（动物学专业论文）多环芳烃对褐菖鲉成体及其胚胎幼体毒性效应的初步研究.pdf

摘要 摘要 在室内实验条件f 将褐菖鲐( s e b a s t i s c u sm a r m o r a t u s ) 置于含0 号柴油水溶性 成分( d i e s e lo i ls o l u b l ef r a c t i o n ，d w s f ) 的海水中，浓度分别为o0 2 、0 1 和o 5m e d l 。 每天更换一半相同浓度的海水，并于暴露后第0 、7 、2 8 、8 4d 以及解除污染成 分的第7 、2 8d 取样，通过测定肝脏中解毒系统两个阶段代表性酶e r o d 及g s t 活力，以及胆汁中多环芳烃( p a h s ) 典型代谢物含量，研究污染物在褐菖鲇体 内的代谢情况及其x , h e g f 系统的影响；对血清和性腺中性类固醇激素如睾酮、雌 二醇水平用免疫放射法进行测定，采用酶联免疫吸附方法检测血清中卵黄蛋白原 ( v t g ) 的含量，并对性腺进行组织学观察。同时，观察菲、芘、苯并( a ) 芘 等p a i l s 对褐菖鲇胚胎及仔鱼发育各项指标的影响。探讨d w s f 对褐菖鲇生殖及 早期发育的影响和可能的作用机制。 1 观察了低浓度长期的d w s f 暴露后褐菖鼬p a h s 代谢与肝脏解毒酶之间 的关系。结果显示，p a h s 典型代谢物的含量和肝脏两种解毒酶e r o d 、g s t 的 活性均可被d w s f 诱导。e r o d 活力先显著诱导升高而后下降，显示褐菖鲇在 长期慢性暴露下发展的适应机制。 2 对d w s f 暴露后褐菖鳓机体与生殖机能有关的生理生化指标及性腺的组 织学变化进行观察，未发现明显的性腺组织损伤，性体指数也没有明显影响。最 长暴露天数雄鱼性腺中1 7 口一雌二醇升高，此天数最高浓度组血清中v t g 被显 著诱导。1 7 p - - 雌二醇水平升高可能是v t g 水平升高的主要原因。雌鱼血清和性 腺中睾酮和1 7 3 - - 雌二醇含量下降，这将对卵细胞的发育、成熟和卵细胞的质量 产生不利影响。显示d w s f 对鱼体具有生殖干扰作用，对雄鱼具有雌激素效应， 并降低雌鱼的生殖能力。 3 将褐菖鼬胚胎分别暴露于梯度浓度的p h ，p y 和b a p 培养液中，观察发 现暴露组胚胎2 4h 死亡率升高、胚胎和仔鱼心率下降、发育时间延缓、孵化率 降低、仔鱼的畸形率升高。p a i l s 引发的胚胎和仔鱼的毒性效应基本上随暴露浓 度的升高而升高，并随其结构中苯环数的增加有增强趋势。结果中m d a 含量增 加显示这几种p a h s 暴露对仔鱼产生了氧化胁迫，g s h 含量的增加及g s t 活力 的升高显示了仔鱼的抗氧化防御系统对p a h s 暴露的敏感反应。对d w s f 的主要 成分p a h s 暴露的敏感性显示出用鱼类早期发育指标作为环境监测生物标志物的 摘要 广阔前景。 关键词：多环芳烃：生殖毒性；发育毒性 摘篮 a b s t r a c t i ne x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n ，s e b a s t i s c u sm o r m o r a t u sw e r ee x p o s e dt od i e s e lo i l s o l u b l ef r a c t i o n ( d w s f ) a tc o n c e n t r a t i o n so fo0 2 ，o 1 ，0 5m g i s a m p l e sw e r et a k e n a f t e re x p o s u r ef o r0 ，7 ，2 8 ，8 4d a y sa n dt r a n s f e r r e dt or e c o v e r yt a n kf o r7 ，2 8d a y s ， r e s p e c t i v e l y h e p a t i ce r o d ，g s ta c t i v i t i e s ，c o n t e n t o fg s ha n db i l i a r yp a i l s m e t a b o l i t e sw e r ed e t e c t e dt oi n v e s t i g a t ep o s s i b l ei n f l u e n c eo nh e p a t i cd e t o x i f c a t i o n s y s t e m e f f e c t so nr e p r o d u c t i v ep o t e n t i a lo ft h ef i s hw e r es t u d i e db yd e t e c t i n gs e x h o r m o n el e v e l si ns e r u ma n dg o n a d ，a n dv i t e l l o g e n i n ( v t g ) c o n t e n ti ns e r u m f e r t i l i z e de g g sw e r ee x p o s e dt op y r e n e ( p y ) ，p h e n a n t h r e n e ( p h ) a n db e n z o ( a ) p y r e n e ( b a p ) a tc o n c e n t r a t i o n so fo 0 1 ，o 1 ，1a n d1 0 弘l t os t u d ye f f e c t so fp o l y c y c l i c a r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a i l s ) o ne m b r y o sa n dl a r v a eo fsm a r m o r a t u s e a r l yl i f e s t a g et e s ti n d i c e si n c l u d e dm o r t a l i t y , m a l f o r m a t i o nr a t e ，h e a r tb e a tr a t e ，h a t c h i n gt i m e ， i m p o r t a n te n z y m e sa c t i v i t i e s a n ds oo n t h e r e s u l t ss h o w e d ： 1 d w s fe x p o s u r ei n f l u e n c e d h e p a t i cd e t o x i f y i n ge n z y m e s a c t i v i t i e si n sm a r m o r a t l i s c o n t e n t so fb i l i a r yp a h sm e t a b o l i t e sw e r ee l e v a t e d ，a n dt h ea c t i v i t i e s o fe r o da n dg s tw e r eb o t hi n d u c e db yd w s ft h ee n z y m e sa c t i v i t i e sm a yb e a l t e r e db yt h ed e f e n s em e c h a n i s mo ft h ef i s h e r o da c t i v i t i e si n c r e a s e df i r s t l ya n d d e c r e a s e ds u b s e q u e n t l y , w h i c hs u g g e s t e dac o m p e n s a t o r yo ra d a p t i v em e c h a n i s m o c c u r r e n c ei nc h r o n i c a l l ye x p o s e dt ot h ep o p u l a t i o n s 2 t h e r ew a sl i t t l ec h a n g ei ng o n a dm o r p h o l o g ya n dg o n a d o s o m a t i ci n d e x ( g s i ) a f t e re x p o s e dt ot h ec o n c e n t r a t i o n so f d w s ff o r8 4d a y s i tw a so b s e r v e dt h a t1 7 5 - - e s t r a d i o lc o n t e n to fs p e r m a r ya n dv t gc o n t e n to fs e r u mw e r ei n c r e a s e di nt h em a l e f i s h i n c r e a s eo f1 7 f l - e s t r a d i o lc o n t e n ti ns e r u ms h o u l db er e s p o n s i b l ef o rt h ei n c r e a s e o fv t gc o n t e n ts e xh o r m o n el e v e lw a sd e c l i n e da tt h es a m et i m ei nt h ef e m a l ef i s h ， w h i c hw i l ld oh a r mt ot h ed e v e l o p m e n ta n dm a t u r eo fo v n m a l li n d i c e ss u g g e s t e d t h a td w s fe x p o s u r eh a db r o u g h tr e p r o d u c t i v et o x i ce f f e c t ，e s p e c i a l l yc a u s e d e s t r o g e n i ce f f e c tt om a l es m a r m o r a t u s 3 p a h sc a u s e dt o x i ce f f e c to ne a r l yl i f es t a g e so fs m a r m o r a t u s e m b r y o sw e r e e x p o s e dt od i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fp h ，p ya n db a pt h r o u g hw a t e r m o r t a l i t yr a t eo f 摘坚 e m b r y o si n c r e a s e da f t e re x p o s e d t op a h sf o r2 4h o u r s ，d e s c e n to fh e a r tb e a tr a t ea n d h a t c h i n gr a t e ，d e l a yo ft h eg r o w t h ，i n c r e a s eo ft h el a r v a em a l f o r m a t i o nr a t ew e r e o b s e r v e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et o x i c i t i e sw e r ec o r r e l a t e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o n o fp a h sa n dh a dat e n d e n c yo fe n h a n c e m e n tt o x i c i t yw i t hi n c r e a s ei nn u m b e ro ft h e b e n z e n er i n g s i n c r e a s eo fm d ac o n t e n ts u g g e s t e dt h a tp a h sc a u s e do x i d a n ts t r e s st o l a r v a e g s hc o n t e n ta n dg s ta c t i v i t yw e r ea l s oi n c r e a s e d ，w h i c hi n d i c t e dt h a tp a i l s e x p o s u r ec a u s e ds e n s i t i v i t yr e s p o n s et oa n t i o x i d a n ld e f e n s es y s t e mo ft h el a r v e e a r l y l i f es t a g e so ff i s hc o u l db ew i d e l yu s e dt oe v a l u a t em a r i n ep o l l u t i o n sf o ri t sh i g h l y f e a s i b i l i t ya n ds e n s i t i v i t y k e y w o r d ：p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ；r e p r o d u c t i v et o x i ce f f e c t ；d e v e l o p m e n t t o x i ce f b c t v 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权 利和责任。 声明人( 签名) ：吾j 喑噶 沙6 年，f 月 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有 权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的 标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 l 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( 忉 ( 请在以上相应括号内打“”) 日期：一年，f 月，f 日 日期：枷6 - 年t f 月f s 日 第一带前言 第一章前言 一、海洋石油污染现状及其对海洋生物影响 当前水域环境污染问题越来越严重，有机物污染及其对生物体的健康和生 态系统所造成的危害日益为人们所认识。海洋中存在的大量有机污染物能影响 水生生物的发育、生殖、活动、行为及对胁迫的应变能力。许多有机污染物对 海洋环境几十年的持续性作用表明，即使现在立刻全面停止向海洋输入有机污 染物，这些污染物仍将滞留于海洋环境中并对海洋生物产生毒性效应。我国近 岸海域的许多重要经济鱼虾类产卵场和育肥场已被大面积污染，严重阻碍了海 水养殖产业的健康发展。其中持久性有机污染物( p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ， p o p s ) 虽在水体中含量甚微，但极难为生物分解，对化学氧化和吸附具有阻抗 作用，可在水生生物、农作物和其它生物体中迁移、转化和富集，具有三致( 致 癌、致畸、致突变) 效应，对生态环境和人体健康造成严重的危害。 在海洋有机污染中，石油是最普遍和最严重的一种。在石油的开采、炼制、 贮运、使用过程中，原油和各种石油制品进入环境而造成污染，其中包括通过 河流排入海洋的废油、船舶排放和事故滋油、海底油田泄漏和并喷事故等等【2 埘。 据2 0 0 0 年国家海洋局公布的中国海洋环境质量公报显示，2 0 0 0 年我国海水中 油类含量超过国家l 类( o 0 5m g l ) 、2 类海水水质标准( o 3 0i n g l e ) 的海域 仍有5 6x 1 0 4 k m 2 。沿海省份中河北、天津、福建、浙江、上海的油污染较重， 烟台近岸、湄州湾、厦门近岸重点海域的含油量已超过2 类海水水质标准【4 l 。 调查表明我国每年排入大海的石油达1 1 5 万吨，并呈增长趋势，近海海域石油 的平均浓度已达到o 0 5 5m g ，l 石油中造成水体污染的主要成分是各种烃类化合物一烷烃、环烷烃、芳香 烃等，它的毒性取决于这些组分的性质及其分散程度。其中芳香类化合物的毒 性较大，尤其是多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p a i l s ) ，这是指分子 中含有两个或两个以上苯环以稠合方式连接起来的广泛存在的一类有机污染物， 包括苯并( a ) 芘 b e n z o ( a ) p y r e n e ，b a p 、- 芘( p y r e n e ，p y ) 、菲( p h e n a n t h r e n e ，p h ) 等嘲。多环芳烃碳氢化合物是石油组分中对海洋生态系统破坏性最大的化合物 多环芳烃对褐茸鳓成体及其胚胎幼体毒陛效府的初步研究 之一，能够在海洋生物特别是底栖生物组织和器官中聚集起来，缓慢而氏期地 实施毒性。美国标准e p a8 3 1 0 公布的1 2 9 种优先控制污染物中，有1 6 种属于 多环芳烃化合物。 海域中石油污染面积和程度的不断扩大加深，影响了海洋生物的生长、存活 和繁殖，进而破坏海洋生态系统的结构和功能。大量实验结果表明，当海水中油 的含量为1i n g l e 或溶于水的石油组分的含量为1t g l 时，就能对敏感生物产生危 害【7 1 a 国内外关于石油影响鱼类生理生化过程的已有很多报道8 _ 】，如研究表明 胜利原油对真鲷( p a g r a s o m u sm a j o r ) 、牙鲆( p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) 及黑鲷( s p a r u s m a e r o c e p h a l u s ) 仔鱼的4 8hl c s 0 分别为6 4 ，1 3 7 和l o 7m g m ，对牙鲆仔鱼和 缎虎鱼( c t e n o g o g i u l s g y m n a c h e n ) 9 6 h l c 5 0 分别为1 6 ，6 6 m g l 1 2 】。但对仔稚鱼 的毒性机制尚不十分清楚。 二、石油在鱼体内的代谢过程和致毒机理 关于石油水溶性成分( w a t e r - s o l u b l ef r a c t i o n ，w s f ) 对水生生物的毒性作用， 国内外在急性毒性、组织病理学、抗氧化系统、d n a 损伤方面开展了一些工作， 而对其在水生生物体中的代谢变化相关研究较少。生物体内代谢系统的一个重 要特征是其水平可随外源物影响而改变，可作为反映污染物暴露情况的指标。 鱼体中生物转化酶系主要包括混合功能氧化酶( m i x e d f u n c t i o no x i d a s e ， m f o ) 系统( i 相酶) 、i i 相解毒酶及相关成分。m f o 属细胞色素p - 4 5 0 依赖性电 子传递系统，由多种酶构成，能够催化羟化、加氧和脱烷基等多种类型的代谢 反应，能够代谢芳烃和农药等外源有机物，使之形成中间产物，通过其他酶类 协同作用，生成易溶性物质排出体外，从而起解毒作用。7 一乙氧基一异吩唑酮 一脱乙基酶f 7 一e t h o x y r e s o r u f i n o d e e t h y l a s e ，e r o d ) 是m f o 中细胞色素p 一4 5 0 的第一阶段生物代谢酶的一种，可做为反映生物体所处污染环境的参数【l 。 e r o d 活性增高越大，说明诱导物的潜在毒性和致癌风险性越高1 4 】。在实验室 生态和体外诱导实验中，绝大多数研究发现其诱导量与石油的污染程度有较好 的相关性 1 5 - 1 7 1 ，但也有少量研究发现外源污染并没有带来明显的e r o d 诱导效 应1 1 8 】。 做为i i 相酶的代表成分，谷胱甘肽硫转移酶( g l u t a t h i o n e s t r a n s f e r a s e s ，g s t ) 第一章前言 可催化上述中间代谢物的结合反应使之形成水溶物排出机体外。还原型谷胱甘肽 r r e d u c e dg l u t a t h i o n e ，g s h ) 是g s t 并d 谷胱甘肽过氧化物酶( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ， g p x ) 的辅助因子，又能直接与动物体内的亲电化合物结合起解毒作用。g s t 催 化的这一结合反应是需氧细胞防御有毒物质和某些内源性化合物进一步代谢的 主要途径1 9 1 。大量的研究指出，g s t 的诱导是生物对化学胁迫的适应性反应，其 表达水平是决定细胞对化学物敏感性至关重要的因素【2 0 。如研究发现柴油水溶性 成分( d i e s e lo i lw a t e r - s o l u b l ef r a c t i o n ，d w s f ) 处理僧帽牡蛎( o s t r e ac u c u l l a t a ) 后 g s t 活性出现显著诱导，表明g s t 在石油烃的解毒过程中有重要作用并具有较强 的敏感性和诱导性【2 ”，然而当前研究结果却不太一+ 致，g s t 活力在污染物暴露下 有的显示诱导，有的未出现明显变化，甚至显示抑制效应 2 2 - 2 3 】。人们提出与i 相 反应系统相比，i i 相酶的诱导效应并不明显 2 4 - 2 5 1 。因而石油污染对解毒酶活性的 影响还需要进一步研究。 三、石油对鱼类生殖的影响 1鱼类生殖过程 硬骨鱼生殖周期是复杂且高度协调的，依赖于垂体的综合活性。生殖是性 腺类固醇调节的，它直接受控于两种促性腺激素( g t h ) ：促卯黄生成激素 ( g t hi ) 和促性腺成熟激素( g t hi i ) 2 6 】。它们促进性腺的类固醇生成作用和 卵细胞的成熟。雌二醇主要合成于卵巢，可以促进卵黄蛋白原( v i t e l l o g e n i n ， v t g ) 在肝脏中的合成。雌性腺也产生孕酮( 黄体酮) ，诱使卵细胞的最终成熟。 现已在卵细胞中发现了这些类固醇激素和v t g 的膜受体。这些受体可能是内分 泌干扰作用的靶位27 1 。性类固醇激素在性未成熟鱼类通过正反馈作用而在性成 熟鱼类通过负反馈作用亦能调节下丘脑促性腺激素释放激素( g n r h ) 干n 脑垂体 g t h 的分泌活动 2 8 】。l i n 2 9 1 总结了世界范围内几十年的研究成果，指出有些污染 物( 杀虫剂、重金属) 是通过下丘脑垂体一性腺轴来影响生殖生理。下丘脑参 与污染物的作用已得到证实，有些杀虫剂和重金属( p b 和h g ) 能抑制下丘脑分 泌g n r h ，降低脑垂体g t h 的释放和生物合成，进而削弱性腺的活动。另外 一些杀虫剂( 艾氏剂等) 抑制性腺活动有两条途径，一是参与下丘脑一垂体一陛 多环芳烃对祸莒蚰成体及胚胎幼体毒件效应的栅步 l 】f 究 腺轴，二是直接作用于性腺。鱼类短期处于含石油或长期处于含s e 的湖泊中， 可以改变一些主要类固醇激素的合成，有些重金属f c d ) 可直接抑制虹鳟鱼 ( o n c o r h y n c h u sm y k i s s ) 离体精巢类固醇激素的合成；一些杀虫剂和污物在非致死 浓度就可以使卵母细胞萎缩，停止发育和退化，以及脑垂体g t h 细胞停止生 长：低p h 能使性腺生殖细胞减少或完全没有成熟生殖细胞。对雌鱼而言，其 机制是干扰卵黄蛋白的合成和在卵母细胞中的沉积，同时对产卵和排卵产生不 利的影响。 精孑的发育成熟包括两个阶段，即精子发! l ( s p e r m a t o g e n e s i s ) 和l 精子形成 ( s p e r m i o g e n e s i s ) 。许多研究表明鱼类雄激素在血液中含量的迅速升高是和精子 排出同时发生的，因而为生殖行为的出现做准备。睾酮和1 1 一酮基睾酮是鱼类 最主要的雄激素。睾酮已证明具有雄激素的作用，但它和雄鱼第二性征和生殖 行为的联系还不明显。雌二醇在雄性精巢内的含量很低，甚至测不出。离体的 孵育实验表明雌二醇对精巢发育不起作用；甚至还发现通过饵料长时间给雄鱼 以低剂量的雌二醇会抑制精子生成【28 1 。在卵子发生过程的最初事件是卵黄前体 蛋白一v t g 在肝中合成，并被卵母细胞吸收。卵子发生是被环境信号所激发， 受一系列调节激素所调控。以温度效应和光周期为例，脑刺激垂体分泌促性腺 激素( 多肽激素) 。这些是脊椎动物中的生殖功能调控激素，同时这些激素促使 减数分裂和排卵 3 0 】。 2内分泌干扰物对鱼类生殖机能的影响 近来环境污染的激素效应引发人们更多重视，围绕内分泌干扰物( e n d o c r i n e d i s r u p t i n gc h e m i c a l s ，e d c s ) ，国内外进行了进行了大量的研究 3 1 - 3 5 】。e d c s 种类 繁多，包括化学药物，除草剂，杀虫剂，工业化学物质( 如增塑剂，聚苯乙烯， p c b s ) ，芳香烃，非离子型表面活性剂和它的降解产物( 烷基酚化合物) 等。 鱼生活的水体容易受到e d c s 的污染，因此，通常把鱼作为进行e d c s 研究的 对象，如以鱼类v t g 和c y p l a 作为生物标志物分别对外源雌激素和芳香烃进 行内分泌干扰效应研究 3 。 评价鱼类生殖的生理生化参数有性腺发育与性别分化、鱼体内类固醇激素 水平以及v t g 含量、激素受体等等。鱼类性类固醇激素是鱼体内胆固醇的衍生 第一章前言 物，是在g t h 作用下，由性腺特化的体细胞分泌产生的，对鱼体的性腺发育、 卵黄形成和卵细胞成熟具有重要的调控作用。外源化学物能够引发机体性类固 醇激素水平的改变，会对生物的生殖功能产生不利的影响【”】。性激素水平作为 污染物对鱼生殖功能损伤的敏感指标已经广泛应用于筛选环境内分泌干扰物。 环境激素会干扰生殖功能，在鱼中，这将导致雄鱼生殖功能的下降和雌鱼 产卵量的下降、性腺减小以及雌鱼的雄化或雄鱼的雌化等效应 3 8 - 3 9 】。a b d e r s o n 等提出p a i l s 通过与雌激素受体结合，使得受体不能与雌激素结合，而使机体 对雄激素无反应，表现出抗雌激素效应 4 0 1 ，z h e n g 等也提出b a p 具有抗雌激素 效应 4 “。p e l i s s e r o 提出虹鳟鱼肝脏中的雌二醇受体能与多种复合物发生亲和作 用【42 1 。研究发现芳香烃，多氯联苯等环境污染物暴露后，鱼血清1 7 肛雌二醇含 量下降，并伴随有生殖异常4 “。据报导了在低污染环境下，卵黄蛋白原含量 相对参照位点( 无污染) 增加，但随着污染的加重急剧下降【4 5 】。a n d e r s o n 等的研 究验证了这一结果，在他们的研究中，在循环雌二醇浓度低的情况下，暴露在 低浓度1 3 一萘黄酮中的虹鳟卵黄蛋白原合成受到促进，然而在高浓度暴露下卵 黄蛋白原合成则被抑制【4 6 】。 b a p 可显著抑制鱼肝细胞中己烯雌酚( d e s ) 诱导的卵黄蛋白原和卵黄蛋 白原m r n a 的表达，呈明显的抗雌激素效应，并同时激活了c y p l a l 基因的表 达；但5 n g m l 的b a p 对卵黄蛋白原和卵黄蛋白原m r n a 的表达却有一定的促 进作用，表明b a p 在不同浓度下，可能呈现出相反的毒性效应f 4 7 1 。 已证实多种污染物可通过降低性激素水平而影响鱼的生殖功能【4 8 4 0 ，降低 鱼的生殖率弘“。如虹鳟鱼雌鱼幼体暴露于外烷基酚类污染物后，卵巢类固醇生 成能力显著改变m 1 ，四种氯代芳烃能造成鲫鱼体内睾酮水平显著下降5 3 1 ，在汇 集造纸和纸浆厂排水的河流中采集的野生鱼类不同程度地失去了类固醇生成能 力【5 4 。在苏必利尔湖，牛皮纸漂白厂的附近水域中，胭脂鱼f c a t o s t o m u s c o m m e r s o n i ) 的雌雄两性都在较大的鱼龄才达到性成熟并且性腺都较小，成年 的雌鱼只有较少的卵，雄鱼的第二性征发育不明显，同时，两性的睾酮以及雌 鱼中1 7 盘一雌二醇等类固醇在血液中的浓度常年都处于较低水平【5 “。有文献报 道，在暴露于环境污染物如芳香烃，多氯联苯等后，虹鳟鱼血清1 7 肛雌二醇含 量下降，并伴随有生殖异常【5 “。低浓度的某些金属和多氯联苯混合物影响了细 多耶芳烃对褐菖鼬成体发_ 胫胎幼体毒性效应的柳步研究 须石首鱼以及其他海洋硬骨鱼的生殖内分泌功能，从而破坏生殖内分泌功能 【5 7 5 8 1 。 v t g 是存在于性成熟卵生脊椎动物血清中的一种糖脂磷蛋白，已被确认是 大多数卵生脊椎动物的卵黄前体物质。雌鱼卵巢在垂体分泌的g t h 的作用下分 泌雌二醇，与雌激素受体结合，特异性地诱导v t g 的生成，经过血液的运输到 达卵巢并加工成卵黄蛋白。雄鱼、雌鱼和未成年鱼的肝脏中都具有雌激素受体， 但在正常条件下，只有成熟的雌性个体才能产生足够的雌二醇诱导v t g 的合 成，以提供卵子发育所必需的营养物质，在生命周期的其他时间，其体内的v t g 的含量很低。在雄鱼、未成年鱼或性腺退化的雌鱼血液中，v t g 水平很低，几 乎检测不到。但在大剂量的人工雌激素作用下，以及在低剂量的类雌激素跃期 作用下，都能诱导体内v t g 的生成。如暴露在雌激素受体拮抗物质的虹鳟鱼雌 雄个体中都观察到v t g 的诱导形成 5 9 】。 脊椎动物的v t g 对其繁殖的成功是至关重要，因为v t g 不仅是胚胎发育 的能源物质并且还具有作为非极性分子或酶的载体的功能1 。此外，在外源性 化合物中可以干扰垂体、卵巢或肝脏功能的非雌激素性化合物会明显减少雌性 正常v t g 的产生，导致卵子变小或卵子数目减少。对肝脏来说，还必须弄清楚 是否由于肝脏的损伤或由于特异性酶系统的功能紊乱而导致v t g 生成减少。有 些有机氯杀虫剂和p c b s 不仅可以干扰卵巢和垂体功能，而且也具有雌激素效 应，它们在鱼体内的作用可能是对垂体、性腺和肝脏的毒性效应与直接刺激肝 脏合成v t g 的雌激素活性之间的联合作用，因此，v t g 在鱼体内的异常出现 被认为是受到环境雌激素刺激的清晰指示 6 1 。6 2 1 。引发的v t g 的改变是源于肝脏 的损伤，还是特异性酶系统的功能紊乱，或是与直接刺激肝脏合成v t g 的雌激 素活性有关，这些都需要进一步深入研究。 3 石油污染对鱼类生殖机能影响及其机制的研究现状 石油污染可造成水生生物生殖形态学和生理学的变化，影响生殖。许多研 究证实油污染造成海洋硬骨鱼生殖参数的下降，观察到的情况包括改变生殖激 素的水平，抑制性腺发育，减少卵和仔鱼的生存发育能力等6 m 6 1 ，1 9 8 9 年美国 瓦尔迪兹油泄漏事件发生后，科研人员观察到油污染水域雌性花羔红点鲑 第一章前言 ( s a l v e l i n u sm a l m a ) 、黄盖鲽( l i m a n d aa s p e r a ) 、鳕鱼( g 昭mc h a l c o g r a m m a ) i f l l _ 浆中1 7 口一雌二醇含量、性腺成熟系数等随胆汁中芳香烃代谢物含量的上升而 下降，其中雌性花羔红点鲑g t hi 水平也发生变化6 7 i 。其他研究也表明油污染 导致黄鲈( p e r c a f l a v e s c e n s ) 性腺增大，改变产卵周期性，提高产卵力，但后代死 亡率增加【“ ，将欧洲鳗口n g u i l l aa n g u i l l a ) 暴露在d w s f 和g w s f ( g a s o l i n e w a t e r - s o l u b l ef r a c t i o n ) r 0 发现这些外源污染物对其内分泌系统造成影响呻9 1 。油污 染也可改变生殖激素水平，抑制性腺发育，如在萘( n a p h t h a l e n e ) 和石油中暴露后 的细须石首鱼( m i c r o p o g o nu n d u l a t u s ) 血浆中雌二醇和睾酮浓度降低，这与卵巢 组织对激素刺激的应激性降低有关7 ，相反也有研究显示在萘、p 萘黄酮 ( p n a p h t h o f l a v o n e ) 和惹烯( r e t e n e ) 中暴露后的鲫鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 的睾酮生 成被诱导 7 ”，鉴于石油暴露对繁殖的影响可能具有多种作用模式，其作用机制 有待深入研究。 四、石油污染对鱼类早期发育影响 1鱼早期发育实验 鱼早期发育( e a r l yl i f es t a g e ，e l s ) 指鱼从受精卵经胚胎发育为仔、稚鱼的阶 段。不易溶于水的持久有机污染物贮存卵黄中的甘油三酸酯滴中，导致在胚胎 发育的最初阶段污染物就高浓度存在。胚胎发育时鱼从卵黄囊内吸收营养，因 此污染物在胚胎发育及器官发生时影响相关代谢，发生生理变化，改变组织中 的化学物质的分配，产生毒性作用【7 ”。同时由于早期发育中生命的本质特征一 开放系统的性质也表现得最为突出：鱼体呈现对数生长，从一个受精卵迅速生 长成为与成体结构基本相似的仔、稚鱼，大多数重要的生命活动过程如受精、 细胞分化增殖、生长、基础代谢和合成、器官发育及定形等都包括在这一生活 阶段中，从而对环境的依赖性和感受性大大高于其它生活阶段。7 0 年代初有学 者提出用鱼的早期发育代替鱼的全生活期实验作为评价污染物的快速、经济的 方法。对此阶段进行慢性毒性短期实验，与传统的亚慢性或慢性毒性实验相比， 具有简便、快速、高效的特点，而且具有良好的重现性和敏感性。 多环芳烃对褐菖鲇成体及e 胚胎幼体毒性效应的初步研究 2 有机污染物对鱼早期发育阶段的影响 研究表明鱼类早期发育阶段对污染物暴露极为敏感 7 3 。”。w a l k e r 等7 6 1 指 出四氯二苯对二恶英( t e t r a c h l o r o d i b e n z o p d i o x i n ，t c d d ) 在湖红点鳟 ( s a l v e l i n u sa l p i n u s ) 卵内积聚浓度达到6 5n g g 时就会引发5 0 鱼苗死亡，研 究又逐步扩展到梭鱼( e s o x & c i u s ) 、青鳝鱼( o r y z i a sl a t i p 四和斑马鱼( d “月f dr e r i o ) 的胚胎及仔鱼中7 7 们。对斑马鱼生命早期阶段t c d d 暴露后的毒理和组织病理 研究发现，t c d d 处理o 4 8h 后卯的死亡率没有明显增加，处理4 8 9 6h 后 对孵化时阐没有影响，但在7 2 h 时观察到了仔鱼心包囊水肿和脑颅畸形，随后 出现卵黄囊肿( 9 6h ) ，死亡率明显增加( 1 3 2h ) ，在2 4 0h 时引发心包囊水肿、 卵黄囊肿、脑颅畸形的半数效应浓度( 即e c 5 0 ) 分别为2 2 ，2 1 和1 9n g g ，与此 同时出现严重的心血管系统影响，如在体腔、头部和鳃部的血流变缓，以及心 跳缓慢等症状【8 1 1 。g u i n e y 等在湖红点鳟发育早期进行t c d d 处理后也有卵 黄囊肿发生率增加的报道，另外对美洲红点鲑( s a h , e l i n u s f o n t i n a l i s ) 等鱼类的 胚胎和仔鱼也进行了大量的相关研究，都指出了这类有机污染物对鱼早期发育 的严重危害作用 8 3 】。 三丁基锡( t r i b u t y l t i n ，t b t ) 会引起仔鱼畸形、仔鱼体长减小，抑制生长发 育。f e n t l 8 4 1 用0 6 9 0 8 2 肛l 的t b t 处理真够( p h o x i n u s p h o x i n “s ) 胚胎，发现 孵化的幼体发生脊柱侧凹且游泳能力丧失，更高浓度处理会产生严重的骨骼畸 形如尾部弯曲、只有- - d 部分肌肉有收缩作用、眼睛不透明等症状。p i n k n e y 等 85 】将美洲狼鲈( m o r o n es a x a t i l i s ) 暴露在o 5 1 4 z g l t b t 中，出现脊索长度的 显著减小。c a r o l y n 8 6 1 通过对青鲻鱼( 0 ，) e f 口sl a t i p e s ) 胚胎的研究，提出t b t 的毒 性效应是贯穿在整个胚胎发育阶段的，并与发育的不同时期相关。 鱼体对有机磷农药如对硫磷( p a r a t h i o n ) 等更为敏感，胚胎及仔鱼暴露引 发骨骼系统发生畸形，神经系统的j 下常生理功能遭到破坏f 8 7 ；0 9m 坍的敌百虫 不仅对鱼的胚胎有致畸性，且对仔鱼也有催畸作用；有机磷酸酯农药 ( o r g a n o p h o s p h a t ep e s t i c i d e s ，o r ，s ) 如毒死蜱( c h l o r p y r i l o s ) 低浓度就可对虹鲻 ( p o e c i l l ar e t i c u l a t a ) 仔鱼产生毒性作用，改变其游泳行为，引起潜在致命性的 麻痹与抽搐等，其l c 5 0 值为7 1 7 m g l 8 引。 其他污染物如五氯苯酚( p e n t a c h l o r o p h e n o l ，p c p ) 降低鲦鱼( p i m e p h a l e s 第一章前吉 p r o m e l a s ) 孵化率1 8 9 。h e i m s t e t t e r 和a l d e n 9 0 1 发现局部单一暴露f7 0 1 地氯 苯酚能穿透青鲻鱼卵膜，在鱼胚胎刚开始发育时期，p c p 会引发心血管及眼部 畸形，暴露1 6d 影响显著，最终导致死亡或孵育失败9 1 1 。与囊胚期( 受精后 5 8 h ) 、心搏开始期( 受精后4 8 h ) 暴露相比，神经胚期( 受精后2 4h ) 对p c p 作用最为敏感，可能由于神经胚期正好在心血管和视觉系统的形成之前，所以 可观察到更高的敏感性，卵中p c p 浓度达到12 5 0 n g g 时胚胎死亡率就会高达 9 0 9 ”。 3 石油对鱼早期发育阶段的影响研究现状 当将胚胎或仔鱼暴露在石油中时，卵黄囊就可能会成为烃进入组织的存贮 位点，在发育阶段的缓慢释放，相当于慢性毒性暴露，从而延长致畸作用时间 哪】。暴露会通过多种机制破坏鱼胚胎期的发育，包括改变隔膜的形成及阻碍 a d p 的磷酸化等引发对卵的毒性。对细鳞大马哈鱼( o n c o r h y ，m h u s g o r b u s c h a ) 自 然发生阶段以及银鲑( o n c o r h y n c h u sk i s u t c h ) 仔鱼等的研究，发现其对暴露的胚胎 或仔鱼产生组织伤害或抑制酶的活性【”】，暴露仔鱼的典型反应为头部难于区分， 眼晶体突出、脊索弯曲、色素沉着89 1 。研究发现2 4 环p a h s 引发斑马鱼胚胎 的不同毒性：双环( 如萘) 及三环( 如菲) 引发畸形及心脏功能紊乱，如出现鱼体 心包囊及卵黄囊肿、颌变形、脊柱前弯和侧凹、仔鱼心搏侩缓以及心律不齐等， 但一般无致癌性【9 5 】；四环以上的复合物如苯并芘、苯并蒽等对鱼胚胎有弱致癌 性，引起外周血管疾病、贫血、神经元细胞坏死等症【9 6 】。l i n d e n 研究石油对波 罗的海鲱( c l u p e ah a r e n g u s ) 影响时发现，鱼卵受精时或受精后6 7 2h 接触石 油水溶性成分，没有显著影响，胚胎发育期间，接触3 1 8 9p p m 轻燃油和两种 原油，胚胎活动性增加，心率降低，提前或延迟孵化，孵出幼鱼7 0 1 0 0 畸形， 1 d 后死亡，温度升高会加剧石油的作用9 7 1 。s m i t h 和c a m e r o n 着重比较了 p r a d h o e 湾原油水溶性部分处理时间长短对太平洋n ( c l u p e ap a l l a s i ) 孵化、畸形 率和幼鱼长度的影响，处理1 2h 新孵出的仔鱼个体变小，处理4 8h 较多形态畸 形，处理6d 受精卵全部死亡【9 8 1 。自瓦尔迪兹原油泄漏严重污染了太平洋鲱和 粉鲑鱼( o n c o r h y n c h u sg o r b u s c h a ) 产卵地之后，进行了一系列有关p a h s 对青鱼 及粉鲑鱼发育的野外和实验室相关研究，发现污染影响下这两种鱼胚胎已受到 多列：芳烃对褐菖鼬成体及其肛胎幼体毒性效应的枷步研究 损伤，出现诸如心包囊肿大、卵黄囊肿大、下颌变形、脊柱前弯或侧凹等畸形， 仔鱼心率降低( 心搏徐缓) 、心率不齐也有发现眇1 03 1 。 五、研究的目的、意义和主要内容 本研究选取我国沿岸海域典型的也是目前应用最多的燃料油一o 号柴油做 为研究石油暴露的污染物，其水溶性成分中芳香烃含量高达9 0 以上，长期低 浓度的暴露更接近环境水平；研究内容包括水体d w s f 暴露处理后对鱼体代谢 活力的浓度一时间效应，通过生殖指标的测定评价其生殖危害，分析可能机制， 探讨石油类物质作为隐型环境激素类内分泌干扰物的可能性，观察p a h s 对褐 菖鲇胚胎和仔鱼发育的影响，为用鱼类早期发育阶段作为敏感性生物标电物评 价海洋污染提供资料。该课题也可为制定水质标准、评价环境质量和管理废