（劳动卫生与环境卫生学专业论文）纳米tio2光催化产物的皮肤毒性研究.pdf

脚| l | f | f f f l | | j i i | i l i f | l f f i f i f | | i | | i i | y 17 613 81 p h o t o c a t a l y t i ct o x i c i t y s t u d i eso ns nw i t ht i t a n i u m d i o x i d e at h e s i ss u b m i t t e dt o s o u t h e a s tu n i v e r s 时 f o rt h ea c a d e m i c d e g r e eo f m a s t e ro fm e d i c i n e b y z h a n g x u e y a n s u p e r v i s e db y p r o f e s s o ry i nl i h o n g s c h o o lo fp u b l i ch e a l t h s o u t h e a s tu n i v e r s 时 僵a y2 0 1 0 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢 意。 研究生签名：毒靴日 期：业 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印 件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸 质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包 括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：孛龇导师签名 中文摘要 纳米二氧化钛光催化产物对皮肤毒性的研究 研究生：张学艳导师：尹立红 东南大学公共卫生学院 中文摘要 纳米t i 0 2 因其具有屏蔽紫外线、消色力高、遮盖力强等诸多优异性能，广泛应用于化 妆品中，成为重要的无机添加剂。但是研究发现，纳米t i 0 2 可吸收紫外辐射产生光催化活 性，生成具有高度化学活性的羟基自由基( o h ) ，引起脂质过氧化反应。近年来的研究表 明，氧化应激可导致细胞凋亡，并能激活丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路，促进m m p 的表达，同时抑制胶原合成，诱导m d a 合成、细胞膜弹性下降，导致光老化皮肤特征性的 改变。 为探讨纳米t i 0 2 光催化产物可能引发的皮肤损害，本研究选用对细胞和机体确定无损 伤剂量的u v a ( 3 6 5 m ，细胞试验照射剂量为5 j c m 2 ，动物试验照射剂量为1 0 j c m 2 ) 进行 照射，通过细胞和动物整体试验分析纳米t i 0 2 ( 1 0 n m 锐钛矿型、2 5 m 锐钛矿型、2 5 衄金 红石型) 的毒性作用，初步探讨低剂量u v a 照射下，纳米t i 0 2 的细胞毒性及对大鼠皮肤 光老化的影响，为纳米t i 0 2 的应用提供一定的毒理学资料。 一、不同类型纳米二氧化钛的光催化活性比较 光催化降解亚甲蓝结果显示，仅给予紫外照射时，亚甲蓝未发生显著降解；同时给予纳 米t i 0 2 处理和紫外照射，亚甲蓝可见显著降解。纳米t i 0 2 光催化降解亚甲蓝的效果和紫外 照射剂量、纳米n 0 2 浓度、粒径大小及晶型有关。光照剂量越大、纳米t i 0 2 浓度越高、粒 径越小，光催化作用越强；相同粒径的锐钛矿型n 0 2 对亚甲蓝的氧化作用大于金红石型， 金红石型t i 0 2 未见显著的光催化作用。 二、纳米二氧化钛光催化产物对小鼠胚胎成纤维细胞的毒性作用 参照国标b a l b c 3 t 3 中性红摄取试验设置不同的染毒剂量组( 1 5 6 、3 1 2 、6 2 5 、1 2 5 、 2 5 0 p 咖l ) ，分别通过四甲基偶氮唑盐( m t t ) 法和中性红摄取光毒性试验检测纳米t i 0 2 对b a l b c 3 t 3 细胞活性的影响。结果显示，纳米t i 0 2 染毒的高剂量组对细胞的影响要大于 低剂量组，而小粒径t i 0 2 的毒性则要大于粒径较大的t i 0 2 ，锐钛矿型t i 0 2 的毒性大于金红 石型。光照前后相比，光照后细胞活性小于光照前。 查堕奎兰堡主堂丝丝茎 d c f h d a 荧光探针测定结果显示，与对照组比较，各实验组细胞内活性氧水平升高， 多数剂量组与对照的差别有统计学意义( p o 0 5 ) 。相同染毒时间，随着染毒剂量的增高， 纳米t i 0 2 染毒组细胞活性氧水平升高；紫外照射组在光照处理后4 h 内细胞活性氧水平与染 毒剂量呈剂量效应关系。与2 0 0 n m 锐钛矿型t i 0 2 组比较，纳米t i 0 2 组细胞内活性氧水平 升高更为明显；相同粒径的锐钛矿型与金红石型t i 0 2 相比，锐钛矿型t i 0 2 染毒组细胞活性 氧水平高于金红石型。光照前后相比，光照处理后2 h 、4 h 光照组细胞内活性氧水平高于无 光照组，4 h 后，光照组细胞内活性氧水平低于五光照组。 为探讨纳米t i 0 2 致b a l b c 3 t 3 细胞毒作用的损伤机制，本研究应用不同浓度( 1 5 6 、3 1 2 、 6 2 5 、1 2 5 、2 5 0 腭恤l ) 纳米t i 0 2 染毒b a l b c 3 t 3 细胞，分析了不同染毒条件下b a l b c 3 t 3 细胞的氧化损伤相关指标、凋亡、细胞间隙通讯功能等，结果显示，纳米t i 0 2 可致b a l b c 3 t 3 细胞氧化损伤，细胞凋亡显著升高，细胞间隙通讯功能下降，锐钛矿型t i 0 2 对细胞损伤程 度大于金红石型。光照与纳米t i 0 2 联合暴露组氧化损伤较纳米t i 0 2 单独暴露组严重，凋亡 率升高，细胞间隙通讯受损更加严重。 本研究进一步分析了不同粒径、剂量和晶型的纳米t i 0 2 染毒条件下b a l b c 3 t 3 细胞的 胶原含量、基质金属蛋白酶含量及细胞因子等指标的水平，以探讨纳米t i 0 2 对b a l b c 3 t 3 细胞分泌功能的影响。结果显示纳米t i 0 2 作用于细胞后，细胞分泌胶原的能力降低，m m p 1 、 m m p 一3 的分泌水平上升，i l 1 水平表达升高，n 师a 、i l 一6 在纳米t i 0 2 剂量较大时分泌量 亦增高；光照后细胞培养上清胶原含量明显少于未光照组，m m p 1 、m m p 3 含量高于未光 照组。细胞因子含量光照前后相比，不同纳米t i 0 2 类型及剂量变化不一，2 0 0 衄锐钛矿型 t i 0 2 组光照后细胞培养上清i l 1 含量上升，i l 6 含量下降，1 0 m n 锐钛矿型t i 0 2 组光照后 细胞培养上清i l 1 含量下降，i l 6 含量上升，t n f 伍光照前后差别无统计学意义。 三、纳米二氧化钛光催化产物对s d 大鼠的皮肤毒性作用 4 0 只s d 大鼠，雌雄各半，随机分为对照组、2 0 纳米t i 0 2 涂抹组、u v a ( 1 0 j c m z ) 组、2 0 纳米t i 0 2 + u v a ( 1 0 j c m 2 ) 组，连续染毒2 1 天。测定不同处理条件下大鼠皮肤病理、 电镜及皮肤细胞氧化损伤和分泌功能，初步分析纳米t i 0 2 与紫外光照联合染毒对大鼠的皮 肤毒性。结果显示，染毒结束各组大鼠皮肤无红斑及水肿，皮肤组织病理未见异常，透射 电镜可见实验组成纤维细胞粗面内质网变宽。与对照组相比，雄性大鼠纳米t i 0 2 + u v 组 t n f a 、i l 1 含量上升，i l 6 含量降低，但差异无统计学意义；u v 组及纳米t i 0 2 组n 盯一a 、 i l 6 含量降低，i l l 含量上升，其中u v 组i l 一6 含量与对照的差异有统计学意义( 正o 0 5 ) 。 三个不同处理组相比，纳米t i 0 2 + u v 组及纳米t i 0 2 组的i l 6 含量较u v 组显著升高 i i 生壅塑茎 ( p o 0 5 ) 。雌性大鼠三个处理组t n f 0 【含量较对照组显著上升，i l 6 含量降低( o 0 5 ) 。 不同处理组相比，纳米t i 0 2 + u v 组i l 一1 含量高于u v 组( 正0 0 5 ) ，纳米t i 0 2 组i l 6 含量 低于u v 组( p 0 0 5 ) 。雌性大鼠纳米t i 0 2 + u v 组m d a 含量较u v 组及纳米t i 0 2 组含量上 升( p o 0 5 ) 。四个实验组间s o d 、g s h p x 差异无统计学意义。 以上研究结果表明，纳米t i 0 2 经紫外照射后可产生羟自由基，产生羟自由基的量与纳 米t i 0 2 的浓度、粒径、晶型及紫外照射剂量有关。高水平的纳米n 0 2 光催化产物有显著细 胞毒性，可抑制细胞增殖，导致细胞氧化损伤，引起细胞凋亡和细胞间隙通讯功能障碍， 并可影响细胞分泌功能，导致细胞光老化的发生及促进炎症反应的发生。动物实验表明， 在实验所选择的受试时间和光照剂量下，虽未见大鼠皮肤光老化的发生，但是纳米t i 0 2 可 诱发皮肤脂质过氧化损伤，并诱导皮肤细胞分泌过量的炎性因子参与炎性反应。 综上所述，纳米t i 0 2 细胞及动物毒理学实验研究表明，纳米t i 0 2 的皮肤毒性与粒径、 晶型及紫外照射有关，纳米t i 0 2 粒径越小其皮肤毒性越高，锐钛矿型t i 0 2 毒性显著高于金 红石型，在低剂量紫外光照下纳米t i 0 2 即可产生较高水平的羟自由基，从而加重细胞及皮 肤组织的损伤程度。 关键词：纳米t i 0 2 ；紫外光照；光催化活性；羟自由基；细胞毒性；皮肤毒性 i i i 东南大学硕士学位论文 t h es k i nt o x i c i t yo fp h o t o c a t a l y t i ct i t a n i u m d i o x i dn a n o p a r t i c l e s z h a n gx u e y a ns u p e i s e db yp r o f e s s o ry i n l i - h o n g s c h o o lo fp u b l i ch e a l t l ls o u t h e a s tu m v e r s i 锣 a b s t r a c t t i 胁i u md i o x i d ( t i 0 2 ) r 啪o p a n i c l e sh a v eb e e nu s e di nc o s m e t i c sa sa 1 1i i l l p o r t a n ti n o 喀a 1 1 i c a d d i t i v e s m o r e 肌dm o r es t l l d i e sh a v es u g g e s t e dt h a t ，w i t hu vi r r a d i a t i o n ，t i 0 2n a n o p 撕i c l e ss h o w 1 1 i g hp h o t o c a t a l y t i ca c t i v i t y ，a n dg e n e r a t eh y d r o x y lr a d i c a l ( o h ) w k c hi st h em a i na c t i v em a t e r i a l i n d u c i n gl i p i dp e r o x i d a t i o n i 沁c e n ts t u d i e sd e m o n s t r a t e dt h a to x i d a t i v es t r e s sc o u l di 1 1 d u c ec e l l 印o p t o s i s ，a c t i v a t em i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s es i g n a lt 啪s d u c t i o np a t h w a y s ，a i l dp r o m o t et h e o v e r e x p r e s s i o no fm m p nc a i la l s oi n h i b i tc o l l a g e ns y n t h e s i s ，i n d u c em d ag e n e r a t i o n ，d e c r e a s e t l l em e m b 啪en e x i b i l i 吼a l l dc a u s et h ep h o t o a g i n g c h a r a c t c r i s t i cc h a n g e si ns 虹n t o 觚h e ru 芏1 d e r s t a n dt h ee 虢c t so fp h o t o c 砌y t i cp r o d u c t so ft i 0 2n a l l o p a r t i c l e so nt h es 虹n ， t h ec y t o t o x i c i t ) ra n ds k i nt o x i c 时o ft i 0 2n a n o p a n i c l e s ( 1o - 脚a i l a 眺e ，2 5 一啪a n a e ，2 5 一眦n l t i l e ， a n d2 0 0 n ma n a e ) w e r ec a 玎i e do u to nm o u s e 锄b r ) ，0 1 1 i c 舶r o b l a s tc e l l sa i l dr a t sr e s p e c t i v e l y u n d e rt h eu ，ai m d i a t i o ni nc o m b i n a t i o ni n “s 咖d y 1 t h e p h o t o c a t a l y t i ca c t i v i t ) r o fd i 珏：r e n ts i z e sa i l d c y s t a l s t r u c t u r e so ft i t a m 啪d i o x i d e n 锄o p a r t i c l e s ，n l ep h o t o c a t a l y t i ca c t i v i t yo ft i 0 2r 姗o p 硼c l e sp a r t i c l e sw a se v a l u a t e d b yd e 鲥a t i o no f m e t h y l e n eb l u e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，c o m p a r e d 嘶t hu 、，ai r r a d i a t i o no n l y ，t h ed e g r a d a t i o nr a t e o fm e t h y l e n eb l u es i 鲥f i c 珊l yi n c r e a s e dw h e n 讹a t e db o t l lt i 0 2p a n i c l e s 锄d 小，a t h e r ew e r e s i g i l i f i c a n ta s s o c i a t i o nb e 僦e e nt l l ed e g r a d a t i o nr a t eo fi n e t l l y l e n eb l u e 甜l dt h ee x p o s u r ed o s e ，s i z e s ， a n dc 巧g 谢s n l l c t u r eo ft i 0 2p a n i c l e sa n dt h ed o s eo fu v ai r r a d i a t i o n a c c o r d i n gt 0t l l ee x p o s u r ed o s eo fu v a a n dt i 0 2p a r t i c l e si n c r e a s i n ga i l dt h es i z e so ft i 0 2 p a n i c l e sd e c r e a s i n g ，m ed e g r a d a t i o nr a t eo fm e t l l y l e n eb l u ei n c r e a s e dr a p i d l yp o 0 5 ) a n dt h e p h o t o c a t a l y t i ce 虢c to fa 1 1 a t a s e t ) ，p e 、v a sh i 曲e rt l l a l lt h a to fn l t i l e - t ) ，p e 0 0 5 ) ，w h i l et h e r e 、v a sn o s t a t i s t i cs i 印i f i c a n c ew h e n e x p o s e dt om t i l e 铆ec o m p a r e d 、) l ，i t hc o n t r o lg r o u p 2 c y t o t o x i c i t ) ro fp h o t o c a t a l y t i cp r o d u c t so ft i 0 2n a i l o p a r t i c l e so nb a l b cs 、i s sm o u s ee m b d r o f i b r o b l a s t s ( b a l b c 3 t 3 ) c e n s i v 英文摘要 t oe v a l u a t et 1 1 ec y t o t o x i c i 够o fp h o t o c a t a l y t i cp r o d u c t so ft i 0 2n a n o p a n i c l e so nb a l b c 3 t 3 c e l l s ，m 7 丌a s s a ya n dn e u t r a lr e dd y eu p t a k ea s s a yw e r ed e t e m l i n e d 、i mt h ee x p o s u r ed o s eo f15 6 ， 31 2 ，6 2 5 ，12 5 ，a n d2 5 0p g m 1 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a sas i g n i f i c a md i f r e r e n c eo fc e l l a c t i v 时b e 铆e e nt h eh i g h - d o s eg m u pa i l dt h el o w o rm o d e r a t e d o s eg r o u p s 谢me x p o s u r eo ft i 0 2 n a l l o p a r t i c l e s 10 - 衄a l l a t a s e t ”et i 0 2p a n i c l e sc o u l di n d u c e ds i 班f i c a n t l yd e c r e a s e db a l b c 3 t 3 c e l l sa c t i v 毋c o m p a r e d 、) l ，i m2 5 一姗a i l 粕e t y p et i 0 2p a r t i c l e s ( p o 0 5 ) ，w h i l e2 5 - 1 1 i i lm t i l e - t ) ，p e t i 0 2p a n i c l e ss h o w e das l i g h tc y t o t o x i c 吼b a l b c 3 t 3c e l l sa c t i v i t ) rr e d u c e ds i 鲥f i c a l l t l yw h e n w e r ee x p o s e db o t ht i 0 2p a r t i c l e sa n du v ai 1 1 r a d i a t i o n r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e si nt h eb a l b c 3 t 3c e l l sw e r ed e t e c t e dw i md c f h d af l u o r e s c e n c e p r o b e c o m p a r e d 、i mc o n t r o lg r o u p s ，也el e v e lo fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e si nt h et r e a t i r i e n tg r o u p s w e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d t h ec o m b i n e dt i 0 2p a n i c l e sa n du 、，ae x p o s u r ei n d u c e dr e a c t i v e o x y g e ns p e c i e si 1 1ad o s e - d e p e n d e n tm 锄e r 谢t h i n4h o u r sa r e ru v ai 仃2 l d i a t i o n t h e r ew e r e s i 盟i f i c a n ta s s o c i a t i o nb e t w e e nt h el e v e lo fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sa n ds i z e so rc 巧s t a ls t m c 劬r eo f t i 0 2p 甜i c l e s r h em e c h a i l i s mo fc y t o t o x i t ) ri n d u c e db yt i 0 2n a l l o p a r t i c l e sw a se x p l o r e d 谢t hm e 嬲s a yo f o x i d a t i v ed a m a g e ，a p o p t o s i s ，a n dg 印j u n c t i o n a l i n t e r c e l l u l a rc o m m u l l i c a t i o n ( g j i c ) ，r i l er e s u l t s s h o w e dt h a tb a l b c 3 t 3c e l l se x p o s e d 诮t ht i 0 2p a r t i c l e s 锄d 叭厂ar e s p e c t i v e l yw e r ei n d u c e dt l i 曲e r l e v e lo fo x i d a t i v ed a m a g ea i l da p o p t o s i sa s 、e l la sr e d u c e dm n c t i o no fg j i cc o m p a r e dw i t hc o n t r o l g r o u p s m o r e o v e r as yn e 】学t i ce 旋c tb 咖e e nt i 0 2p a r t i c l e sa n d 小队e x p o s u r e 、v a so b s e n ，e d 0 0 0 5 ) t oe x p l o r et h ee 髓c to ft i 0 2n a n o p a n i c l e so ns e c r e t o 巧劬c t i o no fb a l b c 3 t 3c e l l s ，t h ec e l l s e x p o s e dt od i 虢r e n ts i z e sa n dc 巧s t a ls t m c t u r eo ft i 0 2p a r t i c l e sa td i 虢r e n td o s e sw e r ee v a l u a t e d f o rt h ea u s s a yo fc o l l a g e nc o n t e n t ，m a t r i xm e t a l l o p r o t e i i l a s e s ( m m p ) ，a r l dc y t 0 虹i l e s t h er e s u l t s s h o w e d l a tt i 0 2n a n o p a r t i c l e ss i 班f i c a n t l yr e d u c e dm ee x p r e s s i o no fc o l l a g e na n di n d u c e dt l l e s e c r e t i o no fm m p - 1a n dm m p 一3b yb a l b c 3 t 3c e l l s i l - 1l e v e lo fb a l b c 3 t 3c e l l ss i 卿f i c a n t l y i n c r e a s e dw h i me x p o s e dt ot i 0 2p a n i c l e s s i 鲥f i c a i l td i f f e r e n c e si i lt l 虾一aa n di l 一6w e r eo b s e r v e d b e 铆e e nt h e1 1 i 曲一d o s e 铲o u pa n dt h e1 0 w - o rm o d e r a t e d o s eg r o u p s 谢t he x p o s u r eo ft i 0 2p a r t i c l e s c 0 1 l a g e nc o n t e ma i l dm a t r i x 础：t a j l o p r o t e i n a s e so fb a l b c 3 t 3c e l l sc h a n g e ds i 印i f i c a n t l yw r h e n e x p o s e d 淅t l lt i 0 2p a n i c l e sa i l du v ai r r a d i a t i o ni 1 1c o m b i l l a t i o n t h er e s u l to fc y t o k i n e sa s s a y i i l d i c a t e dt h a tw h e nc o m b i n e d 诵mu v ai r r a d i a t i o i l ，2 0 0 一啪t i 0 2 p a n i c l e sc o u l di n d u c e s i g n i f i c a n t l yi n c r e a l s e di l - 1l e v e la i l dd e c r e a s e di l 一6l e v e l i nm es u p e m a t a n to fb a l b c 3 t 3c e l l s ， v 东南大学硕士学位论文 w h i l el0 i l r nt i 0 2p a r t i c l e si n d u c e dt h es t a t i s t i c a l l yd e c r e a s e dl e v e lo fi l 一1a n di n c r e a s e dl e v e lo f i l 一6 t h e r ew a sn os i g l l i f i c a md i f r e r e n c ei nt h el e v e lo fn 叮f ab e t w e e nt h ec o m b i n e dt i 0 2 p a r t i c l e sa r l du v ae x p o s u r eg r o u pa n dt i 0 2e x p o s u r e 铲o u p 3 s l ( i nt o x i c 蚵o f p h o t o c a t a l y t i cp r o d u c t so ft i 0 2i 瑚o p a n i c l e so ns p r a g u e d a w l e y ( s d ) r a t s 4 0s dr a t so fh a l fg e n d e rw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t of o u rg r o u p sa sf o l l o w s ：c o n t r 0 1g r o u p ， 2 0 t i 0 2t r e a 缸n e n tg r o u p ，u v ai m d i a t i o ng r o u pw i t ht h ed o s eo f1o j c m za n dc o m b i n e d2 0 t i 0 2a 1 1 du v a i r r a d i a t i o n ( 晰t 1 1t h ed o s eo f10 j c ) g r o u p 1 1 1 er a t so fa 1 1t r e a t m e n tg r o u p sw e r e a d i n i n i s t e r e dd a i l yf o r21d a y s t o x i ce 虢c t sw e r ed e t e r i n i n e d 诹mh i s t o p a t h o l o g y ，t r 锄s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) ，a l l do x i d a t i v ed 锄a g ea 1 1 dt 1 1 es e c r e t o 巧f h n c t i o no fm es k i nc e l l s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tn oe r y t h e m a0 re d e m aw a u so b s e r v e do nt l l es l ( i na 1 1 dh i s t o p a m o l o g i ce v a l u a t i o n o fs k i nt i s s u e ss h o 、v e dn op a t h o l o g i cl e s i o n s u l t r a s t m c t u r a la i l a l y s i si n d i c a t e dr o u 曲e n d o p l a s m i c r e t i c u l u mo ft l l ef i b r o b l a s t se x p a l l d e d as y n e 唱e t i ce 虢c tb e t w e e nt i 0 2p a i r t i c l e s 锄du 、，ae x p o s u r e o nl i p i dp e r o x i d a t i o nw 嬲o b s e r v e do i l l yi 1 1f e m a l er a t sp o 0 5 ) c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ，t h e l e v e l so ft n f 一仅a 1 1 di l 一1 、e r ei n c r e a s e da i l dt l l el e v e lo fi l - 6w 嬲r e d u c e di nt h ec o m b i n e dt i 0 2 a n du v at r e a t m e mg r o u p ，w m l et h el e v e l so f 盯呵f - aa l l di l - 6w e r er e d u c e da n dt h el e v e lo fi l 1 w a si n c r e a l s e di nt h et i 0 2o ru 、，a 骶a n n e n tg r o u pi nt h em a l er a t s ( t h o u 曲t h e s ec h a n g e sw e r en o t s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a l l t ) t h ei n c r e a s e dl e v e l so ft n f 一0 【a n di l 一1a i l dt h ed e c r e a s e dl e v e lo fi l 一6 w e r eo b s e r v e da m o n ga l lt h et r e a t m e n tg r o u p sc o m p a r e d 晰mc o n t r o l i nt h ef e m a l er a t sp t ，0 0 5 ) m o r e o v e r ，m el e v e lo fi l 一1i nt h ec o m b i n e dt i 0 2a n du v a 讹舳e n tg r o u p 、v a ss i 则f i c a n t l y k 曲e rt h a nt h a ti nu 、ai r r a d i a t i o n 伊o u pp 2 0 0 n m ；锐钛矿型t i 0 2 产生光催化产物的能力大于金红石 型。有关研究表明，锐钛矿型t i 0 2 的带隙略高于金红石型，稳定性比金红石型差，金红石型 t i 0 2 对0 2 的吸附能力比锐钛矿型差。目前认为锐钛矿型t i 0 2 表现出高的活性有以下几个原因 【2 1 】：( 1 ) 锐钛矿型t i 0 2 的禁带宽度为3 2 e v ，金红石型t i 0 2 禁带宽度为3 0 e v ，锐钛矿型t i 0 2 较高的禁带宽度使其电子空穴对具有更正或更负的电位，因而具有较高氧化能力；( 2 ) 锐钛 矿型t i 0 2 表面吸附h 2 0 、0 2 、及o h 。的能力较强，导致其光催化活性较高，在光催化反应中 表面吸附能力对催化活性有很大的影响，较强的吸附能力对其活性有利；( 3 ) 在结晶过程中 锐钛矿型晶粒通常具有较小的尺寸及较大的比表面，对光催化反应有利。较小的晶粒尺寸意 味着催化剂的比表面积比较大，相同质量的催化剂可以提供更多的吸附和反应表面【2 2 1 ，因而 小粒径锐钛矿型t i 0 2 表现出较高光催化活性。 综上所述，可以看出紫外照射可引起光催化产物的产生，羟自由基产生的量随着紫外照 射剂量的增加而增加；相同晶型纳米t i 0 2 间比较，粒径越小产生羟自由基的量越多；相同粒 径下，锐钛矿型t i 0 2 产生光催化产物的量多于金红石型。 l o 第二章纳米二氧化钛光催化产物对小鼠胚胎成纤维细胞的毒性作用 第二章纳米二氧化钛光催化产物对小鼠胚胎成纤维细胞的毒性作用 c y t o t o x i c i t yo fp h o t o c a t a i y t i cp r o d u c t so ft i 0 2n a n o p a r t i c l e so n b a l b cs w i s sm o u s ee m b r y of i b r o b l a s t sc e l l s 成纤维细胞是真皮重要组成细胞之一，是皮肤功能完好的重要保证。成纤维细胞具有 合成胶原纤维和弹性纤维，支撑皮肤的结构，以及释放炎症介质主动参与启动和延续炎症反 应的功能。在紫外线辐射引起的皮肤光老化以及炎症反应的发生过程中，成纤维细胞合成和 分泌的t n f a 及i l 1 d 等细胞因子发挥着重要作用。 小鼠胚胎成纤维细胞( b a l b c 3 t 3 ) 细胞是目前最认可的光毒性评价细胞模型，能较好的 反应成纤维细胞的生物学效应变化【2 3 1 。本章以b a l b c 3 t 3 细胞为靶细胞，选择我国目前评价光 毒性规定使用的对细胞无损伤的u v a 照射条件( 3 6 5 1 1 i i l ，5 j c m 2 ) ，探讨在有无光照的情况 下，受试纳米t i 0 2 ( 1 0 n m 锐钛矿型、2 5 m 锐钛矿型、2 5 m n 金红石型、2 0 0 啪锐钛矿型) 的细 胞损伤效应，初步分析纳米光催化产物的主要作用靶点和毒性作用机制。 第一节纳米二氧化钛光催化产物的一般细胞毒性 光毒性是指应用于机体的物质经暴露于光线后诱发或增强( 在低剂量水平时明显) 的毒 性反应【2 3 1 。本节将通过m t t 法及中性红摄取试验，观察在有无紫外光照条件下受试纳米t i 0 2 对b a l b c 3 t 3 细胞形态、细胞内活性氧、细胞活性等方面的影响，初步分析不同类型的纳米 n 0 2 对细胞细胞膜及线粒体等的损伤水平。 1 材料与方法 1 1 试验材料同第一章第一节1 1 。 1 2 实验细胞 小鼠胚胎上皮细胞( b a l b c 3 t 3 ) 株由江苏省疾病预防控制中心馈赠。 1 3 试剂与仪器 1 3 1 细胞培养试剂及其配制 d m e m 高糖培养基的配制同第一章第一节1 2 1 。 0 2 5 胰蛋白酶溶液称取胰蛋白酶( 美国触s c o 公司，进口分装) 1 o g ，用磷酸盐缓 冲液( p b s ) 缓冲液溶解，玻棒搅拌混匀，放置4 冰箱过夜后，定容至4 0 0 m l ，抽滤除菌， 墨堕奎堂堡主兰垡笙茎 分装，2 0 冰箱保存备用。 1 3 2 主要试剂 中性红( 购自北京鼎国生物技术限责任公司) ； m t t ( 购自s i 肿a 公司) ； 2 7 ，7 l 二乙酰二氯荧光素( d c f h - d a ) 荧光探针( 美国i n v i t r o g e n 公司，进口分装) 按照 1 ：1 0 0 0 的比例，用无小牛血清的d m e m 培养液稀释，使终浓度为1 0 岬o l l ，临用前配制。 1 3 3 主要仪器 c 0 2 培养箱( b b 5 0 6 0 u v ，香港h e a lf o r c ed e v e l o p m e n t 公司) ； 倒置显微镜( c k x 4 l ，日本o l y m p u s 公司) ； 全自动酶标仪( m r x ，美国d y n e xt e c h n o l o g i e s 公司) ； 低温超速离心机( 5 4 1 7 r ，德国e p p e n d o r f 公司) ； 紫外辐照仪( 法国v i l b e r 公司) 。 1 4 方法 1 4 1 受试细胞 b a l b c 3 t 3 细胞采用常规传代培养，用d m e m 培养基( 含体积分数为1 0 的胎牛血清、 1 0 0u m l 青霉素、1 0 0p m l 链霉素) 于3 7 、5 c 0 2 培养箱中进行培养。取生长状态良好 的对数生长期细胞进行试验。 1 4 2 纳米t i 0 2 悬液配制同第一章第一节1 3 。 1 4 3 紫外辐照条件波长3 6 5 1 1 i i l ，照射剂量5 j c i n 2 。 1 4 4 细胞形态学观察 细胞悬液( 1 1 0 5 m l ) 接种于2 4 孔细胞培养板，3 7 、5 c 0 2 培养箱中贴壁生长2 4 h 。加 入不同浓度的受试物溶液，相同的受试物浓度序列制备两个板，每块培养板同时设阴性对照， 每组设3 个平行。继续培养1 8 h ，两块板随机选择，其中一块置紫外辐照仪下进行照射，照射 剂量为5 j c m ? ，室温下将另一块置于暗盒内。照射结束后，继续培养4 h 后观察细胞形态。 1 4 5m t t 法检测细胞活性【2 4 】 向9 6 孔板中加入细胞悬液( 1 1 0 5 孔) ，3 7 、5 c 0 2 培养箱中贴壁生长2 4 h 。加入不同 浓度的受试物溶液，相同的受试物浓度序列制备两个板，每块培养板同时设阴性对照，每组 设3 个平行。继续培养1 8 h ，两块板随机选择，其中一块置紫外辐照仪下进行照射，照射剂量 为5 j c m 2 ，室温下将另一块置于暗盒内。照射结束后，继续培养4 h 后吸除培养基，用p b s 清洗 细胞3 次，加入含m t t 培养基，孵育3 h ，吸除培养基，加入d m s o 震荡l o m i n 后用酶标仪在5 7 0 1 1 i i l 处测定吸光值。 1 2 笙三垩塑鲞三篁丝竺堂堡些兰望翌尘塾墅堕盛堑丝塑堕堕童丝堡旦 1 4 6 中性红摄取光毒性