（药剂学专业论文）磁性微球表面瞬时衍生化学发光新技术检测特定序列dna的研究.pdf

摘要 磁性微球表面瞬时衍生化学发光新技术检测特定序列d n a 的研究 摘要 现代医学的研究表明：许多疾病如癌症和遗传病的发生都与基因的突变有关，另外许 多传染性疾病足由环境中的病毒、病菌或寄生虫所引起，因此对特定序列d n a 的分析以 及对d n a 链中碱基突变的拎测在基闻筛选、法医学攀定、遗传疾病的早期诊断和治疗、 病原基因的测定方面具有十分深远的意义。近年来，快速可靠的特定序列d n a 检测技术 得以迅速发展。大量的研究以酶、同位素、荧光、电化学和化学发光等标记物标记d n a 探针，建记高灵敏度、高选择性的特定序列d n a 的榆测技术。鉴于d n a 探针标记物的 存在，一定程度上复杂化了传感器的制备和使用，所以无标记型d n a 检测技术的研究成 为病原基因测定和基因疾病诊断领域新的研究热点之一。 化学发光( c l ) 分析法不斋要光源。避免了杂散光的干扰，凶此具有极高的灵敏度： 且这方法仪器设备简单、操作简便，因而得到了迅速发展。目前，c l 分析成为一个非 常j 工跃的研究领域，已成功地用于药学、生物学、分子生物学、临床医学和环境学中各种 物质的检测。2 0 0 3 年，本研究小组首次报道了基于鸟嘌呤特异性化学发光的无标记( 瞬 时自j 生) d n a 检测新技术。 本论文旨在发展了一系列具有创新意义的磁性微球表面瞬时衍生化学发光d n a 检测 技术，由以下部分构成： 第一章：绪论 第一节，介绍了特定序列d n a 枪测的研究进展及其意义，内容包括：荧光、电化学、 表面基质共振和石英微品天平法等。并列举了近年来它们在该分析领域的典型示例；第二 节，介绍了主要的c l 体系( 如鲁米诺体系、过氧化草酸酯体系、吖啶酯体系和碱性磷酸 酯脾体系) 的原理、特点以及戍用，尤其足在免疫和d n a 分析领域的应用。第三节，阐 述了本论文的h 的和意义，指出了论文的主要研究内容及创新之处。 第二章。基于p o l yt 修饰的磁性微球表面瞬时衍生特定序列d n a 化学发光检铡新技术 1 端粒特定序列检测新技术 端粒是染色体3 术端的霞复性序列，由一种核糖饮蛋白复合体端粒酶在一定条件 一 i 拍要 下合成。端和和端粒酶具有保护细胞小被融合、降解的币要作用它们苹+ 的多少与恶性肿 瘤等疾病的发生密切相关，因此这一一基因片段的测定对重大疾病的早期诊断和防治具有重 要意义。基于磁，降微球表薪瞬时衔，化学发光，建。莎了一种耨裂的端 t 特定序列d n a 无 标记检测技术。整个分析过程由以下三个实验步骤构成：( 1 ) d t 0 修饰的磁性微球j j 连 接有d a 2 0 的捕获探针杂交；( 2 ) 再与端粒特定序列d n a 进行第一二次杂交：( 3 ) 磁性分离 洗涤，基于3 ，4 ，5 - 三甲氧基苯甲酰甲醛( t m p g ) 与端粒中富含的鸟嘌呤( g ) 反晦产 生的特异性c l ，进行端粒d n a 的无标记检测。结果表明：该法具有操作简便、分析快速 和灵敏度高等特点。目标序列浓度在5 - 1 0 0n m 浓度范田内具有良好的线性关系，相天系 数为0 9 9 1 8 ，最低检测浓度为0 5n m 。 2 炭疽杆菌特定序列检测新技术 作为一种全球性的生化武器炭疯丰1 菌引起了公众以及军富酃门的热切哭注，建立实 时有效的识别、检测技术，对控制其传播具有重要意义。本节以炭疽相关的一段含有3 0 个碱蓬的序列作为研究对象，构建了无标、记c l 检测技术，并进一步发腥了基，：g 序列 的放大检测方法。放大检测技术可描述如下：首先通过a 2 0 t 2 0 杂交反虑将捕获探针 州定 于磁性微球袁面；捕获探针】5 个核序酸，馥位弓目标守列相戍序列段杂交结合；然茜切i 入 报告序列j 目标序列的另外1 5 个核 i 酸瞥住进行笫三次杂交反应；利用t m p g 与目枷：序 列和报告序列巾富禽的g 碱基反应产生的c l 束拎测。报告序列禽有两个功能j 列段：一 是能够与目标序列的1 5 个核情酸单位杂交的序列段，另个是富含g 的序列段 _ ( t 2 g 1 5 ) 2 ，结果表明：在6 - 6 0n m 的浓度范【书j 内，c l 信j 譬线州增加( r 。= ( ) 9 9 8 4 ) ， 最低检测浓度为6n m ；采用g 3 i ) 报告序列放大检测技术，目标序列在0 4 5 6n m 浓度范围 内线性良好( r 2 = 0 9 9 1 7 ) ，最低检测浓度为0 4 5n m ( 0 0 4 5p m 0 1 ) ；放大检测技术较不 放大技术灵敏度提高了一个数旨缎，且对a a 单碱琏铺配谚! 荆良好。 第三章t 基于羧基修饰磁性微球表面瞬时衍生的无标记化学发光检测新技术 本章以炭疽杆菌特定序列d n a 为研究对象，采 3 段接修饰的磁性微球为分离和m f 言 集载体，通过羧基氨壤缩合反臆矧定捕获探针，杂交f j 标序列后利用g 碱j 士的持片胜 c l 反应束检测，并在此攮础上发展了g 3 f ) 放大检测技术。该技术操作简单，l ：放大舱测 技术可表述为；在一定条件f ，羧基嵫性微球经过e d c 酒化厉，结合炭疽十r 菌特定j 手列 摘要 的捕获探针，然后通过杂交反应结合目标序列，洗涤转移后利用特异性反应试剂t m p g 直接测定目标序列中的g 碱基：g 3 。放大检测技术足一种央心方法，在上述第一步杂交完 成后，加入一段富含g 的报告序列。与目标序列另外1 5 个核苷酸单位进行第二次杂交反 应，沈涤转移后检测t m p g 与目标序列和报告序列中富含的g 反应产生的c l 信号。结 果表明：该方法具有准确可靠、重现性和选择性好的特点。目标序列浓度在2 5n m 范围 内，c l 信号呈线性增加( r 。= 0 9 9 6 2 ) ，最低可检测浓度为2n m ；g 3 0 放大技术，目标序列 浓度在5 0p m 4n m 范围内，c l 信号线性相关性良好( r 2 = 0 9 9 6 5 ) ，最低检测浓度为5 0 p m ， 较小放大技术灵敏度提高一个数睦级。此外，该技术较壤于p o l y t 修饰的磁性微球的不放 火及g 3 0 放大技术灵敏度提高2 5 和1 0 倍，且a a 单碱基错配识别良好。 第四章。基于碳纳米管放大的特定序列d n a 化学发光检测新技术 奉章以羧肇修饰的磁性微球作为分离以及预富集载体，以碳纳米管( c n t s ) 这种新 型纳米材料作为放大载体，发展了一种高灵敏度c l 新技术检测特定序列d n a 。该技术利 用火心杂交检测法：( 1 ) 将氨捶修饰的捕获探针固定于经过e d c 活化的羧基修饰的磁性 微球表面：( 2 ) 通过第一步杂交将目标序列结合于磁性微球表面；( 3 ) 表面羧基功能化的 碳纳米管，经过e d c 活化后结合大鼍氨基修饰的报告序列形成放大复合物，通过第二步 杂交反应将放大复合物结合于磁性微球表面；( 4 ) 检测t m p g 与目标序列和放大复合物 中的g 碱肇反应产生的c l 信号。报告序列由两个功能序列段组成：一是富含g 的序列段， 二是和目卡，j ：序列互补的序列段：各类c n t s 经过浓硫酸一过氧化氢( 9 ：1 ) 的混合溶液氧 化处理后形成表面羧基功能化的c n t s c o o h ；通过t e m 以及粒度z e t a 电位测定仪对其 性质进行表征。研究了四种碳纳米管的放大效果，并屠终选用两种作为载体进行特定序列 d n a 放人检测；该方法不需要在测定前将待测组分从分离裁体上洗脱下来，也不需要用 酶、荧光染料等对核苷酸作进一步的标记，整个实验可以在3 - 4h 内完成。实验结果表明：、 该泣操作较简便、结果准确、能够高灵敏度检测目标序列：在2 0p m 2n m ( 2 - 2 0 0f m 0 1 ) 浓皮范围内线性良好( 只2 = 0 。9 9 6 ) ，最低检测浓度为1 0p m ( 1f m 0 1 ) ：较不放大的方法灵 敏度提高2 0 0 倍，并且能较好的区别单碱基错配，为d n a 分析提供了一种有效的途径。 第五章：基于聚苯乙烯微球作为放大载体的特定序列d n a 化学发光检测新技术 本章以商品化的链霉亲和素聚苯乙烯微球为放大披体平台，构建了一种省时、省力、 i i i 捕罂 高效的放大检测技术。与碳纳米管作为放大载体的技术年t | 比，不需对放大簸体进行表匝功 能化，节省分析时问，且利于放大技术的进一步发展。简单地来说，该技术原朋，是：结合 子磁性微球上的捕获探针以及通过链霉亲和素生物索反应臼组装j ：聚苯乙烯微球上= 的报告序列，在目标序列存在条件下三者央心杂交结合，无目标宇列存在，放人复合物不 能结合于磁性微球表面。杂交反应结束后，磁性分离去除 ：清液，利用特异性化学发光反 应试剂t m p g 对磁性微球卜结合的组分进行检测。结果表明：该方法简单方便、稳j 芒呵 靠、快速灵敏，整个检测过程在2 3h 内完成。在1 0p m 1n m 浓度范嗣内只有良好的线性 关系( 胄? 0 9 9 5 ) ，最低检测浓度为5p m ( 0 5f m 0 1 ) ，较不放大方法提高4 0 0 倍，较c n t s 放大技术提高2 倍。错配识别实验表明该方法可以较好的区别日标序列和再种销配序列。 综上所述，该法非常适合于高灵敏度检测特定序列d n a 。 第六章t 基于d n a z y m e 的化学发光新技术检测特定序列d n a 利用羧基修饰的磁性微球作为高效分离裁体，基于d n a 催化酶( d n a z y m e ) 催化 l u m i n o l 和h 2 0 2 产生化学发光的原理，构建了科新犁的磁性微球表耐瞬时衍口：特定序列 d n a 检测技术。包括以f 分析步骤：( 1 ) 段转磁性微球山e d c 活化后，陶定氦基修饰的 捕获探针；( 2 ) 捕获探针与日标序列的1 5 个寡聚核苻睃啦位( 5 - a a ta 1 _ rg a ta a g g a t 3 ) 杂交；( 3 ) 目标序列的另1 5 个寡聚核 午酸单位( 5 - g a g g g a t l l a 兀g 兀a - 3 ) 与报告序列的相应序列段进行第- 次杂交，报告序列含自一段能够自我折叠形成四聚体的 序列d ( t 1 rg g gt a gg g c g g gt t gc o ) ，能够特异性结合血红素( h e r n i a ) ，肜成 具有h r p 相似催化性能的复合物( d n a z y m e ) ；( 4 ) 用l u m i n o l 和h 2 0 2 在碱性条件与洗 涤后的磁性微球反应，产生c l 进行柃测。考察并优化了各种实验参数，包括磁性微球量、 杂交时问和c l 检测条件等。在优化的实验条件检测炭疽杆菌特定序列d n a ，结果表明： 该法具有操作简便和分析快速等特点，目标序列浓度在0 2 2 0n m 浓度范嘲内具有良好的 线性关系，相关系数为o 9 9 8 7 ，并在碱肇铺配分辨中有一定效果，为d n a 检测提供了一 种有价值分析手段。 第七章；基于l u m i n o n a l o 一环糊精流动注射的表亟活性剂分析新技术 这章内容是较为早期的e f t ：，旨在发膜一种通用型的流动 l = 射c l 分析技术，用j ：检 测各种类型的表面活性剂阳高f 型、阴离f 璎和 e 离f 型友f 阿活性剂，从i ：业制造、 摘要 科学研究、家庭用品到环境污染物，表面活性剂足一类随处可见的化合物。由于它们涉及 到社会生活的方方面面，对于它们的研究显得尤为重要。其中，发展相应的分析检测方法 是对其研究的一个重要方向。本章发展的技术原理足：在碱性溶液中，l u m i n 0 1 n a i o 。多 羟荩化合物( 如：环糊精、葡萄糖和甘油等) 体系的c l 能够被各种类型的表面活性剂不 同程度的淬灭，在一定浓度范闭内，淬火程度与表面活性剂的浓度线性相关。我们研究了 该现象的反应机制，认为淬灭原因在于多羟基化合物改变了c l 反应的微环境。据此发展 了适应于三种类型表面活性剂检测的c l 技术，阳离子型表面活性剂c t m a b 、阴离子 型表面活性剂一s d s 和非离子型表面活性剂一t r i t o nx 1 0 0 。结果发现：三种表面活性剂 在4 0p m 一0 4m m 浓度范围内线性相关性良好，三种物质的检测灵敏度为2p m ，重复测 定1 0 “m 的表面活性剂所得的相对标准偏差约为3 0 。该技术为多种表面活性剂经过 ， h p l c 或c e 分离后的柱后衍生分析提供了基础。 关键词：磁性微球；无标记；化学发光；特定序列d n a ；端粒；炭疽杆菌；放大载体 羧牡修饰的碳纳米管；链霉呆和素修饰的聚苯乙烯微球；d n a z y m e 中图分类号：r 9 4 v n o v e lm a g n e t i c - b e a db a s e di n s t a n t a n e o u sd e r i v a t i z a t i o nf o rt h e c h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o no fs e q u e n c e - s p e c i f i cd n a a b s t r a c t m e d i c a lr e p o r t si n d i c a t et h a tm o s to ft h ec a n c e r sa n dg e n e t i cd i s e a s e sa r ea s s o c i a t e dw i t h g e n e t i cm u t a t i o n f u r t h e r m o r e ，m a n yi n f e c t i o u sd i s e a s e sa r ec a u s e db yv i r u sa n dp a t h o g e n si n t h ea i r t h e r e f o r e ，i ti sv e r yi m p o r t a n ta n du r g e n t l yn e e d e dt od e v e l o ps e q u e n c e - s p e c i f i cd n a b i o s e n s o r sa n ds i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s md e t e c t i o nt e c h n i q u e sd u et o t h e i rs i g n i f i c a n t a d v a n t a g e s i nv a r i o u sf i e l d ss u c ha s g e n e t i cs c r e e n i n g ，f o r e n s i ca n a l y s i s ，t h ee a r l y s t a g e i d e n t i f i c a t i o no fg e n e t i cd i s o r d e r s ，t h ed i a g n o s i so f i n f e c t i o n sa n dp r o t e o m i ci n v e s t i g a t i o n s f a s ta n dr e l i a b l ed n ab i o s e n s o r sh a v eg r o w nt r e m e n d o u s l yo v e rt h ep a s tf e wy e a r s ，m o s to f w h i c hf o c u so nt h ed e v e l o p m e n to fs e n s i t i v ea n ds e l e c t i v et e c h n i q u e sb yt h ee m p l o y m e n to f v a r i o u s l a b e l s ，s u c h a s e n z y m e ，r a d i o i s o t o p e a n df l u o r e s c e n t d y e s ，q u a n t u m d o t s ， e l e c t r o c h e m i c a la n dc lt a g s g i v e nt h a tt h ec o m p l i c a t e d p r o c e d u r ea n dm u c hm o r e t i m e - c o n s u m p t i o nf o rl a b e l i n g ，c u r r e n t l y ，l a b e l f r e ea l t e r n a t i v e sa t t r a c ti n c r e a s i n gi n t e r e s t d u e t oi t ss i m p l eo p t i c a ls y s t e ma n dl o wb a c k g r o u n dn a t u r e ，c la n a l y s i sh a sb e e nw i d e l ya p p l i e di n c l i n i c , d ，b i o l o g i c a l a n de n v i r o n m e n t a lf i e l d sa n di s b e c o m i n go n eo ft h e m o s tp o w e r f u l t e c h n i q u e sf o ru s ei na n a l y t i c a lc h e m i s t r y i n2 0 0 3 ，o u rr e s e a r c hg r o u pf i r s t l yr e p o r t e dal a b e l f r e ec lt e c h n i q u e ( m a g n e t i cb e a d s b a s e d i n s t a n t a n e o u sd e r i v a t i z a t i o n ) f o rd n ad e t e c t i o nb a s e do nt h er e a c t i o nb e t w e e nas p e c i f i cc l r e a g e n t - - 3 ，4 ，5 - t r i m e t h o x y p h e n y l g l y o x a l ( t m p g ) a n dg u a n i n en u c l e o t i d e s h e r e i n ，as e r i e s o fl a b e l f r e ec lp r o t o c o l sf o rs e q u e n c e s p e c i f i cd n a a s s a y sh a v eb e e nd e v e l o p e di no r d e rt o f u r t h e ri m p r o v ei t ss e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y ，i n c l u d i n gg 3 0s e q u e n c e ，d n a z y m ec o m p o u n d ， g r i c hs e q u e n c el o a d e dp o l y s t y r e n em i c r o s p h e r e so rs u r f a c e - f u n c t i o n a l i z e dc a r b o nn a n o t u b e sa s t h ea m p l i f i c a t i o np l a t f o r m s o v e r a l l ，s i m p l e ，r a p i da n ds t a b l ec lp r o t o c o l sc o u p l e dt h eh i 曲 s e n s i t i v i t yo fc la n a l y s i sw i t he f f e c t i v em a g n e t i cs e p a r a t i o na n dg o o dd i f f e r e n t i a t i o na b i l i t yf o r u n w a n t e dc o n s t i t u e n t ss u c ha ss i n g l e b a s em i s m a t c h e s ，h e n c e ，o f f e rg r e a tp r o m i s ef o rd n a h y b r i d i z a t i o na n a l y s i s d e s c r i p t i o no fr e s e a r c hi nm yt h e s i si sp r e s e n t e d a sf o l l o w s ： v i a b s t r a c t c h a p t e r1 ：t h i st h e s i sf i r s ta d d r e s s e st h en e e dt od e v e l o ps e q u e n c e s p e c i f i cd n a a n ds i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s md e t e c t i o nt e c h n i q u e s ，a n dt h e np r e s e n t sc u r r e n ts t a t eo fk n o w ! e d g eo n d n a a n a l y s i s ，i n c l u d i n gf l u o r e s c e n t ，e l e c t r o c h e m i c a l ，s p ra n dq c mt e c h n i q u e s ，e t c t h e s e c o n dp h a s eo ft h i sc h a p t e rr e v i e w sc u r r e n tm a i nc ls y s t e m ss u c ha sl u m i n o l ，p e r o x y o x a l a t e ， a c r i d i n i u me s t e ra n da l k a n ep h o s p h a t a s e r e l a t e dc lr e a c t i o n s ，a n dt h e i rr e c e n ta p p l i c a t i o n si n v a r i o u sf i e l d s ，e s p e c i a l l yi ni m m u n o a s s a ya n dd n aa s s a y f o l l o w i n gt h a t ，o b j e c t i v e sa n d s i g n i f i c a n c eo ft h i sr e s e a r c ha r es u m m a r i z e d c h a p t e r2 ：p o l yt - m o d i f i e dm a g n e t i cb e a d b a s e di n s t a n t a n e o u sd e r i v a t i z a t i o n f o rc l d e t e c t i o no fs e q u e n c e - p e c i f i cd n a 1 l a b e l f r e ec ld e t e c t i o no ft e l o m e r es e q u e n c e - s p e c i f i cd n a t e l o m e r ei st h e r e p e a t u n i t st ot h e3 - e 删o fc h r o m o s o m a ld n as y n t h e s i z e db ya r i b o n u c l e o p r o t e i n - - t e l o m e r a s ew h i c hp r o v i d s c e i l sw i t ham e c h a n i s mt op r e v e n t g r a d u a l t e l o m e r ee r o s i o n t e l o m e r ea n dt e l o m e r a s ea r et h o u 曲tt ob er e s p o n s i b l ef o rt h ec o n t i n u o u s a n du n c o n t r o l l e dg r o w t ho fc a n c e rc e l l s i nt h i sw o r k ，b a s e do nm a g n e t i ci n s t a n t a n e o u s d e r i v a t i z a t i o n ，an o v e ll a b e l - f r e ec ld e t e c t i o np r o t o c o lw a sp r e s e n t e da se x e m p l i f i e db yt h e s u c c e s s f u ld e t e r m i n a t i o no fs e q u e n c e s p e c i f i cd n a 一一t e l o m e r e t h i sm e t h o dw a sc o m p o s e do f t h r e e s t e p s ：( 1 ) t h ed t z 0 a l r r l - m o d i f i e di nt h em a g n e t i ch e a d sw a sh y b r i d i z e dw i t ht h e d a 2 0 m o d i f i e dc a p t u r ed n a ；( 2 ) t h ef i r s ts t e pw a sf o l l o w e db yt h es e c o n dh y b r i d i z a t i o no ft h e b e a d c a p t u r e dp r o b ew i t ht e l o m e r e ；( 3 ) t h ea m o u n to ft e l o m e r ew a sd e t e r m i n e db yt h eg u a n i n e c lr e a c t i o nw i t ht m p g t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h i ss i m p l ea n ds e n s i t i v ep r o t o c o lw a sm u c h s u i t a b l ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no fs e q u e n c e s p e c i f i cd n as u c ha st e l o m e r ew i t hag o o dl i n e a r c o r r e l a t i o ni nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f5 - 1 0 0n mr r = 0 9 9 1 8 ) 2 l a b e l - f r e ec la p p r o a c hf o rs e q u e n c e s p e c i f i cd n aa s s o c i a t e dw i t ht h ea n t h r a xl e t h a l f a c t o b ， a n t h r a x ，a saw o r l d w i d eb i o w a r f a r ea g e n t ，h a sa t t r a c t e dg r e a ta t t e n t i o no fp u b l i ca n dm i l i t a r y a g e n c i e s t h ep r a c t i c a la n d e f f e c t i v em e t h o d sa r ed e s i r e dt o i d e n t i f y a n dm o n i t o rt h e b i o w a r f a r ea g e n t ，a n dc o n t r o li t si n f e c t i o n si n p u b l i c i nt h i ss e c t i o n ，w ee s t a b l i s h e dt h e v i i l a b e l f r e ec la p p r o a c ht od e t e c tt h e3 0 一m e ro l i g o n u c l e o t i d er e l a t e dt ot h ea n t h r a xl e t h a lf a c t o r s f u r t h e r m o r e ，a na m p l i f i e d a p p r o a c h w a si n v e s t i g a t e dt o i m p r o v et h es e n s i t i v i t y t h i s a m p l i f i e da p p r o a c hw a sc o m p o s e do ft h ef o l l o w i n gs t e p s ：( 1 ) t h ed t 2 0 m o d i f i e da l mi nt h e m a g n e t i cb e a d sw a sh y b r i d i z e dw i t ht h ed a 2 0 一m o d i f i e dc a p t u r ed n a ；( 2 ) t h eb e a d c a p t u r e d p r o b eh y b r i d i z e dt h e3 0 一m a ra n t h r a xt a r g e td n a ；( 3 ) t h et h i r dh y b r i d i z a t i o np r o c e e d e db e t w e e n t a r g e td n aa n dr e p o r t e rd n ac o n t a i n i n gag u a n i n e r i c ho l i g o n u c l e o t i d e ( g 3 0s e q u e n c e ) ；( 4 ) t h e a m o u n to ft h et a r g e td n aw a sd e t e r m i n e db yt h eg u a n i n ec lr e a c t i o nw i t ht m p g t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h i ss i m p l ea n ds e n s i t i v ep r o t o c o lw a sm u c hs u i t a b l ef o r t h ed e t e r m i n a t i o no f s e q u e n c e s p e c i f i cd n ar e l a t e dt ot h ea n t h r a xl e t h a lf a c t o r s u s i n gn o n a m p l i f e dm e t h o d ，a g o o dl i n e a rc o r r e l a t i o nw a so b t a i n e di nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f6 - 6 0n mw i t ht h el o w e s t d e t e c t i o nc o n c e n t r a t i o no f6n m i nc o n t r a s t ，b yu s i n gg 3 0a m p l i f i e dm e t h o d ，ag o o dl i n e a r c o r r e l a t i o nw a sa c h i e v e di nt h er a n g eo fo 4 5 6n mw i t ht h el o w e s td e t e c t i o nc o n c e n t r a t i o no f 0 4 5n m ，w h i c hw a s1 0 一f o l di m p r o v e m e n to nt h en o n a m p l i f e do n e m o r e o v e r t h i sn e wc l p r o t o c o lh a dag o o dd i s c r i m i n a t i o nf o ra as i n g l e - b a s em i s m a t c h c h a p t e r3 ：c a r b o x y lt e r m i n a t e dm a g n e t i cb e a d - b a s e di n s t a n t a n e o u sd e r i v a t i z a t i o nf o rt h e l a b e l f r e ec ld e t e c t i o no f s e q u e n c e s p e c i f i cd n a h e r e i n ，a na m p l i f i e dc la p p r o a c hw a si n v e s t i g a t e d e m p l o y i n gg - r i c hs e q u e n c e a st h e a m p l i f i c a t i o nu n i t t h i sn o v e lm e t h o dw a sc o m p o s e do ft h ef o l l o w i n gs t e p s ：( 1 ) t h ec a r b o x y l t e r m i n a t e dm a g n e t i cb e a d sw e r ea c t i v a t e d b ye d c ，a n dt h e nc o u p l e dt h ea m i n e m o d i f i e d c a p t u r ed n a ；( 2 ) t h eb e a d c a p t u r e dp r o b eh y b r i d i z e dt h e3 0 一m e rt a r g e td n a ；( 3 ) t h et h i r d h y b r i d i z a t i o np r o c e e d e db e t w e e nt a r g e td n a a n dr e p o r t e rd n a ( g r i c hs e q u e n c e ) ；( 4 ) g u a n i n e r i c hi nt a r g e ta n dr e p o r t e rd n ar e a c t e dw i t ht m p gt og e n e r a t et h ec l s i g n a l t h er e s u l t s s h o w e dl h a tt h i sn o v e lp r o t o c o lw a ss i m p l e ，s t a b l ea n ds u i t a b l ef o r t h ed e t e r m i n a t i o no f s e q u e n c e s p e c i f i cd n a r e l a t e dt ot h ea n t h r a xl e l h a lf a c t o r s b o t hn o n a m p l i f i e da n da m p l i f i e d # i p p r o a c h e sa c h i e v e dag o o dl i n e a rc o r r e l a t i o n t h el o w e s td e t e c t i o nc o n c e n t r a t i o nw a s2n m f o rn o n a m p l i f i e dm e t h o da n d5 0p mf o r a m p f i f i e do n e ，w h i c hw a s2 5 一f o l da n d1 0 一f o l d i m p r o v e m e n to nt h ep r e v i o u sw o r kb a s e do np o l yt - m o d i f i e dm a g n e t i cb e a d s ，r e s p e c t i v e l y m o r e o v e r ，t h i sn e wc l p r o t o c o lh a dag o o dd i s c r i m i n a t i o no fp e r f e c tc o m p l e m e n t a r yp a r tf r o m a as i n g l e b a s em i s m a t c h c h a p t e r4 ：g - r i c hs e q u e n c e - f u n c t i o n a l i z e dc a r b o x y lt e r m i n a t e dc a r b o nn a n o t u b e sf o r t h e a m p l i f i e dc ld e t e c t i o no fs e q u e n c e - s p e c i f i cd n a w ed e v e l o p e dan o v e lc l a p p r o a c hw i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n dg o o ds e l e c t i v i t y , b yt a k i n g a d v a n t a g eo f 、m a g n e t i cb e a d sa s t h ep r e c o n c e n t r a t i o nc a r r i e ra n dc a r b o x y lm o d i f i e dc a r b o n n a n o t u b e s ( c n t s c o o h ) a st h ea m p l i f i c a t i o np l a t f o r m b r i e f l y , a “s a n d w i c h - t y p e ”d e t e c t i o n s t r a t e g yw a se m p l o y e di no u rd e s i g n ，w h i c hi n v o l v e dc a p t u r ep r o b ed n ai m m o b i l i z e do nt h e s u r f a c eo fc a r b o x y lt e r m i n a t e dm a g n e t i cb e a d sa n dm u l t i p l ea m i n e - m o d i f i e d r e p o r t e rd n a s e l f - a s s e m b l e do f ft h es u r f a c eo fc n t s c o o h t h e r e p o r t e rd n a i n c l u d e dag r i c h s e q u e n c e d o m a i nf o rt h e g e n e r a t i o n o f l i g h t a n da na d d i t i o n a lt e t h e r e dn u c l e i ca c i dd o m a i n c o m p l e m e n f a r yw i t ht a r g e td n a f o u rk i n d so fc n t s c o o hw e r ep r e p a r e db yaw e l l c o n t r o l l a b l em o d i f i c a t i o nm e t h o d ，i e ，o x i d i z e d b ya9 ：1 c o n c e n t r a t e d s u l p h u r i ca c i d 3 0 h y d r o g e np e r o x i