方法中，成 为一种非常重要的生化试剂，广泛的应用于临床化学环境检测和食品工业等领域。 河北大学理学硕十学位论文 1 1 5 共振光散射技术 1 9 9 3 年r f p a s t e r n a c k 等首次用共振光散射技术( r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ，r l s ) 研究了卟啉类化合物在核酸上的聚集【3 0 1 ，之后p a s t e r n a c k 和他的同事又将共振光散射技 术用于生物大分子的识别、组装和聚集的研究3 卜3 2 1 ，从而揭开了共振光散射技术应用于 生物分析化学的序幕。1 9 9 6 年以来，黄承志等研究表明，这种光散射信号能十分灵敏地 测定生物大分子【3 3 。3 6 1 ，建立了生物大分子的共振光散射光谱分析法。这些研究与测定的 基础是有机染料在蛋白质、核酸等生物大分子上进行堆积出现特征的共振光散射光谱且 光谱信号极大地增强，信号增强的强度与生物大分子的浓度具有良好的线性关系。共振 光散射( r l s ) 光谱法作为二十世纪9 0 年代发展起来的一种新兴的痕量分析测试新技术， 具有仪器简单、分析速度快、灵敏度高、较好的选择性、安全无毒、试剂便宜等特点， 被广泛的应用于核酸、蛋白质等生物大分子的分析测定中，检测限可达纳克级，有着良 好的应用前景，为生化及临床分析样品的微量分析测定提供了一条新的分析途径。 1 2 纳米粒子 近年来随着纳米技术的发展，生物学、化学、物理学等学科之间的交叉渗透，纳米 生物技术成为国际生物技术领域的前沿和热点之一。其中，由于纳米生物材料的诸多良 好的生物学特性，而成为制备高效、靶向的基因治疗载体系统的良好介质。纳米生物技 术与基因治疗相结合，显示出良好的应用前景。 1 2 1 纳米材料概述 纳米材料是指至少一维处于纳米范围( 1 1 0 0 n m ) 的材料。随着物质的超细化，其 表面电子结构和晶体结构发生变化，产生了普通颗粒所不具有的表面效应、小尺寸效应、 量子效应以及宏观量子隧道效应【3 7 4 1 1 ，从而使纳米材料与常规材料相比较，具有一系列 优异的物理、化学性质【4 2 - 4 4 。 1 2 1 1表面效应 固体表面原子与内部原子所处的环境不相同，当粒子直径比原子直径大时，表面原 子可以忽略；但当粒子直径逐渐接近原子直径时，表面原子的数目及作用就不能忽略， 而且这时粒子的比表面积、表面能和表面结合能都发生很大变化，这种特殊的效应就是 表面效应。 6 第1 章引言 1 2 1 2 体积效应 当物质的体积减少时，将会有两种情形：一种是物质本身的性质不发生变化，而只 有那些与体积密切相关的性质发生变化，如半导体电子自由程度变小，磁体的磁区变小 等；另一种是物质本身的性质也发生变化，因为纳米微粒是由有限个原子或分子组成， 改变了原来有无数个原子或分子组成的集体属性，如金属纳米微粒的电子结构与大块金 属迥然不同，这就是体积效应。 1 2 1 3 小尺寸效应 当粒子的尺寸与光波波长、德布罗意波长以及超导态的相干长度或透射深度等物理 特征尺寸相当或更小时，晶体周期性的边界条件将被破坏，非晶态纳米微 粒的颗粒表面层附近原子密度减小，导致声、光、电、磁、热、力学等特性均随 尺寸减小而发生显著变化。例如，光吸收显著增加并产生吸收峰的等离子共振频 移，磁有序态变为磁无序态，超导相向正常态转变，声子发生改变等。 1 2 1 4 量子尺寸效应 当粒子尺寸降到某一值时，费米能级附近的电子能级由准连续能级变为离散 能级的现象和纳米半导体微粒存在不连续的最高占据分子轨道和最低未被占据 分子轨道能级，能级变宽的现象均称为量子尺寸效应。纳米粒子的量子尺寸效应 表现在光学吸收光谱上则是其吸收特性从没有结构的宽谱带过渡到具有结构的 分立谱带。当能级间距大于热能、磁能、静磁能、静电能、光子能量或超导态的 凝聚能时必然导致纳米粒子磁、光、声、热、电以及超导电性与宏观特性有显著 不同，引起颗粒的磁化率、比热容、介电常数和光谱线的位移。 1 2 1 5 宏观量子隧道效应 微观粒子具有贯穿势垒的能力称为隧道效应。人们发现纳米粒子的一些宏观性质， 例如磁化强度、量子相干器件中的磁通量及电荷等亦具有隧道效应，它们 可以穿越宏观系统的势垒而产生变化，故称为宏观量子隧道效应。宏观量子隧道 效应与量子尺寸效应一起，确定了微电子器件进一步微型化的极限，也限定了采用磁带、 磁盘进行信息储存的最短时间。 1 2 2 f e 3 0 4 磁性纳米粒子 1 2 2 1f e 3 0 4 磁性纳米粒子性质 7 河北大学理学硕+ 学位论文 f e 3 0 4 纳米粒子粒径一般分布在1 0 1 0 0n n l 左右，由于小尺寸效应和表面效应而使 得它具有常规晶粒所不具备的磁特性。当f e 3 0 4 纳米粒子的粒径d 5 0 0 0 k ) 、高压( 2 0 m p a ) 以及极高的冷却速率( 1 0 10 k s 。1 ) 等极端条件促使氧化、还原、分解和水解等反应的进 行来制备纳米粒子【6 6 。6 9 】。采用超声化学法制备纳米粒子时反应体系中有三种区域：( 1 ) 具有局部高温高压的气泡内部；( 2 ) 空化气泡与本体溶液之间的界面区域；( 3 ) 本体溶 液区域。在区域( 1 ) 中主要产生的活性物种有氢自由基和氢氧根自由基( h 和o h ) 等，区域( 2 ) 是活性物种的富集区域，区域( 3 ) 是活性物种与原料发生反应的主导区 域。s u s l i c k 6 6 1 等人率先采用超声化学法制备粒径均一的f e 3 0 4 纳米粒子。g e d a b k e n 6 9 】 研究小组以醋酸亚铁为原料，1 3 环糊精为稳定剂，在1 5a t m 的a r 气氛下用超声化学 法制备了f e 3 ；0 4 纳米棒。首先超声波分解水形成氢自由基和氢氧根自由基，氢氧根自由 基缔和形成双氧水( h 2 0 2 ) ；然后双氧水氧化f e 2 + 形成f e 3 + 同时释放出氢氧根离子，这 导致了体系p h 的升高，造成了f e 2 + 和f e ”的同时水解，最终形成了f e 3 0 4 纳米棒。尽 管超声化学法操作简便，但超声化学法属于非均相反应方法，粒子的成核和生长过程受 活性物种的生成和扩散等因素的影响，因此该法在纳米粒子的尺寸和形貌控制方面仍有 待于进一步提高，此外，该方法制备的纳米粒子的结晶度也存在相对低的问题。 1 2 2 2 7 水热法 水热法是指在高温高压反应环境中，采用水作为反应介质，使得通常难溶或不溶的 物质溶解、反应、重结晶而得到理想的产物。水热法又分为水热沉淀法、水热氧化法和 水热还原法。f a n 7 0 】等用水热氧化法，以f e s 0 4 7 1 - 1 2 0 、n a o h 和n a 2 s 2 0 3 为原料，在 1 4 0 c 下反应1 2h ，得到多面体的f e 3 0 4 粒子。何秋星等f 7 l 】利用预紧式高压反应釜水热 法制备球形纳米粒子的粒径为2 7 姗。水热合成法在水溶液中反应，粒子不团聚，制得 的磁粉分散性好、结晶性好，粒径分布较窄，产物纯度高。但水热合成法要求的纯度高、 成本较高，反应中需要使用高压釜，工艺较复杂。 1 2 2 3 磁性纳米粒子在生化分析中的应用 磁性纳米材料由于其独特的性质已经越来越广泛的应用于生活、科研及国防建设等 1 0 第1 章引言 好多领域，其磁性除用于分离富集外还可以用于磁共振成像检测等医学研究，其纳米粒 子特有的磁导向性、小尺寸效应及表面附有的活性基团又使其在生物医药领域( 如磁靶 向药物、固定化酶、基因治疗、细胞分离和免疫分析等) 有着广阔的前景。目前，归纳 起来，对其研究主要集中在富集、分离、磁靶向给药、固定化酶以及基因疾病的诊断和 治疗等诸多方面。 1 2 2 3 1磁靶向作用 靶向作用是指药物能选择性地到达特定生理部位，并在该部位发挥药效。磁性粒子 经过表面修饰而带有一定电荷或功能基团，可与特异性抗体结合，作为药物载体用于药 物的输运。这种磁性载体能借助于外加磁场的导向作用，将药物运送到人体预定的病变 部位进行控制释放，这样即可以减少毒副作用，不杀死正常细胞，又可降低药物用量， 大大提高了药物效率【7 2 - 7 4 1 。 1 2 2 3 2 固定化酶 ”。 在利用生物酶进行催化反应时往往需要将酶固定化，这样一方面有助于实现酶与底 物以及产物分离，另一方面可以实现酶的重复利用。由此可见，发展新的生物酶的固定 和分离技术具有十分重要的应用价值【2 1 。将酶固定在磁性粒子表面不仅能够增加酶的稳 定性，而且能够很容易通过磁分离器实现酶的回收。u l m a n 【7 6 】等通过表面功能化后用 于脂肪酶的固定。通过生物酶在磁性粒子表面的固定化具有以下优点：( 1 ) 方便实现酶 与底物和产物的快速分离，从而提高酶的使用效率；( 2 ) 可以提高酶的稳定性，并保持 酶在不同介质中的催化活性；( 3 ) 磁性纳米粒子巨大的比表面积为同时偶联多种生物酶 提供了场所，因此将发展成熟的生物酶磁偶联和分离技术用于多酶固定，将有利于多酶 链式反应的应用。 1 2 2 3 3 磁分离富集 磁分离是利用功能化磁性粒子的表面配体( 或受体) 与受体( 或配体) 之间 的特异相互作用如：抗体一抗原( a n t i b o d y - a n t i g e n ) 和亲合素一生物素( a v i d i n b i o t i n ) 、 互补的基因片段等来实现对靶向生物目标的快速分离与富集【7 7 】。与常用的磁性微球相 比，纳米磁性粒子在细胞分离方面更具有优势。( 1 ) 较小的尺寸可以避免与细胞发生识 别作用后对细胞产生机械应力；( 2 ) 可以缩短孵育时间，加快分离流程；( 3 ) 磁性纳米 粒子在磁场中可形成稳定的胶体分散体系，不会发生粒子的聚集和沉淀；( 4 ) 具有生物 河北大学理学硕十学位论文 相容性的磁性纳米粒子不影响细胞的功能和发育，磁分离后细胞的存活率高，且不与非 识别细胞发生作用。目前，磁分离方法已广泛应用于酶、核酸、蛋白、多肽及细胞等的 分离纯化中。如图1i ，m i r k i n 等口7 。7 9 峙道了一种基于纳米粒子的蛋白质高灵敏度的检 测方法。他们制各了表面修饰有单克隆抗体的磁性纳米粒子，同时在金纳米粒子表面修 饰有d n a 和多克隆抗体，且金纳米粒子表面修饰的d n a 标记物的含量远高于多克隆 抗体的量。然后将上述两种粒子与待检测的目标蛋白溶液进行混台，利用抗体和特异抗 原的识别，将带有d n a 标记的金纳米粒子富集到磁性纳米粒了的表面，通过磁分离技 术将碰金纳米粒子复合体从混合体系中分离、富集。再通过去杂交技术得到d n a 标记 物，最后通过对d n a 标记物的定量检测成功地实现了对目标蛋白的间接测定。 、i ， ，i m a g n e t i c ：+ 辫 t a r g e t b a r - c o d e m o l e c u l e pr o b e s c a n o m e t r i cd e t e c t i o n o fb ar _ c o d ed n a e i t h e rn u c l e i ca c i dorp r o t e j n 图l1 碰性纳米粒子分离富集测定蚩白质或核酸示意图 m a g n e t i cp r o b e s e p a r a t i o na n d 12234 免疫分析 在免疫学研究中，利用抗体抗原特异性可逆结合原理可以测定免疫活性组 分的存在和浓度。但是在实际生物样品的测定中，由于被测样品很少，标记与检测的分 离步骤复杂，如何有效进行分离及对痕量样品的富集，将直接影响检测的灵敏度和准确 度。由于磁性纳米粒子性能稳定，表面易于功能化，在其表面上引接专一性抗体，利用 抗原抗体的特异性结合就可得到免疫磁球，从而提高其灵敏度。磁性粒子用于免疫检测 的最大优势就是磁性粒子在外加磁场的作用下能快速富集，在短期内能得到浓缩、纯净 的样品，减小了检测中不必要的麻烦，有助于缩短检测时间，提高检测效率“】。 12 235 在磁共振成像方面的应用 】2 建 第1 章引言 磁共振成像( m ) 技术由于可以用来对生物内脏器官和软组织进行无损的 快速检测，目前它已经发展成为诊断软组织病变，尤其是检测肿瘤的最为有效的方法之 一。在肿瘤的治疗中，必须首先对肿瘤组织进行拍照、定位。通常为了增强病变组织与 正常组织的图像之间的对比度，需要选择合适的造影增强剂来显示解剖学特征。因此， 磁共振造影增强剂在肿瘤的诊治中有着十分重要的作用。磁共振造影剂的主要工作原理 是可以有效地改变病变组织中质子的自旋一自旋弛豫时间，从而达到增强对比度的效 果。目前，临床上常用的磁性造影剂是二乙烯三胺五醋酸每l ( g d d t p a ) 配合物，其价格 较昂贵。相对而言，超顺磁性氧化铁价格低廉，而且在生物体内有很高的特异性分布， 同时安全性好，因此很受临床应用的欢迎。当超顺磁性氧化铁纳米粒子通过静脉注射进 人体与血浆蛋白结合后，吞噬细胞就会把它们的结合物作为异物而摄取，从而使超顺磁 性氧化铁纳米粒子集中分布在细胞丰富的组织和器宫中，如肝、脾、淋巴结和骨髓等， 超顺磁性氧化铁粒子在上述特部位的分布有助于提高对该部位的m r 成像对比度晔】。 1 2 2 3 6 在肿瘤磁热治疗方面的应用 肿瘤是威胁人类生命健康的最大杀手，治疗肿瘤的方法有化学药物疗法、放射线疗 法、手术切除以及热疗法。近年来，应用于肿瘤治疗的磁靶向热疗法引起了人们越来越 多的关注，随着纳米技术的出现，肿瘤细胞可吸收由静脉注射的纳米磁流体。g o r d o n 等1 8 5 提出了磁流体热疗( m a g n e t i cf l u i dh y p e r t h e r m i a ，m f h ) 或细胞内热疗 ( i n t r a c e l l u l a r h y p e r t h e r m i a ，i c h ) 的观点。c h a r t 等【8 6 】在人肺癌细胞中加入磁流体，比 较热水浴热疗与磁场诱导热疗的效果，证实两者间无明显差异，认为g o r d o n 等在当时 不可能区分细胞外间质与真正细胞内热疗的效应，故提出了磁靶向间质热疗( m a g n e t i c i n t e r s t i t i a lh y p e r t h e r m i a ，m i h ) 的观点。9 0 年代中期m i t s u m o r i 等姗将磁流体经兔肾动 脉灌注，不仅可栓塞肾动脉，而且施加磁场可使肾区产生高温，因此称之为动脉栓塞热 疗( a r t e r i a le m b o l i z a t i o nh y p e r t h e r m i a ，a e h ) 。2 0 0 0 年，h i l g e r 等【8 8 】在癌病变区注入磁 性粒子，外加磁场，在2 - - 5 m i n 内就使其达到5 8 的高温，从而取得了磁靶向热消融 ( m a g n e t i ct h e r m o a b l a t i o n ，m t a ) 的目的【8 9 】。 总之，磁性纳米粒子在核酸、蛋白与细胞的分离检测以及磁共振成像等研究中有着 重要的意义及应用前景，关于磁性纳米材料在生物样品的快速、实时、高通量检测方面 的显著优势已经吸引了研究者的广泛关注。 河北大学理学硕+ 学位论文 第2 章共振光散射技术测定辣根过氧化物酶 2 1前言 近年来，以酶为标记物的酶联免疫分析方法的研究发展迅速，已广泛应用于疾病诊 断、病毒鉴定等很多领域。其中辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，h r p ) 是最常 用的标记酶之一，它是从辣根中提取的，分子质量为4 4k d a 。h r p 能催化过氧化氢( h 2 0 2 ) 氧化某些还原性底物，生成有色物质，以此建立了光学酶联免疫和电化学酶联免疫分析 法等多种方法【1 2 - 16 1 。 共振光散射技术( r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ，r l s ) 近几年来发展迅速，具有灵敏度高、 操作简单的优点，已广泛应用于蛋白质、d n a 等生物大分子的分析3 6 。9 1 。但利用r l s 测定h r p 的分析方法尚未见报道。h r p 催化h 2 0 2 氧化四甲基联苯胺 ( t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e ，t m b ) 生成自由基，并引发自由基的聚合生成聚四甲基联苯胺的 聚合物，该聚合物是具有共轭结构的大分子。根据r l s 理论【3 6 】，应具有较强的r l s 信 号，据此我们研究了检测h r p 的r l s 分析方法。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与试剂 f 4 5 0 0 荧光分光光度计( 日本日立公司) ；t u 1 9 0 1 紫外可见分光光度计( 北京普 析通用仪器有限公司) ；w h 8 6 1 漩涡混合器( 江苏太仓市科教器材厂) ；s z 9 3 自动双 重纯水蒸馏器( 上海亚荣生化仪器厂) t m b 溶液：称取0 0 1 88g t m b ( 北京欣经科试剂公司) 溶于5m l 无水乙醇中， 用水稀释至1 0m l ，浓度为6 1 0 一m o l l ；h r p 溶液：称取1m gh r p ( 北京欣经科试剂 公司) ，用灭菌水溶解后定容至1m l ，质量浓度为1g l ，4 下保存，使用时逐级稀 释；h 2 0 2 ( 市售3 0 ，天津永大试剂研发中心) ：取1 0 3p l 稀释至1 0m l 制成o 1m o l l ， 使用时配制；磷酸盐缓冲溶液( p b ，0 2m o l l ，p h7 6 ) ；本实验所有化学试剂均为分 析纯，水均为去离子二次蒸馏水。 1 4 第2 章共振光散射技术测定辣根过氧化