（水产养殖专业论文）短蛸四个地理群体遗传多样性研究.pdf

上海海洋大学硕j 二学位论文 短蛸四个地理群体遗传多样性研究 摘要 短蛸( o c t o p u so c e l l a t u s ) 属头足纲，蛸亚纲，八腕目，蛸科，蛸属。我国南 北沿海均有分布，主要群体栖居于温带偏北海域，在黄、渤海产量较大，山东的 青岛、烟台、威海，辽宁的大连、营口，河北的乐亭产量较多，是我国北部沿海 蛸类中最重要的经济种之一。近年来随着渔业捕捞强度的加大，短蛸自然资源和 种质遗传多样性正面临着日益严重的破坏。因此，摸清短蛸遗传多样性水平，开 展人工育苗及养殖迫在眉睫。而近年来发展起来的d n a 标记技术所具有的稳定性、 可靠性和准确性使其能够准确的反应生物的遗传信息。本文利用a f l p 和线粒体 d n ac 0 1 基因两种研究方法对我国北方近海四个野生短蛸群体的遗传结构和遗传 变异进行了研究，并且比较了线粒体d n a1 6 sr r n a 基因和c 0 1 基因的序列差异， 以期了解短蛸的遗传背景和为接下来的遗传育种工作提供理论基础。 通过a f l p 技术对四个群体的短蛸进行遗传多样性分析，所筛选的六对引物 e 3 3 m 5 4 ，e 3 9 m 5 4 、e 4 4 m 6 0 、e 3 5 m 5 8 、e 4 2 m 5 8 和e 3 8 m 4 9 共扩增得到3 0 3 个位 点，其中多态位点比率最高的是大连群体( d l ) ，为6 7 9 3 ，最低的是青岛群体 ( q d ) ，为6 2 0 3 。s h a n n o n 多样性指数的变化范围在0 3 4 6 7 - - - 0 3 8 9 3 之间，n e i 指数( h ) 的变化范围在0 2 3 5 3 - - 一0 2 6 1 7 之间，群体间的遗传距离为0 0 4 9 7 0 0 8 5 ， 大连群体的多态位点比例、s h a n n o n 多样性指数和群体n e i s 基因多样性指数均高 于其他三个群体。a m o v a 分析的结果显示：短蛸群体8 8 2 8 的变异来源于群体 内，群体间的变异仅占1 1 7 2 ，显示短蛸的遗传变异主要来源于群体内，但群体 f a j 已经有了一定程度的遗传分化。 采用聚合酶链式反应( p c r ) 技术对中国北部沿海短蛸4 个自然群体3 1 个野生 个体的c 0 1 基因片段进行了扩增和测序，经比对获得7 0 9 b p 的碱基序列。其中碱 基a 、t 、g 和c 的平均含量分别为3 8 5 、2 8 6 、1 8 0 和1 5 o ，a + t 的含量 明显高于g + c 的含量。结果发现3 个插入缺失突变的核苷酸位点，检测到2 6 个 多态性核苷酸位点，1 8 种单倍型，其中2 种共享单倍型。m e g a 3 1 计算群体间遗 卜海海洋大学硕j 二学位论文 传距离，大连和青岛遗传距离最远，为0 0 0 5 2 ，青岛和连云港遗传距离最近，为 0 0 0 2 9 。a m o v a 分析表明，四群体间总遗传分化系数f s t = o 11 4 3 9 ，说明变异主 要来自于群体内，但是群体间已经有了一定程度的遗传分化。群体内，大连和烟 台群体的核苷酸差异数k 以及平均核苷酸多样性指数p i 最高，连云港群体最低； 群体间，大连群体在群体间核苷酸差异数k 、群体间平均每位点核苷酸替代数d x y 和群体间每位点净核苷酸替代数d a 三个指标上都表现出比其它群体较高的水平， 说明大连群体具有最为丰富的遗传多样性。利用c o i 基因序列构建的u p g m a 分 子系统树显示各群体没有明显的聚类。 采用p c r 扩增和序列测定等技术，对短蛸( o c t o p u so c e l l a t u s ) 线粒体d n a 的1 6 sr r n a 和c o i 基因片段进行了初步研究。经p c r 扩增和序列测定，分别得 到1 6 sr r n a 和c o i 两个基因片段的碱基序列，其中1 6 s r r n a 基因片段的大小为 5 5 4 b p ，碱基a ，t ，g ，c 的含量分别为3 8 1 、11 0 、3 3 6 、1 7 2 ；c o i 基 因片段的大小为7 0 9 b p ，碱基a ，t ，g ，c 的含量分别为2 8 6 、1 4 9 、3 8 5 、 1 8 o ；在2 种基因片段中，a + t 含量均明显高于g + c 含量。在3 个样本中，1 6 s r r n a 基因片段有2 个插入缺失位点，2 个转换位点；c o i 基因片段中有1 个插入 觖失位点，一个转换位点，2 个颠换位点。另外，比较本研究所得序列与g e n b a n k 中八腕目其他8 个科9 个种的c o 和1 6 sr r n a 基因片段序列后，发现其聚类结 果与传统分类基本上是一致的。 关键词：短蛸，a f l p ，线粒体d n a ，c 0 1 基因，1 6 sr r n a 基因，遗传多样性 i i ：海海洋大学硕十学位论文 s t u d yo ng e n e t i cd i v e r s i t yf o rf o u rg e o g r a p h i c p o p u l a t i o n so fo c t o p u so c e l l a t u s a bs t r a c t o c t o p u so c e l l a t u s ( c e p h a l o p o d e ，o c t o p o d ao c t o p o d i d a e ) ，m o s t l yl i v ei nt h en o r t h t e m p e r a t ea r e a ，s u c ha st h ey e l l o ws e a a n dt h eb o h a is e a ，d i s t r i b u t i n gf r o mn o r t ht o s o u t ho ft h ec h i n ac o a s t q i n g d a t ) ，y a n t a i ，w e i h a i ，d a l i a n ，y i n g k o ua n dl e t i n ga r et h e m a i np l a c e so fp r o d u c t i o n i ti so n eo ft h em o s ti m p o r t a n te c o n o m i cs p e c i e si nn o r t h e r n c o a s to fc h i n a w i t hf i s h i n gi n c r e a s e di n s e n s i t i v e l yi nr e c e n ty e a r s ，g e r m p l a s mg e n e t i c d i v e r s i t yo f0 o c e l l a t u sa n di t sn a t u r a lr e s o u r c e sa r ee x p o s e dt oa l li n c r e a s i n g l ys e v e r e d a m a g e t h e r e f o r e , i ti su r g e n tt or e v e a lt h eg e n e t i cd i v e r s i t ya n dc a r r yo u ta r t i f i c i a l b r e e d i n g a n da q u a c u l t u r e d n am o l e c u l e a rm a r k e ri sa b l et o e x p r e s sg e n e t i c i n f o r m a t i o na c c u r a t e l yf o ri t se x c e l l e n c eo f s t a b i l i t y , a c c u r a c ya n ds e c u r i t y i nt h i sp a p e r , w es t u d i e dt h ep o p u l a t i o ng e n e t i cs t r u c t u r ea n dg e n e t i cv a r i a t i o no ff o u rw i l do c t o p u s o c e l l a t u sg r o u p si nt h en o r t hc o a s to fc h i n a 、删mt w om e t h o d s ：a f l pa n dm i t o c h o n d r i a l c o lg e n e ，a n ds t u d i e dt h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h em i t o c h o n d r i a ld n a16 sr r n a g e n e a n dc o ig e n es e q u e n c e ，e x p e c t e dt or e a l i z et h eg e n e t i cb a c k g r o u n da n dp r o v i d ea t h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o rg e n e t i cb r e e d i n g i nt h i s s t u d y , a n e wm o l e c u l a r t e c h n o l o g y ：a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ( a f l p ) w a sa p p l i e dt oa s s e s st h eg e n e t i cv a r i a t i o na m o n gf o u r p o p u l a t i o n so fo c t o p u so c e l l a t u s ，d a l i a n ( d l ) ，q i n g d a o ( q d ) ，y a n 诅i ( y t ) a n dl i a n y u n g a n g ( l y ) g r o u p s t o t a lo f3 0 3b a n d sa m p l i f i e dw i t h6a f l pp r i m e rc o m b i n a t i o n sw e r e o b t a i n e df r o m1 2 0i n d i v i d u a l s t h ep e r c e n t a g eo f p o l y m o r p h i cl o c ir a n g e df r o m6 2 0 3 t o6 7 9 3 w i t h i nt h ef o u rp o p u l a t i o n s t h en e i sg e n ed i v e r s i t y ( h ) o ft h ef o u r p o p u l a t i o n sw e r e0 2 3 5 34 0 2 617 t h es h a n n o nd i v e r s i t yi n d i c e s ( i ) w e r e0 3 4 9 7 - - 一 0 3 8 6 3 ，t h eg e n e t i cd i s t a n c e s ( d ) w e r e0 0 4 9 7 0 0 8 5a m o n gp o p u l a t i o n s t h e p e r c e n t a g eo fp o l y m o r p h i cl o c i ( p ) ，s h a n n o nd i v e r s i t yi n d i c e ，a n dg e n e t i cd i s t a n c eo f t h ed lp o p u l a t i o nw e r eh i g h e s ti nt h o s eo ft h ef o u rp o p u l a t i o n s a m o v aa n a l y s i s i n d i c a t e dt h a t11 7 2 o fv a r i a n c ew a sa m o n gp o p u l a t i o n sa n d8 8 2 8 o fv a r i a n c e w a sw i t h i np o p u l a t i o n s a v e r a g ef s tv a l u eo v e r a l ll o c iw a so 117 2 t h e 上海海洋大学顾+ 学位论文 f o u rp o p u l a t i o n sw e r ec l u s t e r e di n t ot w om a j o rc l a d e st h r o u g hu p g m am e t h o db a s e d o ng e n e t i cd i s t a n c e p o p u l a t i o n so fd la n dy tw e r ec l u s t e r e di n t ot h es a m ec l a d e ，a n d q da n dl yw e r ec l u s t e r e di n t ot h eo t h e r a l t h o u g ht h ef o u rp o p u l a t i o n sw e r eg r o u p e d i n t ot w oc l u s t e r sb yw h o l ep o p u l a t i o n , a l lt h e12 0i n d i v i d u a l sf r o mf o u rp o p u l a t i o n s w e r ec l u s t e r e dw i t he a c ho t h e rt h r o u g hu p g m am e t h o db a s e do nt h e i rg e n e t i c d i s t a n c e s t h ei n f o r m a t i o nm a yb eb e n e f i c i a lt of u t u r eb r o o d s t o c ks e l e c t i o na n d d e f i n i n gc o n s e r v a t i o nm a n a g e m e n tf o rt h ed i f f e r e n tp o p u l a t i o n so fo c t o p u s o c e l l a t u s m i t o c h o n d r i a lc o ig e n ef r a g m e n t so fw i l do c t o p u so c e l l a t u sw e r ea m p l i f i e d w i t hp c r , t h e nt h ep c r p r o d u c t sw e r ep u r i f i e da n ds e q u e n c e d ，a n d7 0 9 b pn u c l e o t i d e s e q u e n c e sw e r eo b t a i n e d t h ea ，t ，ga n dcc o n t e n t si nt h e s ef r a g m e n t sw e r e3 5 8 ， 2 8 6 ，18 0 a n d15 0 ，r e s p e c t i y e l y , a n dt h ea + tc o n t e n tw a sh i g h e rt h a nt h e ( 汁c c o n t e n t t h r e en u c l e o t i d ep o s i t i o n sh a dg a p so ri n s e r t i o n so fb a s e p a i r sa m o n g i n d i v i d u a l sa n d2 6v a r i a b l en u c l e o t i d ep o s i t i o n sw e r ed e t e c t e di nt h ea n a l y z e d7 0 9 b p c o is e q u e n c e s 18h a p l o t y p e sa r ed e f i n e da m o n gf o u rp o p u l a t i o n s ，b u to n l y2s h a r e d h a p l o t y p e sw e r eo b s e r v e d t h ef i x a t i o ni n d i c e s ( f s 0a n a l y z e db ya m o v ao f a r l e q u i nv e r s i o n3 1 t o t a l l e dt o0 114 3 9 ，w h i c hs h o w sn os i g n i f i c a n tg e n e t i c f i x a t i o na m o n gt h ef o u rp o p u l l a t i o n sb u tw i t h i nt h ef o u rp o p u l a t i o n s t h ek i m u r a 2 - p a r a m t e rg e n e t i c d i s t a n c ec a l c u l a t e d b y t h em e g av e r s i o n3 1b e t w e e n t h e p o p u l a t i o no fq i n g d a o ( q d ) a n dd a l i a n ( d l ) i sh i g h e s t , u pt oo 0 0 5 2 ，w h i l et h a t b e t w e e nt h ep o p u l a t i o no fq i n g d a o ( q d ) a n dl i a n y u n g a n g ( l y ) i sl o w e s tt o0 0 0 2 9 a m o n ga l lt h ep o p u l a t i o n s ，i n d e x e ss u c ha sp ia n dk i nd a l i a na n dy a n t a ip o p u l a t i o n w e r eh i g h e ra n dt h el o w e s tw a sl i a n y u n g a n g ( l y ) p o p u l a t i o n n el e v e lo fg e n e t i c d i v e r s i t yw a sf o u n dh i g hi nd a l i a np o p u l a t i o n ，w i t ht h eh i g h e s tkd x va n dd av a l u e s o f t h ep o p u l a t i o n s m i t o c h o n d r i a l16 sr r n aa n dc o lg e n ef r a g m e n t so fo c t o p u so c e l l a t u sw e r e a m p l i f i e dv i ap c r t h e nt h ep c rp r o d u c t sw e r ep u r i f i e da n ds e q u e n c e d f o r16 sr r n a g e n ef r a g m e n t s ，5 5 4 b pn u c l e o t i d es e q u e n c e sw e r eo b t a i n e d ，a n dt h ea ，t ，ga n dc c o n t e n t so ft h i sf r a g m e n tw e r er e s p e c t i v e l y3 8 1 ，1 1 o ，3 3 6 ，1 7 2 t h es i z eo f t h ec o ig e n ef r a g m e n t sw a s7 0 9 b pa n dt h ea ，t ，ga n dcc o n t e n t sw e r e2 8 6 ， 1 4 9 ，3 8 5 ，1 8 o ；a n a l y s i so f1 6 sr r n aa n dc 0 1g e n ef r a g m e n t si n d i c a t e dt h a t t h ea + tc o n t e n tw a sh i g h e rt h a nc + gc o n t e n t i nt h et e s t e dt h r e es a m p l e s t h e r ew e r e2 i n s e r t i o n d e l e t i o na n d2t r a n s i t i o n sl o c i si nt h es e q u e n c eo f 】6 sr r n af r a g m e n t s , a n d t h e r ew e r eo n ei n s e r t i o n d e l e t i o n ，o n et r a n s i t i o na n d2t r a n s v e r s i o n sl o c i si nt h ec o i l v 上海海洋大学硕士学位论文 g e n ef r a g m e n t s i na d d i t i o n , i ti sf o u n dt h a tt h eg r a p h i c a lp h y l o g e n e t i ct r e eo f16 s r r n aa n dc 0 1g e n ef r a g m e n to f8f a m i l i e s9 s p e c i e si s c o n s i s t e n tw i t hc u r r e n t s y s t e r n a t i c so ft h e s es p e c i e s k e yw o r d so c t o p u so c e l l a t u s ，a f l p ，m i t o c h o n d r i a ld n a ，c o ig e n e ，16 sr r n a g e n e ，g e n e t i cd i v e r s i t y v 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学 位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。 除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰 写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人 承担。 学位论文作者签名：飙戈渴 日期：3 。听年r 月，日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密口 学位论文作者签名：多长& 匆 、y 日期：p 1 钳月p 同 指导教师签名： 日期：呷钳肌汨 上海海洋大学硕士学位论文 引言 1 短蛸( o c t o p u so c e l l a t u s ) 概述 1 1 分类地位及地理分布 短蛸( o c t o p u so c e l l a t u s ) 隶属于头足纲( c e p h a l o p o d a ) 、八腕目( o c t o p o d a ) 、 蛸科( o c t o p o d i d a e ) 、蛸属( o c t o p u s ) ，又称短脚蛸、饭蛸、岩章、八带等。广 泛分布于西太平洋沿岸，在我国南北沿海均有分布，在黄、渤海产量较大，山东 的青岛、烟台、威海，辽宁的大连、营口，河北的乐亭产量较多，是我国北部沿 海蛸类中最重要的经济种之一。 1 2 形态结构 短蛸是一种小型章鱼，一般体长1 5 - 2 7 厘米。胴部卵圆形或球形。胭背面粒 状突起密集。各腕较短，其长度大体相等，腕长相当于脑部近2 倍。背部两眼间 具一浅色纺锤形或半月形的斑块，两眼前方由第2 对至第4 对腕的区域内各具一 椭圆形的金色圈。腕吸盘2 行。体黄褐色，背部较浓，腹部较淡。 1 3 生物学特性及生活史 短蛸为冷温性，主要营底栖生活，在繁殖期间有短距离的洄游移动，在山东 青岛沿岸的繁殖期约为3 月下旬到5 月初，4 月最盛；初春桃花开时，短蛸从较深 水处集群向沿岸移动，俗称“桃花蛸”，渔汛随之开始，短蛸的产卵适温约为6 1 0 ，8 c 左右集群密集；在水深5 、6 米至2 0 余米的砂砾海底交配，产卵，此时 的钻壳行为特别明显。全长1 6 0 - 1 8 0 毫米的雌体，怀卵3 0 0 - - - 4 0 0 个左右。卵子 分批成熟，分批产出，卵常产于空贝壳中，产出的卵子很像煮熟的大米饭粒，饭 蛸即由此得名；卵子的长径4 5 - - 6 3 毫米，短径2 6 - - 3 0 毫米，一穗一穗地结附 上海海洋大学硕+ 学位论文 在一起，水温1 5 2 1 时，孵化期约为4 0 - 4 5 日；刚孵出的稚仔全长1 0 毫米以 内，与成体形态已甚接近，能自由活动，生长迅速，半年后，体长即可接近于性 成熟的个体，稚仔对低盐度的适应力弱，短蛸稚仔的安全盐度范围为3 5 2 9 o o ， 盐度低于2 5 o 时，一昼夜死去一半，盐度低于2 0 o 时，6 小时内全部死亡，盐度 为1 0 。左右时，1 0 分钟内全部死亡。 在繁殖期间，由于东南风的影响，短蛸会涌向砂底的潮问带，最高能达到潮 间带上区，并钻入砂中。海滩的石头下面也有短蛸栖居。钻砂时，体缩狭，体色 变浓，各腕逐渐收拢，胴部后端上抬，然后以腕的基部压挤砂堆，形成一个凹窝， 腕的基部随即没入砂中，此时腕的项部翻上胴背，整个身体继续缩狭，头部和胴 部渐次潜入砂中，各腕顶部最后没入砂中，潜砂行为在一分钟内即可完成，潜入 甚浅，仅覆盖全体，有得仅露出两只眼睛，其轻微的呼吸动作，在砂面隐约可见。 在潮间带，短蛸的分布也有一定得密度，较多时，一人一天可采获二、三十个【l j 。 1 4 经济价值 短蛸为我国北方沿岸蛸类中最重要的经济种，山东沿岸的年产量达数百吨。 肉较嫩，味鲜美，可食部分达百分之九十五，蛋白质丰富，含脂率高，干制品为 地质勘探、生物考察和行军野外生活的理想食品。 国外对于章鱼的研究较深入，章鱼是含牛磺酸最高、脂肪最低的海洋食品之 一。蛸类还具有较好的药用价值，据本草纲目记载：“甘咸，寒，无毒”，“养 血益气”之说，药用鲜肉和干肉，沿海民间用作补益强壮药，催乳，治疟疾等。目 前认为章鱼具有消炎、活血、抗癌等作用。从蛸类肉的煮汁中，可提取牛磺酸 ( t a u r i n e ) ，为止虚汗剂和特殊兴奋剂，用于治疗结核病、关节炎j 神经病、腺质病 和血液障碍等。章鱼视紫质中糖蛋白的n 连接糖链的结构特性与功能是一个很大 的发现，现已用于老人视力障碍的治疗。章鱼毒素，又称头足毒素( c e p h a l o t o x i n ) ， 存在于多种章鱼的唾液腺中。自从1 9 1 3 年以来许多国外学者对章鱼的唾液腺各种 提取物有过多方面研究，现已分离出酪胺、组胺和章鱼胺等低分子胺类。不同种 类的章鱼毒素成分不同，毒性也不同。章鱼毒素对许多生理系统均有强烈效应， 初步认为有希望制成中枢神经系统药物。 2 遗传标记技术的发展状况 遗传标记( g e n e t i c m a r k e r s ) 是研究生物遗传多样性问题的合适指标，是指可 2 上海海洋大学硕士学位论文 以明确反映遗传多态性的生物特质。在遗传研究的过程中，人们一直在致力于寻 找一些可靠的遗传标记来提高研究效率和效能。遗传标记的种类和数量随着遗传 学的发展而不断增加，经历了一个从简单到复杂、从宏观到微观、从表形到本质 的进步过程。随着生物学技术的不断发展，遗传标记也在不断发展，经历了形态 学、细胞学、生物化学及分子标记等几个主要发展阶段。 2 1 遗传标记的发展及其类型 遗传标记( g e n e t i cm a r k e r s ) 是指与目标基因性状紧密连锁，同该性状共同分 离且易于识别的可遗传的等位基因变异【l 】。遗传标记应该具备两个特点：1 ) 变异 性，即被研究的作为遗传标记的性状或物质在不同的个体之间存在遗传差异；2 ) 遵循一定得遗传方式，只有变异性而不能遵循某种简单遗传方式的性状或物质则 不能或难以从遗传角度揭示个体问内在的必然的联系。1 9 世纪6 0 年代，m e n d e l 以豌豆为材料研究相对性状的遗传规律，构成了最早的遗传标记一一形态学标记， 奠定了近代遗传学的基础。2 0 世纪初，m o r g a n 等将m e n d e l 提出的遗传因子 ( i n h e r i t e df a t o r ) 的行为和染色体行为结合研究，由此诞生了细胞遗传学，产生了 细胞学标记。1 9 4 1 年b e a l d 和t a t u m 提出“一个基因一个酶”假说，创立了生化遗 传学，使得生化标记得以应用。1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 提出d n a 分子结构双螺 旋模型，宣布了分子遗传学时代的到来，开始了直接应用d n a 多态性作为遗传标 记的新阶段。1 9 8 5 年m u l l i s 等发明了聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ， p c r ) ，实现了可直接扩增d n a 的多态性。由于p c r 的迅速发展，相继产生了 各种新型的分子标记，遗传标记进入了一个全新的发展阶段。目前遗传标记主要 有四种类型，即形态标记、细胞标记、生化标记和分子标记。 2 1 1 形态学标记 形态学标记是与目标性状紧密连锁，表形上可识别的等位基因突变体。如鱼 的体长、体高、体色、骨骼特征等的变异。从广义上讲形态学也包括与色素、生 殖生理特性、抗病性和生态习性、寄生物的分布等有关的标记，这也是m e n d e l 遗 传学的重要基础。形态学标记的特点有以下几点： ( 1 ) 形态标记数量少，不能随机代表生物体遗传组成。 ( 2 ) 无法确定哪些性状更为重要，更符合研究目的。 ( 3 ) 形态标记变异小，通常只有两种变异类型。 ( 4 ) 观测方便易行。 3 上海海洋大学硕+ 学位论文 目前，已建立了许多作物的形态标记遗传图谱，如：水稻、棉花等。但是生 物表型是遗传因素与环境因素相互作用的综合结果，利用形态标记检测亲缘关系 很近的基因型时往往不能获得令人满意的结果；同时，由于形态标记数量少，可 鉴别标记的基因有限，并不能完全或真实的反映遗传变异，得到的结果往往变异 不明显，因而难以建立饱和的遗传图谱和在全球范围内应用。 2 1 2 细胞学标记 细胞学标记是指能明确反映遗传多态性的细胞学特征。生物学研究进入细胞 学水平后，染色体组型分析染色体多态性研究成为重要研究工具。这种方法 通过比较细胞分裂时期染色体的形态参数，如相对长度、着丝点指数、臂比等将 每条染色体按各自特征区分开，得到一定的染色体组型。同时利用染色体显带技 术进行差异显色，借助特殊处理使染色体显示特定的带纹以便进行更细致的染色 体带型分析。根据带型和常规组型分析的指标识别染色体的异同，揭示染色体多 态性。染色体多态性对于生物遗传多态性的认识非常重要，但对染色体数目相等、 形态相似的物种、类群或同一群体不同个体来说，单纯用染色体多态性来进行遗 传学研究是不够的，而其染色体的研究经常需要大量的人力和物力。同时有些物 种对染色体的耐受性较差，增加了获得相应标记材料的难度，这在一定程度上制 约了细胞学标记在遗传标记方面的应用。 2 1 3 生物化学标记 酶作为遗传标记是在m a r k e r & m o l l e r t 2 】提出了同工酶的概念后迅速发展起来 的。同工酶( i s o z y m e s ) 是指具有相同催化功能而结构及理化性质又不同的一类酶， 其结构差异来源于基因类型的差异，并不一定是同一基因的产物。每一个酶的不 同的酶谱表现型可能是由于不同的基因座引起，也可能是同一基因座位上的不同 的等位基因引起的，后者又叫等位酶( a l l o z y m e s ) 。蛋白质是基因表达的产物， 本质上仍是表型标记，但与形态性状、细胞学特征相比，数量上更丰富，受环境 影响更小，能更好地反映遗传多态性。同工酶电泳技术问世，并在随后的二十多 年时间内成为研究群体遗传变异和群体问遗传分化、系统发育的主要手段。同工 酶是基因表达的产物，分子的大小和形状有所不同，在定的缓冲介质中不同的 同工酶所带电荷就不同，它们可通过电泳分离，并经过与底物反应或是染色，检 测其是否存在和分子量大小。通过同工酶的电泳表型可推断出编码同工酶的基因 的基因型，并且可以得到基因及基因型在群体中的分布频率，以此对群体的遗传 4 上海海洋大学硕十学位论文 结构和遗传变异水平进行研究。由此可见，同工酶作为共显性标记可以揭示基因 的序列和功能差异。同工酶标记已经被广泛应用于建立遗传图谱、种群分析、资 源评价等的研究中【3 “】。但同工酶分析仍存在其内在的局限性： ( 1 ) 同工酶是基因表达产物而不是基因本身，因此在翻译后可能会被修饰，且其 活性受环境及发生状态的影响。 ( 2 ) 同工酶只能分析编码酶蛋白的基因位点，而对非结构基因则无能为力；只能 检测出可导致产物分子静电荷改变的氨基酸组成性变异。 2 1 4 分子水平标记 由于分子生物学的不断发展，遗传标记的概念发展为在核酸分子水平上具有 相对差异的等位基因。他们广泛存在于高等生物d n a 编码区及非编码区，因此被 称为d n a 分子标记。与自订三种标记( 形态、细胞、生化标记) 不同，分子标记是 d n a 水平上遗传变异的直接反应。近2 0 年来，分子标记的研究和应用飞速发展， 一系列分子标记系统相继形成，已经有越来越多的标记应用于遗传连锁作图，数 量性状遗传等。与其他三种遗传标记相比，分子标记具有下列优越性【5 】： ( 1 ) 直接以d n a 形式表现，不受实验材料、生长时期、季节、环境限制。 ( 2 ) 数量多，遍及整个基因组。 ( 3 ) 多态性高，自然界存在许多等位变异。 ( 4 ) 样品需求量少。 ( 5 ) 很多分子标记表现为共显性，能鉴别出纯合基因型和杂合基因型，能提供完 整的遗传信息【6 】。 2 2 分子标记的种类 分子标记研究的基本原则是采用可遗传的、离散的和稳定的标记去鉴别个体、 群体和种特征的基因型。 2 2 1 以s o u t h e r n 杂交为基础的分子标记技术 r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 限制性片段长度多态性标记) r f l p 技术是出现最早，基于分子杂交的d n a 标记，于1 9 8 0 年由b o s e t n i 等 首先提出，至今仍被广泛应用【7 1 ，它是指由于d n a 分子中限制性内切酶酶切位点 之间的插入、缺失、重排或突变导致酶切位点的增减所引起的基因型间限制性片 5 上海海洋大学硕士学位论文 段长度的差异。该技术的基本步骤如下：d n a 提取；用d n a 限制性内切酶切割； 凝胶电泳分离限制性片段；将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜 上；用放射性同位素或非放射性物质标记d n a 做探针与膜上的d n a 杂交；放射 性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。因此， r f l p 是一项综合技术，涉及到d n a 片段的克隆、基因组d n a 提取、限制酶切、 凝胶电泳、s o u t h e r n 印记转移、d n a 探针制备及分子杂交等生物技术。r f l p 的优 缺点有： ( 1 ) 标记数目理论上是无限的，可用于物种分类或组建高密度遗传图谱。 ( 2 ) 大部分标记符合孟德尔遗传规律的共显性性状，分析无需特殊方法。 ( 3 ) 结果稳定、可靠。无表型效应，不受发育阶段和器官特异性的限制。 ( 4 ) r f l p 标记的获得依赖限制性内切酶识别位点中碱基的改变或是识别位点位 置的移动，这很大程度上限制了此技术的应用。 ( 5 ) d n a 需要量大，检测技术烦杂，工作量大，难以大规模应用。 ( 6 ) 要接触放射性污染。 r f l p 通常只用于种类鉴定或种内种群问的遗传进化研究，很少用于种以上阶 元的系统发育分析【8 】。 2 2 2 建立在重复序列基础上的分子标记技术 m i c r o s a t e l h t e ( 微卫星d n a 标记) 微卫星d n a 又称简单重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ss s r ) ，它是一类由几 个( 2 - - 5 ) 碱基为重复单位组成的长达几十甚至上百个核苷酸串联而成的d n a 重 复序列，一般较短，如：( g a ) n 、( a c ) n 、( g a a ) n 。它在真核生物中每隔约1 0 n 5 0 k b 就有一个微卫星序列，广泛随机分布于基因组的不同位置。微卫星d n a 重复单位 的重复次数在同物种的不同基因型间的随机性造成了每个座位的多态性。序列重 复数越多，其变异越大，则该微卫星位点的等位基因数越多【9 】。s s r 标记的主要特 点为： ( 1 ) 数量丰富，遍布整个基因组。 ( 2 ) 具有较多的等位性变异。 ( 3 ) 是共显性标记，可鉴别出纯合子和杂合子。 ( 4 ) 引物的通用性好，所需模板少，试验重复性好，结果可靠。 ( 5 ) 因需要知道重复序列两端的序列信息，因此开发有难度，费用较高。 6 上海海洋人学硕士学位论文 内部简单重复序列( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t , i s s r 标记) 基因组中分布有大量的重复序列，根据其在基因组中的含量可将其分为轻度、 中度、和高度重复序列。微卫星是一种高度串联重复序列，i s s r 技术的基本原理 就是在s s r 的3 或5 断加锚1 - - - 4 个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具 有反向排列s s r 的一段d n a 序列进行扩增，然后进行电泳、染色，根据谱带的 有无及相对位置来分析不同样品间i s s r 标记的多念性。其原理和操作与s s r 、 r a p d 非常相似，只是引物设计要求不同，但其产物多态性远比r f l p 、s s r 、r a p d 更加丰富，可以提供更多的关于基因组的信息，而且比r a p d 技术更加稳定可靠， 实验重复性更好。 2 2 3 建立在p c r 基础上的分子标记技术 r a p d ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ，d n a 随机扩增多态性d n a ) r a p d 是由w i l l i a m s 1 0 】和w e l s h 1 1 】领导的2 个小组同时独立发展起来，建立在 p c r 技术上的分子标记技术。其原理是：采用随机合成的较短的( 9 1 0 b p ) 单个 随机引物对基因组d n a 进行p c r 扩增，一般情况下，每个引物可以扩增出2 1 0 个片断，每个片断即可代表基因组上的一个位点。个体间扩增d n a 片段的多态性 主要是由于两个或是其中一个引物结合位点的序列变异，造成某一特定扩增片段 的有无、或是两结合位点之间d n a 序列的插入或缺失而引起的两结合位点之间的 距离变化，从而导致扩增d n a 长度的变化；也可能造成扩增产物的出现或消失。 就某一引物而言，尽管其检测基因组d n a 多态性的区域是有限的，但是如果使用 一系列的随机引物，则可以使检测区域扩大到整个基因组。r a p d 具有其自身独特 优点： ( 1 ) 使用随机引物，无需专门设计p c r 引物。随机引物没有种属特异性，可 用于任何物种。此技术省时省力，技术简便、利于操作。 ( 2 ) 分辨率比较高。随机引物的数目可任意增加。 r a p d 技术也存在其自身的局限性： ( 1 ) 呈显性孟德尔方式分离，难以区分显性纯合基因型和杂合基因型。 ( 2 ) 反应受多种因素影响，重复性不高。 由于r a p d 技术简单、快捷、灵敏度较高等特点，它已经在遗传学的很多研 究领域得到广泛的应用。 7 上海海洋人学硕士学位论文 a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，