（高分子化学与物理专业论文）基于纳微米多级孔结构或寡肽修饰的聚乳酸类组织工程支架：构建及对细胞作用研究.pdf

基于纳微米多级孔结构或寡肽修饰的聚乳酸类组织 工程支架：构建及对细胞作用研究 专业：高分子化学与物理 博士研究生：何留民 指导教师：卢江教授全大萍副教授 摘要 组织工程( t i s s u ee n g i n e e r i n g ) 概念自2 0 世纪8 0 年代提出以来得到了迅速的 发展，其基本原理和方法是：将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种生物 相容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞生物材料复合物 植入机体组织或器官病损部位，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中 形成新的具有形态和功能的相应组织、器官，达到修复创伤和重建功能的目的。 采用组织工程技术体外构建人工组织或器官，给急需组织修复和器官移植的病 人带来了曙光。利用生物材料构建的三维支架为细胞生长和功能化提供人工细 胞外基质和三维支撑。同时支架材料还能做为模板引导组织生长和整合，提供 特殊的生物活性信号，诱导细胞定向分化和维持细胞功能。因此在为组织形成 构建特定环境时支架材料的选择及其物理和化学性质是关键。最近组织工程研 究的重要趋势是设计和制备在结构和功能上仿生的支架材料，通过在支架中引 入物理或和化学生物信号获得特异性细胞反应，达到引导组织再生的目的。 因此，本论文研究首先构建具有纳米微米多级孔结构的聚乳酸类三维支 架，模仿天然细胞外基质中胶原的显微结构纳米或亚微米纤维网络，采用 相分离技术构建出系列具有微米多通道、微米孔径和纳米纤维的聚乳酸类组织 工程支架，研究了支架微结构与细胞之间的相互作用。在此基础上，利用静电 纺丝技术制各具有不同拓扑形貌的纳米纤维；合成出一种含端功能基团的 p l l a ，通过化学方式键合两种层粘连蛋白衍生短肽。然后在2 d 支架中考察了 它们在促进神经细胞粘附和轴突长出的作用，为进一步仿生制备同时具有生物 学信息和物理诱导功能的组织工程支架提供科学依据。具体如下： 一、具有多纵向排列通道、多级孔结构的p l g a 导管的制备及在脊髓损伤修复 中应用研究 神经导管可为神经修复提供一个合适的微环境，使得神经纤维能够再生并 顺利到达远端。在本章节研究中我们采用热诱导相分离和低温注射成型相结合 的技术制备出具有可控多纵向排列通道、大孔微孔多级结构的p l g a 神经导 管。神经导管的外径及内部通道的数目和内径可以通过改变模具结构控制，通 道之间壁的多孔结构可以通过调节p l g a 溶液浓度和进一步加入致孔剂控制。 体外降解实验显示7 通道神经导管在3 7o cp b s 缓冲溶液中能够保持外形1 2 周， 降解液p h 值维持在4 1 4 5 之间。大鼠脊髓间充质干细胞( r a tm s c s ) 单独培养或 者与大鼠雪旺细胞( r a ts c s ) 共培养时能够在神经导管中很好的黏附、伸展和增 殖，显示出神经导管具有良好的细胞相容性。p l g a 神经导管体内移植到大鼠 脊髓能够很好的与宿主结合，没有发生明显的炎症反应，并且有宿主细胞向导 管内迁移，结果显示导管在大鼠脊髓组织内具有良好的相容性。因此本章节研 究中所制备的p l g a 多纵向排列通道、多级孔结构的神经导管在脊髓损伤修复 中具有潜在的应用前景。 二、具有纳米纤维结构的p c l b - p l l a ( 5 0 5 0 ) 三维多孔支架的制备与性能研究 采用液液相分离和盐沥滤相结合的技术制备出p c l b p l l a 三维多孔纳米 纤维支架，支架大孔孔径为1 4 4 + 3 6l x m ，孔壁由直径为1 5 1 士5 6n n l 的纳米纤维 网络构成。d s c 结果显示嵌段共聚物p c l b p l l a 为半晶质聚合物，p c l 链段 和p l a 链段在体系凝胶化过程中分别结晶但相互又有一定的干扰。低温条件下 易于凝胶化形成结晶微区，滤出溶剂冷冻干燥后即得到纳米纤维结构。纳米纤 维的形貌与凝胶化温度相关，当5 ( r v r 3p c l - b p l l a t h f 溶液在2 0o c 和4 0 o c 凝胶化时能够形成均匀的纳米纤维网络，而在4o c 凝胶化时在纳米纤维网络 中出现片状节点，升高凝胶化温度会增大片状结构面积进而形成连续结构。这 主要是因为p c l 链段在t h f 溶液中的凝胶化温度较低，以及p c l 分子链重排 受到p l a 刚性段的干扰而致使结晶度下降，无定型部分比例升高。与平滑的实 体孔壁相比，纳米纤维结构能够促进软骨细胞黏附和细胞外基质的合成，纳米 l i 纤维支架上软骨细胞中蛋白质含量和d n a 含量分别是平滑实体孔壁支架上的 1 3 1 4 和1 2 1 4 倍。研究结果表明这种具有多孔和纳米纤维结构的 p c l - b - p l l a 三维支架在软骨组织工程中具有广阔的应用价值。 三、改进相分离技术制备具有可控孔结构的p l l a 纳米纤维支架 单独以t h f 为溶剂制备的纳米纤维支架中微孔孔径在1 0p m 以下，大大限 制了该技术在组织工程中的应用。在本章节研究中我们以二氧六环水为共溶 剂，制备出同时具有大孔微孔和纳米纤维结构的p l l a 三维支架。支架中大孔 孔径主要由相分离过程中粗化因素决定，而纳米纤维网络的形成则是由凝胶化 过程中p l l a 结晶引起。凝胶化温度和双组分溶剂比例是影响支架形貌的两个 重要因素。当凝胶化温度为1 2o c ，水含量分别为1 0 和1 2 时，支架中微孔 直径为5 04 - 2 5 岬，孔壁由纤维直径在5 0 2 0 0n n l 之间的纳米纤维网络构成。 升高凝胶化温度或者增加水在双组分溶剂中含量，支架孔径增加，甚至会产生 直径达3 0 0p m 的大孔。但是当凝胶化温度高于1 2o c 或水含量超过1 2 时，观 察到尺寸在微米级的片状结构而非纳米纤维网络。d s c 分析结果显示p l l a 纳 米纤维支架材料的结晶度随凝胶化温度升高和水含量增加而升高，x r d 结果进 一步显示纳米纤维结构中p l l a 主要表现为a 晶型，而片状结构所对应的晶型 主要为伐型。s e m 和m t t 检测结果显示纳米纤维支架为大鼠脊髓间充质干细 胞( r a tm s c s ) 黏附、伸展和增殖提供了一个比片状结构支架更好的环境。 四、具有不同拓扑形貌的p l l a 静电纺丝纳米纤维的制备及对c 1 7 2 神经干细 胞生长和分化的影响 纳米纤维能够模仿天然细胞外基质的物理结构，为细胞生长提供了一个良 好的环境。然而细胞纳米纤维作用以及纳米纤维拓扑形貌例如直径和取向对细 胞生长和功能的影响在以往研究中却很少涉及，而细胞材料作用在组织工程支 架研究中具有重要的指导意义。在本章节中我们采用静电纺丝技术制备了一系 列具有不同取向和不同纤维直径的p l l a 纤维支架。纵向排列纤维的直径在3 0 7 士4 7r i m 9 1 74 - 8 4n l n 之间，无规分布纤维的直径在3 2 74 - 4 0n m - 1 1 5 04 - 1 0 9n n l 之间。纤维的直径受各种因素影响，包括聚合物浓度、溶剂、电压以及环境温 度和湿度。新生小鼠小脑c 1 7 2 干细胞在p l l a 纤维上的活性和增殖不但受纤 维直径的影响而且也受到纤维支架的孔径影响。较小直径的纤维能够吸附更多 i i i 的营养因子因而能促进细胞黏附和增殖，但太小的纤维直径会产生较小的孔径 反而抑制细胞在纤维支架上渗透。纤维纵向排列时能够引导细胞沿着纤维长轴 方向生长和伸展，最后形成极化和拉长的胞体。而在无规分布纤维上的细胞则 呈现出无规分布的梭形或者多角形。与无规分布纤维相比，纤维纵向排列时能 促进细胞长出更长的神经轴突，突显其接触引导效应。因此我们的研究为纤维 支架的设计和制备提供了重要的参考价值。 五、两种层粘连蛋白衍生短肽序列修饰改性p l l a 及对c 1 7 2 神经干细胞生长 和分化影响 大量可降解吸收的聚酯类高分子已经广泛应用于组织工程和药物载体，但 是由于缺乏功能基团，不能连接生物活性分子，其应用也受到限制。在本章节 中，首先合成赖氨酸封端的p l l a k - ( c h 2 ) n - p l l a ( n _ 2 ，5 ，8 ) 】，通过改变赖氨酸 与p l l a 主链亚甲基数目调节连接末端氨基的臂长；然后将k - ( c h 2 ) n p l l a 与 p l l a ( 1 0 9 0 ，i v 叨复合浇注成膜，采用极性水溶剂诱导聚合物中氨基向膜表面 聚集。原子力显微镜观察结果显示复合膜与纯p l l a 膜相比表面粗糙度增加， 由于k - ( c h 2 ) n p l l a 分子链末端氨基和p l l a 主链骨架亲水性的差异，复合膜 表面出现微相分离现象。增加p l l a 主链与赖氨酸的连接臂长、延长水诱导时 间可以进一步增加膜的粗糙度，促进微相分离。利用双偶联剂s u l f o s m c c 将 存在于层粘连蛋白中的两个短肽序列c y i g s r ( c y s t y r - u e - g l y - s e r - a r g ) 和 c s i k v a v ( c y s s e r - l l e - l y s v a l - a l a - v a l ) 与复合膜表面氨基键合，实现了短肽修 饰p l l a 的目的。与纯p l l a 膜相比，短肽修饰复合膜能够提高新生小鼠小脑 c 1 7 2 细胞的活性，促进细胞长出更长的神经轴突，当连接臂长为5 个亚甲基 时( 对应于k ( c h 2 ) s p l u 帅l l a ) ，复合膜表面短肽密度达最大值( o 2 8 士0 0 3 p g c m 2 ) ，短肽对c 1 7 2 细胞的粘附和轴突长出的促进作用最为显著。因此本章 节的研究建立了一种以赖氨酸端基化的p l l a 化学键合层粘连蛋白衍生短肽来 促进神经细胞粘附和轴突长出的新方法，该方法对于聚酯的改性和组织工程支 架材料的短肽修饰具有参考价值。 关键词：组织工程；相分离；电纺丝；纳米纤维；短肽。 i v p o l y l a c t i d es c a f f o l d s w i t hn a n o m i c r o - m u l t ip o r o u s a r c h i t e c t u r eo ro l i p e p t i d em o d i f i c a t i o n ：f a b r i c a t i o n a n de f f e c t so nc e l l s m a j o r ：p o l y m e rc h e m i s t r ya n dp h y s i c s p h d c a n d i d a t e ：l i u m i nh e s u p e r v i s o r ：p r o f j i a n gl u ，a pd a p i n gq u a i l a b s t r a c t t i s s u ee n g i n e e r i n gi sa ne x c i t i n gr e s e a r c ha r e at h a ta i m sa tt h eu s eo fa c o m b i n a t i o no fc e l l s ，e n g i n e e r i n ga n dm a t e r i a l sm e t h o d s ，a n ds u i t a b l eb i o c h e m i c a l a n dp h y s i o - c h e m i c a lf a c t o r st oi m p r o v eo rr e p l a c eb i o l o g i c a lf u n c t i o m b i o m a t e r i a l s p r o v i d e t h r e e - d i m e n s i o n a l o d ) t e m p l a t e s a n ds y n t h e t i ce x t r a c e u u l a rm a t r i x e n v i r o n m e n t sf o rc e l lg r o w t ha n df u n c t i o ni nt h et i s s u ee n g i n e e r i n gs t r a t e g y t h e y a l s op r o v i d eat e m p o r a r ys c a f f o l d i n gt og u i d en e wt i s s u eg r o w t ha n do r g a n i z a t i o na n d m a yp r o v i d eb i o a c t i v es i g n a l s ( c g ，c e l l a d h e s i o np e p t i d e sa n dg r o w t hf a c t o r s ) r e q u i r e df o rt h er e t e n t i o no ft i s s u e - s p e c i f i cg e n ee x p r e s s i o n t h e r e f o r et h en a t u r eo f t h em a t e r i a la n di t sp h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e sa r ec r i t i c a lt oc r e a t et h ed e s i r e d c o n d i t i o n sf o rt i s s u ef o r m a t i o n t h ed e v e l o p m e n to fb i o m a t e r i a l sf o rt i s s u e e n g i n e e r i n ga p p l i c a t i o n sh a sr e c e n t l yf o c u s e d0 1 1t h ed e s i g no fb i o m i m e t i cm a t e r i a l s t h a ta r ec a p a b l eo fe l i c i t i n gs p e c i f i cc e l l u l a rr e s p o n s e sa n dd i r e c t i n gn e wt i s s u e f o r m a t i o nm e d i a t e db ys p e c i f i ci n t e r a c t i o n s ，w h i c hc a nb em a n i p u l a t e db yi n t r o d u c i n g p h y s i c a la n d o rb i o c h e m i c a lc u e si n t ot h es c a f f o l d s c o n s i d e r i n gt h em e n t i o n e da b o v e , t h ep h d t h e s i si sd e s i g n e dt of i r s t l yf a b r i c a t e 3 dp o l y l a c t i d es c a f f o l d sw i t hn a n o m i c r o a r c h i t e c t u r e s ，t om i m i ct h es t r u c t u r eo ft h e n a t u r a le x t r a c e u u l a rm a t r i xw h i c hh a saf i b r o u ss t r u c t u r ew i t hd i a m e t e r so nt h e n a n o m e t e ro rs u b m i c r o m e t e rs c a l e s as e r i e so fs c a f f o l d sw e r ef a b r i c a t e dw i t l l v m a c r o p o r e s ，n a n o f i b e r s ，m u l t i p l ec h a n n e l sa n dp r e c i s eh i e r a r c h i c a lp o r e s ，r e s p e c t i v l y t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h ec e l l sa n dm a t r i xw e r ei n v e s t g a t e di nd e t a i l s i na d d i t i o n ， p l l an a o f i b e r sw i t hd i f f e r e n t t o p o g r a p h i c a lm o r p h o l o g i e sw e r e c r e a t e d b y e l e c t r o s p i n n g ，p l l aw i t he n df u n c t i o n a lg r o u p sw a ss y n t h e s i z e da n df u r t h e r c o v a l e n t l y 蓼m e dw i t ht w ol a m i n i n d e r i v e dp e p t i d e s t h ea d h e s i o na n dn e u r i t e o u t g r o w t ho fc 17 2c e l lo nt h e2 ds c a f f o l dw e r ee v a l u a t e d t h e r e f o r e ，t h e s er e s e a r c h r e s u l t sp r o v i ds p e c i a lr e f e r e n c e st os c a f f o l df a b r i c a t i o nw i t hb i o a c t i v ec u e sa n d p h y s i c a lg u i d a n c ef o rc e l l sa n dt i s s u e f i v ec h a p t e r sw e r ei n c l u d e di nt h et h e s i sa s s h o w e db e l o w ： ( 1 ) p l g am u l t i p l e c h a n n e lc o n d u i t sw i t hp r e c i s eh i e r a r c h i c a lp o r ea r c h i t e c t u r e sa n d i nv i t r o v i v oe v a l u a t i o nf o rs p i n a lc o r di n j u r y n e r v ec o n d u i t sh a v eb e e nu s e dt og u i d et h en e w l yr e g e n e r a t e dn e r v ef i b e r st o g r o wf r o mp r o x i m a ln e r v es t u m pt o w a r d st h ed i s t a ls t u m p i nt h i ss t u d y , an o v e ln e r v e c o n d u i tw i map l u r a l i t yo fc h a n n e l sa n dm a c r o m i c r o p o r o u sa r c h i t e c t u r ew a s f a b r i c a t e du s i n gp l g a ( 7 5 ：2 5 ，眠= 1 2 2 x 1 0 5 ) b yt h em e t h o do fi n j e c t i o nm o l d i n g c o m b i n e dw i mt h e r m a l l yi n d u c e dp h a s es e p a r a t i o n t h ep a r a m e t e r so ft h ec o n d u i t ， i n c l u d i n gt h ed i a m e t e ro ft h ec o n d u i t ，t h en u m b e ra n dt h ed i a m e t e ro fc h a n n e lc o u l d b er e g u l a t e db yc h a n g i n gt h ep a r a m e t e r so ft h em o u l d m e a n w h i l et h eh i e r a r c h i c a l p o r e sa r c h i t e c t u r eo ft h ew a l l sc o u l db ec o n t r o l l e dt h r o u g hv a r y i n gt h es o l u t i o n c o n c e n t r a t i o na n dt h ea d d i t i o no fp o r o g e n t h ed e g r a d a t i o ns t u d yi nv i t r os h o w e dt h a t 7 - 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p o r e sa n dn a n o f i b r o u ss t r u c t u r ew a sf a b r i c a t e db y p h a s es e p a r a t i o nf r o mat e r n a r yp l l a d i o x a n e w a t e rs y s t e m t h ep o r es i z ew a s m a i n l yd e t e r m i n e db yt h ec o a r s e n i n ge f f e c t si nt h ep h a s es e p a r a t i o np r o c e s s ，w h i l e t h en a n o f i b r o u ss t r u c t u r ew a sd u et ot h ef o r m a t i o no fp l l am i c r o e r y s t a l l i t e v h d o m a i n si nt h eg e l a t i o np r o c e s s g e l a t i o nt e m p e r a t u r ea n dt h er a t i oo fd i o x a n e w a t e r w e r et h et w oi m p o r t a n ti n f l u e n t i a lf a c t o r so nt h em o r p h o l o g yo fs c a f f o l d p o r e sw i t h t h ed i a m e t e ro f5 04 - 2 5l x mf o r m e da tag e l a t i o nt e m p e r a t u r eo f12o ca n d10 一12 w a t e rc o n t e n t t h ep o r ew a l lw a sn a n o f i b r o u sn e t w o r kw i t ht h ef i b e rd i a m e t e r v a r y i n gf r o m5 0n n lt o2 0 0n n l i n c r e a s i n gt h eg e l a t i o nt e m p e r a t u r eo rt h ec o n t e n to f w a t e ri nt h em i x e ds o l v e n ts y s t e mw o u l dd e f i n i t e l yi n c r e a s et h ep o r es i z ea n d m a c r o p o r e su pt o3 0 0p mw e r eo b s e r v e d p l a t e l e l i k es t r u c t u r ea p p e a r e di n s t e a do f n a n o f i b e r sa tg e l a t i o nt e m p e r a t u r e sh i g h e rt h a n12 。co rt h ep r o p o r t i o no fw a t e r e x c e e d e d12 d s ca n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ec r y s t a l l i n i t yd e g r e ei n c r e a s e d w i t hi n c r e a s i n gt h eg e l a t i o nt e m p e r a t u r eo rt h ew a t e rc o n t e n ti nt h em i x e ds y s t e m x r dr e s u l t sf u r t h e ri n d i c a t e dt h a ta c r y s t a lf o r mw a sm a i n l yc o r r e s p o n d i n gt ot h e n a n o f i b e r ss t r u c t u r e ，w h i l ec tc r y s t a lw a sd e t e c t e di nt h ep l a t e l e l i k es t r u c t u r e s e m a n dm t ta s s a yi n d i c a t e dt h a tt h en a n o f i b r o u ss c a f f o l dp r o v i d e daf a v o r a b l e e n v i r o n m e n tf o rr a tm s c a t t a c h m e n t ，s p r e a da n dv i a b i l i t y ( 4 ) p l l ae l e l c t r o s p u nn a n o f i b e r sw i t hd i f f e r e n tt o p o g r a p h i c a lm o r p h o l o g i e sa n dt h e i n f l u e n c e so nc17 2c e l lg r o w t ha n dd i f f e r e n t i a t i o n n a n o f i b e r sw h i c hc a l lm i m i ct h es t r u c t u r eo fn a t u r a le x t r a c e l l u l a rm a t r i xp r o v i d e af a v o r a b l ee n v i r o n m e n tf o rc e l l s h o w e v e r , c e l l - 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