（法医学专业论文）大鼠皮肤切创后e选择素表达及死后稳定性研究.pdf

重庆医科大学硕士研究生学位论文 大鼠皮肤切创后e 选择素的表达及死后稳定性研究 摘要 研究背景及目的：皮肤作为人体最大的器官，与外界直接接触， 对机体具有重要的屏障和保护作用，其最易遭受机械性损伤在法医学 实践中，皮肤损伤时间的推断常是法医工作者需要解决的关键问题。 正因为如此，关于皮肤损伤时间推断方面的研究，一直以来是国内外 法医病理学者的研究热点问题之一。e 一选择素是细胞粘附分子 ( a d h e s i o nm o l e c u l e ，a m ) 中选择素家族( s e l e c t i nf a m i l y ，s e ) 成 员之一。在体内分布非常局限，主要由毛细血管、后微静脉的内皮细 胞分泌，其胞内无储存。它只在外伤、炎症等刺激后在血管内皮细胞 表面表达，且具有特异性。e 一选择素产生后，参与记忆t 淋巴细胞、 单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的聚集，以及内皮细胞增殖、 迁移、管状形成和毛细血管的生成，但最主要是介导血液中中性粒细 胞粘附。e 一选择素参与损伤早期修复作用，目前国内外对e 一选择素的 研究多侧重于临床方面，而对于它在法医学领域方面对皮肤损伤后不 同时间的表达变化及死后稳定性的研究甚少。尤其是国内对e 一选择素 在皮肤机械性损伤修复时间的推断方面几乎未见报道。本研究通过建 立大鼠皮肤切创损伤模型，运用免疫组化技术及其阳性细胞计数法对 损伤组织进行e 一选择素的检测与分析，探讨在皮肤创伤愈合过程中其 表达的时序性变化规律，以及死后稳定性状况，有可能为法医病理学 皮肤损伤时间的推断，鉴别生前伤和死后伤提供一个新的理论依据。 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文 方法：采用完全随机分组方法，分为实验组和对照组。实验组又分 为生前造创组、死后造创组、死后稳定性一2 0 $ n 2 5 组。根据造创后 处死时间不同，将实验大鼠随机分为伤后3 0 m i n 、l h 、2 h 、3 h 、5 h 、7 h 、 9 h 、1 2 h 、l d 、3 d 、5 d 、7 d 共1 2 亚组；死后造创组分为0 5 h ，1 h ，3 h 共 3 亚组；另设一组为正常对照组，即未造创组。生前造创组在大鼠头部 制做全层切创，在预定时间分别颈椎脱臼法处死后即刻取材；死后造 创组于处死大鼠后在预定时间造创取材。死后稳定性组中将大鼠造创 后于1 d 将它们颈椎脱臼法处死。随机分为1 4 亚组，其中9 亚组置于- 2 0 环境中，于6 h 、1 2 h 和1 d 、2 d 、3 d 、4 d 、5 d 、6 d 、7 d 取材；另5 亚置 于2 5 环境中，于6 h 、1 2 h 禾i l d 、2 d 、3 d 取材。取材皮肤组织用多聚甲 醛- p b s 液中固定后，石蜡包埋切片，进行常规h e 染色光镜观察；采用 免疫组织化学染色法进行e 一选择素染色，采用s p s s l1 0 统计软件包对 所得数据进行统计分析。 结果：1 、h e 染色观察：伤后1 h ，创口周围毛细血管扩张、充血， 组织间水肿；伤后1 2 h 内，可见大量炎性细胞游出，主要以中性粒细胞 浸润为主；伤后l - - 3 d ，肉芽组织逐渐形成并大量增生，炎性细胞以单 核一巨噬细胞为主；伤后5 7 d ，肉芽组织成熟，成纤维细胞生成，炎 性细胞消失，创口基本愈合。死后造创组及正常对照组镜下无上述改 变。死后在一2 0 。c 下6 小时至7 d ，皮肤损伤部位组织结构与断颈处死即 刻基本一样，没有发生明显变化，在第6 、7 d 可见其内极少数炎症细胞 结构欠清晰，核固缩、粹裂，但边缘、组织结构较清楚；在2 5 下， 皮肤损伤部位组织中炎症细胞、部分组织细胞逐渐自溶；以至损伤边 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 缘结构模糊不清。2 、免疫组织化学s a b c 法染色观察：伤后l h ，创缘周 围毛细血管内皮细胞可见棕黄色阳性表达，以后持续升高，至伤后1 d ， 阳性表达达到高峰：以后表达逐渐减弱，至伤后7 d ，仍可见有少量阳性 表达。一2 0 死稳定性组中，不同时间阳性表达与伤后l d 处死即刻没有 明显变化；2 5 环境中，随着时间延长，组织及细胞的自溶，各亚组 的表达情况与伤后1 d 处死即刻有明显变化，阳性表达逐渐减少，在2 d 时未见表达。在正常对照组及死后伤组中均未见e 一选择素表达。3 、阳 性细胞计数法结果：阳性细胞率( p r 值) 在伤后1 h 到伤后1 d 逐渐上升， 伤后1 d 达到高峰，伤后3 d - - - - 7 d ，p r 值逐渐下降。4 、统计学处理结果： 方差分析结果表明生前创伤各相邻两组之间e 一选择素p r 值相比均具有 显著差异( p o 0 1 ) 。其中生前创伤l d 组与其他各时间组相比均有显 著差异( p o 0 1 ) 。 结论：大鼠皮肤切创后e 一选择素可迅速增量表达，且与时间相关， 呈一定规律性，呈上升一高峰一下降的时序变化；在伤后1 d 达到高峰。e 选择素在生前及死后均不表达，选择素在皮肤创伤后表达的时序性变 化规律并具有特异性，有望作为皮肤损伤发生后个体存活时间推断的 一个客观有效的指标。且在死后e 选择素表达稳定性与否受温度影响很 大，在一2 0 下，其稳定性好，但在2 5 环境中，其稳定性差。 关键词：免疫组织化学，e 一选择素，皮肤切伤，死后稳定性 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 as t u d yo nt h ee x p r e s s l 0 n0 fe s e l e c t i ni n i n c i s e ds k i na n dp o s t m o r t e ms t a b i l i t y a b s t r a c t s t u d yb a c k g r o u n da n do b je c t i v e ：h u m a ns k i ni st h el a r g e s to r g a n ， d i r e c t l yc o n t a c t sw i t ht h eo u t s i d ew o r l d ，t h es k i nh a sa ni m p o r t a n tr o l ef o r b o d yt op r o t e c ta n db a r r i e r s ，a n dm o s tv u l n e r a b l et om e c h a n i c a li n j u r y , s oi n t h ep r a c t i c eo ff o r e n s i cm e d i c i n e ，t i m i n go fw o u n da g ei st ob er e s o l v e d k e yi s s u ef o rf o r e n s i cw o r k e r s b e c a u s eo ft h i s ，t h er e s e a r c ho fe s t i m a t i o n o ns k i ni n ju r ya g e ，h a sb e e no n eo ft h eh o ti s s u e sa th o m ea n da b r o a df o r f o r e n s i cp a t h o l o g yw o r k e r s e s e l e c t i ni so n eo ft h em e m b e r so ft h es fo f a m i t sd i s t r i b u t i o ni sv e r yl i m i t e di nt h eb o d y ，e s e l e c t i ni sc r i n e dm a i n l y b ye n d o t h e l i a lc e l l so ft h ec a p i l l a r i e sa n dp o s tv e n u l e ，a n dw i t h o u ts t o r a g e i nt h ec e l l s a f t e ro n l yi nt r a u m aa n di n f l a m m a t o r ys t i m u l a t i o n ，e s e l e c t i n e x p r e s s e so nt h es u r f a c eo fv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s ，a n dh a sas p e c i f i c i t y a f t e re s e l e c t i n e x p r e s s i o n ，i tp a r t i c i p a t e s i nm e m o 叫tl y m p h o c y t e ， m o n o c y t e s ，e o s i n o p h i l sa n db a s o p h i l sg r a n u l o c y t eo ft h eg a t h e r i n g ，a n d e n d o t h e l i a lc e l lp r o l i f e r a t i o n ，m i g r a t i o n ，t u b u l a rc a p i l l a r yf o r m a t i o na n dt h e g e n e r a t i o n ，b u ti t i sm o s ti m p o r t a n tf o re s e l e c t i nt ol e a di nt h eb l o o d n e u t r o p h i la d h e s i o n e - s e l e c t i np a r t i c i p a t e si nr e p a i r i n ga tt h ee a r l yd a m a g e i ti sm o s tf o c u s e do nt h ec l i n i c a la s p e c t sf o rr e s e a r c ho fe s e l e c t i na t h o m ea n da b r o a da tp r e s e n t f o ri t ，i nt h ef i e l do ff o r e n s i cm e d i c i n e ，i ti s 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 v e r yr a r eo nt h er e s e a r c hf o re x p r e s s - i o no fe - s e l e c t i na f t e rs k i nd a m a g e d i f f e r e n tt i m e sa n dp o s t m o r t e ms t a b i l i t y e s p e c i a l l yo nd o m e s t i c ，i ti s a l m o s tr e p o r t e df o re s e l e c t i no ft i m i n go fs k i nm e c h a n i c a li n ju r ya n d r e p a i ra g e t h e r e f o r e ，w ee s t a b l i s h e dt h em o d e lo fs k i ni n c i s e dw o u n di n t h eh e a ds k i no fr a t sa n de m p l o y e di m m u n o h i s t o c h e m i c a la n dp o s i t i v ec e l l c o u n t i n gt e c h n i q u e st oe x a m i n ea n da n a l y z et h ee x p r e s s i o no fe s e l e c t i ni n t h eh e a l i n g p r o c e s so fw o u n da n dt h ei d e n t i f i c a t i o no fh i sa n t e m o r t e m w o u n d so rp o s t m o i r t e mi n j u r yt op r o v i d ean e wt h e o r e t i c a le v i d e n c ef o rt h e w o u n d i n gi n t e r v a le s t i m a t i o no f f o r e n s i cp a t h o l o g y m e t h o d s ：f o rt h ee x p e r i m e n t ，r a t sw e r ed i v i d e di n t oe x p e r i m e n t a l a n dc o n t r o lg r o u p sc o m p l e t e l ya tr a n d o mm e t h o d s t h ee x p e r i m e n t a l g r o u p w a sd i v i d e di n t oa n t e m o r t e mi n c i s i o n g r o u p s ( k i l l e d a t o 5 h ，lh , 2 h ，3 h ，5 h ，7 h 9 h ，12 h ，ld ，3 d ，5 d ，7 d a f t e ri n c i s i o n ) a n dp o s t m o r t e m i n c i s i o n g r o u p s ( 0 5 h ，lh ，3 h ) ，p o s t m o r t e ms t a b i l i t yg r o u p a t 一2 0 。c ( 6 h ，1 2 h ，l d ，2 d ，3 d ，4 d ，5 d ，6 d ，7 d a f t e r d e a t h ) a n da t2 5 。c ( 6 h ，1 2 h ，l d ，2 d ，3 d a f t e rd e a t h ) ，a n dt h en o n - i n c i s e dr a t ss k i nw a su s e da sc o n t r 0 1 i n a n t e m o r t e mi n c i s i o ng r o u p sa nw o u n dw a sm a d ei nt h eh e a ds k i no fr a t s a n do b t a i n e da ta r r a n g e dt i m ea f t e rd e a t h ，p o s t m o r t e ms t a b i l i t yg r o u p s w e r ea l lk i l l e da tlda f t e rh e a ds k i ni n c i s e dw o u n d 。w h i l ei np o s t m o r t e m i n c i s i o ng r o u p sa ni n c i s e dw o u n dw a sm a d ea ta r r a n g e dt i m ea f t e rd e a t h a n do b t a i n e d i m m u n o h i s t o c h e m i c a la n dp o s i t i v ec e l lc o u n t i n gt e c h n i q u e s w e r ee m p l o y e di n v i t a ls k i ni n c i s i o ng r o u p sa n dp o s t m o r t e ms t a b i l i t y 6 重庆医科大学硕士研究生学位论文 g r o u p sa n dp o s t m o r t e mi n c i s i o ng r o u p sa sw e l la st h en o n i n c i s e dr a t s s k i n ，t oe x p l o r et h ee x p r e s s i o no fe s e l e c t i nd u r i n gs k i ni n c i s e dw o u n d h e a l i n ga n dt h ea p p l i c a b i l i t yo ft i m e d e p e n d e n te x p r e s s i o n so fe s e l e c t i n t od e t e r m i n a t i o no fw o u n da g e t h es a m p l e ss u r r o u n d i n gt h el e s i o nw e r e h a r v e s t e da td i f f e r e n tt i m e p o i n t s t h e s k i nt i s s u ew a sf m e dw i t p a r a f o r m a l d e h y d e - p h o s p h a t eb u f f e r e d a sl i n e ，p a r a f f i nw a xe m b e d d e d s e c t i o n sw e r ep r e p a r e df o rh es t a i n i n ga n dm i c r o s c o p eo b s e r v a t i o n t h e e x p r e s s i o no fe s e l e c t i np r o t e i na td i f f e r e n tt i m ew e r ed e t e c t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ym e t h o dt h ed a t ac o ll e c t e dw e r ea n a l y z e db yt h es t a t i s t i c a l p a c k a g eo fs p s s 11 0s o f t w a r e r e s u l t s ：1 o b s e r v a t i o no ft h eh es t a i n i n g ：t h ei n f i l t r a t i o no fm a s s i n f l a m m a t i o nc e l l sw e r eo b s e r v e dw i t h i n12 hw o u n ds i t e sm o s to fw h i c h w e r en e u t r o p h i l s f u r t h e r m o r e ，t h eg r a d u a lf o r m a t i o na n dp r o l i f e r a t i o no f g r a n u l a t i o nt i s s u ew e r eo b s e r v e di nl 3 da f t e ri n c i s i o na n dt h em a j o r i n f l a m m a t i o nc e l l sw e r em o n o n u c l e a rc e l l sa n dm a c r o p h a g e s t h eg r a d u a l m a t u r a t i o no fg r a n u l a t i o nt i s s u ew i t he x t i n c t i o no fi n f l a m m a t i o nc e l l sa n d p l e r o s i so f t h ew o u n d sw e r eo b s e r v e di n5 7 da f t e ri n c i s i o n a sc o m p a r e a s i n s t a n t l y r a t so f d e a t ha f t e r1dh e a ds k i ni n c i s e d w o u n d ，a t 一2 0 。cp o s t m o r t e ms t a b i l i t yg r o u p s i n c i s e dh e a ds k i nt i s s u ew e r e l e s sc h a n g e sb e t w e e n6 ha n d5 d ；t h e r ew e r ev e r ys m a l ln u m b e ro f i n f l a m m a t o r y c e l l sw i t h i nt h es t r u c t u r el e s s c l e a r , k a r y o p y k n o s i s ，c u i c r a c k e d ，b u tt h ee d g eo fac l e a ro r g a n i z a t i o n a ls t r u c t u r eb e t w e e n6 d 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 a n d 7 d h o w e r e ，a t2 5 。ct h es i t eo fs k i ni n j u r yi ni n f l a m m a t o r yc e l ls ，s o m e o r g a n i z a t i o n sg r a d u a l l yn e c r o s i s ，a u t o l y s i s a n dd i s s o l v e d ，a sw e l la s d a m a g et h ee d g e o fa m b i g u i t yb e t w e e n6 ha n d3 d t h e p o s t m o r t e m i n c i s i o ng r o u p sa n dt h en o r m a lc o n t r o lg r o u ph a dn oa l t e r a t i o nl i k et h a t 2 o b s e r v a t i o no ft h ei m m u n o h i s t 6 c h e m i c a ls a b cs t a i n i n g ：a f t e ri n c i s i o n w i t h i nlh ，t h e r ew a sl i t t e rb r o w np o s i t i v er e a c t i o no nt h ec a p i l l a r y e n d o t h e l i a lc e l l sa r o u n dm a r g i no fi n c i s e ds k i nw o u n da n dt h e np o s i t i v e r e a c t i o ns u s t a i n e di n c r e a s e d ，t i l lt old ，p o s i t i v ee x p r e s s i o nr e a c h e dap e a k ； g r a d u a l l ye x p r e s s i o nw e a k e n e da f t e re x p r e s s i o n ，i n7 dt h e r ew a sas m a l l a m o u n to fp o s i t i v ee x p r e s s i o n a sc o m p a r ea si n s t a n t l yr a t so fd e a t ha f t e r 1dh e a ds k 证i n c i s e dw o u n d ，a t 2 0 p o s t m o r t e ms t a b i l i t yg r o u p s ，t h e r e ， 一 ， 一 一 w e r en os i g n i f i c a n c ec h a n g e sb e t w e e n6 ha n d7 d ，h o w e v e r ，a t2 5 ，w i t h t h ee x t e n s i o n o ft i m e ，o r g a n i z a t i o na n dc e l ln e c r o s i sa n dd i s s o l v e d ，t h e e x p r e s s i o no fi n j u r ylde x e c u t e di m m e d i a t e l ya f t e ras i g n i f i c a n tc h a n g e t h ee s e l e c t i np o s i t i v ee x p r e s s i o ng r a d u a l l yr e d u c e db e t w e e n6 ha n d2 d ，i n 2 d ，t h e r ew a sm o s t l yn op o s i t i v ee x p r e s s i o n i nt h ec o n t r o lg r o u pa n dd e a t h t h e r ew e r en oe s e l e c t i ne x p r e s s i o n 3 ，p o s i t i v ec e l lc o u n tr e s u l t s ：p o s i t i v e c e l l sr a t e ( p rv a l u e ) lha f t e ri n j u r yt i l lt olde s e l e c t i np o s i t i v ee x p r e s s i o n g r a d u a l l yi n c r e a s e d ，lda f t e ri n j u r ye - s e l e c t i np o s i t i v ee x p r e s s i o nr e a c h e d ap e a k ，a f t e ri n j u r y3 d 7 d ，p rv a l u ed e c r e a s e dg r a d u a l l y 4 ，t h er e s u l t sw e r e ： v a r i a n c ea n a l y s i ss h o w - e dt h a th i sw o u n d sb e t w e e nt h et w on e i g h b o r i n g e s e l e c t i np rv a l u e sa r ec o m p a r e dw i t hs i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s ( p o 01 ) 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ldt r a u m ao fh i sg r o u pa n do t h e rg r o u p st i m ew e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t ( ，p o 01 ) 3t h er e s u l t so fp o s i t i v ec e l lc o u n t i n gt e c h n i q u e s ：i nt h ev i t a l s k i ni n c i s i o n s ，t h ef i g u r e so fp rb e g a na tlha f t e ri n c i s i o n ，w h i c h i n c r e a s e ds u b s e q u e n t l y ，a n dp e a k e da tld t h e nt h eq u a n t i t yo fe s e l e c t i n e x p r e s s i o nd e c r e a s e dg r a d u a l l ya n dm i n i m i z e di nt h es p e c i m e n sa g e d7 d a y s i np o s t m o r t e ms t a b i l i t yg r o u p sa t - 2 0 。c ，t h ee x p r e s s i o no fe s e l e c t i n s h o wn o s i g n i f i c a n c e d i f f e r e n c eb e t w e e nld a ya n d7 d a y h o w e r e ，a t 2 5 。c t h e e x p r e s s i o no fe s e l e c t i ns h o ws i g n i f i c a n c ed i f f e r e n c eb e t w e e n l d a ya n d3 d a y 4 。t h e r e s u l t so fs t a t i s t i c a l p r o c e s s i n g ：t h e r e s u l t so f a n a l y s i so fv a r i a n c ew e r ei n d i c a t e dt h a tt h e r ew e r es i g n i f i c a n c el e v e l s b e t w e e nc o n s e c u t i v e g r o u p s ( p 0 01 ) c o m p a r i n g o fe a c h g r o u p s i n d i c a t e dt h a tt h e r ew e r es i g n i f i c a n c el e v e l sb e t w e e nt h eg r o u po flda f t e r i n j u r ya n de l s eg r o u p s ( p o 0 5 ) 2 5 条件下有著性差异，( p 0 0 5 ) ；s i g n i f a n c ed i f f e r e n c ea t2 5 ，( p o 0 1 ) 1 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 3 讨论 e 一选择素又名人类白细胞分化抗原c d 6 2 e ，曾被称为“内皮细胞白细胞黏附 分子l ”，是一种分子量为1 1 5 k d 的细胞表面跨膜i 型单链糖蛋白，于1 9 8 5 年被 发现，其基因被于1 9 8 9 年克隆；e 一选择素属于a m s 家族中的s f 成员之一，e 一 选择素与s f 的其他成员相同，由氨基末端c 型植物凝集素区、表皮生长因子区、 4 9 个短重复序列区、单一的跨膜区以及一个胞浆区蛋白区订1 域片段构成。e 一选 择素还有2 个主要结构特点：补体调节型的多个重复序列与凝集素和表皮生长因 子区域结合；每个补体调节重复片段含6 个半胱氨酸。e 一选择素凝集素区域与甘 露糖结合蛋白紧密排列，c 型凝集区域和表皮生长因子区域具有高度的保守性， 使其在与配体结合方面有重要作用。研究表明，e 一选择素有多种配体：s l e x 和s l e a 及相关的寡聚糖。s l e x 在中性粒细胞表面呈高密度表达，是e 一选择素识别的主要 结构，但与e 一选择素的亲和力较低。s l e a 是s l e x 的同分异构体，常表达在某些 肿瘤细胞上，可能与肿瘤的转移有关。外伤、炎性因子i l - 1 、t n f 一0 、l p s 等刺 激血管内皮细胞后，产生e 一选择素，其产生是在转录水平诱导的；转录抑制剂( 如 放线菌素d ) 或翻译抑制剂( 如环己酰亚胺) 都会抑制e 一选择素的表达。e 一选择素主 要由毛细血管、后微静脉的内皮细胞分泌伯一1 ，其胞体内无储存。e 一选择素产生后， 参与记忆t 淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的聚集，以及内 皮细胞增殖、迁移、管状形成和毛细血管的生成，但最主要是介导血液中中性粒 细胞粘附。e 一选择素的生物学功能：与膜型c d 6 2 e 竞争结合相应配体而抑制白 细胞与内皮细胞间的粘附；触发表面含有相应配体的效应细胞而启动免疫反应， 促进炎症的发生。其升高程度能反映内皮细胞上c d 6 2 e 的表达状况，可作为内皮 细胞激活的标志。 e 一选择素的作用：1 参与炎性反应：e 一选择素是诱导性黏附分子，介导白细胞 在炎症和组织损伤区域的滚动，t n f a 、i l l 或脂多糖均可刺激内皮细胞合成e 一 选择素。e 一选择素可能促进肿瘤细胞与内皮细胞的黏附、影响肿瘤转移的发生及 部位、介导白细胞向炎症部位迁移。在炎性反应中大多数的白细胞与内皮细胞形 成接触时需要e 一选择素作为起动因子。2 e 一选择素介导活化的内皮细胞与中性粒 细胞黏附的作用，经证实，e 一选择素还能介导内皮细胞与单核细胞、记忆t 细胞、 1 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 嗜酸及嗜碱性粒细胞、血液树突状淋巴细胞、前t 细胞、成人t 细胞性白血病细 胞等的结合。内皮细胞上e - 选择素可锚定白细胞，继而介导其活化，因而有助于 白细胞稳定地黏附于内皮细胞，继而迁移至血管外组织。3 e 一选择素介导白细胞 招募到皮肤，尤其是记忆性t 细胞在移植入联合免疫缺陷小鼠的皮肤中，白细胞 的聚集是依赖e 一选择素的：在许多皮肤疾病中，如恶性病变、多位点的慢性炎症， e 一选择素的高表达与t 细胞的渗入紧密相联；在成人变应性皮炎患者，可溶性e 一 选择素可以反应病变的活动性，并且与病情严重程度存在明显的相关性n 引。 w o l k e r s t o r f e rn 1 + 等又发现，在儿童患者有相同的改变。故e 一选择素可作为组织 特异性的归巢受体 e 一选择素是活化内皮细胞最特异指标，f o r l o wn 2 1 等在c d 。、e 一选择素基因 共同敲除的小鼠，白细胞黏附能力下降9 5 ，表明e 一选择素的作用不能被其他 黏附分子取代。e 一选择素表达具有瞬时性及特异性。e 一选择素的表达主要局限于 活化的内皮细胞，正常血管内皮细胞不表达或低表达。只有内皮细胞在被细胞因 子或细菌内毒素等刺激后，e 一选择素基因快速而短暂的表达n 钉。e 一选择素和趋化 因子均可触发滚动的中性粒细胞的捕获n 4 1 。创伤后早期炎性反应时，炎性介质的 释出以及细菌成分( l p s ) 可激活自细胞和内皮细胞。白细胞补充到组织涉及粘附分 子参加的多步骤过程，选择素及其相关的配体促发白细胞与内皮细胞首轮反应。 各种炎症性因子可诱导其表达，通过识别其相应配体( s - l e w i s 、l p s - 1 等) 主要 介导白细胞( 中性粒细胞、单核细胞) 在内皮细胞表面最初的滞留和滚动，以及随 后迁移到炎症的组织。周学武n 钉总结国外研究资料显示：创伤后粘附分子表达增 多，血液和组织液中可溶性粘附分子含量相应增多，反映了体内白细胞激活和内 皮细胞损伤，并与创伤严重程度密切相关，对于评估创伤严重程度、判断预后有 重要意义。d r e s s l e r ，j 等n 6 对1 9 7 例皮外伤病人的研究表明：伤后皮肤l h 即 有e 一选择素表达，并与创伤的严重程度相关。 本实验研究表明：e 一选择素在生前造创组内的表达变化为在伤后1 h 可见e 选择素主要在创缘周围毛细血管内皮细胞呈阳性表达，一直至伤后l d ，e 选择素表 达达到高峰：以后表达逐渐减弱，至伤后7 d ，仍可见e 一选择素有少量表达。e 选 择素具有伤后l h 出现，同时，在死后伤、正常对照组中未见其表达，这充分表明， e 选择素在判定死后伤与生前伤方面，无疑具有非常重要的意义。e 选择素在皮肤 2 0 重庆医科大学硕士研究生学位论文 创伤后表达的时序性变化具有规律及特异性，有望作为皮肤损伤发生后个体存活 时间推断的一个客观有效的指标。e 一选择素的失活是由多种因子联合作用的结果。 首先：基因的转录在诱导后6 9 h 迅速下调，且m r n a 半衰期短；另外，e 一选择素 受溶酶体作用降解，这导致e 一选择素在内皮细胞表面表达是短暂的n 。由于冻 存尸体时间最长不得超过l 周n 引。本实验将皮肤切创l d 后处死大鼠放置于- 2 0 l 周及2 5 3 天环境中，以对e 选择素的死后稳定性进行研究。e 一选择素在死后稳 定性组内的表达变化：在- 2 0 c 条件下不同时间可见e 选择素在皮肤组织中呈阳性 表达与伤后l d 处死后即刻没有明显变化；2 5 条件下，随着细胞、组织的自溶， 不同时间可见e 选择素在皮肤组织中呈阳性表达较伤后l d 处死后即刻变化明显， e 选择素表达逐渐减少，在2 d 时基本消失。 探寻创伤后e 一选择素表达增强的原因我们推测至少有以下可能：( 1 ) 创伤 的直接刺激作用：( 2 ) 创伤后多种细胞因子水平增加，如t n f - c x 、n f - k b 、i l - 1 、 i l - 6 、i f n _ y 、l p s 等，上述因子均可诱导促进e 一选择素的表达； 探讨e 一选择素在不同温度条件下其稳定性不同的原因： 1 在- 2 0 条件下，1 周内e 选择素表达强度受时间因素的影响不大，稳定性 好。这可能与低温环境下，各种酶活性处于低水平，组织自溶和蛋白质降解受到 抑制有关。2 在2 5 条件下，死后6 小时至3 天，e 一选择素表达强度受时间因素 的影响较大，稳定性差。其可能原因有：一方面死后随时间的延长，细胞、组织 自溶后释放大量溶酶体酶，对e 一选择素蛋白降解；同时细胞、组织白溶速度及溶 酶体酶活性与环境温度有关，温度越高，其自溶速度越快，其酶的数量及活性也 越高；还可能与e 一选择素在不同环境中激活的内皮细胞中e 一选择素m r n a 的种类 及稳定性有关n 钔。 国外有关于皮肤损伤的研究，和本实验都显示了e 一选择素随着损伤时间不同 在创口组织内的表达呈时序性变化规律。但国外研究以人体损伤、手术后皮肤为 样本，各实验中的研究条件不尽相同( 如个体差异、疾病状况不同等) ，因此很 难达到标准化。故认为应该首先建立标准化的动物实验模型以实验动物作为研究 对象，再过渡到人体损伤的研究并在法医实际检案中验证。 e 一选择素的法医学前景：采用联合分子生物学方法对创口组织内的e 一选择素 表达进行检测。可进一步完善实验方案检测e 一选择素稳定性以及其受死后环境因 2 l 重庆医科大学硕士研究生学位论文 素影响表达的变化。本实验仅局限于一种指标的观测，且对生存期损伤的早期推 断只能作为辅助指标，应进一步结合其他指标作综合判断。 2 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文 全文结论 本实验采用免疫组织化学染色方法检测大鼠皮肤切创后不同时间段的e 选 择素的表达及其在2 0 与2 5 环境下的稳定性可得出： 1 e 一选择素在正常皮肤对照组及死后伤组中均未见表达。 2 e 一选择素表达具有特异性，在伤后l h 可见e 选择素在皮肤组织中呈阳性 表达，主要表达在创缘周围毛细血管内皮细胞，呈逐渐升高高峰期一下降期变化， 其表达水平在伤后l d 达到高峰；以后表达逐渐减弱。故可作为皮肤损伤发生后个 体存活时间推断的一个客观有效的指标。 3 e 选择素在2 0 条件下，一周内可稳定表达；在2 5 条件下，e 选择素表 达不稳定。说明e 选择素的死后稳定性受温度影响很大。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 参考文献 【l 】t k o n d o ，to h s h i m a ，e ta1 1 m m u n o h i s t o c h e m i c a ld e t e c t i o n0 fc h e m o k i n e i nh u m a ns k i nw o u n d sa n di t sa p p l i c a t i o nt ow o u n da g ed e t e r m i n a t i o n j 】i n tj l e g a lm e d ，2 0 0 2 ，l1 6 ：8 7 【2 】龚非力，主编基础免疫学【m 】武汉：湖北科学技术出版社，1 9 9 8 【3 】党双锁医学常用实验技术精编【m 】西安：世界图书出版公司，2 0 0 4 ，3 5 3 7 ， 【4 】王慧君，阮海根，黄光照p d g f b ，p d g f r b ，t g f 一1 3 1 ，b f g f 在创伤 愈合过程中的表达变化与损伤时间关系的研究【j 】法医学杂志，2 0 0 1 ，1 7 ( 4 ) ：19 8 2 0 4 【5 】张慧，宋旭东，朱少华。小鼠皮肤切创i l 一1 0 和i l 4 的表达及其与损伤 时间关系【j 】中国法医学杂志，2 0 0 4 ，1 9 ( 5 ) - 2 8 0 2 8 3 【6 】周建清，王永忠，胡治国。大鼠损伤组织中v e g fb f g f 表达变化的免疫 组化研究 j 】江苏大学学报( 医学版) ，2 0 0 4 ，1 4 ( 1 ) - 一1 3 1 6 【7 】b e v i l a c q u